Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Szczepionki są jednym z największych osiągnięć ludzkości i uratowały miliony istnień ludzkich w ciągu ostatniego stulecia. Paradoksalnie, niewiele wiadomo o mechanizmach fizjologicznych, które pośredniczą w odpowiedziach immunologicznych na szczepionki, być może ze względu na ogólny sukces szczepień, który zmniejszył zainteresowanie molekularnymi i fizjologicznymi mechanizmami odporności poszczepiennej. Jednak kilka ważnych patogenów ludzkich, w tym wirus grypy, nadal stanowi wyzwanie dla szczepień i może przynieść korzyści dzięki strategiom opartym na odporności.
Chociaż genetyka odwrócona grypy została z powodzeniem zastosowana do generowania żywych atenuowanych szczepionek przeciw grypie (LAIV), dodanie narzędzi molekularnych do preparatów szczepionkowych, takich jak składniki znacznikowe, aby śledzić kinetykę szczepień in vivo, nie zostało rozwiązane. Ponadto najnowsza generacja modeli mysich, które umożliwiają specyficzne zubożenie leukocytów podczas badań kinetycznych, otworzyła okno możliwości zrozumienia podstawowych mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw ochrony wywołanej szczepionką. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób połączenie genetyki odwrotnej i chimerycznych modeli myszy może pomóc w dostarczeniu nowych informacji na temat działania szczepionek na poziomie fizjologicznym i molekularnym, na przykładzie rekombinowanej, przystosowanej do zimna, żywej atenuowanej szczepionki przeciw grypie (LAIV). Wykorzystaliśmy wygenerowane laboratoryjnie LAIV zawierające znaczniki komórek, a także konkurencyjne chimery szpiku kostnego (BMC), aby określić wczesną kinetykę odporności szczepionkowej i główne mechanizmy fizjologiczne odpowiedzialne za inicjację odporności adaptacyjnej specyficznej dla szczepionki. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób technika ta może ułatwić badania funkcji genów u pojedynczych zwierząt podczas odpowiedzi immunologicznej na szczepionki. Proponujemy, aby technika ta mogła być zastosowana w celu ulepszenia obecnych strategii profilaktycznych przeciwko patogenom, w przypadku których potrzebne są pilne medyczne środki zaradcze, na przykład grypa, HIV, Plasmodium i wirusy gorączki krwotocznej, takie jak wirus Ebola.
Wprowadzenie
Generowanie pamięci immunologicznej przy braku choroby jest fizjologiczną podstawą skutecznego szczepienia1. Ostatnio podejścia oparte na biologii systemowej ujawniły, że skuteczne szczepionki, takie jak szczepionka przeciwko żółtej febrze, indukują silną indukcję wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i aktywację kilku podzbiorów komórek dendrytycznych (DC), co z kolei prowadzi do wieloliniowej aktywacji limfocytów T specyficznych dla antygenu2,3. Ponieważ DC są jedyną populacją komórek odpornościowych zdolną do aktywacji naiwnych limfocytów Tspecyficznych dla antygenu 4, badanie ich funkcji podczas szczepienia ma kluczowe znaczenie dla....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i zgodnie z wytycznymi niemieckiego prawa o ochronie zwierząt. Wszyscy pracownicy przeprowadzający doświadczenia na zwierzętach przeszli programy szkoleniowe zgodnie z kategorią B lub C Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych.
1. Wytwarzanie rekombinowanych, żywych atenuowanych szczepionek przeciw grypie metodą genetyki odwrotnej
UWAGA: Szczegółowy protokół generowania rekombinowanych wirusów grypy metodą odwrotnej genetyki został opisany w poprzednich badaniach5 i wykracza poza zakres t....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Generowanie rekombinowanych atenuowanych szczepionek przeciw grypie można osiągnąć poprzez transfekcję plazmidów kodujących osiem segmentów wirusa grypy pod kontrolą promotorów bidirekcjonalnych5. Szczepionka przeciw grypie przystosowana do niskich temperatur zazwyczaj zawiera sześć segmentów szczepu zimnoadaptowanego oraz HA i NA wybranego szczepu grypy (np. H1N1) (Ryc. 1A). Zasada zimnej adaptacji opiera się na ograniczonej replikacji wirusa w temperaturze 33 °C, która jest temperat.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym badaniu opisujemy, w jaki sposób genetyka odwrotna i chimeryczne modele myszy mogą być wykorzystane do wyjaśnienia fizjologicznych i molekularnych mechanizmów odporności wywołanej szczepionką. Genetyka odwrotna grypy została ustalona w wielu laboratoriach i odegrała główną rolę w zrozumieniu patogenezy, replikacji i transmisji grypy17. Kluczowym punktem naszego protokołu jest uratowanie szczepionek przeciw grypie przystosowanych do zimna, wykazujących ekspresję obcych epitopów. Chociaż strategia wprowadz.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Sergio Gómez-Medinie za doskonałe wsparcie techniczne przy eksperymentach na myszach. Prace te były wspierane przez fundusze Stowarzyszenia Leibniza i Centrum Infekcji Leibniza. A.L. jest stypendystką Leibniz Graduate School.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dulbecco´ s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM 1x) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| OptiMEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofektamina 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Jaja zarodkowe | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1x) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μ M Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Bufor lizujący czerwone krwinki (RBCL) 10x | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mysz BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-Mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-Mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-Mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-Mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-Mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anty-mysz CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anty-mysz CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Barwnik proliferacyjny | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2,5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymetylosulfotlenek (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Albumina jaja kurzego | Sondy molekularne | O23020 | |
| Toksyna dyfteryjna (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsyna-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Cytometr | przepływowy BD Biosciences | ||
| Oprogramowanie do analizy komórek FlowJo 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Niebieska plama trypanowa (0,4%) | Life technologies | T10282 | |
| Hrabina Automatyczny licznik komórek | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
Bibliografia
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Tagi
Donosowe podawanie szczepionkiżywa atenuowana szczepionka przeciw grypiegenetyka odwrotnakonkurencyjna chimera szpiku kostnegoanaliza cytometrycznamigracja komórek dendrytycznychproliferacja limfocytów T CD8amplifikacja wirusa w zarodkach kurzychizolacja komórek węzłów chłonnychdeplecja szpiku kostnego
