Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego

10.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52788

⸱

21 kwietnia 2015

 , 
1Microbiology Doctoral Training Program, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół generowania i obrazowania zlokalizowanej infekcji bakteryjnej w pęcherzyku zewnętrznym danio pręgowanego.

Streszczenie

Patogen wodny, Streptococcus iniae, jest odpowiedzialny za ponad 100 milionów dolarów rocznych strat dla przemysłu akwakultury i jest w stanie powodować choroby ogólnoustrojowe zarówno u ryb, jak i u ludzi. Lepsze zrozumienie patogenezy choroby S. iniae wymaga odpowiedniego systemu modelowego. Podatność genetyczna i przezroczystość optyczna wczesnych stadiów rozwojowych danio pręgowanego pozwalają na generowanie i nieinwazyjne obrazowanie linii transgenicznych z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami odpornościowymi. Adaptacyjny układ odpornościowy nie jest w pełni funkcjonalny do kilku tygodni po zapłodnieniu, ale larwy danio pręgowanego mają konserwatywny wrodzony układ odpornościowy kręgowców zarówno z neutrofilami, jak i makrofagami. W ten sposób wygenerowanie modelu infekcji larwalnej pozwala na badanie specyficznego wkładu odporności wrodzonej w kontrolowanie infekcji S. iniae.

Miejsce mikroiniekcji określi, czy infekcja jest ogólnoustrojowa, czy początkowo zlokalizowana. W tym miejscu przedstawiamy nasze protokoły iniekcji pęcherzyków usznych u danio pręgowanego w wieku 2-3 dni po zapłodnieniu, a także nasze techniki fluorescencyjnego obrazowania konfokalnego infekcji. Zlokalizowane miejsce infekcji pozwala na obserwację początkowej inwazji drobnoustrojów, rekrutacji komórek gospodarza i rozprzestrzeniania się infekcji. Nasze odkrycia wykorzystujące model larwalny danio pręgowanego zakażenia S. iniae wskazują, że danio pręgowany może być wykorzystany do zbadania różnych udziałów neutrofili i makrofagów gospodarza w zlokalizowanych infekcjach bakteryjnych. Ponadto opisujemy, w jaki sposób fotoznakowanie komórek odpornościowych może być wykorzystywane do śledzenia losu poszczególnych komórek gospodarza w trakcie infekcji.

Wprowadzenie

Streptococcus iniae jest głównym patogenem wodnym, który jest zdolny do wywoływania chorób ogólnoustrojowych zarówno u ryb, jak i u ludzi1. Chociaż S. iniae jest odpowiedzialny za duże straty w przemyśle akwakultury, jest również potencjalnym patogenem odzwierzęcym, zdolnym do wywoływania chorób u gospodarzy z obniżoną odpornością z patologiami klinicznymi podobnymi do tych wywoływanych przez inne paciorkowcowe patogeny ludzkie. Biorąc pod uwagę podobieństwa do patogenów ludzkich, ważne jest badanie patogenezy choroby S. iniae w kontekście naturalnego gospodarza. Model zakażenia S. iniae u dorosłego ryba danio pręgowanego wykazał silną infiltrację leukocytów gospodarza do zlokalizowanego miejsca infekcji, a także szybki czas do śmierci gospodarza, czas zbyt krótki, aby zaangażować adaptacyjny układ odpornościowy7. Aby uzyskać dogłębne spojrzenie na wrodzoną odpowiedź immunologiczną na zakażenie S. iniae in vivo, konieczne jest użycie modelu, który jest bardziej podatny na nieinwazyjne obrazowanie na żywo.

Larwa danio pręgowanego ma szereg zalet, które czynią go coraz bardziej atrakcyjnym modelem kręgowców do badania interakcji gospodarz-patogen. Danio pręgowany jest stosunkowo niedrogi i łatwy w użyciu i utrzymaniu w porównaniu z modelami ssaków. Odporność adaptacyjna nie jest funkcjonalnie dojrzała do 4-6 tygodni po zapłodnieniu, ale larwy mają wysoce konserwatywny wrodzony układ odpornościowy kręgowców z dopełniaczem, receptorami Toll-podobnymi, cytokinami oraz neutrofilami i makrofagami o zdolnościach przeciwdrobnoustrojowych, w tym fagocytozie i wybuchu oddechowym2-6,8-11. Ponadto podatność genetyczna i przezroczystość optyczna embrionalnych i larwalnych etapów rozwoju pozwalają na generowanie stabilnych linii transgenicznych z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami odpornościowymi, co umożliwia badanie interakcji gospodarz-patogen w czasie rzeczywistym in vivo. Generowanie tych linii transgenicznych przy użyciu fotokonwertowalnego białka, takiego jak Dendra2, pozwala na śledzenie pochodzenia i losu poszczególnych komórek gospodarza w trakcie infekcji12.

