Wysokoprzepustowy pomiar uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA i ilościowego tworzenia NET w ludzkich neutrofilach in vitro

Podsumowanie

Testy o wysokiej przepustowości są prezentowane, które w połączeniu dostarczają doskonałych narzędzi do ilościowego oznaczania uwalniania NET z ludzkich neutrofili.

Streszczenie

Granulocyty neutrofilowe są najliczniejszymi leukocytami w ludzkiej krwi. Neutrofile są pierwszymi, które docierają do miejsca infekcji. Neutrofile rozwinęły kilka mechanizmów przeciwdrobnoustrojowych, w tym fagocytozę, degranulację i tworzenie pułapek zewnątrzkomórkowych neutrofili (NET). NET składają się z rusztowania DNA ozdobionego histonami i kilkoma markerami granulek, w tym mieloperoksydazą (MPO) i ludzką elastazą neutrofilową (HNE). Uwalnianie NET jest aktywnym procesem obejmującym charakterystyczne zmiany morfologiczne neutrofili prowadzące do wydalenia ich DNA do przestrzeni zewnątrzkomórkowej. NET są niezbędne do walki z drobnoustrojami, ale niekontrolowane uwalnianie NET wiąże się z kilkoma zaburzeniami. Aby dowiedzieć się więcej o znaczeniu klinicznym i mechanizmie powstawania NET, potrzebne są niezawodne narzędzia zdolne do ilościowego oznaczania NET.

Tutaj przedstawione są trzy metody, które mogą ocenić uwalnianie NET z ludzkich neutrofili in vitro. Pierwszym z nich jest wysokoprzepustowy test do pomiaru uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA z ludzkich neutrofili przy użyciu nieprzepuszczalnego dla błony barwnika wiążącego DNA. Ponadto opisano dwie inne metody zdolne do ilościowego określania powstawania NET poprzez pomiar poziomów specyficznych dla NET kompleksów MPO-DNA i HNE-DNA. Te metody oparte na mikropłytkach w połączeniu zapewniają doskonałe narzędzia do skutecznego badania mechanizmu i regulacji powstawania NET u ludzkich neutrofili.

Wprowadzenie

NET Powstawanie jest nowym mechanizmem, za pomocą którego neutrofile zwalczają patogeny. ¹ Rdzeniem sieci NET jest jądrowe DNA. ¹ Ta sieć DNA jest związana z białkami granulek neutrofili i histonami. ¹ Główną formą powstawania NET jest śmierć neutrofili charakteryzująca się dekondensacją chromatyny, zanikiem błon ziarnistych i jądrowych, translokacją elastazy neutrofili do jądra, cytrulinacją histonów i wreszcie wyciekiem NET opartych na DNA. ^{cyfra arabska} NET więzią i zabijają szeroką gamę drobnoustrojów i są istotną częścią wrodzonego repertuaru broni immunologicznej. Niekontrolowane tworzenie NET jest jednak powiązane z licznymi chorobami autozapalnymi. ^3,4 Pomimo coraz większego znaczenia tych zjawisk, niewiele wiadomo na temat mechanizmu i regulacji uwalniania NET.

Neutrofile umierające przez uwolnienie NET różnią się od neutrofili apoptotycznych czy nekrotycznych. ^3,5 Neutrofile uwalniające NET wykazują kilka cech charakterystycznych dla powstawania NET. Składniki granulek są związane z DNA w sieciach NET. ¹ Mieloperoksydaza (MPO) i ludzka elastaza neutrofilowa (HNE) znajdują się w pierwotnych ziarnistościach w komórkach w stanie spoczynku, ale są translokowane do jądra, aby związać się z DNA w NET. ¹ Kompleksy MPO-DNA i HNE-DNA są specyficzne dla NET, nie występują w apoptotycznych lub neutrofilach neutrochłonnych. ^1,3,5 Dekondensacja chromatyny to kolejna cecha typowa dla NETosis. ^{cyfra arabska} Uwolnienie NET wymaga również cytrulinacji histonów przez aminidazę peptydylu 4 (PAD4). ⁶ Cytrynowane histony są cechami charakterystycznymi neutrofili, które uległy uwolnieniu NET. ⁶

Tutaj przedstawiono trzy metody, które w połączeniu dostarczają doskonałych narzędzi do ilościowego oznaczania NET na skali o wysokiej przepustowości. Pierwszy test został zastosowany w terenie z różnymi zmianami i określa ilościowo uwalnianie zewnątrzkomórkowego DNA w formacie mikropłytki. Drugi i trzeci test zapewniają potwierdzenie NET poprzez pomiar specyficznych dla NET kompleksów MPO-DNA i HNE-DNA.

