Artykuł metodologiczny

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52771

⸱

29 kwietnia 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Streszczenie

Tradycyjne adiuwanty szczepionkowe, takie jak ałun, wywołują nieoptymalne odpowiedzi limfocytów T CD8+. Aby sprostać temu głównemu wyzwaniu w opracowywaniu szczepionek, zaprojektowano różne systemy nanocząstek, które naśladują cechy patogenów w celu poprawy dostarczania antygenu do drenujących węzłów chłonnych i zwiększenia wychwytu antygenu przez komórki prezentujące antygen, co doprowadziło do powstania nowych preparatów szczepionek zoptymalizowanych pod kątem indukcji odpowiedzi limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu. W tym artykule opisujemy syntezę systemu nanocząstek "naśladującego patogeny", określanego jako usieciowane pęcherzyki wielopłytkowe (ICMV) usieciowane międzywarstwowo, które mogą służyć jako skuteczny nośnik szczepionki do jednoczesnego dostarczania antygenów podjednostkowych i środków immunostymulujących oraz wywoływania silnych odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T CD8 + (CTL). Opisujemy metody charakteryzowania wielkości hydrodynamicznej i ładunku powierzchniowego nanocząstek szczepionki za pomocą dynamicznego rozpraszania światła i analizatora potencjału zeta oraz przedstawiamy procedurę opartą na mikroskopii konfokalnej do analizy dostarczania antygenu za pośrednictwem nanocząstek do drenujących węzłów chłonnych. Ponadto pokazujemy nową technikę obrazowania bioluminescencji całych zwierząt, wykorzystującą adoptywny transfer limfocytów T CD8 + CD8 + z ekspresją lucyerazy, specyficznych dla antygenu do myszy biorców, a następnie szczepienie nanocząsteczkami, co pozwala na nieinwazyjne badanie wzorców ekspansji i transportu CTL w czasie rzeczywistym. Opisujemy również barwienie tetramerowe i analizę cytometryczną przepływową komórek jednojądrzastych krwi obwodowej w celu podłużnego oznaczania ilościowego endogennych odpowiedzi limfocytów T u myszy zaszczepionych nanocząstkami.

Wprowadzenie

Tradycyjne opracowanie szczepionki opierało się głównie na empirycznym podejściu prób i błędów. Jednak dzięki niedawnemu rozwojowi szerokiej gamy biomateriałów i odkryciu molekularnych determinantów aktywacji immunologicznej, możliwe jest obecnie racjonalne projektowanie preparatów szczepionek z biofizycznymi i biochemicznymi wskazówkami pochodzącymi z patogenów1,2. W szczególności zbadano różne platformy dostarczania leków w postaci cząstek stałych jako nośniki szczepionek, ponieważ mogą być one współładowane z antygenami podjednostkowymi i środkami immunostymulującymi, chronić składniki szczepionki przed degradacją i zwiększać ich jednoczesne dostarczanie do komórek prezentujących antygen (APC) znajdujących się w węzłach chłonnych (LN), maksymalizując w ten sposób stymulację immunologiczną i aktywację3-5. W tym raporcie opisujemy syntezę systemu nanocząstek "naśladującego patogeny", określanego jako usieciowane pęcherzyki wielopłytkowe (ICMV) usieciowane międzywarstwowo, które wcześniej wykazano jako potężna platforma szczepionkowa do wywoływania silnych cytotoksycznych limfocytów T (CTL) i humoralnej odpowiedzi immunologicznej zarówno w przedziałach tkanki układowej, jak i błony śluzowej6-9. W szczególności szczepienie ICMV spowodowało znaczne zwiększenie poziomu IgG w surowicy przeciwko antygenowi malarii w porównaniu ze szczepieniem konwencjonalnymi adiuwantami (np. ałunem i montanidem)7, a także wywołało silną odpowiedź CTL przeciwko komórkom nowotworowym i modelom prowokacji wirusowej u myszy9. Tutaj, wykorzystując ICMV jako modelowy system nanocząstek szczepionkowych, opisujemy metody charakterystyki nanopreparatów szczepionkowych, w tym pomiary wielkości cząstek i potencjału zeta oraz śledzenie transportu cząstek do drenujących LN (dLN) z wykorzystaniem obrazowania konfokalnego tkanek poddanych kriosekcji7. Ponadto przedstawiamy opartą na obrazowaniu całego zwierzęcia metodę analizy ekspansji odpowiedzi CTL u myszy po adoptywnym transferze limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu z ekspresją lucyferazy9,10. Na koniec opisujemy barwienie tetramerowe komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w celu podłużnego oznaczania ilościowego endogennych odpowiedzi limfocytów T u myszy zaszczepionych nanocząstkami6,9.

