Artykuł metodologiczny

Mysi model odrzucenia naczyniowego indukowanego alloimmunologicznie i miażdżycy tętnic po przeszczepie

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52800

⸱

17 maja 2015

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół szczepienia interpozycji aorty u myszy. Celem protokołu jest dostarczenie modelu, za pomocą którego można badać procesy patologiczne i strategie terapeutyczne związane z reakcjami alloimmunologicznymi w tętnicach i wynikającymi z nich zmianami tętniczymi, które przyczyniają się do niewydolności przeszczepu narządu.

Streszczenie

Odrzucenie naczyniowe, które prowadzi do miażdżycy przeszczepu (TA) jest główną reprezentacją przewlekłej niewydolności przeszczepu serca. W TA układ odpornościowy biorcy powoduje uszkodzenie ściany tętnicy oraz dysfunkcję komórek śródbłonka i komórek mięśni gładkich. Wywołuje to patologiczną reakcję naprawczą, która charakteryzuje się pogrubieniem błony wewnętrznej i okluzją światła. Zrozumienie mechanizmów, za pomocą których układ odpornościowy powoduje odrzucenie naczyń krwionośnych i TA, może pomóc w opracowaniu nowych sposobów radzenia sobie z niepowodzeniem przeszczepu. W tym miejscu opisujemy mysi model interpozycji aorty, który można wykorzystać do badania patogennych mechanizmów odrzucania naczyń i TA. Model polega na przeszczepieniu odcinka aorty od zwierzęcia dawcy do biorcy allogenicznego. Odrzucenie odcinka tętnicy wiąże się z reakcjami alloimmunologicznymi i powoduje zmiany tętnicze, które przypominają odrzucenie naczyniowe. Podstawowe podejście techniczne, które opisujemy, może być stosowane w przypadku różnych szczepów myszy i ukierunkowanych interwencji, aby odpowiedzieć na konkretne pytania związane z odrzuceniem naczyniowym i TA.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich 30+ lat, postęp w lekach immunosupresyjnych zmniejszył odrzucenie przeszczepu z powodu ostrego odrzucenia, ale przewlekłe odrzucenie pozostaje głównym wyzwaniem. Głównym objawem przewlekłego odrzucenia przeszczepu serca jest miażdżyca przeszczepu (TA) 1,2. Stan ten charakteryzuje się przerostem błony wewnętrznej i dysfunkcją naczynioruchową tętnic przeszczepu allogenicznego i rozwija się w wyniku immunologicznego ukierunkowania na komórki śródbłonka i mięśni gładkich przez układ odpornościowy biorcy. Specyficzne ukierunkowanie na unaczynienie przeszczepu spowodowane rozpoznaniem obcego peptydu i głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) jest podkreślone przez rozwój TA wyłącznie w tętnicach przeszczepu, oszczędzając naczynia gospodarza 3. Zgadza się z tym obserwacja, że TA nie występuje eksperymentalnie, gdy biorca jest genetycznie identyczny z dawcą lub gdy biorca nie ma limfocytów T i B 4. Uszkodzenie i dysfunkcja naczyń o podłożu immunologicznym powoduje rozwój pogrubienia i zwłóknienia błony wewnętrznej błony wewnętrznej, a także nieprawidłową akumulację lipidów i białek ECM w TA 5. Pogrubienie błony wewnętrznej ma tendencję do koncentrycznego występowania na całej długości drzewa tętniczego 4-6. Utrata i obumarcie przeszczepu zwykle występują w wyniku postępującego niedokrwienia wynikającego z niedrożności światła tętnic przeszczepu allogenicznego 4.

W 1991 roku Mennander et al. 7 opracowano pionierski model interpozycji aorty u szczurów do modelu TA. Kilka grup dostosowało następnie tę procedurę do stosowania u myszy. W tym modelu w segmentach aorty przeszczepu allogenicznego rozwijają się zmiany o cechach porównywalnych z TA obserwowanymi w przeszczepach klinicznych. Obejmuje to pogrubienie błony wewnętrznej charakteryzujące się nagromadzeniem komórek przypominających mięśnie gładkie i leukocytów biorcy 7. W ciągu ostatnich 2 dekad model ten został wykorzystany do uzyskania ważnych informacji na temat mechanizmów uszkodzenia naczyniowego, odrzucenia i TA. Może być używany do badania pytań związanych z odpowiedziami immunologicznymi i naczyniowymi podczas patologii tętnic. Wybór niezgodności antygenowej wpływa na zdolność do odpowiedniego odpowiedzenia na te pytania.