Protokół

Instytucjonalna Komisja Rewizyjna Uniwersytetu Georgia zatwierdziła badanie z udziałem ludzi w celu pobrania krwi obwodowej od zdrowych ochotników (UGA# 2012-10769-06). ^5,7,8 Ochotnicy podpisali wymagany formularz świadomej zgody przed pobraniem krwi. Badania przeprowadzone w tym artykule są zgodne z wytycznymi etycznymi dotyczącymi badań medycznych z udziałem ludzi, zawartymi w Deklaracji Helsińskiej.

1. Izolacja neutrofili z obwodowej krwi ludzkiej (Rysunek 1)

Uwaga: Istnieje kilka sposobów izolowania neutrofili z krwi obwodowej. Poniższy protokół zapewnia jedną z możliwości. Protokół ten daje dużą liczbę nieaktywowanych ludzkich neutrofili zdolnych do uwalniania NET po zewnętrznej stymulacji. Użyj 40 ml krwi pełnej uzyskanej od zdrowych ochotników przez nakłucie żyły. ^7,9

1. Podwielokrotność 20 ml krwi rozlać do dwóch stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Dodać 10 ml 6% dekstranu. Delikatnie wymieszaj.
2. Po 20 minutach przenieś górną fazę bogatą w leukocyty bez pobierania granulowanych czerwonych krwinek do czystych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i napełnij ją sterylnym PBS.
3. Odwirować przy 400 x g 10 min. Zawiesić osad w 4 ml sterylnego PBS.
4. Przygotuj 5-stopniowy gradient Percoll 85%-80%-75%-70%-65% w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i nałóż 2 ml zawiesiny leukocytów na każdy gradient.
5. Wirować 800 x g przez 30 minut przy wyłączonych hamulcach.
6. Zbierz wszystkie komórki (neutrofile) w warstwach na granicy 75%/80% i 70%/75%.
7. Umyj komórki dwukrotnie w PBS (350 x g, 10 min, RT) i policz komórki za pomocą hemocytometru.

2. Pomiar kinetyki uwalniania zewnątrzkomórkowego DNA za pomocą fluorymetru mikropłytkowego

Uwaga: Metoda ta umożliwia pomiar zmian fluorescencji nieprzepuszczalnego dla błony barwnika wiążącego DNA, wskazującego na uwalnianie DNA na 96-dołkowej mikropłytce (ryc. 2).

1. Przygotować zawiesinę neutrofili w pożywce do oznaczania (HBSS + 1% (v/v) surowica autologiczna + 5 mM glukozy) w stężeniu 2 x 10⁶ komórek/ml.
2. Dodać 5 μmol/l nieprzepuszczalnego dla błony barwnika wiążącego DNA. Delikatnie wymieszaj.
3. Podwielokrotność ludzkich neutrofili (50 μl/dołek) na 96-dołkowe czarne, przezroczyste mikropłytki dolne. Upewnij się, że podłoże testowe pokrywa całe dno studzienki. Jeśli nie, delikatnie postukaj w talerz z boku.
4. Rozgrzać płytkę zawierającą neutrofile przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
5. W międzyczasie należy przygotować roztwory bodźców o podwójnym stężeniu końcowym, które mają być użyte (w ciepłym pożywce do oznaczania o temperaturze 37 °C). Jako dodatnią kontrolę NET użyj ludzkich neutrofili ze 100 nM octanem forbolu (PMA) przez 4 godziny, aby wyzwolić maksymalne uwalnianie NET. ^{Stymulacja 5,8} PMA przez 4 godziny zapewnia maksymalne uwolnienie NET, podczas gdy spontaniczne tworzenie NET pozostaje na niskim^{poziomie 5,8}.
6. Przygotować fluorymetr na mikropłytce do pomiaru (4 godziny, 37 °C, 530 nm dla wzbudzenia i 590 nm dla emisji).
7. Stymulować neutrofile, dodając 50 μl roztworu stymulującego do 50 μl zawiesin neutrofili. Użyj 0,5 μg/ml saponiny w jednym dołku, aby zmierzyć maksymalny sygnał uwalniania DNA.
8. Umieść płytkę w czytniku i mierz zmiany fluorescencji przez 4 godziny co 2 minuty bez wstrząsania.
9. Do analizy danych oblicz znormalizowane wzrosty fluorescencji w czasie.
   1. Odejmij fluorescencję wyjściową od wartości końcowych dla wszystkich studzienek, w tym saponiny (Rysunek 2A, B). Wzrost fluorescencji saponin powinien być najwyższym sygnałem. Nazywa się to "maksymalnym uwalnianiem DNA" (ryc. 2A).
   2. Oblicz procenty uwolnienia DNA w nieznanych próbkach, dzieląc wzrost fluorescencji nieznanych próbek przez maksymalne uwolnienie DNA.
   3. Uśrednione wyniki kontrprób i przedstaw je jako "% maksymalnego uwolnienia DNA" (Figura 2C).

