Method Article

Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w skrawkach mózgu za pomocą hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/52799

⸱

June 17th, 2015

 ,  ,  , 
1College of Physicians and Surgeons, Columbia University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hybrydyzacja in situ (ISH) RNA umożliwia wizualizację RNA w komórkach i tkankach. Tutaj pokazujemy, jak połączenie RNAscope ISH z immunohistochemią lub barwnikami histologicznymi może być z powodzeniem wykorzystane do wykrywania mRNA zlokalizowanych na aksonach w odcinkach mózgu myszy i człowieka.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mRNA są często zlokalizowane w aksonach kręgowców, a ich lokalna translacja jest wymagana do odnajdywania ścieżki aksonów lub rozgałęziania się podczas rozwoju oraz do utrzymania, naprawy lub neurodegeneracji w okresach postrozwojowych. Wysokoprzepustowe analizy wykazały niedawno, że aksony mają bardziej dynamiczny i złożony transkryptom, niż wcześniej oczekiwano. Analizy te zostały jednak przeprowadzone głównie w hodowanych neuronach, w których aksony można wyizolować z przedziałów somato-dendrytycznych. Osiągnięcie takiej izolacji w całych tkankach in vivo jest praktycznie niemożliwe. W związku z tym, aby zweryfikować rekrutację mRNA i ich znaczenie funkcjonalne u całego zwierzęcia, analizy transkryptomu powinny być idealnie połączone z technikami, które umożliwiają wizualizację mRNA in situ. Niedawno opracowano nowatorskie technologie ISH, które wykrywają RNA na poziomie pojedynczej cząsteczki. Jest to szczególnie ważne podczas analizy subkomórkowej lokalizacji mRNA, ponieważ zlokalizowane RNA zwykle znajdują się na niskich poziomach. W tym miejscu opisujemy dwa protokoły wykrywania mRNA zlokalizowanych aksonalnie przy użyciu nowatorskiej technologii ultraczułego RNA ISH. Połączyliśmy RNAscope ISH z przeciwbarwieniem aksonalnym za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej lub barwników histologicznych, aby zweryfikować rekrutację mRNA Atf4 do aksonów in vivo w dojrzałych mózgach myszy i ludzi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aksonalna rekrutacja mRNA i lokalna translacja umożliwiają aksonom reagowanie na bodźce zewnątrzkomórkowe w sposób ostry czasowo i przestrzennie1. Wewnątrzaksonalna synteza białek jest najlepiej rozumiana w kontekście rozwoju neurologicznego, gdzie odgrywa kluczową rolę w zachowaniu stożka wzrostu2-8, odnajdywaniu ścieżki aksonu9-11 i sygnalizacji wstecznej12,13. Ale znacznie mniej wiadomo o funkcjonalnym znaczeniu syntezy białek aksonalnych w neuronach porozwojowych, gdy poziomy mRNA i rybosomów w aksonach są znacznie zmniejszone14,15. Od dawna uważa się, że dojrzałe aksony kręgowców są nieaktywnetranslacyjnie16. Jednak ostatnie badania wskazują, że translacja lokalna jest reaktywowana w dojrzałych aksonach w warunkach patologicznych. Na przykład podzbiór mRNA jest rekrutowany do regeneracji aksonów po uszkodzeniu nerwów, a do prawidłowej regeneracji tych aksonów wymagana jest wewnątrzaksonalna synteza białek17. Ponadto nasza grupa wykazała, że specyficzne mRNA są rekrutowane do aksonów po miejscowej ekspozycji na peptyd choroby Alzheimera Aβ1-42, a lokalna translacja czynnika transkrypcyjnego ATF4 jest wymagana do propagacji neurodegeneracyjnych skutków Aβ1-42 z aksonów do neuronalnej somy18. Wreszcie, wysokoprzepustowe analizy wykazały, że dojrzałe aksony mają bardziej złożony i dynamiczny transkryptom niż oczekiwano18-21, zwłaszcza w warunkach patologicznych. W świetle tych badań potrzebna jest wysoce czuła i specyficzna metoda wykrywania aksonalnie zlokalizowanych mRNA w układzie nerwowym dorosłego człowieka.

