Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52803

⸱

25 czerwca 2015

 ,  ,  , 
1Laboratory of Emerging Viruses, Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology

W tym artykule

Podsumowanie

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Streszczenie

Szczepionki są jednym z największych osiągnięć ludzkości i uratowały miliony istnień ludzkich w ciągu ostatniego stulecia. Paradoksalnie, niewiele wiadomo o mechanizmach fizjologicznych, które pośredniczą w odpowiedziach immunologicznych na szczepionki, być może ze względu na ogólny sukces szczepień, który zmniejszył zainteresowanie molekularnymi i fizjologicznymi mechanizmami odporności poszczepiennej. Jednak kilka ważnych patogenów ludzkich, w tym wirus grypy, nadal stanowi wyzwanie dla szczepień i może przynieść korzyści dzięki strategiom opartym na odporności.

Chociaż genetyka odwrócona grypy została z powodzeniem zastosowana do generowania żywych atenuowanych szczepionek przeciw grypie (LAIV), dodanie narzędzi molekularnych do preparatów szczepionkowych, takich jak składniki znacznikowe, aby śledzić kinetykę szczepień in vivo, nie zostało rozwiązane. Ponadto najnowsza generacja modeli mysich, które umożliwiają specyficzne zubożenie leukocytów podczas badań kinetycznych, otworzyła okno możliwości zrozumienia podstawowych mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw ochrony wywołanej szczepionką. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób połączenie genetyki odwrotnej i chimerycznych modeli myszy może pomóc w dostarczeniu nowych informacji na temat działania szczepionek na poziomie fizjologicznym i molekularnym, na przykładzie rekombinowanej, przystosowanej do zimna, żywej atenuowanej szczepionki przeciw grypie (LAIV). Wykorzystaliśmy wygenerowane laboratoryjnie LAIV zawierające znaczniki komórek, a także konkurencyjne chimery szpiku kostnego (BMC), aby określić wczesną kinetykę odporności szczepionkowej i główne mechanizmy fizjologiczne odpowiedzialne za inicjację odporności adaptacyjnej specyficznej dla szczepionki. Ponadto pokazujemy, w jaki sposób technika ta może ułatwić badania funkcji genów u pojedynczych zwierząt podczas odpowiedzi immunologicznej na szczepionki. Proponujemy, aby technika ta mogła być zastosowana w celu ulepszenia obecnych strategii profilaktycznych przeciwko patogenom, w przypadku których potrzebne są pilne medyczne środki zaradcze, na przykład grypa, HIV, Plasmodium i wirusy gorączki krwotocznej, takie jak wirus Ebola.

Wprowadzenie

Generowanie pamięci immunologicznej przy braku choroby jest fizjologiczną podstawą skutecznego szczepienia1. Ostatnio podejścia oparte na biologii systemowej ujawniły, że skuteczne szczepionki, takie jak szczepionka przeciwko żółtej febrze, indukują silną indukcję wrodzonej odpowiedzi immunologicznej i aktywację kilku podzbiorów komórek dendrytycznych (DC), co z kolei prowadzi do wieloliniowej aktywacji limfocytów T specyficznych dla antygenu2,3. Ponieważ DC są jedyną populacją komórek odpornościowych zdolną do aktywacji naiwnych limfocytów Tspecyficznych dla antygenu 4, badanie ich funkcji podczas szczepienia ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia odpowiedzi immunologicznej na szczepionki i zaprojektowania przyszłych strategii przeciwko trudnym patogenom.