ICMV to preparat nanocząsteczkowy na bazie lipidów, syntetyzowany przez kontrolowane połączenie prostych liposomów w struktury wielopłytkowe, które są następnie chemicznie stabilizowane przez sieciowanie funkcjonalizowanych maleimidem fosfolipidowych grup głównych w warstwach lipidowych za pomocą środków sieciujących ditiool6. Po zsyntetyzowaniu ICMV, niewielka frakcja nanocząstek może być wykorzystana do określenia wielkości cząstek i potencjału zeta (tj. ładunku powierzchniowego cząstek) za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) i analizatora potencjału zeta. DLS mierzy zmiany rozpraszania światła w zawiesinach cząstek, co pozwala na wyznaczenie współczynnika dyfuzji i wielkości hydrodynamicznej cząstek11. Osiągnięcie stałej wielkości cząstek z syntezy między partiami ma kluczowe znaczenie, ponieważ wielkość cząstek jest jednym z głównych czynników wpływających na drenaż limfatyczny cząstek szczepionki do dLN i późniejszy wychwyt komórkowy przez APC12,13. Ponadto potencjał zeta można uzyskać poprzez pomiar prędkości cząstek po przyłożeniu prądu elektrycznego, co pozwala na określenie ruchliwości elektroforetycznej cząstek i ładunku powierzchniowego cząstek11. Zapewnienie stałych wartości potencjału zeta cząstek jest ważne, ponieważ ładunek powierzchniowy cząstek decyduje o stabilności koloidalnej, co ma bezpośredni wpływ na dyspersję cząstek podczas przechowywania i po podaniu in vivo 14,15. W celu śledzenia lokalizacji cząstek w dLN, ICMV mogą być znakowane pożądanymi fluoroforami, w tym barwnikami lipofilowymi i kowalencyjnie znakowanymi antygenami. Po szczepieniu myszy mogą zostać poddane eutanazji w różnych punktach czasowych, wycięte dLN, poddane kriosekcji i przeanalizowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia wizualizację drenażu limfatycznego zarówno nośników szczepionki nanocząsteczkowej, jak i antygenu do dLN. Skrawki tkanek można dodatkowo wybarwić fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami i wykorzystać do uzyskania większej ilości informacji, takich jak typy komórek związanych z antygenem i tworzenie centrów rozrodczych, jak pokazaliśmy wcześniej7.

Gdy synteza cząsteczek zostanie zoptymalizowana i transport do dLN zostanie potwierdzony, ważne jest, aby potwierdzić możliwość uzyskania ekspansji CTL in vivo. W celu analizy wywołania specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8 + w odpowiedzi na szczepienie nanocząsteczkami, wykorzystaliśmy modelowy antygen, albuminę jaja kurzego (OVA), z immunodominującym epitopem limfocytów T CD8 + peptydu OVA257-264 (SIINFEKL), co umożliwia szczegółowe analizy immunologiczne odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu w celu wstępnego opracowania szczepionki16,17. W szczególności, aby zbadać dynamikę ekspansji i migracji limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu, wygenerowaliśmy podwójnie transgeniczny model myszy, krzyżując transgeniczne myszy eksprymujące lucyferazę świetlika (Luc) z transgenicznymi myszami OT-I, które posiadają limfocyty T CD8 + z receptorem komórek T (TCR) specyficznym dla SIINFEKL (w połączeniu z H-2Kb). Z tych myszy OT-I / Luc limfocyty T OT-I CD8 + z ekspresją lucyferazy można wyizolować i przygotować do adoptywnego transferu do naiwnych myszy C57BL / 6. Po wysianiu, udana immunizacja nanocząstkami zawierającymi OVA spowoduje ekspansję przeniesionych limfocytów T, które można śledzić, monitorując sygnał bioluminescencji za pomocą systemu obrazowania całego zwierzęcia9,10. Ta nieinwazyjna technika obrazowania całego ciała była stosowana z innymi antygenami wirusowymi lub nowotworowymi w ciągu ostatnich18-20 lat, ujawniając procesy związane z ekspansją limfocytów T w tkankach limfatycznych i rozprzestrzenianiem się do tkanek obwodowych w sposób podłużny.