Transplantacja przez pełne bariery MHC pozwala na kompleksową ocenę odpowiedzi immunologicznych, o których wiadomo, że są zaangażowane w odrzucenie przeszczepu narządu. Obejmuje to bezpośrednie rozpoznawanie limfocytów T CD4 i CD8 i celowanie w obcy peptyd-MHC prezentowany przez komórki pochodzące z przeszczepu, pośrednie rozpoznawanie limfocytów T CD4 (i prawdopodobnie CD8) oraz celowanie w alloantyny pochodzące z przeszczepu prezentowane przez komórki prezentujące antygen biorcy oraz rozpoznawanie alloantygenów za pośrednictwem przeciwciał na powierzchniach komórek naczyniowych 8. Jednak odpowiedź naczyniowa na uraz w kompletnych eksperymentach z niedopasowaniem MHC może być inna niż obserwowana klinicznie. Johnson i wsp. 9 wykazało, że w przeszczepach międzypozycyjnych aorty przeszczepionych przez całkowitą barierę niedopasowania MHC, większość komórek neointimalnych pochodzi od biorcy, a nie od dawcy. Jest to różnica w porównaniu z obserwowaną w przypadku przeszczepów u ludzi, gdzie większość komórek mięśni gładkich błony wewnętrznej pochodzi od dawcy 9,10. Aby uwzględnić to ograniczenie, opracowano alternatywne modele eksperymentalne, które obejmują przeszczepianie przez drobne niezgodności tkankowe antygenów, które wywołują reakcje naczyniowe, które bardziej przypominają te obserwowane w przeszczepie klinicznym 11. Podczas gdy te alternatywne modele pozwalają na wyciągnięcie ważnych wniosków dotyczących odpowiedzi naczyniowych, które napędzają rozwój TA, procesy immunologiczne, które powodują odrzucenie naczyniowe w niewielkich niezgodnych przeszczepach antygenu zgodności tkankowej, nie powodują całkowitej rekapitulacji tych, które występują w warunkach klinicznych. Na przykład drobne antygeny zgodności tkankowej są słabo rozpoznawane przez przeciwciała reaktywne przeszczepu 12. Biorąc pod uwagę powyższe rozważania, ważne jest, aby wziąć pod uwagę kwestię patologiczną badaną przy wyborze rodzaju niedopasowania antygenu stosowanego w modelu interpozycji aorty. Tutaj opisujemy szczegółowy protokół przeszczepu interpozycji aorty mysiej aorty. Opisujemy szczepienie interpozycyjne między kompletnymi niedopasowanymi myszami MHC, ale ten sam protokół jest używany do szczepienia innych niedopasowanych antygenowo szczepów myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły w tym badaniu zostały przejrzane i zatwierdzone przez komisję etyczną ds. opieki nad zwierzętami Uniwersytetu Simona Frasera. Użyj myszy dawcy Balb/cYJ (H2d) i myszy biorcy C57Bl/6 (H2b) do zbadania reakcji allogenicznych. Myszy są wykorzystywane do eksperymentów w wieku od 8 do 12 tygodni. Użyj myszy żeńskiej lub męskiej. Kontrole syngeniczne składają się z odcinków aorty od dawców C57Bl/6 do biorców C57Bl/6.

1. Przygotowanie dawcy i biorcy

Uwaga: Zarówno dawca, jak i biorca są znieczuleni i przygotowani przed operacją, aby zminimalizować niedokrwienie przeszczepu. W protokole stosuje się środki znieczulające do wstrzykiwań, aby zapobiec niedrożności zwierzęcia przez sprzęt potrzebny do dostarczania wziewnych środków znieczulających. Jednak w razie potrzeby odpowiednią alternatywą jest wziewny środek znieczulający. Od pierwszego wstrzyknięcia środków znieczulających cała procedura trwa około 90 minut. Czas niedokrwienny przeszczepu wynosi mniej niż 30 minut.