Wiele prac nad rekrutacją mRNA i lokalną translacją w dojrzałych aksonach przeprowadzono na hodowanych neuronach. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku analiz transkryptomu, ponieważ istnieją specjalistyczne metody hodowli, które pozwalają na wyizolowanie aksonów z przedziału somato-dendrytycznego18-20. Chociaż takie badania dostarczyły cennych informacji na temat roli lokalnej translacji w dojrzałych aksonach, pytanie, czy hodowane neurony wiernie reprezentują sytuację in vivo, czy też rekrutacja mRNA jest adaptacyjną reakcją aksonów na warunki hodowli, jest nadal otwarte. Niewiele badań dostarczyło dowodów na rekrutację mRNA do dojrzałych aksonów in vivo. Na przykład transkrypt kodujący białko markera węchowego został wykryty w aksonach w dorosłych neuronach czuciowych22. Transgen zawierający 3' UTR mRNA β-aktyny jest transportowany do aksonów w neuronach obwodowego i ośrodkowego układu nerwowego u myszy i ulega lokalnej translacji po okresach rozwojowych23. MRNA laminy b2 jest zlokalizowane w aksonach siatkówki w kijankach Xenopues laevis, a jej wyczerpanie wpływa na utrzymanie aksonów po rozwoju aksonów21. Interferencja z transportem aksonalnym mRNA kodującego oksydazę cytochromu C IV zmienia zachowanie myszy24. Wreszcie, mRNA Atf4 znajduje się w dorosłych aksonach myszy i ludzkich mózgów w kontekście neurodegeneracji indukowanej przez Aβ1-42 18.

Wysokoprzepustowe analizy transkryptomu okazały się przydatne do identyfikacji profili mRNA w izolowanych aksonach in vitro, ale mają ograniczenia w badaniach in vivo, ponieważ w całych tkankach aksony nigdy nie występują w izolacji, ale mieszają się z ciałami komórek neuronalnych, komórkami glejowymi i innymi typami komórek. W związku z tym takie analizy muszą być połączone z technikami obrazowania, które potwierdzają subkomórkową lokalizację mRNA. Hybrydyzacja RNA in situ (RNA ISH) umożliwia wykrywanie i wizualizację określonych sekwencji RNA w komórkach i tkankach. Jednak oryginalne testy RNA ISH były odpowiednie tylko do identyfikacji bardzo obfitych RNA25, co rzadko ma miejsce w przypadku mRNA zlokalizowanych aksonalnie. W ostatnich dziesięcioleciach coraz intensywniej wkłada się w rozwój nowatorskich technologii, które pozwalają na wykrywanie mRNA na poziomie pojedynczej cząsteczki25,26. Na przykład Singer i jego współpracownicy opracowali sondy ISH do wykrywania mRNA w pojedynczych komórkach, składających się z 5 nienakładających się na siebie fluorescencyjnie znakowanych 50-merów (szczegóły w 27). Główna różnica między wyżej wymienionymi technikami a opisaną tutaj polega na tym, że ta druga wykorzystuje 20 sond o podwójnej strukturze Z (nie liniowych), które zazwyczaj celują w ~ 1 kb region interesującego RNA, zapewniając specyficzność i niski poziom tła. Sondy są następnie hybrydyzowane z sekwencjami przedwzmacniacza i wzmacniacza, które są ostatecznie znakowane fluorescencyjnie lub sprzężone z enzymami umożliwiającymi reakcje chromogenne. Te etapy wzmocnienia poprawiają stosunek sygnału do szumu w porównaniu z innymi technologiami ISH28. W tym miejscu opisujemy dwa protokoły wykorzystujące RNAscope w połączeniu z immunocytochemią fluorescencyjną lub z barwnikami histologicznymi umożliwiającymi przeciwbarwienie aksonów. Oba protokoły są odpowiednie do wizualizacji aksonalnej lokalizacji mRNA Atf4 w mózgach dorosłych myszy i ludzi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Columbia i przestrzegano obowiązujących wytycznych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Uwaga: Przygotuj wszystkie używane do procedur ISH w wodzie wolnej od RNaz lub uzdatnionej przez DEPC. Zalecenie to nie jest bezwzględnie konieczne po zakończeniu ISH, ale sugeruje się, aby były nadal przygotowywane w autoklawowanej wodzie podwójnie destylowanej i/lub sterylizowane przez filtrowanie.

1. Wykrywanie mRNA Atf4 zlokalizowanego w aksonach cholinergicznych w mózgu dorosłej myszy za pomocą fluorescencji hybrydyzacji in situ (FISH), a następnie immunohistochemii