Podczas opracowywania modelu infekcji larw danio pręgowanego, wybrane miejsce mikroiniekcji określi, czy infekcja jest początkowo zlokalizowana, czy ogólnoustrojowa. Ogólnoustrojowe zakażenia krwi do żyły ogonowej lub przewodu Cuviera są najczęściej stosowane do badania patogenów mikrobiologicznych u danio pręgowanego i są przydatne do badania interakcji między komórkami gospodarza i drobnoustrojów, odpowiedzi cytokin i różnic w zjadliwości między szczepami patogenów. W przypadku wolniej rosnących mikroorganizmów wczesne wstrzyknięcie do woreczka żółtkowego zarodka w stadium 16-1000 komórek może być wykorzystane do wywołania infekcji ogólnoustrojowej13,14, przy czym optymalnym etapem rozwoju mikroiniekcji wolno rosnącego mikroorganizmu jest stadium od 16 do128 komórek 15. Jednak wstrzyknięcia wielu drobnoustrojów do woreczka żółtkowego na późniejszych etapach rozwoju gospodarza wydają się być śmiertelne dla gospodarza ze względu na bogate w składniki odżywcze środowisko dla drobnoustroju i brak naciekających leukocytów16-18.

Zlokalizowana infekcja zazwyczaj powoduje ukierunkowaną migrację leukocytów w kierunku miejsca infekcji, którą można łatwo określić ilościowo za pomocą nieinwazyjnego obrazowania. Ten rodzaj infekcji może pozwolić na rozbiór mechanizmów pośredniczących w migracji leukocytów, a także na zbadanie różnych zdolności migracyjnych i fagocytarnych różnych populacji leukocytów. Miejscowe infekcje są również przydatne przy badaniu różnic w zjadliwości między szczepami bakteryjnymi, a także przy badaniu mechanizmów inwazji drobnoustrojów, ponieważ fizyczne bariery gospodarza muszą zostać przekroczone, aby miejscowa infekcja stała się ogólnoustrojowa. Danio pręgowany jest zazwyczaj hodowany w temperaturze 25–31 °C19, ale może być również utrzymywany w temperaturach nawet 34–35 °C w celu badań inwazyjności niektórych patogenów u ludzi przy ścisłych wymaganiach temperaturowych dotyczących zjadliwości20,21.

Wiele różnych miejsc zostało wykorzystanych do wygenerowania początkowo zlokalizowanej infekcji bakteryjnej, w tym komora tylnomózgowia22, mięsień grzbietowy ogona18, jama osierdziowa23 i pęcherzyk uszny (ucho)5,16,24. Stwierdzono jednak, że wstrzyknięcie bakterii do mięśnia ogonowego może powodować uszkodzenie tkanek i stan zapalny niezależnie od bakterii, co może zniekształcić wyniki podczas badania odpowiedzi leukocytów13. Chociaż mniejsze uszkodzenia są związane z wstrzyknięciem do tyłomózgowia i chociaż początkowo jest ono pozbawione leukocytów w młodych zarodkach, komora tylnomózgowia stopniowo zyskuje więcej komórek odpornościowych w miarę zadomowienia się mikrogleju. Komora tylnomózgowia jest również trudniejszym miejscem do zobrazowania. Pęcherzyk uszny jest zamkniętą, pustą jamą bez bezpośredniego dostępu do układu krwionośnego25,26. Zwykle jest pozbawiony leukocytów, ale leukocyty mogą być rekrutowane do pęcherzyka usznego w odpowiedzi na bodźce zapalne, takie jak infekcja. Jest to również preferowane miejsce mikroiniekcji bakterii u danio pręgowanego w wieku 2-3 dni po zapłodnieniu (dpf) ze względu na łatwość obrazowania i wizualizację iniekcji. Dlatego wybraliśmy pęcherzyk uszny jako miejsce miejscowej infekcji bakteryjnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Dorosłe i embrionalne rybo pręgowane były utrzymywane zgodnie z Centrum Badań nad Zwierzętami Uniwersytetu Wisconsin-Madison.