  1. Znieczulić mysz wstrzyknięciami dootrzewnowymi ketaminy (100 mg/kg; 10 mg/ml) i ksylazyny (10 mg/kg; 1 mg/ml). Mysz zostanie uspokojona w ciągu 10 do 15 minut. Oceń głębokość znieczulenia, ściskając tłustą część poduszki stopy zwierzęcia. W razie potrzeby należy podawać 1/3 pierwotnej dawki koktajlu znieczulającego, aż zwierzę nie będzie wykazywać odruchu odstawienia. Uważnie monitoruj częstość oddechów po każdym podaniu koktajlu. Podczas zabiegu należy oceniać poziom znieczulenia co 15 minut, ściskając przednią ścianę brzucha parą kleszczy. Myszy powinny pozostać głęboko znieczulone przez 60 do 90 minut.
  2. Nasmaruj oczy myszy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.
  3. Gol włosy jak najbliżej skóry w brzusznej części brzucha od połowy klatki piersiowej do łona. Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie naciąć skóry. Nie używaj kremu do depilacji, ponieważ może on wchłonąć się w skórę i może mieć działanie zapalne.
  4. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na ręczniku nad stołem grzewczym lub podkładką.
  5. Oczyścić miejsce operacji wstępnym peelingiem z 2% chloroheksydyną. Przygotuj duży obszar roboczy, aby zmaksymalizować pole operacyjne. Rozpocznij szorowanie od środka pola operacyjnego i przesuwaj się na zewnątrz w sposób liniowy lub okrężny. Wyrzuć gazę. Powtórz tę procedurę jeszcze co najmniej 5 razy. Nałóż wacik nasączony alkoholem na ten sam obszar. Gdy alkohol wyschnie, przygotuj czyste miejsce roztworem Betadine i obłóż sterylną gazą.

