Artykuł metodologiczny

Charakterystyka progenitorów osadzania się grasicy w zarodku myszy za pomocą testów in vivo i in vitro

DOI:

10.3791/52795

⸱

9 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center Growth and Signaling, INSERM U845, Institut Cochin, 2Unit for Biology of Lymphocyte Populations, Immunology Department, Institut Pasteur and CIMI, Unity of Treg Biology and Therapy, University of Pierre & Marie Curie, 3Unit for Lymphopoiesis, Immunology Department, INSERM U668, University Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, Cellule Pasteur, Institut Pasteur

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje metodologię in vivo i in vitro do charakteryzowania przodków osiadania grasicy poprzez analizę kinetyki powstawania, fenotypu i liczby ich potomstwa limfocytów T.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka progenitorów osadzających się w grasicy jest ważna dla zrozumienia przed-grasiczych etapów rozwoju limfocytów T, niezbędna do opracowania strategii wymiany limfocytów T u pacjentów limfonowych z limfopeną. Badaliśmy przodków osadzania się grasicy od mysiego embrionalnego dnia 13 i 18 thymi za pomocą dwóch uzupełniających się technik in vitro i in vivo, obie oparte na metodzie "wiszącej kropli". Metoda ta pozwoliła na kolonizację napromieniowanych płatów grasicy płodu przodkami grasicy E13 i/lub E18 wyróżniającymi się markerami allotypowymi CD45, a tym samym podążanie za ich potomstwem. Kolonizacja populacjami mieszanymi pozwala na analizę autonomicznych różnic we właściwościach biologicznych komórek progenitorowych, podczas gdy kolonizacja dowolną populacją usuwa ewentualne konkurencyjne naciski selekcyjne. Skolonizowane płaty grasicy mogą być również szczepione u samców myszy biorców z niedoborem odporności, co pozwala na analizę dojrzałego potomstwa limfocytów T in vivo, takich jak dynamika populacji obwodowego układu odpornościowego i kolonizacja różnych tkanek i narządów. Posiewy narządów grasicy płodu ujawniły, że progenitorzy E13 szybko rozwinęli się we wszystkie dojrzałe komórki CD3 + i dali początek kanonicznej podgrupie limfocytów T γδ, znanej jako endrytyczne nabłonkowe limfocyty T. Dla porównania, przodkowie E18 mają opóźnione różnicowanie i nie byli w stanie wytworzyć dendrytycznych komórek T nabłonka. Monitorowanie krwi obwodowej myszy CD3-/- szczepionych grasicą wykazało ponadto, że przodkowie osadzający się grasicy E18 generują z czasem większą liczbę dojrzałych limfocytów T niż ich odpowiedniki E13, co jest cechą, której nie można było docenić w krótkoterminowych hodowlach płodowych narządów grasicy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

T limfocyty, posiadające αβ lub receptor γδ limfocytów T (TcR), różnicują się w wyspecjalizowanym narządzie, grasicy. W pełni rozwinięta grasica jest zorganizowana w dwóch odrębnych regionach: korze mózgowej, w której rozwijają się przodkowie grasicy i gdzie tymocyty, które produktywnie reorganizują β i α geny łańcuchowe, są ratowane przed zaprogramowaną śmiercią (proces znany jako selekcja pozytywna); oraz rdzeń, w którym usuwane są wybrane tymocyty o zbyt silnej reaktywności na samoligandy (selekcja ujemna)1,2. Grasica pochodzi z warstwy endodermalnej trzeciego worka gardłowego, która jest później otoczona komórkami mezenchymalnymi3. Jest kolonizowany przez hematopoetyczne komórki progenitorowe począwszy od dnia embrionalnego E12, a następnie wymagana jest ciągła rekrutacja do prawidłowego rozwoju limfocytów T4. Imigranci grasicy ewoluują przez kolejne etapy rozwoju, koordynowane przez ściśle regulowany program, inicjowany i utrzymywany przez aktywację szlaku sygnałowego Notch na tymocytach po interakcji z jego ligandem, delta podobnym do 4, ulegającym ekspresji na komórkach nabłonka grasicy (TEC)5.