Uzupełnienie do analizy adoptywnie przenoszonych komórek T CD8+ specyficznych dla antygenu, endogenne odpowiedzi limfocytów T po szczepieniu mogą być badane za pomocą testu tetramerowego peptyd-major histocompatibility complex (MHC)21, w którym kompleks tetramerowy peptyd-MHC, składający się z czterech znakowanych fluoroforem cząsteczek MHC klasy I załadowanych epitopami peptydowymi, jest używany do wiązania TCR i znakowania limfocytów T CD8+ w sposób specyficzny dla antygenu. Test tetrameru peptyd-MHC można przeprowadzić albo w końcowych badaniach sekcji zwłok w celu identyfikacji limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu w tkankach limfoidalnych i obwodowych, albo w badaniach podłużnych z komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) uzyskanymi z seryjnych pobrań krwi. Po barwieniu limfocytów tetramerem peptyd-MHC przeprowadza się analizę cytometrii przepływowej w celu szczegółowych analiz fenotypu CTL lub ilościowego określenia ich częstości wśród limfocytów T CD8+.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (UCUCA) na Uniwersytecie Michigan i przeprowadzone zgodnie z ustalonymi zasadami i wytycznymi.

1. Synteza i charakterystyka ICMV współładowanych antygenami białkowymi i cząsteczkami adiuwantowymi

  1. Zmieszać stosunek molowy 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfocholiny (DOPC) i 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[4-(p-maleimidofenylo)butyramidu] (MPB) w chloroformie, utrzymując całkowitą ilość lipidów na poziomie 1,26 μmol na partię (tj. 500 μg DOPC i 630 μg MPB) w szklanej fiolce o pojemności 20 ml (średnica = 28 mm i wysokość = 61 mm).
  2. Dodaj leki lipofilowe, takie jak monofosforylowy lipid A (MPLA) lub barwniki lipofilowe (np. DiD), do roztworu lipidów w żądanym stężeniu. Dokładnie usunąć rozpuszczalnik organiczny, przepłukując je dodatkowym suchym azotem i umieszczając próbki w próżni O/N.
  3. Uwodnić płaszcz lipidowy, dodając 200 μl 10 mM bis-tris propanu (BTP, pH 7,0) zawierającego leki rozpuszczalne w wodzie (np. antygeny białkowe). Wiruj przez 10 sekund co 10 minut przez 1 godzinę przy temperaturze regulowanej.
  4. Przenieś zawartość szklanej fiolki do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, umieść próbki w łaźni lodowo-wodnej i poddaj soniku w sposób ciągły przez 5 minut, używając ustawienia intensywności 40% na sonikatorze 125 W/20 kHz z końcówką sondy.
  5. Dodać 4 μl 150 mM ditiotreitolu (DTT) do każdej partii (stężenie robocze 2,4 mM), odwirować i krótko odwirować za pomocą mikrowirówki stołowej.
  6. Dodać 40 μl z 200 mM CaCl2 i wymieszać z pipetą (stężenie robocze 33 mM). Próbki należy inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby umożliwić sieciowanie warstw lipidowych zawierających MPB za pomocą naziemnej telewizji cyfrowej.
  7. Odwirować próbki o masie 20 000 x g przez 15 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w 200 μl ddiH2O.
  8. Powtórzyć krok 1.7 i ponownie odwirować po drugim płukaniu ddiH2O w celu usunięcia CaCl2, nieprzereagowanej DTT i niekapsułkowanych materiałów wsadowych z supernatantu.
  9. Przygotować 10 mg/ml tiolu glikolu polietylenowego o stężeniu 2 kDa (PEG-SH) w ddiH2O. Zawiesić każdą próbkę ICMV w 100 μl roztworu PEG-SH i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  10. Wykonać dwa płukania ddiH2O (krok 1.7) i ponownie zawiesić końcowe granulki ICMV w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem wymieszać zawiesinę ICMV, ponieważ cząstki mogą osiąść na dnie po dłuższym przechowywaniu.
  11. W celu scharakteryzowania cząstek, należy usunąć niewielką porcję (~10%) ICMV z każdej partii i rozcieńczyć indywidualnie w całkowitej objętości 1 ml ddiH2O. Umieścić pojedynczą próbkę w komórce Zetasizer i zmierzyć wielkość cząstek, wskaźnik polidyspersyjności i potencjał zeta próbek za pomocą systemu pomiaru potencjału DLS i zeta (zgodnie z protokołem producenta).