2. Kompleksowa procedura zespolenia

  1. Operacja dawcy
    1. Utrzymuj technikę aseptyczną przez cały czas trwania operacji. Przed użyciem wyczyść wszystkie powierzchnie blatów i stołów chirurgicznych 0.5% przyspieszonym roztworem nadtlenku wodoru. Przed użyciem owinąć i autoklawować wszystkie narzędzia chirurgiczne, gazy, zasłony i fartuchy. Sprawdź sterylność narzędzi za pomocą paska wskaźnikowego sterylizatora parowego umieszczonego w każdym opakowaniu. Sterylne rękawice chirurgiczne są używane i utylizowane między operacjami. W przypadku wielu operacji sterylizuj narzędzia chirurgiczne między użyciami za pomocą sterylizatora z gorącymi szklanymi kulkami.
    2. Umieść mysz dawcę w pozycji leżącej na plecach na czystej, cienkiej desce z pleksiglasu owiniętej sterylną serwetą pod mikroskopem operacyjnym pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu 8-30X.
    3. Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia chirurgicznego, jak opisano w punkcie 1.1, należy przystąpić do zabiegu chirurgicznego.
    4. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj pojedyncze dolne podłużne nacięcie brzucha w linii środkowej, od łona do wyrostka ksylowego.
    5. Za pomocą małego retraktora otwórz ściany brzucha, aby odsłonić jamę.
    6. Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką delikatnie cofnij jelita górnie do lewej strony zwierzęcia i przykryj gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Przesuń narządy rozrodcze niżej i zlokalizuj aortę podnerkową i żyłę główną dolną (IVC). Okresowo zwilżać odsłonięte tkanki roztworem soli fizjologicznej.
    7. Za pomocą kleszczy medycznych nr 5 oddziel aortę od IVC, od poziomu lewej tętnicy nerkowej do rozwidlenia. Użyj nici monofilamentowych z poliamidu 10-0, aby podwiązać małe gałęzie w pobliżu aorty.
    8. Po oddzieleniu aorty dawcy od IVC nasącz naczynie solą fizjologiczną, przykryj odsłonięty ubytek zwilżoną gazą i odłóż dawcę na bok w sterylnym miejscu. Sprawdzaj stan dawcy (czynność układu oddechowego i sercowo-naczyniowego oraz głębokość znieczulenia) co 15 minut. Rozpocznij operację na biorcy, izolując aortę, jak opisano poniżej (kroki od 2.2.1 do 2.2.7).
    9. Po oddzieleniu aorty biorcy od IVC i odłożeniu na bok, należy zwrócić dawcę pod mikroskop. Zacisk krzyżowy (proksymalny i dystalny w stosunku do interesującego segmentu) aorty dawcy, w odległości około 5 mm od siebie, z dwoma zaciskami mikronaczyniowymi 4 mm.
    10. Za pomocą mikronożyczek Vannas-Tubingen wykonaj transekcję małego segmentu przeszczepu (o długości od 3 do 4 mm) aorty brzusznej.
    11. Za pomocą igły 25 G 5/8 dołączonej do strzykawki, przepłukać wyciętą aortę heparynizowanym (100 j./ml) roztworem soli fizjologicznej. Upewnij się, że końcówka igły nie styka się z naczyniem.
    12. Umieścić aortę w heparynizowanym (100 j./ml) roztworze soli fizjologicznej na lodzie i odstawić na bok. Będąc jeszcze w głębokim znieczuleniu, zwolnij zaciski mikronaczyniowe. Poddać dawcę eutanazji przez wykrwawienie.
    13. Wszczepić naczynie dawcze w ciągu 30 minut od wycięcia. Chociaż możliwe jest użycie jednego naczynia dawczego dla wielu biorców poprzez wycięcie większej długości aorty, czas niedokrwienia powinien być krótszy niż 30 minut.
  2. Operacja odbiorcy
    1. Zachowaj technikę aseptyczną przez cały czas trwania operacji, tak jak w przypadku operacji z dawcą.
    2. Umieść mysz odbiorcy w pozycji leżącej na cienkiej płycie z pleksiglasu owiniętej sterylną serwetą pod mikroskopem operacyjnym w powiększeniu 8-30X.
    3. Po zapewnieniu odpowiedniego znieczulenia należy przystąpić do zabiegu, gdy zwierzę nie wykazuje odruchu wycofania.
    4. Za pomocą sterylnych nożyczek wykonaj pojedyncze dolne podłużne nacięcie brzucha w linii środkowej, od łona do wyrostka ksylowego.
    5. Za pomocą małego retraktora otwórz ściany brzucha, aby odsłonić jamę.
    6. Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką delikatnie cofnij jelita górnie do lewej strony zwierzęcia i przykryj gazą zwilżoną roztworem soli fizjologicznej. Przesuń narządy rozrodcze niżej i zlokalizuj aortę podnerkową i IVC. Okresowo zwilżać odsłonięte tkanki roztworem soli fizjologicznej.
    7. Oddziel aortę od IVC, od poziomu lewej tętnicy nerkowej do rozwidlenia. W razie potrzeby użyj nici monofilamentowych z poliamidu 10-0, aby podwiązać małe gałęzie w pobliżu aorty.
    8. Zacisk krzyżowy (proksymalny i dystalny w stosunku do interesującego segmentu) aorty, w odległości około 5 mm od siebie, z dwoma zaciskami mikronaczyniowymi 4 mm.
    9. Za pomocą mikronożyczek Vannas-Tubingen wykonaj pojedynczą aortotomię poziomą i wyciąć mały segment (nie więcej niż 0,5 mm) aorty brzusznej, aby pomieścić przeszczep aorty dawcy.