  1. Przygotowanie próbki do zamrożonych plastrów mózgu utrwalonych paraformaldehydem
    1. W poniższym przykładzie przygotuj plasterki z zamrożonych mózgów myszy.
      1. Krótko mówiąc, uśmierc 9-miesięczne myszy przez znieczulenie ketaminą (100 mg kg-1 masy ciała) i ksylazyną (10 mg kg-1 masy ciała), a następnie przezsercową infuzją 4% paraformaldehydu w PBS (pH 7,4).
      2. Usunąć mózg i post-fix w 4% paraformaldehydzie przez 24 godziny w temperaturze 4 oC.
      3. Po utrwaleniu przemyć próbki trzykrotnie w PBS i krioprotektorować w 30% sacharozie w PBS (pH 7,4) przez 24 godziny w temperaturze 4 oC.
      4. Osadzać mózgi w związku zamrażającym OCT, szeregowo ciąć pod kątem 20 μm na kriostacie i zamontować na szkiełkach mikroskopowych poddanych działaniu poli-D-lizyny. Trzymaj plastry mózgu w temperaturze -20 oC do czasu użycia.
    2. Wyjmij plastry mózgu z utrwalonym paraformaldehydem z zamrażarki i susz na powietrzu przez 30 minut w temperaturze stężonej temperatury.
    3. Umyj trzy razy 1x PBS.
    4. W dygestorium ponownie napraw plastry mózgu przez 20 minut za pomocą 4% paraformaldehydu w RT.
      UWAGA: UWAGA: 4% paraformaldehyd jest toksyczny i należy się z nim odpowiednio obchodzić i wyrzucać zgodnie z protokołami bezpieczeństwa.
    5. Umyj trzy razy 1x PBS.
    6. Odwodnić plastry mózgu.
      1. Przygotuj 50%, 75% i 100% roztwory etanolu.
      2. Zanurz szkiełka w 50% etanolu na 5 minut przy RT.
      3. Zanurz szkiełka w 75% etanolu na 5 minut przy RT.
      4. Zanurz szkiełka w 100% etanolu na 5 minut w RT.
      5. Zanurz szkiełka w świeżym 100% etanolu na 5 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Alternatywnie szkiełka można przechowywać w 100% etanolu w temperaturze -20oC do 1 miesiąca.
  2. Test FISH, a następnie immunohistochemia z użyciem demaskowania antygenu/RNA wywołanego ciepłem
    1. Przed rozpoczęciem przygotuj wszystkie wymagane materiały:
      1. Podgrzej piec do hybrydyzacji do 40 oC i umieść w nim blachę zawierającą wodę destylowaną, aby stworzyć nawilżone środowisko.
      2. Weź pudełko na slajdy i umieść w nim ręczniki papierowe nasączone wodą destylowaną, aby nawilżyć pudełko na slajdy. Umieść pudełko na szkiełka w piecu do hybrydyzacji.
      3. Wyjmij sondy (zarówno ujemne, jak i docelowe) z lodówki i podgrzewaj je w piecu hybrydyzacyjnym przez 10 minut. Pozwól sondom ostygnąć w temperaturze pokojowej.
      4. Zrównoważyć odczynniki wzmacniające AMP 1-4 (zawarte w zestawie odczynników do fluorescencji multipleksowych) w temperaturze pokojowej.
      5. Przygotuj roztwór do pobierania antygenu: 10 mM cytrynian sodu (pH 6), 0,05% Tween 20. Uwaga: Roztwór może być przechowywany w RT przez czas nieokreślony i może być używany do przyszłego barwienia.
      6. Przygotuj 1x bufor do płukania, rozcieńczając 50x roztwór podstawowy (zawarty w zestawie odczynników do fluorescencyjnych multipleksów) w wodzie wolnej od RNaz lub uzdatnionej DEPC.
        UWAGA: 1x bufor do płukania może być przechowywany w RT przez 1 miesiąc i może być używany do przyszłego barwienia. 50-krotny bufor do płukania może się wytrącić. Jeśli tak, podgrzej 50x bufor do płukania w temperaturze 40 oC przez 10 minut przed przygotowaniem 1x roztworu.
    2. Usuń szkiełka ze 100% etanolu i susz na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować słoik z kopiną zawierający 50 ml roztworu do pobierania antygenu. Zanurz szkiełka w roztworze do pobierania antygenu i gotuj je przez 10 minut w kuchence mikrofalowej.
      UWAGA: Alternatywnie umieścić szkiełka poziomo w okrągłym szklanym naczyniu o średnicy 100 mm zawierającym 100 ml roztworu do pobierania.
      1. Napełnij zlewkę o pojemności 1 l wodą destylowaną i umieść ją w kuchence mikrofalowej.
        UWAGA: Woda będzie "buforować" ciepło podczas wykonywania demaskowania.
      2. Umieść szkiełka w roztworze do pobierania antygenu w kuchence mikrofalowej. Gotuj szkiełka z dużą mocą przez 5 minut. Natychmiast po tym, jak próbki przestaną wrzeć, ciepło ponownie przesuwa się z dużą mocą przez dodatkowe 5 minut.