3. Kwantyfikacja powstawania NET za pomocą testów MPO-DNA i HNE-DNA ELISA

Uwaga: Testy te zmodyfikowane (MPO-DNA) lub ustalone (HNE-DNA) w naszym laboratorium określają ilościowo tworzenie NET poprzez pomiar poziomów kompleksów MPO-DNA i HNE-DNA. ⁵

1. Pokryj 96-dołkowe płytki ELISA o wysokiej zdolności wiązania przez noc przeciwciałami wychwytującymi (50 μl/dołek): anty-MPO (rozcieńczenie 1:2,000) lub anty-HNE (1:2,000).
2. Umyj płytki ELISA trzykrotnie PBS (200 μl/dołek) i zablokuj je 5% BSA i 0,1% albuminy surowicy ludzkiej przez 2 godziny w RT (200 μl/basenik). Umyj trzy razy PBS.
3. Wysiewaj neutrofile na 96-dołkowych mikropłytkach o gęstości 100 000 komórek/studzienkę w pożywce testowej 100 μl i stymuluj tworzenie NET. Inkubować komórki: 4 godziny w temperaturze 37 °C.
4. Przeprowadzić ograniczone trawienie DNazy, dodając 2 U/ml DNazy do supernatantów neutrofili, dobrze je wymieszać. Trzymaj je w RT.
5. Zatrzymać DNazę po 15 minutach, dodając 11 μl 25 mM EGTA (stężenie końcowe 2,5 mM). Dobrze wymieszaj. Zebrać supernatanty w czystych probówkach do mikrofuge. Wiruj próbki, aby pozbyć się resztek komórek w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieś ich supernatanty do czystych probówek do mikrofiltrów. Trzymaj je na lodzie, aż będą gotowe.
6. Użyj podwielokrotności wcześniej przygotowanego "standardu NET".
   Uwaga: Standard NET jest mieszanką trawionych przez DNazę supernatantów neutrofili stymulowanych PMA, uzyskanych od co najmniej 5 różnych, niezależnych dawców ludzkich.
   1. Aby używać tego samego wzorca przez długi czas, należy zebrać i podwielokrotnić dużą ilość supernatantów neutrofilowych od każdego indywidualnego dawcy. Zebranie na przykład 2 ml trawionych przez DNazę supernatantów neutrofili stymulowanych PMA da 200 podwielokrotności (po 10 μl każdy) wystarczających na 200 płytek ELISA. Dane charakteryzujące standard NET znajdują się na rysunku 5.
   2. Stymuluj ludzkie neutrofile za pomocą 100 nM PMA przez 4 godziny i zastosuj trawienie DNazy do ich supernatantów zgodnie z krokami 3.4-3.5.
   3. Zebrać, połączyć, podzielić (10 μl) i zamrozić (-20 °C) supernatanty neutrofilowe.
   4. Aby przygotować "standard NET", należy rozmrozić jedną porcję/donor uzyskany od co najmniej pięciu oddzielnych dawców, wymieszać je i przechowywać na lodzie.
   5. Wyrzuć rozmrożone próbki i użyj świeżych do następnego eksperymentu.
   6. Przygotować seryjne rozcieńczenie standardu NET w stosunku 1:2 w PBS+EGTA.
7. Rozcieńczyć próbki strawione przez DNazę1 (standardowe i nieznane supernatanty) 20-krotnie w PBS+EGTA i podzielić je na podwielokrotności na płytkach ELISA pokrytych przeciwciałami wychwytującymi.
8. Inkubować płytki ELISA przez noc w temperaturze 4 °C i przemyć je trzykrotnie PBS.
9. Zastosuj roztwór przeciwciała detekcyjnego (100 μl/dołek): przeciwciało anty-DNA sprzężone z peroksydazą chrzanu (1:500, mysz). Inkubować przez 1 godzinę w ciemności.
10. Po czterech płukaniach PBS dodać substrat peroksydazy TMB: 100 μl/dołek, 30 min. Niebieskie zabarwienie jest wskazaniem na aktywność peroksydazy (obecne NET).
11. Zatrzymać reakcję, dodając 100 μl/basenik 1 M HCl. Niebieskie roztwory zmienią kolor na żółty (Rysunek 5A).
12. Odczytać absorbancję przy 450 nm za pomocą fotometru mikropłytki.
13. W celu analizy danych należy obliczyć ilość kompleksów MPO-DNA LUB HNE-DNA w porównaniu ze standardem NET.
    1. Odjąć wartość gęstości optycznej tła pożywki do oznaczania od wszystkich próbek.
    2. Wykreślić wartości absorbancji (oś X) rozcieńczonych próbek wzorcowych w stosunku do ich względnej zawartości NET (oś Y) (rysunek 5A).
    3. Korzystając z nienasyconego zakresu tej krzywej standardowej, ustal linię trendu (użyj najlepszego dopasowania wykładniczego z używanego oprogramowania) (Rysunek 5A). Równanie tej linii trendu określa konwersję wartości OD na ilościowe ilości NET.
    4. Wprowadzić zmierzone wartości OD niewiadomych do równania linii trendu z 3.13.3, które da ilość NET w nieznanej próbce jako procent normy NET (rysunek 5A).
    5. Obliczyć średnie powtórzeń (potrójne) i przedstawić dane końcowe jako "ilość kompleksów MPO-DNA lub HNE-DNA (% wzorca)" (Rysunek 5C).