    10. Przepłukać wyciętą aortę heparynizowanym (100 j./ml) roztworem soli fizjologicznej. Przeszczep aorty dawcy powinien mieć odpowiednią długość, aby połączyć przecięte końce aorty biorcy.
    11. Umieścić przeszczep aorty dawcy w pozycji ortotopowej i zestopić koniec przeszczepu dawcy z końcem biorcy, dopasowując odpowiednią orientację anatomiczną przeszczepu do orientacji biorcy.
    12. Delikatnie chwyć osłonkę zewnętrzną naczynia i lekko ją przetrzyj za pomocą kleszczy medycznych nr 5. Za pomocą kleszczy wbić igłę przymocowaną do nici monofilamentowej z poliamidu 10-0 przez całą grubość ściany naczynia w celu przymocowania przeszczepu aorty dawcy do wyciętego naczynia biorcy. Uważaj, aby otwór naczynia nie został zamknięty z powodu przypadkowego zszycia tylnej ścianki naczynia.
    13. W przypadku szwów ciągłych należy umieścić szwy odciągowe na godzinie 9 zarówno w górnym, jak i dolnym końcu przeszczepu. Zaczynając od górnego końca przeszczepu od godziny 3, zespolić wycięte końce za pomocą 2 szwów biegnących i przymocować szew do szwu podciągowego.
      1. Odwróć przeszczep i kontynuuj szew biegnący do grzbietowej części naczynia, spotykając się ze szwem początkowym. Zabezpiecz bez wywierania dużego nacisku na naczynie. Powtórzyć szycie dla dolnego zespolenia.
        Uwaga: Szwy przerywane rozpoczynają się w taki sam sposób jak szew ciągły, z wyjątkiem tego, że naczynie jest zespolene z trzema oddzielonymi szwami między szwami podciągowymi. Czas zespolenia wynosi zwykle 20 min.
    14. Po zakończeniu zespolenia zwolnij dystalny zacisk mikronaczyniowy, aby umożliwić przepływ krwi wstecznej i sprawdź, czy miejsca zespolenia nie przeciekają. Jeśli dojdzie do wycieku, natychmiast umieść szew, aby zamknąć uszkodzone miejsce. Jeśli w tych miejscach nie ma krwawienia, zwolnij proksymalny zacisk.
    15. Zbadaj przeszczep i sprawdź, czy nie ma niedrożności krwi w przeszczepie oraz w bliższej i dalszej części naczynia biorcy. Energiczny puls zarówno w naczyniu dawcy, jak i biorcy jest podstawową wskazówką, że krew przepływa swobodnie. Za pomocą kleszczy delikatnie chwyć jeden koniec szwów podciągowych i lekko pociągnij naczynie, aby sprawdzić tylną ścianę naczynia.
      Uwaga: Nie powinno być marszczenia ścianki naczynia na obu końcach miejsc zespolenia. Słaby przepływ krwi po zdjęciu klamer jest oznaką zakrzepicy.
    16. Za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką wciągnij jelita z powrotem do jamy brzusznej.
    17. Za pomocą uchwytu na igłę Castroviejo i kleszczyków Graefe zamknij ścianę brzucha za pomocą szwów polipropylenowych 5-0 za pomocą ciągłego szycia. Zamknij warstwę skóry tymi samymi szwami za pomocą zamknięcia podskórnego.
    18. Torbugesic (1 mg/kg) należy podać domięśniowo natychmiast po zakończeniu przeszczepu.
    19. Natychmiast podawać, w podanej kolejności, Atipamezol (1 mg/kg), ketoprofen (5 mg/kg) i podskórnie podgrzany roztwór Ringera z mleczanami.
    20. Bezpośrednio po zabiegu umieść myszy w ogrzewanej klatce pod kocem wodnym na noc (12 godzin). W okresie rekonwalescencji anestezjologicznej należy umieścić zwierzęta same w czystym, suchym, niezakłóconym miejscu. Wyłóż klatkę (w autoklawie) czystymi ręcznikami papierowymi i ustaw temperaturę koca wodnego na około 20 do 22 °C. Na podłodze klatki zapewnij suche i mokre krokiety ad libitum.
      Uwaga: Ważnym elementem opieki pooperacyjnej jest obserwacja zwierzęcia i odpowiednia interwencja, w razie potrzeby, podczas rekonwalescencji po znieczuleniu i operacji. Niezbędna intensywność monitorowania będzie różna w zależności od zwierzęcia i może być większa w okresie natychmiastowej rekonwalescencji anestezjologicznej w porównaniu z późniejszą rekonwalescencją pooperacyjną.
    21. Stale monitoruj zwierzęta poddane znieczuleniu, monitorowane do momentu całkowitego wyzdrowienia. Zwierzę musi być w stanie utrzymać samodzielne leżenie mostka i musi wydawać się spokojne i wolne od bólu, zanim będzie mogło zostać pozostawione bez opieki.
    22. Buprenorfinę (0,1 mg/kg mc. dwa razy na dobę) i ketoprofen (5 mg/kg mc. dwa razy na dobę) należy podawać przez trzy dni, oba podskórnie.
    23. Monitoruj czynność układu sercowo-naczyniowego i oddechowego, temperaturę ciała oraz ból lub dyskomfort pooperacyjny podczas rekonwalescencji po znieczuleniu przez co najmniej trzy dni. Może być wymagana dodatkowa opieka, taka jak podawanie leków przeciwbólowych i innych leków oraz płynów pozajelitowych w celu zminimalizowania odwodnienia i utraty elektrolitów.
    24. Oceń powodzenie operacji przeszczepu, obserwując funkcję motoryczną kończyn tylnych. Całkowite powodzenie przeszczepu wiąże się z niezakłóconym przepływem krwi do tylnej kończyny i ogona, który powinien nastąpić natychmiast po wyzdrowieniu zwierzęcia i całkowitym wyzdrowieniu bez paraliżu kończyn tylnych na drugi dzień