1. Przygotowanie igieł do mikroiniekcji

  1. Przygotować cienkościenne szklane igły do iniekcji kapilarnych (1,0 OD/0,75 ID) za pomocą ściągacza do mikropipet z następującymi ustawieniami: ciśnienie powietrza 200, ciepło 502, ciągnięcie 90, prędkość 80, czas 70, czas powietrza na początku ciągnięcia 5, czas powietrza na końcu ciągnięcia 5.
  2. Za pomocą cienkiej pęsety odłamać końcówkę wyciągniętej igły tak, aby otwór końcówki miał średnicę około 10 μm.

2. Przygotowanie potraw do wstrzykiwania larw

  1. Opłucz żelowy grzebień o szerokości około 4-5 mm w sterylnej wodzie i pozostaw do wyschnięcia.
  2. Przygotuj 1,5-2% wysokotopliwy roztwór agarozy w pożywce E319 i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej, aż roztwór będzie klarowny. Po ostygnięciu wlej część agarozy na szalkę Petriego (100 x 15 mm) i zamieszaj, dodając tylko tyle agarozy, aby całkowicie pokryła dno naczynia.
  3. Gdy warstwa agarozy stwardnieje, umieść wypłukany i wysuszony grzebień żelowy na wierzchu tak, aby nieczesany koniec spoczywał tylko na wierzchu szalki Petriego, a czesany koniec dotykał agarozy. Upewnij się, że grzebień jest jak najbardziej poziomy, tworząc kąt 30° w stosunku do dolnej warstwy agarozy.
  4. Wlej dodatkową niewielką ilość agarozy na styk grzebienia i dolnej warstwy agarozy, tak aby świeża warstwa agarozy pokryła dołki grzebienia. Pozostaw do całkowitego ostygnięcia przed wyjęciem grzebienia. Za pomocą końcówki pipety usuń wszelkie zwisające kawałki agarozy z dołków.
  5. Wlać pożywkę E3 na wierzch formy wtryskowej i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  6. Przed każdym użyciem należy wymienić na świeże podłoże i ciepłe rampy iniekcyjne w temperaturze 28,5 °C na co najmniej godzinę przed wstrzyknięciem.
  7. Bezpośrednio przed wstrzyknięciem należy zastąpić E3 na rampie iniekcyjnej podłożem E3 zawierającym 200 μg/ml 3-aminobenzoesanu etylu (trikainy).

3. Przygotowanie inokulum S. iniae

  1. Przygotuj i autoklaw pożywki bulionowej Todd Hewitt uzupełnionej 0,2% ekstraktem drożdżowym i 2% peptonem proteozy (THY+P): 30 g/L Todd Hewitt, 2 g/L ekstraktu drożdżowego, 20 g/L peptonu proteozy. W przypadku płytek agarowych dodaj 14 g/l agaru.
  2. Przygotować kultury bakteryjne na noc przed zakażeniem, pipetując 100 μl podwielokrotności zamrożonego bulionu bakteryjnego do 10 ml bulionu THY+P w szczelnie zamkniętej probówce o pojemności 15 ml. Inkubować przez noc bez mieszania w temperaturze 37 °C. Po 14-16 godzinach wzrostu użyj kultury przez noc, aby przygotować bulion do zamrażania lub przygotować do użycia w zastrzykach.
  3. Przygotuj wywary do zamrażania, umieszczając 1 ml kultury przez noc w 500 μl 80% glicerolu w probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml. Aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, należy przygotować 100 μl jednorazowych porcji z tej mieszanki i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. W przypadku S. iniae stosowanych w zakażeniach należy rozcieńczyć posiew na noc w stosunku 1:100 do całkowitej objętości 10 ml kultury, dodając 0,1 ml kultury na noc do 9,9 ml bulionu THY+P. Rosnąć w temperaturze 37 °C bez mieszania przez około 4-5 godzin. Monitoruj gęstość optyczną (OD) przy 600 nm za pomocą spektrofotometru Nanodrop i zbierz bakterie w środkowej fazie logarytmicznej, gdy OD600 nm osiągnie 0,250-0,500. Od600 nm równy 0,250 odpowiada około 108 jednostkom tworzącym kolonie (CFU)/ml.
  5. Osad 1 ml kultury bakteryjnej w probówce wirówkowej o pojemności 1,7 ml przy 1 500 x g przez 5 minut. Zawiesić w 1 ml świeżego PBS i powtórzyć. Zmierz OD600 nm bakterii w PBS, osadzie i ponownie zawiesić w PBS, aby osiągnąć pożądane stężenie.
  6. Aby ułatwić wizualizację mikroiniekcji, dodaj czerwień fenolową do zawiesin bakteryjnych przed wstrzyknięciem, aby uzyskać końcowe stężenie 0,1%.
  7. W przypadku eksperymentów polegających na wstrzykiwaniu bakterii zabitych termicznie, należy ogrzewać bakterie w PBS w temperaturze 95 °C przez 30 minut. Potwierdzić, że proces zabijania termicznego zmniejszył liczbę żywych bakterii do niewykrywalnych poziomów, poprzez posiew objętość iniekcji (około 1 nl) na stałych płytkach agarowych THY+P i inkubację przez noc w temperaturze 37 °C.