2. Badanie drenażu węzłów chłonnych ICMV znakowanych fluorescencyjnie za pomocą mikroskopii konfokalnej

  1. Przygotowanie ICMV obciążonych antygenem znakowanym fluoroforem i lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym
    1. Przygotuj białko znakowane fluoroforem, takie jak albumina jaja kurzego reagująca z estrem sukcynimidylu Alexa Fluor 555, zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Aby przygotować ICMV znakowane fluoroforem w otoczce lipidowej, dodaj lipofilowy barwnik fluorescencyjny (np. 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-Tetramethylindodicarbocyanine, (DiD)) podczas przygotowywania filmu lipidowego (Krok 1.2) w 0,05% molowej ilości lipidów. Do uwodnienia filmu lipidowego (krok 1.3) użyj buforu zawierającego antygen znakowany fluoroforem i zakończ syntezę ICMV, jak opisano w krokach 1.4-1.11.
  2. Podskórne podawanie nanocząstek u podstawy ogona
    1. Znieczulenie myszy za pomocą parownika o kontrolowanym przepływie wyposażonego w komorę indukcyjną wykorzystującą 3% izofluranu i przepływ tlenu 1,5 l/min zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez IACUC. Gdy mysz straci przytomność, należy szybko wykonać następujące czynności przed ustąpieniem znieczulenia, aby umożliwić optymalny dostęp do miejsca wstrzyknięcia i zminimalizować dyskomfort zwierzęcia. Alternatywnie, użyj odpowiednio dopasowanego stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie. Jeśli myszy są znieczulone dłużej niż 5 minut, należy nałożyć lubrykant do oczu niezbędny do zminimalizowania podrażnień po zabiegu.
    2. Spryskaj podstawę ogona 70% etanolem, aby zdezynfekować i zwilżyć sierść Rozchyl mokre włosy, aby odsłonić mały fragment widocznej skóry, który można wykorzystać do wizualizacji igły pod skórą.
    3. Przygotować zawiesinę do wstrzykiwań zawierających pożądaną ilość antygenu i adiuwanta na 100 μl dawki szczepionki w PBS (np. 10 μg OVA i 0,3 μg MPLA na 100 μl dawki iniekcyjnej stosowano w przeszłości6,9).
    4. Narysować zawiesinę cząstek do strzykawki z igłą o sile 27-29 G i wprowadzić igłę u podstawy ogona (~5 mm od linii włosów) skosem skierowanym do góry i wstrzyknąć 50 μl zawiesiny cząstek22.
    5. Odczekaj kilka sekund, aż ciśnienie się wyrówna, aby zapobiec nadmiernemu przepływowi wstecznemu i wyciągnij igłę. Powtórzyć wstrzyknięcie po drugiej stronie podstawy ogona, aby dotrzeć do obu drenujących pachwinowych LN.
  3. Przygotowanie kriosekcji węzłów chłonnych i badanie za pomocą mikroskopii konfokalnej.
    1. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie CO2 , a następnie indukowaną odmę opłucnową zgodnie z zatwierdzonym przez IACUC protokołem na zwierzętach. Ekstrahować pachwinowe LN zgodnie z protokołem przedstawionym w Bedoya23 i wypłukać krew, umieszczając tkanki w 1 ml PBS o temperaturze 4 °C.
    2. Wchłonąć PBS z tkanek z tkankami i umieścić tkankę w krioformach tkankowych (10 x 10 x 5 mm3) wstępnie wypełnionych do góry pożywką do zamrażania OCT24. Zamroź blok tkanki w ciekłym azocie na 30 sekund. Alternatywnie umieść blok tkanki na suchym lodzie na 30 minut. Zamrożoną tkankę przechowywać w zamrażarce w temperaturze -80 °C.
    3. Wyciąć skrawki tkanek o grubości 5-10 μm w kriosacie ustawionym w temperaturze -20 °C24.
    4. W razie potrzeby wykonaj znakowanie immunofluorescencyjne i zbadaj tkankę za pomocą mikroskopii konfokalnej, jak wykazano wcześniej24.