Rozwój tymocytu rozpoczyna się w tak zwanych stadiach podwójnie ujemnych (DN) CD4-CD8. Tymocyty DN można dalej podzielić w zależności od ekspresji CD25 i CD44 na DN1 (CD25-CD44+), DN2 (CD25+CD44+), DN3 (CD25+CD44-) i DN4 (CD25-CD44-). CD24 (HSA) i CD117 (c-Kit) dalej dzielą przedział DN1 na 5 podzbiorów, w których DN1a i b odpowiadają wczesnym przodkom grasicy (ETP). Tymocyty przegrupowują łańcuchy TcR δ, β i α w stopniu DN i przechodzą selekcję wstępną TcR (stopnie DN3-DN4). Następnie przechodzą do przedziału podwójnie dodatniego (DP) CD4 + CD8 +, w którym łańcuch α TcR zmienia układ przed selekcją pozytywną i ujemną. Na tym etapie większość tymocytów jest eliminowana i tylko niewielki procent (3-5%) dociera do przedziału dojrzałych limfocytów T CD4 + lub CD8 +.

Szlak różnicowania limfoidalnego przechodzi przez etapy HSC, które generują multipotencjalne progenitory (MPP) i limfoidalne multipotencjalne progenitory (LMPP), które utraciły potencjał erytrocytów i megakariocytów6. LMPP są fenotypowo definiowane przez brak zróżnicowanych markerów komórek krwi (linia ujemna, Lin-), ekspresję c-Kit (CD117), Sca-1 i Flt3/Flk2 (CD135) oraz brak wykrywalnych poziomów łańcucha α receptora interleukiny (IL)-7 (IL-7rα lub CD127). LMPP dalej różnicują się w wspólne limfoidalne komórki progenitorowe (CLP)7, które na tym etapie utraciły zdolność do wytwarzania komórek szpikowych. CLP zachowują potencjał limfocytów (limfocytów B i T), komórek NK, DC i wrodzonych komórek limfoidalnych (ILC) i różnią się od LMPP ekspresją CD127 i brakiem wysokich poziomów Sca-1.

Chociaż natura przodków osadzających się w grasicy (TSP) była szeroko dyskutowana8, ostatnio stało się jasne, że TSP zmieniają fenotyp, potencjał różnicowania i funkcję w trakcie rozwoju9. Przeprowadziliśmy testy in vitro i in vivo, aby scharakteryzować TSP, wyizolowane przez sortowanie komórek FACS z E13 (pierwsza fala) lub E18 (druga fala). Hodowle płodowych narządów grasicy (FTOC) z napromieniowanymi płatami grasicy skolonizowanymi przez równą liczbę progenitorów E13 i E18, noszących różne markery allotypowe, pozwoliły śledzić ich potomstwo w podobnym środowisku rozwojowym i ujawniły wewnętrzne właściwości komórki, różne dla obu typów komórek progenitorowych. Płaty grasicy skolonizowane przez E13 lub E18 TSP umożliwiały rozwój bez selekcji ze względu na konkurencję między oboma przodkami. Przeszczepienie in vivo skolonizowanych płatów grasicy wykazało ponadto, że również dojrzałe potomstwo E13 i E18 TSP ma różne właściwości biologiczne in vivo. TSP z pierwszej fali szybko generują limfocyty T, ale powodują niewielką liczbę limfocytów T αβ i γδ. Wśród tych ostatnich wykryliśmy Vγ5Vδ1 limfocyty T nabłonka dendrytycznego (DETC), które mają niezmienny TcR, migrują do naskórka, gdzie pełnią funkcję w gojeniu się ran i są wytwarzane tylko podczas rozwoju embrionalnego10. Natomiast TSP z drugiej fali potrzebują więcej czasu na wytworzenie dużej liczby limfocytów T TcR+ i nie są w stanie wygenerować DETC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z Kartą Etyki Instytutu Pasteura, zatwierdzoną przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa, oraz zgodnie z wytycznymi UE. Manipulator przeszkolony w zakresie chirurgii małych gryzoni, certyfikowany przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa, wykonuje wszystkie interwencje chirurgiczne.
UWAGA: Patrz w załączniku tabela 1 przedstawiająca 5-etapową procedurę planowania.