System pozwalający na śledzenie różnych podzbiorów DC podczas odpowiedzi immunologicznej na szczepionki byłby pożądany w celu ustalenia dokładnej kinetyki migracji DC do tkanek limfoidalnych, a tym samym zapewnienia wglądu w mechanizmy fizjologiczne odpowiedzialne za inicjację specyficznej dla szczepionki odporności adaptacyjnej. Podejścia oparte na odwróconej genetyce dają możliwość generowania zmodyfikowanych, żywych atenuowanych szczepionek, które mogą być stosowane eksperymentalnie w tym celu. Od czasu jej wdrożenia w badaniach nad grypą, genetyka odwrotna oparta na plazmidzie jest szeroko stosowana do generowania rekombinowanych szczepów grypy, w tym LAIV. Standardowe protokoły ratowania rekombinowanych wirusów grypy wymagają wielokrotnej transfekcji wysoce transfekcyjnych linii komórkowych z plazmidami ambisense (wytwarzającymi zarówno dodatnie, jak i ujemne RNA) zawierających osiem segmentów wirusa grypy, a także amplifikacji w systemie permisywnym, takim jak komórki nerki psów Madin-Darby (MDCK) i/lub jaja zarodkowe kurczaka5. Jednak zastosowanie genetyki odwrotnej do generowania narzędzi molekularnych w celu badania mechanizmów immunologicznych szczepień pozostaje niezbadane.

Generowanie nowych modeli mysich pozwalających na specyficzne zubożenie podzbiorów komórek odpornościowych, w tym DC, otworzyło nowe możliwości zrozumienia podstawowych mechanizmów immunologicznych leżących u podstaw ochrony wywołanej przez szczepionkę. Porównanie funkcji podzbioru DC u myszy i ludzi ujawniło, że w dużym stopniu mysie i ludzkie DC są funkcjonalnie homologiczne6,7, odkrycia te silnie sugerują, że rozwój modeli mysich pozwalających na specyficzne zubożenie DC w stanie stacjonarnym i podczas stanów zapalnych może służyć do zrozumienia fizjologii odpowiedzi DC u ludzi. W ostatnich latach wygenerowano szereg modeli mysich przenoszących transgeny wyrażające receptor małpiej toksyny błoniczej (DT) (DTR) pod kontrolą regionu promotorowego genu będącego przedmiotem zainteresowania8,9. Ponieważ tkanki myszy nie wykazują naturalnej ekspresji DTR, modele te pozwalają na warunkowe zubożenie podzbiorów komórek przenoszących docelowy gen będący przedmiotem zainteresowania po inokulacji myszy DT. W ten sposób nasza zdolność do zubożenia określonych DC i innych leukocytów in vivo podczas procesów fizjologicznych została znacznie zwiększona przez rozwój ro na bazie DTR. Jednakże, podczas gdy te transgeniczne modele myszy były szeroko wykorzystywane do zrozumienia ontogenezy układu odpornościowego, ich zastosowanie do opracowywania szczepionek zostało prawie nie przetestowane. Tutaj, łącząc genetykę odwróconej grypy i konkurencyjne chimery szpiku kostnego oparte na DTR, proponujemy metodę badania kinetyki odporności poszczepiennej, a także funkcji poszczególnych genów podczas odpowiedzi immunologicznej na szczepionki in vivo. Zastosowanie tej technologii do przedklinicznej oceny nowych szczepionek przeciwko trudnym chorobom zakaźnym może pomóc w racjonalizacji projektowania szczepionek i testowaniu kandydatów na szczepionki in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i zgodnie z wytycznymi niemieckiego prawa o ochronie zwierząt. Wszyscy pracownicy przeprowadzający doświadczenia na zwierzętach przeszli programy szkoleniowe zgodnie z kategorią B lub C Federacji Europejskich Stowarzyszeń Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych.

1. Wytwarzanie rekombinowanych, żywych atenuowanych szczepionek przeciw grypie metodą genetyki odwrotnej

UWAGA: Szczegółowy protokół generowania rekombinowanych wirusów grypy metodą odwrotnej genetyki został opisany w poprzednich badaniach5 i wykracza poza zakres tego raportu. Krótko mówiąc, ratowanie szczepionek przeciw grypie przystosowanych do przeziębienia (CAV) odbywa się w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II przy poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2) i obejmuje kroki opisane poniżej. Protokół transfekcji i infekcji jest zgodny z protokołem Martineza-Sobrido i wsp. Rozdział 5.