3. Monitorowanie ekspansji limfocytów T CD8+ swoistych dla antygenu i ekspresji lucyferazy po szczepieniu nanocząsteczkami za pomocą obrazowania całego zwierzęcia

  1. Izolacja specyficznych dla OVA257-264, eksprymujących lucyferazy limfocytów T CD8 + od transgenicznych myszy OT-I / Luc
    1. Poddać eutanazji transgeniczną mysz OT-I/Luc z uduszeniem CO2 i wywołać odmę opłucnową zgodnie z protokołem na zwierzętach zatwierdzonym przez IACUC. Pobrać śledzionę w sterylny sposób, uzyskując dostęp do jamy otrzewnej i ostrożnie odłączając tkankę od trzustki23 i umieścić w 5 ml 4 °C PBS + 2% FBS w celu przeniesienia do kaptura do hodowli tkankowej.
    2. Umieść śledzionę na nylonowym sitku o średnicy 70 μm na stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml (do 3 śledziony na raz). Za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 3 ml zmielić komórki przez sitko.
    3. Umyć tłok i sitko środkiem PBS + 2% FBS i wyrzucić. Doprowadzić całkowitą objętość do 10 ml/śledzionę w probówce o pojemności 50 ml, pobrać małą próbkę zawiesiny komórek do policzenia za pomocą hemocytometru i odwirować przez 10 minut przy 300 x g.
    4. Korzystając z dostępnego w handlu zestawu do selekcji magnetycznego negatywu, wyizoluj populację limfocytów T CD8 +, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Po umyciu komórek PBS policz liczbę wyizolowanych limfocytów T CD8 +. Aby ocenić czystość wyizolowanych limfocytów T CD8 +, inkubować ~ 20 000-30 000 komórek w 20 μl mysiego przeciwciała CD16/32 (0,025 mg / ml) przez 10 minut, a następnie dodać 20 μl przeciwciała αCD8-APC (0,005 mg / ml) i inkubować przez 30 minut. Wszystkie inkubacje należy przeprowadzić w temperaturze 4 °C w PBS + 1% w/v BSA. Wykonać analizę cytometrii przepływowej25.
  2. Adoptywny transfer izolowanych limfocytów T CD8+ i wizualizacja ich ekspansji po szczepieniu
    1. Wykonaj adoptywny transfer izolowanych limfocytów T OT-I / Luc CD8 + do naiwnych myszy C57BL / 6, podając 1-10 × 105 komórek w objętości 200 μl PBS poprzez dożylne wstrzyknięcie żyły ogonowej22 (dzień -1). Biorąc pod uwagę, że futro i czarne plamy skóry u myszy C57BL / 6 mogą zakłócać sygnał bioluminescencyjny, ogolone myszy albinosy C57BL / 6 są idealne do tych badań.
    2. Po upływie jednego dnia (dzień 0) należy podać szczepionkę w sposób opisany wcześniej (punkt 2.2).
    3. Podawać 150 mg lucyferyny na kg masy ciała myszy dootrzewnowo w objętości 300 μl PBS. Po 10 minutach znieczulij myszy izofluranem (jak w kroku 2.2.1) i uwidocznij limfocyty T OT-I/Luc CD8 +, uzyskując sygnał bioluminescencji przez 5-10 minut za pomocą systemu obrazowania całego zwierzęcia (IVIS; szczegółowe instrukcje można znaleźć w Wilson26). Powtórz w razie potrzeby w przypadku badań podłużnych.