3. Pobieranie tkanek

Uwaga: Wstępnie określone punkty końcowe wahają się od 3 do 60 dni w zależności od rodzaju pożądanej analizy i charakteru niedopasowania antygenu. Ogólnie rzecz biorąc, pogrubienie błony wewnętrznej jest silne w 30 dniu po przeszczepie w kompletnych niedopasowanych szczepach myszy MHC.

  1. Znieczulić mysz wstrzyknięciami dootrzewnowymi ketaminy (100 mg/kg; 10 mg/ml) i ksylazyny (10 mg/kg; 1 mg/ml). Oceń głębokość znieczulenia, ściskając tłustą część poduszki stopy zwierzęcia. Kontynuuj operację, gdy zwierzę nie wykazuje odruchu wycofania.
  2. Oczyść miejsce operacji wodą, a na koniec zalać 70% alkoholem.
  3. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach na tacy wyłożonej wkładką chłonną.
  4. Otwórz jamę brzuszną z dużym podłużnym nacięciem w linii środkowej. Umieść retraktor samozabezpieczający, aby odsłonić jamę, IVC i aortę brzuszną.
  5. Delikatnie oddziel przeszczepiony odcinek aorty dawcy od sąsiedniego IVC za pomocą pary kleszczy medycznych nr 5. Należy szczególnie uważać, aby nie usunąć przydanki z przeszczepionego naczynia.
  6. Odsłoń klatkę piersiową, przecinając żebra po obu stronach kręgosłupa piersiowego aż do wlotu klatki piersiowej. Odbij przednią ścianę klatki piersiowej wyżej, aby odsłonić osierdzie i zabezpieczyć klatkę piersiową parą hemostatów.
  7. Po odsłonięciu serca wprowadzić igłę 5/8 o strzykawce o sile 25 g (dołączoną do strzykawki) do lewej komory i przepłukać 0,1 ml heparynizowanego (100 U/ml) roztworu soli fizjologicznej.
  8. Za pomocą nożyczek usuń prawy przedsionek, aby krew, heparynizowana sól fizjologiczna i utrwalacz mogły opuścić ciało podczas perfuzji. Przeprowadzić perfuzję zwierzęcia z 5 ml 4% paraformaldehydu lub do momentu, gdy płyn będzie klarowny. Usuń serce, aby zapewnić eutanazję.
  9. Wyciąć przeszczepiony segment naczynia i zanurzyć w 4% paraformaldehydzie na nie dłużej niż jedną godzinę. Ustaw przeszczepione naczynie w matrycy OCT (optymalna temperatura cięcia) i błyskawicznie zamroź. Przeciąć naczynie pod kriostatem ustawionym na grubość 8 μm. Wybarwienia skrawków za pomocą Haematoxyliny i Eozyny i/lub elastycznego barwnika Verhoeffa-van Giesona (van Giesona).