      3. Zjeżdżalnie chłodzące w RT.
        UWAGA: KROK KRYTYCZNY: czas gotowania i procedura powinny być określone przez użytkownika, w zależności od charakterystyki kuchenki mikrofalowej. Im szybciej rozpocznie się wrzenie, tym większe szanse na odparowanie roztworu. W takim przypadku zaleca się, aby próbki były gotowane przez krótsze okresy czasu, więcej niż dwa razy, aby uzyskać całkowity czas demaskowania wynoszący 10 minut. Wręcz przeciwnie, jeśli ogrzewanie odbywa się przy średniej lub niskiej mocy, demaskowanie można wykonać raz na 10 minut. Jeśli jednak próbki nie gotują się w sposób ciągły przez łącznie około 10 minut, może to spowodować częściowe zdemaskowanie zarówno docelowego RNA, jak i białka, które ma zostać wykryte.
    4. Umyj szkiełka trzy razy za pomocą 1x PBS.
    5. Dodaj 2 - 3 krople (~100 μl) zestawu sondy dapB do tych wycinków mózgu, które służą do oceny barwienia tła. Uwaga: Zestaw sondy dapB jest ukierunkowany na gen bakteryjny i nie powinien rozpoznawać żadnego ssaczego RNA.
    6. Dodaj 2-3 krople sondy celowniczej ustawionej do tych wycinków mózgu, które są używane do wykrywania interesującego RNA. Uwaga: w tym przykładzie użyto zestawu sond ukierunkowanych na reszty 20 - 1,381 mRNA myszy Atf4.
    7. Przykryj szkiełka parafilmem, aby uniknąć parowania sondy, umieść je w nawilżonym pudełku na szkiełka wewnątrz pieca do hybrydyzacji i inkubuj w temperaturze 40 oC przez 2 godziny.
      UWAGA: OPCJONALNIE: dodatkowe wycinki mózgu można zhybrydyzować za pomocą zestawu sond ukierunkowanych na mysz Polr2A i użyć jako kontroli pozytywnej.
    8. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    9. Dodać 2 - 3 krople odczynnika do amplifikacji AMP 1-FL do każdego wycinka mózgu, przykryć szkiełka parafilmem, umieścić je w pudełku na szkiełka i inkubować w temperaturze 40 oC przez 30 minut w piecu do hybrydyzacji.
    10. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    11. Dodać 2 - 3 krople odczynnika do amplifikacji AMP 2-FL do każdego wycinka mózgu, przykryć szkiełka parafilmem, umieścić je w pudełku ze szkiełkami i inkubować w temperaturze 40 oC przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji.
    12. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    13. Dodać 2 - 3 krople odczynnika do amplifikacji AMP 3-FL do każdego wycinka mózgu, przykryć szkiełka parafilmem, umieścić je w pudełku ze szkiełkami i inkubować w temperaturze 40 oC przez 30 minut w piecu do hybrydyzacji.
    14. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    15. Dodać 2 - 3 krople odczynnika do amplifikacji AMP 4-FL do każdego wycinka mózgu, przykryć szkiełka parafilmem, umieścić je w pudełku na szkiełka i inkubować w temperaturze 40 oC przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji.
    16. Umyj szkiełka dwukrotnie 1x buforem do płukania przez 2 minuty w RT i dwa razy za pomocą 1x PBS.
    17. Dodać 100 - 200 μl (lub objętość wystarczającą do całkowitego pokrycia plasterków) roztworu blokującego zawierającego 3 mg/ml BSA, 100 mM glicyny i 0,25% Triton X-100 w PBS (pH 7,4) do szkiełek, przykryć je parafilmem i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    18. Dodać 100 - 200 μl przeciwciała anty-ChAT rozcieńczonego w roztworze blokującym (1/100) do szkiełek, przykryć je parafilmem i inkubować przez 2 dni w temperaturze 4 oC. Upewnić się, że plastry mózgu nie wyschły. W razie potrzeby ponownie nałóż roztwór przeciwciała anty-ChAT na wycinki mózgu 24 godziny po inkubacji.
    19. Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBS przez 5 minut w RT.
    20. Dodać 100 - 200 μl odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z Alexą (np. Alexa-594 anty-koza osła dla tego konkretnego przykładu) do szkiełek, przykryć parafilmem i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    21. Umyj szkiełka trzy razy w 1x PBS przez 5 minut w RT.
    22. Umyj szkiełka raz wodą destylowaną.
    23. Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego zawierającego DAPI.
    24. Wizualizuj wycinki mózgu pod mikroskopem fluorescencyjnym.