4. Barwienie tetramerów peptydowo-MHC PBMC do analizy specyficznych dla antygenu limfocytów T CD8+

Uwaga: Poniższa procedura protokołu może być wykonana przy użyciu myszy C57BL/6 adoptycyjnie przeniesionych z limfocytami T OT-I/Luc CD8+ lub myszy C57BL/6 bez transferu adoptywnego.

  1. W pożądanym momencie po szczepieniu należy pobrać około 100 μl krwi (4-6 kropli) od myszy za pomocą techniki krwawienia podżuchwowego27 do probówki pokrytejK2EDTA i kilkakrotnie odwrócić, aby zapobiec zakrzepom.
  2. Przenieść 100 μl krwi do probówki mikrowirówkowej, dodać 1 ml buforu do lizy i inkubować przez 2 do 3 minut w celu usunięcia czerwonych krwinek (RBC). Odwirować próbki przez 5 minut przy 1 500 x g i usunąć supernatant. Jeśli osad nadal wydaje się czerwony (co wskazuje na niepełne usunięcie erytrocytów), powtórz etap lizy z krótką inkubacją (< 1 min) buforu do lizy.
  3. Przemyć pozostałe PBMC 1 ml buforu FACS (PBS + 1% w/v BSA) i odwirować przy 1 500 x g przez 5 minut.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić próbkę w 20 μl mysiego przeciwciała CD16/32 (0,025 mg/ml) w celu zablokowania wiązania przeciwciał niespecyficznych i za pośrednictwem FcR. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Przenieść komórki z probówek do mikrowirówek do 4 ml okrągłodennych probówek FACS. Do każdej próbki dodać 20 μl roztworu H-2Kb OVA Tetramer-SIINFEKL-PE zgodnie ze specyfikacją producenta i inkubować przez 30 minut na lodzie.
  6. Przygotuj koktajl przeciwciał (np. przeciwciała αCD8-APC, αCD44-FITC i αCD62L-PECy7 (stężenie odpowiednio 0,005, 0,005 i 0,002 mg/ml)). Dodać 20 μl do każdej próbki doświadczalnej i inkubować przez 20 minut na lodzie. Przygotować pojedyncze kontrole fluoroforowe, znakując komórki każdym tetramerem lub przeciwciałem znakowanym fluoroforem w stężeniu wskazanym powyżej.
  7. Przemyć 2 razy buforem FACS i ponownie zawiesić końcowe osady w buforze FACS zawierającym 2 μg/ml DAPI. Komórki są teraz gotowe do analizy metodą cytometrii przepływowej (szczegóły i przykłady można znaleźć w Scheffold25).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Etapy syntezy ICMV przedstawiono na Rysunku 16. W skrócie, film lipidowy zawierający leki lipofilowe lub barwniki fluorescencyjne jest hydratowany w obecności leków hydrofilowych>. Kationy dwuwartościowe, takie jak Ca2+, są dodawane w celu zainicjowania fuzji liposomów anionowych w pęcherzyki wielowarstwowe. Ditiolowy czynnik sieciujący, taki jak DTT, jest dodawany w celu „zszycia” lipidów funkcjonalizowanych maleimidem na przeciwległych warstwach lipidowych, a na koniec pozostałe z...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół przedstawiony w tym artykule opisuje syntezę i charakterystykę nowego systemu nanocząstek na bazie lipidów, określanego jako ICMV, i zapewnia proces walidacji skuteczności preparatów szczepionek opartych na nanocząstkach w indukowaniu odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu. Synteza ICMV jest zakończona we wszystkich warunkach wodnych, co jest dużą zaletą w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi układami nanocząstek polimerowych (np. cząstkami kwasu poli(laktydowo-ko-glikolidowego)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Perkin Elmer podał koszty produkcji poniesione podczas publikacji tego artykułu.