4. Znakowanie S. iniae za pomocą czerwonego barwnika fluorescencyjnego CellTracker

  1. Aby oznaczyć żywe komórki bakteryjne, przygotuj roztwór podstawowy barwnika fluorescencyjnego CellTracker lub jego odpowiednika. Ponieważ użyty barwnik występuje w podwielokrotnościach proszku o wymiarach 20 x 50 μg i musi być ponownie zawieszony w DMSO, dodaj 7,3 μl DMSO do probówki, aby uzyskać stężenie podstawowe 10 mM.
  2. Przetestuj zakres stężeń barwnika (np. 0,5-25 μM) na bakteriach, aby określić najniższe optymalne stężenie, które barwi komórki. Szybko dzielące się komórki i dłuższe eksperymenty mogą wymagać wyższego stężenia barwnika.
    1. Osad 1,0 ml kultury bakteryjnej w probówce o pojemności 1,7 ml przez odwirowanie, jak opisano powyżej (sekcja 3). Zawiesić osad w 1 ml świeżego PBS i dodać odpowiednią ilość barwnika do kultury bakteryjnej.
    2. Inkubować bez mieszania w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Odwirować bakterie i ponownie zawiesić w 1 ml wstępnie podgrzanego bulionu THY+P i inkubować bez mieszania przez dodatkowe 30 minut w temperaturze 37 °C.
    3. Odwiruj bakterie i umyj je dwa razy w PBS przed pomiarem OD600 nm i rozcieńczeniem bakterii do mikroiniekcji, jak opisano powyżej (sekcja 3). Zazwyczaj wstrzykujemy około 100 CFU w 1 nl objętość iniekcji w naszych badaniach rekrutacji leukocytów i fagocytozy.

5. Przygotowanie larw danio pręgowanego do infekcji

  1. Ustaw pary lęgowe poprzedniej nocy i zbierz zarodki zgodnie z opisem Rosena i wsp.27 Inkubować zarodki w pożywce E3 w temperaturze 28,5 °C do momentu uzyskania gotowości do zakażenia.
  2. W przypadku danio pręgowanego, który będzie obrazowany, należy zapobiec rozwojowi pigmentu (melanizacji) poprzez dodanie N-fenylotiomocznika (PTU) do pożywki E3 w 24 godziny po zapłodnieniu (hpf) do końcowego stężenia 0,2 nM.
  3. W przypadku zakażeń obejmujących zarodki w wieku 2 dpf należy ręcznie usunąć zarodki z zakrętu za pomocą cienkiej pęsety. Alternatywnie, dekorionate zarodki poprzez usunięcie E3 i zastąpienie pronazą (2 mg/ml) przez około 5 minut lub do momentu, gdy delikatne pipetowanie odbije zarodki od kosmówki. Większość larw powinna wykluć się naturalnie do 3 dpf.
  4. Znieczulenie danio pręgowanego na kilka minut przed zakażeniem poprzez umieszczenie zdekorionowanych larw w pożywce E3 zawierającej 200 μg/ml trikainy.