2. Wykrywanie mRNA Atf4 zlokalizowanego w aksonach w próbkach ludzkiego mózgu za pomocą chromogenicznej hybrydyzacji in situ (CISH), a następnie barwienia przeciwstawnego Luxol Fast Blue i Cresyl Violet

  1. Przygotowanie próbek do próbek ludzkiego mózgu zatopionego w parafinie utrwalonym w formalinie
    1. Plastry pieczemy w suchym piekarniku w temperaturze 60 oC przez 1 godzinę.
    2. Odparafinować plastry mózgu w dygestorium.
      UWAGA: UWAGA: odczynniki są toksyczne i należy się z nimi obchodzić i wyrzucać zgodnie z odpowiednimi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa
      1. Zanurz szkiełka w alternatywnym środku czyszczącym z ksylenu dwukrotnie na 10 minut.
      2. Zanurz szkiełka w 100% etanolu dwukrotnie na 1 minutę.
      3. Plastry suszone na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Alternatywnie próbki mogą być suszone w temperaturze RT O/N, ale muszą zostać zużyte w ciągu 24 godzin.
  2. Chromogenny test ISH na bazie diaminobenzydyny (DAB), a następnie szybkie barwienie luksolem na niebiesko i fiolet krezylowy przy użyciu demaskowania RNA indukowanego ciepłem i proteazą
    1. Przed rozpoczęciem przygotuj wymagane materiały:
      1. Podgrzej piec do hybrydyzacji do 40 oC i umieść tacę z wodą destylowaną, aby stworzyć nawilżone środowisko.
      2. Weź pudełko na slajdy i umieść w nim ręczniki papierowe nasączone wodą destylowaną, aby nawilżyć pudełko na slajdy. Umieść pudełko na szkiełka w piecu do hybrydyzacji.
      3. Przygotuj 1x Pretreat 2, rozcieńczając 10x roztwór podstawowy (zawarty w zestawie odczynników CISH) w wodzie wolnej od RNaz lub uzdatnionej DEPC. Jeżeli obróbka wstępna jest wykonywana na płycie grzejnej, należy dodać 100 ml roztworu do obróbki wstępnej do szklanego naczynia o średnicy 100 mm, aby zwiększyć powierzchnię styku między naczyniem a płytą grzejną (jeżeli obróbka wstępna jest wykonywana w kuchence mikrofalowej, zamiast tego można użyć słoika z kopinem, jak określono w ppkt 1.2.3). Podgrzać roztwór do temperatury 100 °C i utrzymywać go w stanie wrzenia nie dłużej niż 30 minut przed zanurzeniem próbek.
      4. Podgrzać sondy ujemne i dodatnie 10 minut w temperaturze 40 oC i schłodzić w temperaturze pokojowej.
      5. Zrównoważ odczynniki amplifikacyjne AMP 1-6 (zawarte w zestawie odczynników CISH) w temperaturze pokojowej.
      6. Przygotuj 1x bufor do przemywania rozcieńczając 50x roztwór podstawowy (zawarty w zestawie odczynników CISH) w wodzie destylowanej. Uwaga: 1x bufor do mycia może być przechowywany w RT przez 1 miesiąc i może być używany do przyszłego barwienia.
    2. Dodaj ~4 krople (~120 μl) Pretreat 1 do każdego wycinka mózgu, przykryj parafilmem i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    3. Umyj 3 do 5 razy w świeżej wodzie destylowanej.
    4. Wykonaj demaskowanie wywołane ciepłem:
      1. Przenieść szkiełka do gorącego roztworu Pretreat 2 (zawartego w zestawie odczynników CISH) i gotować przez 15 minut. Uwaga: Gotowanie można przeprowadzić na płycie grzejnej zapewniającej ciągłe gotowanie lub w kuchence mikrofalowej, wykonując krytyczne kroki określone w ppkt 1.2.3).
    5. Natychmiast przenieś szkiełka do wody destylowanej i umyj 3 do 5 razy.
    6. Umyj szkiełka 3 do 5 razy w świeżym 100% etanolu.
    7. Plastry suszyć na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Uwaga: Alternatywnie plastry można suszyć O/N.
    8. Wykonaj demaskowanie wywołane proteazą:
      1. Dodać 4 krople Pretreat 3 (dołączonego do zestawu odczynników CISH), przykryć parafilmem i inkubować przez 30 minut w temperaturze 40 oC w piecu do hybrydyzacji.
    9. Umyj szkiełka 3 do 5 razy w świeżej wodzie destylowanej.
    10. Dodaj 4 krople zestawu sondy dapB do tych wycinków mózgu, które służą do oceny barwienia tła.
    11. Dodaj 4 krople zestawu sondy celowniczej do tych wycinków mózgu, które służą do wykrywania interesującego RNA.
      UWAGA: W tym przykładzie zastosowano zestaw sond ukierunkowany na reszty 15 - 1,256 ludzkiego mRNA ATF4. OPCJONALNIE: dodatkowe wycinki mózgu można zhybrydyzować za pomocą zestawu sond ukierunkowanych na ludzki PPIB i wykorzystać jako kontrolę pozytywną.
    12. Umieścić szkiełka w pudełku ze szkiełkami i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 40 oC w piecu do hybrydyzacji.