1. Selekcja zarodków

  1. Użyj 36 C57BL/6 CD45.2 żeńskich, 12 żeńskich CD45.1, 12 C57BL/6 CD45.1 męskich i 12 C57BL/6 CD45.2 męskich. Krzyżowanie samic o jednym z męskich genotypów da zarodki CD45.1/2 i CD45.1 wykorzystywane jako źródło TSP lub CD45.2 wykorzystywane jako źródło płatów grasicy biorcy. Umieść wszystkich samców indywidualnie.
  2. Aby uzyskać zarodki do izolacji E18 TSP, należy umieścić 2 samice w klatce z jednym samcem CD45.1 o godzinie 18:00, 21 dni przed eksperymentem szczepienia. Sprawdź obecność czopa dopochwowego następnego dnia, przed południem. Oddziel podłączone żeńskie.
  3. Aby uzyskać zarodki E14 do kolonizacji przez TSP, powtórzyć powyższą procedurę (1.2), używając samców CD45.2, 17 dni przed eksperymentem szczepienia.
  4. W celu uzyskania zarodków do wyizolowania E13 TSP, należy powtórzyć powyższą procedurę (1.2), używając samców C57BL/6 CD45.1, 16 dni przed eksperymentem szczepienia.

2. Sekcja zarodków pod poziomym kapturem z przepływem laminarnym

UWAGA: Dwa dni przed eksperymentem z szczepieniem.

  1. Ciężarne samice należy złożyć w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy lub przez stopniowe podawanie gazu CO2 przez co najmniej 5 minut, w nasycającej zamkniętej komorze. Zapewnij śmierć poprzez definitywne zatrzymanie ruchów krążeniowo-oddechowych. Zwilż brzuch 70% etanolem.
  2. Wykonaj podłużne nacięcie w skórze w linii środkowej brzucha i otwórz je, rozsuwając skórę. Otwórz otrzewną kleszczami i nożyczkami, nie dotykając przewodu pokarmowego. Wyciągnij dwudzielną macicę i oddziel ją od pochwy nożyczkami.
  3. Umieścić macicę na szalce Petriego o wymiarach 90 x 15 mm zawierającej 40-50 ml DPBS i przeciąć poprzecznie między decyduami każdego zarodka.
  4. Za pomocą nożyczek z cienką końcówką i cienkich kleszczyków usuń błonę mięśniową macicy, wyjmij zarodki, przecinając między łożyskiem a woreczkiem żółtkowym i usuń amnios, który zatrzymuje zarodki.
  5. Umieścić zarodki na szalce Petriego o wymiarach 90 x 15 mm zawierającej HBSS + 1% płodowej surowicy cielęcej (FCS). W przypadku zarodków starszych niż E15 należy usunąć głowy nożyczkami przed dalszym rozbiorem.

3. Izolacja grasicy

  1. Pod lupą obuoczną umieść zarodek leżący w pozycji leżącej na wznak (widok brzuszny) na mokrej gazie.
  2. Włóż jeden kleszcz wzdłużnie wzdłuż chrząstki mostka, ściśnij i otwórz siatkę piersiową. Za pomocą zakrzywionych kleszczy odciągnij ścianę klatki piersiowej na bok, aby uwidocznić płaty grasicy po obu stronach tchawicy.
  3. Ostrożnie przytrzymaj każdy płat, ściskając go pod spodem cienkimi kleszczami i umieść je na szalce Petriego zawierającej 1 ml HBSS + 1% FCS. Odizolować płaty i usunąć otaczającą tkankę łączną za pomocą dwóch strzykawek o pojemności 1 ml + igieł 26 G 3/8", nie uszkadzając kapsułki.
  4. Umyj płaty w 3 ml HBSS + 1% FCS, aby wyeliminować komórki krwi.
    UWAGA: Przed E15 płaty grasicy znajdują się po obu stronach tchawicy, a później łączą się pośrodku, tworząc narząd dwupłatowy.

4. Zawiesiny komórek

  1. Rozsuń płatki pod lornetką powiększającą za pomocą dwóch igieł 26 G zamontowanych na strzykawkach o pojemności 1 ml, w HBSS + 1% FCS. Przefiltruj zawiesinę komórek przez nylonową siatkę.

5. Barwienie przeciwciałami fluorescencyjnymi i sortowanie komórek

UWAGA: Wszystkie przeciwciała są wcześniej miareczkowane, aby uzyskać optymalną definicję populacji (miareczkowanie może się różnić w zależności od partii przeciwciał).