Wyniki

Rysunki w tym manuskrypcie opisują metodę izolacji neutrofili, procedury eksperymentalne i prezentują reprezentatywne wyniki wraz z wyjaśnieniem analizy danych. Rysunek 1 przedstawia sekwencyjne etapy przygotowania ludzkich neutrofili. Protokół ten stanowi tylko jeden z możliwych sposobów izolacji neutrofili. Daje duże ilości spoczynkowych neutrofili zdolnych do uwalniania NET po stymulacji. Rysunek 2 pokazuje, jak działa test uwalniania DNA oparty na flu...

Dyskusja

NET reprezentują fascynujący nowy mechanizm, za pomocą którego neutrofile zabijają patogeny. ¹ Chociaż literatura na temat NET stale się poszerza w ciągu ostatnich dziesięciu lat od ich odkrycia, kilka ważnych pytań związanych z ich rolą w biologii, mechanizmach i regulacji pozostaje niejasnych. Należy opracować odpowiednią metodologię pomiaru NET, tego bardzo unikalnego mechanizmu przeciwdrobnoustrojowego. W tym artykule opisano metody, których można użyć do ilościowego określania sieci NET w sposób o wysokie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Elastaza anty-ludzka neutrofilowa  Królik Ab	Calbiochem	481001	1:2,000x powlekana
anty-mieloperoksydaza Ab (królik)	Millipore	07-496	1:2,000x powlekana
DNaza-1	Roche	10-104-159-001	1 µ g/ml używany do trawienia
20 mM EGTA/ PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
2,5 mM EGTA/PBS	Sigma-Aldrich	E3889-25G
Wykrywanie śmierci komórki ELISA Anti-DNA POD	Roche	11544675001	1:500x
Spektrofotometr Eon Microplate	Biotek
Gen5 All-in-One oprogramowanie do mikropłytek	Narzędzie analityczne Biotek		(ELISA)
Sytox orange	Life Technology	S11368	0,2% końcowe stężenie / objętość
1 M Hepes	Cellgro	25-060-Cl	Użyj 10 mM stężenie końcowe.
1 M	glukoza Sigma		Użyj 5 mM stężenie końcowe.
HBSS	Corning	21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3	Thermoscientific
PMA	Sigma	P 8139	100 nM final used
Płytka ELISA	Greiner bio-one	655061
Probówki stożkowe 15 ml	Thermoscientific	339650
Probówki stożkowe 50 ml	Thermoscientific	339652
Perkol (pH 8,5-9,5)	Sigma	P 1644	Chlorek sodu, Sigma, S7653-250G
Dextran	Spectrum	D1004
RPMI 1640 media	Corning Cellgro	17-105-CV
96 płytka do oznaczania dołków płytka z przezroczystym dnem	Costar	3603