    13. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    14. Dodać 4 krople odczynnika AMP 1 do każdego wycinka mózgu, przykryć szkiełka parafilmem, umieścić je w pudełku ze szkiełkami i inkubować w temperaturze 40 oC przez 30 minut w piecu do hybrydyzacji.
    15. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    16. Dodać 4 krople odczynnika AMP 2 do każdego wycinka mózgu, przykryć szkiełka parafilmem, umieścić je w pudełku ze szkiełkami i inkubować w temperaturze 40 oC przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji.
    17. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    18. Dodać 4 krople odczynnika AMP 3 do każdego wycinka mózgu, przykryć szkiełka parafilmem, umieścić je w pudełku ze szkiełkami i inkubować w temperaturze 40 oC przez 30 minut w piecu do hybrydyzacji.
    19. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    20. Dodać 4 krople odczynnika AMP 4 do każdego wycinka mózgu, przykryć szkiełka parafilmem, umieścić je w pudełku ze szkiełkami i inkubować w temperaturze 40 oC przez 15 minut w piecu do hybrydyzacji.
    21. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    22. Dodaj 4 krople odczynnika AMP 5 do każdego wycinka mózgu, przykryj szkiełka parafilmem i inkubuj 30 minut w temperaturze pokojowej.
    23. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    24. Dodaj 4 krople odczynnika AMP 6 do każdego wycinka mózgu, przykryj szkiełka parafilmem i inkubuj 15 minut w temperaturze pokojowej.
    25. Umyj szkiełka dwukrotnie za pomocą 1x bufora do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    26. Wymieszać równą objętość odczynników BROWN-1 i BROWN-2 (zawartych w zestawie odczynników CISH), dodać ~120 μl roztworu do każdego wycinka mózgu, przykryć parafilmem i inkubować 10 minut w temperaturze pokojowej.
    27. Umyj szkiełka dwukrotnie 1x buforem do płukania przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i raz spłucz w wodzie destylowanej.
      UWAGA: KROKI KRYTYCZNE: następujące kroki mają kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnego przeciwbarwienia aksonalnego bez maskowania obecności granulek RNA.
    28. Przed wykonaniem barwienia przeciwstawnego sprawdź obecność interesującego mRNA pod mikroskopem jasnego pola. Zdefiniuj obszary referencyjne w próbkach mózgu, w których należy monitorować obecność puncta przez cały czas trwania procedury barwienia przeciwbarwnego.
    29. Rozgrzej roztwór luxol fast blue w temperaturze 60 oC.
    30. Umieść szkiełka w luxol fast blue i inkubuj 30 min w temperaturze 60 oC.
    31. Spłucz kilka razy w wodzie destylowanej.
    32. Zanurz kilka razy w 0,05% roztworze węglanu litu, aby rozpocząć różnicowanie.
    33. Zanurz szkiełka dwukrotnie w świeżym 75% etanolu.
    34. Spłucz w wodzie destylowanej.
    35. Sprawdź wycinki mózgu pod mikroskopem jasnego pola. Należy pamiętać, że istota szara i biała powinny zacząć być rozróżnialne, a granulki RNA nadal widoczne jako ciemnoniebiesko-puncta. Sprawdź, czy aksony zaczynają pojawiać się jako jasnoniebieskie włókna.
    36. Powtórz kroki od 2.2.28 do 2.2.32. Wykonuj inkubacje z roztworem luxol fast blue w krokach co 10 - 20 minut, uważnie monitorując barwienie przeciwstawne i obecność granulek RNA. Uwaga: Zazwyczaj optymalne barwienie przeciwstawne uzyskuje się w ciągu 60 - 90 minut (całkowity czas inkubacji), ale czas ten można skrócić, jeśli podejrzewa się, że granulki RNA mogą być zamaskowane przez barwnik luxol fast blue barw (patrz przykład na rysunku 2).
    37. Szkiełka inkubować w roztworze fioletu krezylowego przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    38. Opłucz szkiełka w wodzie destylowanej.
    39. Zanurz szkiełka od 5 do 10 razy w 70% etanolu.
    40. Dehydrate brain przechodzi przez 3 szybkie wymiany 100% etanolu.
    41. W dygestorium oczyścić mózg poprzez dwukrotną inkubację w alternatywnym środku czyszczącym z ksylenu przez 2 minuty i trzeci raz przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    42. Zamontuj plastry mózgu w trwałym podłożu mocującym na bazie ksylenu.
    43. Analizuj próbki pod mikroskopem w jasnym polu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krótkie podsumowanie procedur opisanych powyżej jest pokazane na rysunku 1.