6. Wstrzyknięcie pęcherzyków usznych S. iniae do trzydniowych larw

  1. Włącz mikrowtryskiwacz i ustaw zakres czasu na "milisekundę". Otwórz zawór na zbiorniku dwutlenku węgla, aby wpuścić gaz do przewodu. Ciśnienie mikrowtryskiwacza powinno wynosić około 20 PSI. Wyreguluj ciśnienie w zespole mikrowtryskiwaczy, obracając zgodnie z ruchem wskazówek zegara czarne radełkowane pokrętło w celu zwiększenia ciśnienia lub obracając w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zmniejszyć ciśnienie.
  2. Przygotować przygotowaną kulturę S. iniae w czerwieni fenolowej i PBS należy zawirować i za pomocą końcówki mikroładowarki załadować 2-3 μl kultury do ciągniętej igły do wstrzykiwań kapilarnych.
  3. Zamontuj załadowaną igłę na mikromanipulatorze podłączonym do statywu magnetycznego i umieść ją pod mikroskopem stereoskopowym tak, aby igła znajdowała się pod kątem około 45-65° w stosunku do podstawy mikroskopu.
  4. Naciśnij pedał nożny mikrowstrzykiwacza, aby dozować kroplę inokulum na końcówkę igły. Zmierz średnicę kropli za pomocą skali w soczewce okularowej mikroskopu.
    1. Alternatywnie, oszacuj średnicę kropli, wstrzykując objętość do kropli oleju mineralnego na szklanym szkiełku mikroskopowym z paskiem skali. Średnica kropli powinna wynosić około 0,10 mm, co odpowiada objętości około 1 nl.
    2. Dostosuj wielkość kropli, dostosowując ustawienie czasu trwania na mikrowstrzykiwaczu lub odcinając większą część końcówki igły za pomocą cienkiej pęsety. Należy pamiętać, że czas wstrzyknięcia powinien wynosić od 20 do 35 ms, aby uniknąć spowodowania zbyt dużego uszkodzenia tkanki.
  5. Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś 12 znieczulonych larw do każdej studzienki formy wtryskowej.
  6. Użyj szklanego pręta, pętli do włosów lub plastikowej końcówki, aby delikatnie ustawić larwy tak, aby głowy były skierowane w stronę tylnej części mikroskopu, a woreczki żółtkowe znajdowały się po lewej stronie studzienki. Skieruj lewe ucho larwy w stronę sufitu.
  7. Patrząc przez soczewkę okularową mikroskopu stereoskopowego, użyj pokręteł na mikromanipulatorze, aby wyrównać załadowaną igłę z pęcherzykiem usznym tak, aby obie znajdowały się w tym samym polu widzenia. Przebić zewnętrzną warstwę nabłonka pęcherzyka usznego końcówką igły tak, aby końcówka igły znalazła się tuż wewnątrz pęcherzyka.
  8. Nacisnąć pedał nożny, aby wstrzyknąć 1 nl żądanej dawki S. iniae. Upewnij się, że używasz wystarczająco niskiego ciśnienia, aby nie pęknąć wnęki. Jeśli wstrzyknięcie się powiedzie, pęcherzyk uszny, ale nie otaczająca go tkanka, powinien wypełnić się inokulum czerwieni fenolowej (ryc. 1 Ai). Natychmiast usunąć wszelkie błędnie wstrzyknięte ryby z płytki iniekcyjnej.
  9. Ostrożnie wyjąć igłę z larwy i ręcznie przesunąć płytkę iniekcyjną tak, aby następna larwa była widoczna. Zrób to w 5-krotnym powiększeniu.
    Uwaga: Wycofanie igły może spowodować osadzanie się niektórych bakterii poza pęcherzykiem usznym, co może zniekształcić wyniki przeżycia i rekrutacji leukocytów. Aby tego uniknąć, zaleca się wstrzykiwanie bakterii znakowanych barwnikiem fluorescencyjnym i wizualne skanowanie wstrzykniętych larw pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu usunięcia larw w miejscach, w których to nastąpiło. Prawidłowo wstrzyknięta larwa jest pokazana na (ryc. 1 Bi).
  10. Aby upewnić się, że objętość wstrzyknięcia/inokulum pozostaje taka sama w trakcie eksperymentu, należy wstrzyknąć kroplę zawiesiny bakteryjnej do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml zawierającej 100 μl sterylnego PBS po każdym 48.zarodku. Umieścić 100 μl na płytkach agarowych THY+P w temperaturze 37 °C przez noc, aby określić jtk w objętości wstrzyknięcia.
  11. Po wstrzyknięciu całej grupy 12 larw na rampie iniekcyjnej ostrożnie należy użyć plastikowej pipety transferowej, aby usunąć larwy ze studzienek i umieścić je na nowej szalce Petriego (35 x 10 mm2). Usunąć roztwór trikainy i zastąpić go około 2 ml świeżej pożywki E3, aby larwy mogły się zregenerować.
  12. Wstrzyknięte larwy należy pipetować do pojedynczych studzienek na 96-dołkowej płytce i inkubować w temperaturze 28,5 °C. Monitorować larwy w czasie pod kątem przeżycia w tych płytkach lub usunąć je później w celu obrazowania lub zliczenia CFU.

7. Sudan Czarne zabarwienie neutrofili

Uwaga: Następujące kroki można wykonać w temperaturze pokojowej na małej szalce Petriego (35 x 10 mm2) na wytrząsarce orbitalnej, chyba że zaznaczono inaczej. Na każdym etapie ilość użytego odczynnika wynosi około 2 ml na naczynie, przy użyciu tylko tyle płynu, aby całkowicie pokryć larwy.