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez grant Narodowego Instytutu Zdrowia 1K22AI097291-01 oraz przez National Center for Advancing Translational Sciences of the National Institutes of Health w ramach Nagrody Numer UL1TR000433. Wyrażamy również uznanie dla prof. Darrella Irvine'a z MIT i prof. Matthiasa Stephana z Fred Hutchinson Cancer Center za ich wkład we wstępne prace nad nanocząstkami szczepionki i transgenicznymi myszami OT-I/Luc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1. Synteza i charakterystyka ICMV współobciążonych antygenem białkowym i cząsteczkami adiuwantowymi
1,2-dioleoiloilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidofenylo)butyramid] (sól sodowa) (MPB)Avanti Polar Lipids, INC.
1,2-dioleoiloilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DOPC)Avanti Polar Lipids, INC.
Monofosforylowy lipid A (syntetyczny) (PHAD™) (MPLA)Avanti Polar Lipids, INC.699800
20 ml szklane fiolkiWheaton0334125D
Symphny Piekarnik próżniowyVWR414004-580
Albumina jaja kurzego (OVA)Worthington3054
Bis-tris Propan (BTP)FisherBP2943
Q125 Sonikator (125  W/20  kHz)QsonicaQ125-110
Ditiothreitol (DTT)FisherBP172
2 kDa Tiolowany glikol polietylenowy (PEG-SH)Laysan BioMPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP Malvern
ZetaSizer KuwetyMalvernDTS1070
2. Badanie drenażu węzłów chłonnych znakowanych fluorescencyjnie ICMV za pomocą mikroskopii konfokalnej
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonian Salt (DID)Life TechnologiesD-7757
Alexa Fluor 555-succinimidylowy ester (AF555-NHS)Life TechnologiesA37571
Podłoże do zamrażania Tissue-Tek OCT VWR25608-930
Krioformy tkankoweVWR25608-922
3. Monitorowanie ekspansji specyficznych dla antygenu, eksprymujących lucyferazy limfocytów T CD8 + po szczepieniu nanocząsteczkami za pomocą obrazowania całego zwierzęcia< / strong>
C57BL / 6 myszyJackson000664
Albinos C57BL / 6 myszyJackson000058
OT-1 C57BL/6 myszyJackson003831
70 μ m nylonowe sitkoBD352350
EasySep™ Zestaw do izolacji limfocytów T myszy CD8 +StemCell19853
IVIS® system obrazowania całych zwierzątPerkin Elmer
4. Barwienie tetramerem peptydowo-MHC jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) do analizy cytometrycznej limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu < / strong>
K2EDTA ProbówkiBD365974
bufor do lizy ACKLife TechnologiesA10492-01 
Blok anty-CD16/32 FcEbioscience14-0161-86
H-2Kb OVA TetramerMBLTS-5001-1C
Anty-CD8-APCBD553031
Anty-CD44-FITCBD553133
Anty-CD62L-PECy7Ebioscience25-0621-82
4&,6- Dichlorowodorek dimidyno-2-fenyloindolu (DAPI)SIGMAD8417-10MG
Cytometr przepływowy CyAn OprogramowanieBeckman Coulter
FlowJo
870012850375

Bibliografia

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130(2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771(2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765(2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740(2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465(2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105(2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627(2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Antygenowo swoiste limfocyty T CD8cytometria przep ywowaobrazowanie bioluminescencyjnebarwienie tetrameramimononuklearne kom rki krwi obwodowejdynamiczne rozpraszanie wiat aanaliza potencja u zetamikroskopia konfokalna

Powiązane artykuły