Optymalna detekcja granulek mRNA Atf4 w aksonach cholinergicznych za pomocą demaskowania wywołanego ciepłem

Podczas oceny lokalizacji aksonalnej mRNA, kluczowe jest to, aby móc zidentyfikować aksony i móc wizualizować RNA o niskiej obfitości. Opisana tutaj technologia RNA ISH umożliwia detekcję RNA w rozdzielczości pojedynczej cząsteczki. Standardowe protokoły wykor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym raporcie opisano zastosowanie technologii ISH o wysokiej rozdzielczości w wykrywaniu aksonalnie zlokalizowanego mRNA Atf4 . Te i wcześniej opublikowane badania pokazują, że technologia ta jest kompatybilna z wykrywaniem białek w tkankach, a nawet całych zarodkach na podstawie przeciwciał33. Co ważne, od niedawna wykorzystuje się go do wykrywania łukowego mRNA w dendrytach neuronów hipokampa34. Można go również łączyć z barwnikami histologicznymi do barwienia tkanek. Wr...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Alzheimer's Association (NIRG-10-171721; do U.H.), National Institute of Mental Health (MH096702; do U.H.), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NS081333; do C.M.T.), oraz nagrody za badania pilotażowe z National Institute on Aging-fundowane przez Alzheimer's Disease Research Center na Uniwersytecie Columbia (AG008702; do J.B. i Y.Y.J.), które również wspierają New York Brain Bank. Dziękujemy członkom laboratorium Hengst za komentarze i dyskusje

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
niestandardowa sonda celująca w pozostałości 20-1,381 myszy Atf4 mRNA (NM_009716)Niestandardowasonda
celująca w pozostałości 15-1,256 ludzkiego mRNA ATF4 (NM_001675.2)Zaawansowana diagnostyka komórkowa-sonda
kontroli ujemnej-DapBZaawansowana diagnostyka komórkowa310043 sonda
sonda kontroli pozytywnej-mysz Polr2A (opcjonalnie)Zaawansowana diagnostyka komórkowaSonda
kontroli pozytywnej 312471 sonda kontroli dodatniej - ludzki PPIB (opcjonalnie)Zaawansowana diagnostyka komórek313901sonda
RNAscope Fluorescencyjny zestaw odczynników multipleksowych (do wykrywania fluorescencji)Zaawansowana diagnostyka komórkowa320850in situ zestaw
do hybrydyzacjiZestaw odczynników RNAscope 2.0 HD - BRĄZOWY (do detekcji chromogennej)Cell Diagnostics310035in situ
Kozie przeciwciało poliklonalne anty-ChATMilliporeAB144P
Luxol Fast Blue-Cresyl Echt Violet Stain KitAmerican MasterTechKTLFB
Clearify (substytut ksylenu)American MasterTechCACLEGAL
Montaż ProLong Gold  średni z DAPILife TechnologiesP36935
DPX medium montażoweSigma6522
Advanced Cell DiagnosticsZestaw do hybrydyzacji Advanced