  1. Do utrwalenia zakażonych larw użyj szklanej pipety Pasteura, aby usunąć pożywkę E3 i zastąpić lodowatym 4% paraformaldehydem w roztworze PBS. Natychmiast umieść rybę w temperaturze 4 °C w celu eutanazji. Utrwalić przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Umyj 3 razy w PBS po 5 minut każdy.
  3. Barwienie Sudan Black (0,18% bulionu rozcieńczonego 1:5 w 70% etanolu, 0,1% fenolu) przez 30 minut do 5 godzin. Użyj stereomikroskopu, aby sprawdzić, czy granulki neutrofili wchłonęły plamę.
  4. Wykonaj serię 5-minutowych prań, zaczynając od pojedynczego prania w 70% etanolu, następnie pojedynczego prania w stosunku 1:1 70% etanolu i PBS, a następnie końcowego prania w PBS.
  5. Uzupełnij nawodnienie do PBS plus 0,1% tween (PBT).
  6. Aby usunąć pigment z larw, przemyj 1% wodorotlenku potasu/1% nadtlenku wodoru przez około 6-10 minut. Uważnie monitoruj próbkę, a po około 5 minutach sprawdź larwy pod mikroskopem stereoskopowym, aby zobaczyć, ile pigmentu zostało usunięte. Jeśli roztwór zostanie pozostawiony zbyt długo, woreczki żółtkowe pęcznieją i pękają.
  7. Umyj 3 razy po 5 minut w PBS.
  8. Próbki należy przechowywać w PBS lub PBT w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, aż będą gotowe do zobrazowania i zliczenia.
  9. Aby zobrazować larwy Sudanu zabarwione na czarno, przenieś ryby do PBT, a następnie do 80% glicerolu i umieść na pojedynczym szkiełku wgłębienia. Umieścić nieruchome larwy pod mikroskopem stereoskopowym za pomocą końcówki pipety. Obraz za pomocą kolorowej kamery cyfrowej w mikroskopie stereoskopowym (ryc. 1 Aii-iv).

8. Wyliczanie żywotnych bakterii z zakażonych larw

  1. Poddaj larwy eutanazji w pożądanym czasie po zakażeniu w lodowatym roztworze trikainy o stężeniu 200-300 mg/l w pożywce E3.
  2. Pipetować uśpione larwy do probówek wirówkowych o pojemności 1,7 ml. Usunąć roztwór tricainy i zastąpić go 100 μl 0,2% Triton X-100 w PBS (PBSTx).
  3. Homogenizować larwy, przepuszczając 10 razy w górę i w dół przez igłę 27 G.
  4. Przygotować seryjne rozcieńczenia homogenatów w sterylnym PBS. Na przykład, jeśli dawka zakaźna wynosi 100 jtk, odpipetuj 100 μl homogenatu do 900 μl sterylnego PBS. Za pomocą nowej końcówki pipety przenieść 100 μl rozcieńczonego homogenatu do 900 μl sterylnego PBS.
  5. Umieścić 100 μl rozcieńczeń na agarze Columbia CNA w celu selektywnej izolacji bakterii Gram-dodatnich i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. To podłoże zapewni większy wybór niż płytki agarowe THY+P, co będzie wspierać wzrost zarówno bakterii Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich.
  6. Na płytkach zawierających mniej niż 500 pojedynczych kolonii policz liczbę kolonii i pomnóż przez współczynnik rozcieńczenia, aby określić liczbę CFU.

9. Utrwalanie larw do obrazowania

  1. Utrwalić larwy w lodowatym 4% roztworze paraformaldehydu w roztworze PBS, jak opisano w sekcji 7.
  2. W temperaturze pokojowej myć 3 razy po 5 minut w PBS przed obrazowaniem.