4. Analiza morfologiczna przeszczepów

Uwaga: TA charakteryzuje się pogrubieniem błony wewnętrznej 13. W tym modelu pogrubienie błony wewnętrznej i wynikające z tego zmniejszenie rozmiaru światła odzwierciedlają nasilenie uszkodzenia naczyń o podłożu immunologicznym. Kontrole syngraftu służą do określenia wyjściowej charakterystyki naczyń przy braku allogenicznych odpowiedzi immunologicznych. Kontrole te pozwalają również na ocenę uszkodzenia tętnic, do którego dochodzi w wyniku zabiegu chirurgicznego. W synprzeszczepach nie powinno być pogrubienia błony wewnętrznej.

  1. Aby zbadać pogrubienie błony wewnętrznej i okluzję światła, zmierz obszar w warstwie komórek śródbłonka, wewnętrznej elastycznej blaszki (IEL) i zewnętrznej elastycznej blaszki (EEL) na elastycznych wybarwionych odcinkach tętnic van Giesona za pomocą oprogramowania do analizy obrazu. Poniższe parametry można wykorzystać do wyznaczenia zmian tętniczych odzwierciedlających TA.
    1. Zmierz bezwzględną powierzchnię wewnętrzną: obszar w wewnętrznej blaszce elastycznej - obszar w warstwie komórek śródbłonka. Zapewnia to absolutny pomiar ekspansji wewnętrznej, która jest znakiem rozpoznawczym TA.
    2. Zmierz bezwzględną powierzchnię przyśrodkową: obszar w obrębie zewnętrznej blaszki elastycznej - obszar w wewnętrznej blaszce elastycznej. Zapewnia to bezwzględny pomiar degradacji lub wzrostu przyśrodkowego, który czasami może wystąpić w wyniku zmian w tym regionie ściany naczynia za pośrednictwem układu odpornościowego.
    3. Zmierz całkowitą powierzchnię naczynia jako powierzchnię wewnątrz zewnętrznej blaszki elastycznej. Zapewnia to pomiar przebudowy naczynia, która polega na rozszerzeniu lub zwężeniu tętnicy w wyniku uszkodzenia immunologicznego.
    4. Zmierz błonę wewnętrzną/Media: (obszar w wewnętrznej blaszce elastycznej – obszar w warstwie komórek śródbłonka) / (obszar w obrębie zewnętrznej blaszki elastycznej – obszar w wewnętrznej blaszce elastycznej). Zapewnia to względną miarę rozszerzania się błony wewnętrznej i normalizuje się pod kątem różnic w wielkości naczynia.
    5. Zmierz % zwężenia światła: [ (obszar w wewnętrznej blaszce elastycznej – obszar w warstwie komórek śródbłonka) / obszar z wewnętrzną elastyczną blaszką) ]*100. Stanowi to miarę zakresu okluzji światła, która wynika z połączenia rozszerzania się błony wewnętrznej i przebudowy (do wewnątrz lub na zewnątrz) ściany naczynia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym modelu aorta brzuszna myszy Balb/cYJ jest wszczepiana do aorty podnerkowej biorcy C57Bl/6. Pozwala to na kompleksową ocenę odpowiedzi alloimmunologicznych skierowanych przeciwko tętnicom allograftu. Immunologicznie zapośredniczone uszkodzenie naczyniowe w tym modelu inicjuje reakcje naprawcze naczyń, które kończą się pogrubieniem intimy, zwężeniem światła naczynia i rekrutacją komórek odpornościowych (Ryc. 1 i 2). Kryteria te służą następnie jako wskaźnik nasilenia odpowiedzi alloi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisaliśmy protokół przeszczepu interpozycji aorty u myszy, który jest przydatny do badania odrzucenia naczyń krwionośnych za pośrednictwem układu odpornościowego i TA. Model ten może być wykorzystany do zbadania przyczyn TA, a także do opracowania nowych strategii terapeutycznych. Był używany w przeszłości w celu ustalenia istotnej roli odporności adaptacyjnej, odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T, odpowiedzi efektorowych limfocytów T CD4 za pośrednictwem cytokin oraz uszkodzeń przeszczepu za pośrednictwem przeciwcia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem oraz Fundacji Serca i Udaru Mózgu BC & Yukon (JCC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
C57BL/6J (H-2b)Jackson Laboratories, Bar Harbour MEStrain# 000664