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, H., Yoon, B. C., Holt, C. E. Axonal mRNA localization and local protein synthesis in nervous system assembly, maintenance and repair. Nat. Rev. Neurosci. 13, 308-324 (2012).
  2. Campbell, D. S., Holt, C. E. Chemotropic responses of retinal growth cones mediated by rapid local protein synthesis and degradation. Neuron. 32, 1013-1026 (2001).
  3. Wu, K. Y., et al. Local translation of RhoA regulates growth cone collapse. Nature. 436, 1020-1024 (2005).
  4. Piper, M., et al. Signaling mechanisms underlying Slit2-induced collapse of Xenopus retinal growth cones. Neuron. 49, 215-228 (2006).
  5. Yao, J., Sasaki, Y., Wen, Z., Bassell, G. J., Zheng, J. Q. An essential role for β-actin mRNA localization and translation in Ca2+-dependent growth cone guidance. Nat. Neurosci. 9, 1265-1273 (2006).
  6. Hengst, U., Deglincerti, A., Kim, H. J., Jeon, N. L., Jaffrey, S. R. Axonal elongation triggered by stimulus-induced local translation of a polarity complex protein. Nat. Cell Biol. 11, 1024-1030 (2009).
  7. Gracias, N. G., Shirkey-Son, N. J., Hengst, U. Local translation of TC10 is required for membrane expansion during axon outgrowth. Nat. Commun. 5, 3506(2014).
  8. Preitner, N., et al. APC Is an RNA-Binding Protein, and Its Interactome Provides a Link to Neural Development and Microtubule Assembly. Cell. 158, 368-382 (2014).
  9. Brittis, P. A., Lu, Q., Flanagan, J. G. Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target. Cell. 110, 223-235 (2002).
  10. Tcherkezian, J., Brittis, P. A., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation. Cell. 141, 632-644 (2010).
  11. Colak, D., Ji, S. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay. Cell. 153, 1252-1265 (2013).
  12. Cox, L. J., Hengst, U., Gurskaya, N. G., Lukyanov, K. A., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation and retrograde trafficking of CREB promotes neuronal survival. Nat. Cell Biol. 10, 149-159 (2008).
  13. Ji, S. J., Jaffrey, S. R. Intra-axonal translation of SMAD1/5/8 mediates retrograde regulation of trigeminal ganglia subtype specification. Neuron. 74, 95-107 (2012).
  14. Bassell, G. J., Singer, R. H., Kosik, K. S. Association of poly(A) mRNA with microtubules in cultured neurons. Neuron. 12, 571-582 (1994).
  15. Kleiman, R., Banker, G., Steward, O. Development of subcellular mRNA compartmentation in hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 14, 1130-1140 (1994).
  16. Hengst, U., Jaffrey, S. R. Function and translational regulation of mRNA in developing axons. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 209-215 (2007).
  17. Deglincerti, A., Jaffrey, S. R. Insights into the roles of local translation from the axonal transcriptome. Open Biology. 2, 120079(2012).
  18. Baleriola, J., et al. Axonally synthesized ATF4 transmits a neurodegenerative signal across brain regions. Cell. 158, 1159-1172 (2014).
  19. Gumy, L. F., et al. Transcriptome analysis of embryonic and adult sensory axons reveals changes in mRNA repertoire localization. RNA. 17, 85-98 (2011).
  20. Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
  21. Yoon, B. C., et al. Local translation of extranuclear lamin B promotes axon maintenance. Cell. 148, 752-764 (2012).
  22. Dubacq, C., Jamet, S., Trembleau, A. Evidence for developmentally regulated local translation of odorant receptor mRNAs in the axons of olfactory sensory neurons. J. Neurosci. 29, 10184-10190 (2009).
  23. Willis, D. E., et al. Axonal Localization of transgene mRNA in mature PNS and CNS neurons. J. Neurosci. 31, 14481-14487 (2011).
  24. Kar, A. N., et al. Dysregulation of the axonal trafficking of nuclear-encoded mitochondrial mRNA alters neuronal mitochondrial activity and mouse. Dev. Neurobiol. 74, 333-350 (2014).
  25. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  26. Trcek, T., et al. Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast. Nat. Protoc. 7, 408-419 (2012).
  27. Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat. Methods. 5, 877-879 (2008).
  28. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14, 22-29 (2012).
  29. Ge, S., Crooks, G. M., McNamara, G., Wang, X. Fluorescent immunohistochemistry and in situ hybridization analysis of mouse pancreas using low-power antigen-retrieval technique. J. Histochem. Cytochem. 54, 843-847 (2006).
  30. Wang, H., et al. Dual-Color Ultrasensitive Bright-Field RNA In Situ Hybridization with RNAscope. Methods Mol. Biol. 1211, 139-149 (2014).
  31. Kluver, H., Barrera, E. A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 12, 400-403 (1953).
  32. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and Practice of Histotechnology. , 2nd edn, Battelle Press. (1987).
  33. Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos. BMC Biol. 12, 55(2014).
  34. Farris, S., Lewandowski, G., Cox, C. D., Steward, O. Selective localization of arc mRNA in dendrites involves activity- and translation-dependent mRNA degradation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34, 4481-4493 (2014).
  35. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 14, 22-29 (2012).
  36. Sheehan, D. C., Hrapchak, B. B. Theory and practice of histotechnology. , 2d edn, Mosby. (1980).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

In Situ HybridizationRNAscope TechnologyAxonal mRNA DetectionBrain Section AnalysisFluorescence ImmunohistochemistryAntigen UnmaskingProbe HybridizationSignal AmplificationCholine Acetyltransferase StainingLuxol Fast Blue Counterstain

Related Articles