  1. Inkubować tymocyty (E13 lub E18) przez 15-30 minut w temperaturze 4 °C ze 100 μl koktajlu biotynylowanych przeciwciał w celu barwienia dodatnich komórek linii (anty-CD19, anty-Gr1, anty-Ter119, anty-NK1.1, anty-CD11c, anty-CD3, anty-CD4, anty-CD8, anty-CD25).
  2. Aby zmyć nadmiar przeciwciał, odwiruj probówki z 4 ml HBSS + 1% FCS w dawce 280 x g przez 7 minut, wyeliminuj supernatant i ponownie zawiesij osad w świeżym HBSS + 1% FCS. Powtórzyć wirowanie.
  3. Inkubować komórki znakowane biotyną E18 z mikrogranulkami streptawidyny przez 15 minut w temperaturze 4 °C i dwukrotnie przemyć komórki w HBSS 1% FCS. Ponownie zawiesić komórki w 2 ml HBSS + 1% FCS. Większość tymocytów E13 jest ujemna pod względem linii produkcyjnej i dlatego nie wymaga wzbogacania MACS przed sortowaniem komórek.
  4. Przepuść komórki na kolumnie LS, zgodnie z instrukcjami producenta. Gdy cała zawiesina komórkowa dostanie się do kolumny, dodać 2 ml HBSS + 1% FCS. Odzyskać 4 ml przepływu, przez którą przepływa kolumna, i odwirowywać komórki przez 7 minut przy 280 x g.
  5. Ponownie zawiesić osad zubożonych tymocytów E18 lub całkowitego E13 w 50 μl mieszaniny przeciwciał TSP (anty-CD117 APC, anty-CD135 PE, anty-CD127 PECy7, anty-CD24 FITC, anty-CD44 APCCy7 i streptawidyna Pacific Blue) i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  6. Umyj komórki 4 ml HBSS + 1% FCS i ponownie zawieś komórki w 1 ml HBSS + 1% FCS z jodkiem propidyny.
  7. Posortuj komórki TSPs Lin-CD44+CD117+CD24o niskiej zawartościCD127+CD135+ w FACS (z 4 laserami) na probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 200 μl kompletnej pożywki + 20% FCS. Najpierw bramkuj komórki zgodnie z ich rozmiarem i ziarnistością na kanałach FSC i SSC. Wyeliminuj martwe komórki (barwienie jodkiem propidyny), wyklucz dublety i naoceń fluorescencję w skalach wykładniczych. Około 100 lub 600 TSP można uzyskać odpowiednio z jednej grasicy E13 lub jednej grasicy E18.

6. Kolonizacja płatów grasicy E14 z przodkami: technika wiszących kropli

  1. Napromieniować (30 Grays = 30 Gy) E14 płaty grasicy z zarodków CD45.2, 3 godziny przed posiewem.
    UWAGA: Płaty grasicy E14 lub E15 są z powodzeniem stosowane jako biorcy komórek progenitorowych limfocytów T. Stosowanie płatów grasicy biorcy w późniejszych dniach ciąży powoduje przedwczesną martwicę ze względu na większy rozmiar narządu, podczas gdy płaty grasicy we wcześniejszych dniach ciąży rozwijają się słabo, prawdopodobnie z powodu niepełnego rozwoju komórek nabłonka.
  2. Odwirować posortowane TSP i ponownie zawiesić komórki w pożywce hodowlanej (kompletna pożywka OPTI-MEM z 10% FCS, penicyliną (50 jednostek/ml), streptomycyną (50 μg/ml) i 2β-merkaptoetanolem (50 μM)) tak, aby 35 μl zawierało 500 TSP.
  3. Umieść 35 μl kropli zawiesiny komórkowej co drugi dołek na 60-dołkowej płytce Terasaki.
    UWAGA: Krople o objętości 35 μl mogą się stopić, jeśli zostaną umieszczone w sąsiednich studzienkach.
  4. Umieść jeden napromieniowany płat na powierzchni każdej kropli. Zamknij płytkę Terasaki i odwróć płytkę do góry nogami, aby komórki dotarły grawitacyjnie do wierzchołkowego bieguna kropli.
  5. Delikatnie uderz w górną stronę odwróconej płytki, aby zmusić płaty do zsunięcia się do wierzchołkowej krawędzi kropli. Inkubować odwróconą płytkę Terasaki w nawilżanym inkubatorze przez 48 godzin w temperaturze 37 °C + 5% CO2 . Po kolonizacji albo hodować E14 thymi w FTOC7, albo przeszczepić pod torebkę nerkową dorosłej myszy biorcy 8.