Balb/cBYJJackson Laboratories, Bar Harbour MEStrain# 001026
Chlorowodorek ketaminy do wstrzykiwań USP 100 mg/mlKetaleanDIN 00612316
Ksylazyna do wstrzykiwań 20 mg/mlRompumDIN 02169592
Ketoprofen do wstrzykiwań 100 mg/mlAnafenDIN 01938126
Winian butorfanolu  iniekcja 10 mg/mlTorbugesicDIN 008450000
Buprenorfina do wstrzykiwań 0,3 mg/mlReckitt BenckiserB.N. 5241
Chlorowodorek atypamezolu sterylny roztwór do wstrzykiwańAntisedanDIN 02237744
Heparyna do wstrzykiwań sodu, USP, 1,000 jednostek/mlMcKesson DystrybucjaDIN 02264315
Maść okulistyczna Tears naturaleAlconDIN 02082519
LeicaM80
0,9% chlorek sodu, sterylnyBaxter Corporation
Lactated Ringer' s roztwór, sterylnyBaxter Corporation
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań, sterylny, 10 mlBaxter Corporation
Alkoholowe podkładki przygotowawczeLoris
Powidon JodBetadina
Glukonian chloroheksydyny 4% w/vGermi-Stat
monofilament poliamidowyAROSurgical NarzędziaT4A10Q07
Szew, szew 10-0, 70 mikronówCorporation
Niebieski szew monofilamentowy 5-0, igła P3Ethicon8698G
1 ml StrzykawkaBDREF 309659
10 ml StrzykawkaBDREF 309604
1cc TB strzykawka insulinowa 28 G 1/2BDREF 309309
25 G 7/8, igła podskórnaBDREF 305124
27 G 1/2, igła podskórnaBDREF 305109
Zwijacz Colibri - 1,5 cm rozstaw 4 cmFine Science Tools17000-04
S& T CAF-4 Szczypce do nakładania klipsów, bez zamkaFine Science Tools00072-14
Kleszcze Supergrip, S& TFine Science Tools00632-11
Kleszcze medyczne nr 5Narzędzia do nauki pięknej11253-20
Nożyczki dla niemowląt LexerFine Science Tools14078-10
Kleszcze Micro Adson ząbkowaneFine Science Tools11018-12
Mikronożyczki Vannas-TubingenFine Science Tools15003-08
Mikrozaciski, b-1; 3,5mm x 1mm; Długość 7mmFine Science Tools00396-01
Kleszcze Graefe, 10cm 1x2 zębyFine Science Tools11054-10
Castroviejo z zamkiem i szczękami wolframowymiFine Science Tools12565-14
Sterylizator do gorących szklanych kulekInotech 250IS-250 - Steri-250
Gazy włókninoweProgene
z końcówką bawełnianą AplikatoryPuritan
Trymer do brodyWahl
Poduszka grzewczaSunbeam
Mikroskop stereoskopowy

Bibliografia

  1. Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
  2. Foegh, M. L. Chronic rejection--graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
  3. Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
  4. Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
  5. Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
  6. Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
  7. Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
  8. Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
  9. Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
  10. Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
  11. Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
  12. Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
  13. Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
  14. Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
  15. Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
  16. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
  17. Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
  18. Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
  19. Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
  20. Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
  21. Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
  22. Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
  23. Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
  24. Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
  25. Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Interpozycja aortyreakcje alloimmunologicznepogrubienie intimyzw enie wiat aanaliza immunohistochemicznatechnika mikrochirurgicznaprzeszczep aorty mysiejakumulacja kom rek odporno ciowych

Powiązane artykuły