10. Przygotowanie larw do obrazowania na żywo

  1. Przygotuj 1,5% roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia w E3, podgrzewając w kuchence mikrofalowej, aż roztwór będzie klarowny.
  2. Umieścić roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C, aby ostygł, ale nie stwardniał.
  3. Dodaj trikainę do agarozy do końcowego stężenia 0,016%.
  4. Za pomocą plastikowej pipety transferowej umieść 4-5 znieczulonych larw w naczyniu ze szklanym dnem na stoliku mikroskopu stereoskopowego.
  5. Wyjąć roztwór trikainy i agarozy z łaźni wodnej o temperaturze 55 °C i pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 1-2 minuty. Podczas gdy agaroza stygnie, usuń jak najwięcej płynu ze znieczulonych larw.
  6. Wlej schłodzoną agarozę do naczynia, aż pokryje się około połowy powierzchni. Zakręć naczyniem, aby rozprowadzić agarozę. Należy pamiętać, że jeśli agaroza jest zbyt gorąca, zabije larwy. Ponadto, jeśli do naczynia zostanie dodana zbyt duża ilość agarozy, soczewka obiektywu mikroskopu może uderzyć w dno naczynia podczas ustawiania ostrości przez agarozę.
  7. Za pomocą pipety transferowej zbierz larwy, które wypłynęły na boki naczynia i odpipetuj je z powrotem do środka.
  8. Pod mikroskopem stereoskopowym delikatnie ustaw larwy zgodnie z potrzebami za pomocą pętli do włosów, długiej końcówki pipety lub szklanego pręta. W celu zobrazowania pęcherzyka usznego należy ustawić larwy tak, aby lewy pęcherzyk uszny przylegał płasko do dna naczynia.
  9. Pozwól agarozie ostygnąć przez około 10 minut przed przeniesieniem naczynia. Larwy mogą zmieniać pozycje, jeśli agaroza nie jest stała. Delikatnie odpipetuj trochę trykainy i roztworu E3 na wierzch warstwy agarozy, aby była wilgotna.

11. Konfokalne obrazowanie infekcji

  1. Umieść szklane naczynie z larwami na stoliku mikroskopu odwróconego z laserowym skaningowym systemem konfokalnym FV-1000.
  2. Ustaw otworek na 200-300 μm i za pomocą soczewki obiektywowej 0,75/20X z aperturą numeryczną ustaw stosy z warstwami 3-6 μm.
  3. Użyj ciągłego skanowania linii, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora dla każdego kanału.
  4. Korzystając z sekwencyjnego skanowania liniowego dla każdego kanału fluorescencji (np. 488 i 543 nm) i różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), przeprowadzaj film poklatkowy lewego pęcherzyka usznego co 3 minuty przez 2-6 godzin, aby obserwować wstępną rekrutację i fagocytozę przez neutrofile i makrofagi. W przypadku dłuższych kursów czasu umieść pokrywkę na szalce Petriego, aby zapobiec parowaniu i wysychaniu agarozy.
  5. Zdobądź nieruchome obrazy stałych (ryc. 1B) lub żywych (ryc. 2) larw w powiększeniu 20x lub 40x.

12. Fotokonwersja leukocytów znakowanych Dendra2 w pęcherzyku usznym

Uwaga: Dendra2 może być fotokonwertowany z zielonej na czerwoną fluorescencję poprzez skupienie lasera 405 nm (50-70% mocy lasera powinno być wystarczające) na obszarze zainteresowania (ROI) przez 1 minutę. Poniżej znajduje się protokół krok po kroku używany dla systemu konfokalnego skanowania laserowego FV-1000:

  1. Wizualizacja próbki za pomocą skanowania stosu z laserami 488 nm i 543 nm. Użyj ciągłego skanowania linii, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora. Sprawdź, czy nie ma przypadkowo fotokonwertowanej czerwonej fluorescencji.
  2. W oknie "Kontrola akwizycji obrazu" w sekcji "Ustawienia bodźca" wybierz narzędzie "Użyj skanera" i wybierz "główny". Wybierz laser 405 nm i ustaw go na 70% mocy. Korzystając z opcji okręgu, zdefiniuj ROI w pęcherzyku usznym.
  3. W sekcji "Ustawienie startu bodźca" wybierz "Aktywacja szeregowo" z wstępną aktywacją 1 klatki i czasem aktywacji 60 000 ms. W oknie "Ustawienia akwizycji" pod nagłówkiem "Skanowanie czasu" wybierz 2 interwały 00:01:00 (jeden dla pre- i jeden dla post-fotokonwersji).
    Uwaga: Po zakończeniu skanowania serii poklatkowej, Dendra2 powinna zostać fotokonwertowana do stanu czerwonej fluorescencji.
  4. Zeskanuj próbkę za pomocą stosu z użyciem laserów 488 nm i 543 nm, aby uwidocznić fotokonwertowaną czerwoną fluorescencję, a także pozostałą zieloną fluorescencję (ryc. 3).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Mikroiniekcja S. iniae do pęcherzyka słuchowego (Rycina 1 oraz Rycina 2) skutkuje początkowo zlokalizowaną odpowiedzią gospodarza. W przypadku prawidłowej iniekcji bakterie powinny być widoczne wyłącznie w pęcherzyku słuchowym, a nie w otaczających tkankach lub krwi. Można to zwizualizować podczas mikroiniekcji za pomocą barwnika czerwieni fenolowej (Rycina 1A). Alternatywnie, w przypadku iniekcji bakterii znakowanych, szybkie skanowanie zainfekowanych larw bezp...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zastosowana tutaj metoda infekcji jest przydatna do badania odpowiedzi immunologicznej gospodarza na początkowo zlokalizowaną infekcję w zarodkach i larwach 2-3 dpf. Ognisko bodźca zapalnego, takiego jak infekcja, w zamkniętej jamie, takiej jak pęcherzyk uszny, pozwala na badanie chemotaksji neutrofili i makrofagów oraz fagocytozy. Jednym z zastrzeżeń związanych z wstrzykiwaniem bakterii do pęcherzyka usznego jest to, że zdolność neutrofili do skutecznego fagocytozy bakterii w jamach wypełnionych płynem może zależeć od k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować członkom laboratorium za opiekę i utrzymanie danio pręgowanego. Praca ta była wspierana przez National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 E. A. Harvie i NIH R01GM074827 dla Anny Huttenlocher.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,7 ml EppendorfsMidSciAVSS1700
14 ml probówka FalconBD Falcon352059
27 G x ½ in. igłaBD Biosciences305109
96-dołkowa płytkaCorning Incorporated3596
AgarBD Biosciences214030
Czerwonesondy molekularne CellTracker, InvitrogenC34552
CNA agarDot Scientific, Inc7126A Jednorazowe
pipety transferoweFisher Scientific13-711-7m
Luneta sekcyjnaNikonSMZ745
DMSOSigma AldrichD2650
Etanol 200 proofMDS2292
Drobna pęsetaFine Science Tools11251-20
Grzebień żelowyVWR27372-482Szerokość 4,2 mm, grubość 1,5 mm
szklanym dnemWykonane na zamówienie poprzez wywiercenie otworu 16 - 18 mm w środku dna naczynia do hodowli tkankowej 35 mm i umieszczenie w otworze okrągłego szkiełka nakrywkowego #1 o średnicy 22 mm i uszczelnienie cienką warstwą kleju optycznego Norland Optical Adhesive 68 utwardzonego światłem UV.
GlycerolFisher ScientificG33-4
Agaroza o wysokiej temperaturze topnieniaDenville Scientific, Inc.CA3510-6
Nadtlenek wodoruFisher ScientificH325
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyOlympusz systemem
Agaroza niskotopliwaFisherBP165-25
Stojak magnetycznyTritech (Narishige)GJ-1
System mikroiniekcjiParkerPicospritzer III
Końcówki do pipet do mikroładowarekEppendorf930001007
MikromanipulatorTritech (Narishige)M-152
Ściągacz do mikropipetSutter Instrument CompanyFlaming/Brown P-97
Spektrofometr NanodropThermo ScientificND-1000
N-fenylotiomocznik (PTU)Sigma AldrichP7629
ParaformaldheydeMikroskopia elektronowa Nauki15710
Szalki PetriegoFisher ScientificFB0875712100 x 15 mm
PhenolSigmaAldrich P-4557
Phenol RedRicca Chemoical Company572516
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher ScientificBP665-1
Wodorotlenek potasuSigma AldrichP-6310
PronaseRoche165921
Pepton proteazyFluka Biochemika29185
Naczynie do hodowli małych komórekCorning Incorporated43016535 x 10 mm
Sudan BlackSigma AldrichS2380
Cienkościenne szklane kapilarne igły iniekcyjneWorld Precision Instruments, Inc.TW100-3
Todd HewittSigma Aldrich/Fluka AnalyticalT1438
Trikaine (3-aminobenzoesan etylu)Argent Chemical Laboratory/FinquelC-FINQ-UE-100G
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
Tween 20Fisher ScientificBP337-500
Ekstrakt drożdżowyFluka BiochemikaNumer katalogowy 92144
Naczynia zeFV-1000

Bibliografia

  1. Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
  2. Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
  3. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  4. Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
  5. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
  7. Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
  8. Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
  9. Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
  10. Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
  11. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
  12. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
  14. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779(2011).
  15. Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  16. Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
  17. Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
  18. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  19. Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
  20. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  21. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
  22. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  23. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697(2009).
  24. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
  25. Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  26. Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
  27. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  28. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
  29. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  30. Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Larwy rybki danio ostregowstrzykiwanie do p cherzyka s uchowegomikroskopia konfokalnafotoznakowanie kom rek odporno ciowychrekrutacja neutrofililedzenie makrofag wfluorescencyjne linie transgeniczne
Nieinwazyjne obrazowanie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej w modelu larwalnym zakażenia Streptococcus iniae u larwala danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.