7. Posiew narządów grasicy płodu

  1. Umieścić 3 ml kompletnego podłoża na szalce Petriego o średnicy 35 mm. Umieścić filtr membranowy izoporowy unoszący się na podłożu. Umieść rozpuszczone płaty na krawędzi membrany za pomocą kleszczy (nie więcej niż 8 płatów na jednej membranie).
  2. Umieścić szalki Petriego zawierające płatki grasicy na szalce Petriego o średnicy 90 mm wraz z szalką 35 mm bez pokrywy, zawierającą 2 ml wody, aby zapewnić optymalną wilgotność. Inkubować przez 12 dni w temperaturze 37 °C + 5% CO2 .

8. Przeszczepy pod torebką nerkową w sterylnych warunkach

UWAGA: Miąższ nerki jest otoczony tkanką łączną tworzącą kapsułkę. Obszar podtorebkowy jest szczególnie bogaty w naczynia krwionośne i limfatyczne, zapewniając w ten sposób odpowiednie środowisko do rozwoju przeszczepów (np. płaty grasicy, wyspy trzustkowe lub serca noworodków). Przeszczepy są zwykle wykonywane na lewej nerce, ponieważ jest ona bardziej dostępna niż prawa nerka. Samce myszy CD3-/- wykorzystano jako biorców, unikając w ten sposób reakcji przeszczep kontra gospodarz z powodu niewielkich antygenów zgodności tkankowej związanych z chromosomem Y, ponieważ określenie płci przed E15 nie jest łatwe.

  1. Wysterylizuj narzędzia i załóż sterylne rękawiczki wzdłuż zabiegu. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu ketaminy 10 mg/ml + ksylazyny 1 mg/ml rozcieńczonego w PBS: (50 do 100 μl na 10 g masy ciała), za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Zweryfikuj znieczulenie, sprawdzając brak odruchów międzypalcowych. Umieść kroplę żelu hydro-Optimune na każdym oku, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
    UWAGA: Roztwór należy przygotować doraźnie i ogrzać w temperaturze pokojowej przed wstrzyknięciem. Znieczulenie trwa co najmniej 20 minut. Stopień znieczulenia powinien być kontrolowany przez cały czas trwania zabiegu. Znieczulenie można przedłużyć poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie połowy dawki co 20 min.
  2. Umieść mysz po prawej stronie, pod poziomą osłoną z przepływem blaszki. Wysterylizuj pole operacyjne 70% etanolem i 10% roztworem jodkowym skóry. Za pomocą kleszczy rozchyl włosy myszy wzdłuż długości 2 cm tuż nad stawem tylnej nogi. Ogolić obszar operacyjny.
  3. Za pomocą skalpela należy najpierw wykonać nacięcie o długości 1,5 cm, tkankę skórną, a następnie nożyczkami przeciąć tkankę mięśniową. Lekko dociśnij obie strony nacięcia, co wypchnie nerkę z jamy brzusznej.
  4. Nałóż sól fizjologiczną z patyczkiem kosmetycznym, aby nerki były wilgotne. Jeśli masz trudności z odsłonięciem narządu, użyj płaskich kleszczy, aby wyciągnąć otaczającą tkankę adipocytów, do której przyczepiona jest nerka. Utrzymuj nerkę z dala od jamy zaotrzewnowej za pomocą wacika umieszczonego pod narządem.
  5. Za pomocą dwóch cienkich kleszczyków wykonaj otwór o średnicy 2-3 mm w kapsułce (unikaj dotykania miąższu, aby zapobiec krwawieniu). Podczas całego zabiegu chirurgicznego należy utrzymywać odsłoniętą torebkę nerkową w ciągłym nawilżaniu.
  6. Ostrożnie włóż płaty pod torebkę nerkową, utrzymując ściankę kapsułki otwartą i wsuń przeszczep pod kapsułkę w kierunku bieguna krawędziowego. Umieść do 6 płatów na nerkę.
  7. Wymień nerkę w jamie zaotrzewnowej. Zszyj rozcięgna mięśniowe, a następnie skórę indywidualnymi węzłami chirurgicznymi. Zwilż ranę 10% roztworem jodu i powidonu. Umieść mysz na podkładce rozgrzanej w temperaturze 37 °C.
  8. Badaj przeszczepioną mysz aż do pełnego wyzdrowienia ze znieczulenia poprzez kontrolę ruchów serca, oddechowych i wąsów, kolorów błony śluzowej, aż do całkowitego wyzdrowienia widzianego przez samodzielne ruchy.
    UWAGA: Zalecamy wstrzyknięcie roztworu przeciwbólowego (Buprenorfina, 0,1 mg/kg) do mięśni bezpośrednio po operacji i 2 dni po operacji, aby zapobiec bólowi pooperacyjnemu.
  9. Operowane zwierzę należy trzymać w izolacji do czasu całkowitego wyzdrowienia. Sprawdzaj co drugi dzień szwy rany, aby zweryfikować i zapobiec infekcji. Nigdy nie zaobserwowano zakażenia rany po tym zabiegu.
    UWAGA: Cotygodniowa analiza komórek krwi obwodowej od myszy szczepionych CD3 / - pozwala nam wykryć populacje pochodzące z grasicy pochodzące od progenitorów E13 lub E18 przy użyciu markera allotypowego CD45 i przeciwciał specyficznych dla linii limfocytów T (Figura 3).

9. Analiza potomstwa TSP za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Drażnić FTOC indywidualnie, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek (patrz sekcja 4 protokołu).
  2. Zawiesiny komórek barwiących z poszczególnych płatów należy zabarwić mieszaniną przeciwciał zawierającą przeciwciała rozpoznające CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 Pacific Blue, Vγ5 FITC, Vδ1 PE i inkubować zgodnie z opisem w sekcji 5.
  3. Ponownie zawiesić komórki w HBSS + 1% FCS + jodku propidyny i przeanalizować w cytometrze przepływowym (patrz wyniki na rysunku 2).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wybrać metodę usuwania endogennych tymocytów z płatów grasicy, umożliwiającą najlepszy rozwój kolonizujących progenitorów, porównaliśmy poziom rekonstrukcji limfocytów T w płatach grasicy skolonizowanych po napromieniowaniu lub 5-dniowej kuracji deoxyguanozyną (d-Gua). Wyniki pokazują, że choć w 9. dniu hodowli nie ma różnic, to w 12. dniu płaty napromieniowane zawierały więcej limfocytów T niż te traktowane d-Gua. Zatem napromieniowanie jest bardziej odpowiednie niż kuracja d-Gua w celu uzyskania rozwoju limfocytów ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do analizy różnicowania limfocytów T ex vivo można zastosować dwa główne testy. Ostatnio zgłoszono kohodowlę krwiotwórczych komórek progenitorowych z komórkami zrębu BM, OP9, wyrażającymi ligandy Noth1, delta jak 1 lub 412. Ten test 2D jest łatwy do wykonania, wysoce wydajny i czuły, co pozwala na analizę na poziomie pojedynczej komórki. Jednak ani nie wspiera rozwoju limfocytów T poza etapem DP, ani wytwarzania γδ DETC13, które wymagają bezpośrednich interakcji z nabłonkiem grasicy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wspierane przez Instytut Pasteura, INSERM, Agence Nationale de Recherche ANR (Grant 'Lymphopoiesis'), REVIVE Future Investment Program i "La Ligue contre le Cancer".

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plastikowe płytki Petriego o wymiarach 90 x 15 mm i 35 x 15 mm.TPPT93100/T9340Pobieranie próbek
26 g i frac38; " Strzykawki 0,45 x 10 mm z igłamiBD Plastipak300015Zawieszenie komórek
Tkanina kotwiąca z siatki nylonowej sterylizowana 50/50 mm kawałki.SEFAR NITEX03-100/32Filtracja komórek
Etanol 70%.VWR83801.36Działania w zakresie sterylności
Jodek Powidon 10% (Betadine)MEDA Pharma314997.8sterylności
Ketamina 100 mg/ml (roztwór podstawowy)MERIALŚrodek znieczulający
Ksylazyna 100 mg/ml w PBS (roztwór podstawowy)SigmaX1251-1GŚrodek znieczulający i zwiotczający mięśnie
Buprenorfina 0,3 mg/ml roztwór podstawowyAXIENCEMorfiniczny środek przeciwbólowy
Żel oftalmiczny (0,2% cyklosporyny)Schering-Plough ZdrowieOchrona oczu
DPBS (+ CaCl2, MgCl2)GIBCO Life Technology14040-174do izolacji zarodków
HBSS Zbilansowany roztwór soli Hanksa (+ CaCl2, MgCl2)GIBCO Life Technology24020-091do wypłukiwania krwi i preparować zarodki
OPTI-MEM I GlutaMAX IGIBCO Life Technology51985-026Pożywka do hodowli
Płodowa surowica cielęcaEUROBIOCVFSVF00-0Udodatek do hodowli Penicilina
i streptomycynaGIBCO Life Technology15640-055Antybiotyki do hodowli
2-merkaptoetanoluGIBCO Life Technology31350010dodatek do kultur
Mikroskop preparacyjny LEICA MZ610445111 OkularMZ6W-PL10x/23
Źródło zimnej lampySCHOTT VWRKL1500 compactDwa włókna gęsiej szyi dostosowane
elastomerusilikonowego World Precision InstrumentsSYLG184Podkładka preparcyjna
Łyżka, okrągła i perforowanaFine Science Tools10370-18Narzędzia do preparacji
Fine Nożyczki do tęczówkiNarzędzia do nauki o naczyniu14090-09Narzędzia do preparowania
Nożyczki sprężynowe VannasNarzędzia do15018-10Narzędzia do preparowania
Kleszcze: Dumont #5/45 Inox 11 cmFST11253-25Narzędzia do preparacji
2 pary cienkich prostych kleszczy zegarmistrzowskich Dumont #5 11 cm cienkie końcówki.Fine Science Tools11295-20Narzędzia do preparowania
Nić poliamidowa z igłą 6-0 C-3 3/8cETHICONF2403do szwów
Uchwyt do igiełMORIA/F.S.T.12060-02do szwów
Poduszka grzewczaVWR100229-100Do utrzymywania temperatury myszy podczas znieczulenia
Izopor membranowy RTTPO2500DUTSCHER44210FTOC
Terasaki 60 dołkówFISHER1x270 10318801Do techniki wiszącej
kropli Waciki z gazy sterylne 7,5 x 7,5 cmHydrex11522Do stosowania roztworu dezynfekującego
Przeciwciała znakowane fluorescencją lub biotynąBD Biosciences, Biolegend lub e-Biocsiences Numer klonu patrz tabela poniżejBarwienie komórek
MACS Kolumny/Mikrogranulki streptawidynyMiltenyi Biotec130-042-401/130-048-101Myszy z wyczerpaniem komórek
Rivers Laboratories (CD45.1) i Janvier Labs  (CD45.2)C57BL/6 CD45.1 LUB CD45.2Źródło komórek i płatów grasicy
MyszyCDTA Orlé ans, FrancjaCD 3 epsilon Ko CD45.2Eksperyment szczepienia
Działania w zakresie zwierząt wizyjny LEICA do nauki o naprawie szczegółów Do płytek Charles

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).
  2. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  3. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  4. Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation. Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).
  5. Calderon, L., Boehm, T. Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments. Cell. 149, 159-172 (2012).
  6. Adolfsson, J., et al. Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment. Cell. 121, 295-306 (2005).
  7. Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow. Cell. 91, 661-672 (1997).
  8. Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from. Immunity. 26, 678-689 (2007).
  9. Ramond, C., et al. Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus. Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).
  10. Allison, J. P., Havran, W. L. The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors. Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).
  11. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
  12. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  13. Barbee, S. D., et al. Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).
  14. Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. Blood. 99, 463-471 (2002).
  15. Malissen, M., et al. Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene. EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

P atki grasicy p odowejmetoda wisz cej kroplicytometria przep ywowahodowla organ w grasicyprzeszczep pod torebk nerkiallotypowe markery CD45progenitory E13 E18r nicowanie limfocyt w Tdendrytyczne kom rki nab onkowe T

Powiązane artykuły