  1. Wygeneruj reasortant, przystosowaną do zimna szczepionkę przeciw grypie, używając jako tła przystosowanego do zimna szczepu A/Ann Arbor/6/60 (H2N2), a także hemaglutyniny (HA) i zmodyfikowanej neuraminidazy (NA) szczepu A/PR/8/34 (H1N1) (Figura 1A). Modyfikacja genu NA polega na zastąpieniu przez PCR konserwatywnej sekwencji w łodydze białka (reszty od 65 do 72) krótką sekwencją cDNA kodującą peptyd SIINFEKL pochodzący z albuminy jaja kurzego (OVA) (Figura 1B). Peptyd SIINFEKL jest peptydem wysoce dominującym immunologicznie w kontekście ograniczonej odpowiedzi H-2b MHC klasy I myszy C57BL / 612.
  2. Płytka 106 komórek 293T na studzienkę w płytkach 6-dołkowych przy użyciu DMEM 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) uzupełnionej 1% penicyliną/streptomycyną (P/E).
  3. Przygotować mieszaninę transfekcji plazmidów: Dodać 1 μg każdego z plazmidów kodujących cDNA dla PB2, PB1, PA, NP, M, NS ze szczepu grypy A/Ann Arbor/6/60 i 1 μg plazmidów kodujących NA-SIINFEKL i HA z grypy A/PR/8/34. Dodać wstępnie podgrzany OptiMEM (15 μl, aby uzyskać końcową objętość 100 μl/dołek).
  4. Inkubować mieszankę transfekcyjną przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać 100 μl mieszanki transfekcyjnej/studzienki i inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Zmień pożywkę komórkową za pomocą DMEM 0,3% BSA, 1% P/E w temperaturze 33 °C i 5% CO2 przez 5 godzin.
  7. Dodać 106 komórek MDCK przepuszczających grypę do DMSO zawierających 1 μg/ml trypsyny z trzustki bydła traktowanej ketonem L-1-tozyloamido-2-fenyloetylochlorometylowym (TPCK-trypsyna). Utrzymuj kokultury 293T-MDCK przez 2 - 3 dni w temperaturze 33 °C i 5% CO2 .
  8. Zebrać supernatanty z kokultur komórkowych MDCK-293T i oczyścić przez odwirowanie przy 260 x g przez 5 min.
  9. Zaszczepić 9-10 jednodniowych jaj zarodków kurzych w sterylnych warunkach. Aby to zrobić, zrób otwór na wierzchu skorupki jajka, jak wskazano Martinez-Sobrido i wsp. Rozdział 5.
  10. Przykryj skorupkę jajka roztopionym woskiem za pomocą bawełnianego wacika i inkubuj zaszczepione jaja kurze przez 3 dni w temperaturze 33 °C.
  11. Zbierz płyn omoczniowy z zakażonych zarodków jajowych: Umyj skorupki jaj 70% etanolem. Otwórz jajko z bardzo delikatnym pęknięciem w górnej części i usuń błonę omocznikową za pomocą sterylnych kleszczyków. Użyj pipety o pojemności 10 ml, aby zebrać jak najwięcej płynu (zwykle 6-10 ml). Wirować przy 260 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przenieść oczyszczony płyn omoczniowy do nowych probówek.

2. Śledzenie odporności specyficznej dla szczepionki

  1. Śledzenie komórek dendrytycznych zawierających peptydy (DC)
    1. W przypadku szczepienia myszy należy znieczulić myszy 5% izofluranem w tlenie za pomocą precyzyjnego waporyzatora. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl podać 50 μl PBS zawierającego 103 jednostek tworzących blaszkę miażdżycową (pfu) szczepionki wykazującej ekspresję peptydu SIINFEKL za pośrednictwem kropelek bezpośrednio do nozdrzy myszy.
    2. Trzy dni po szczepieniu należy poddać myszy eutanazji w znieczuleniu izofluranem, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.
    3. Podnieś skórę myszy na linii środkowej tuż pod klatką piersiową za pomocą kleszczy i wytnij małe nacięcie przez skórę nożyczkami. Od miejsca nacięcia wykonaj nacięcie o długości 3 - 5 cm przez skórę w kierunku głowy i ogona, a następnie dwa nacięcia o długości 2 cm od linii środkowej z boku od każdego końca. Złuszcz skórę, aby odsłonić jamy otrzewnej i klatki piersiowej. Ostrożnie przeciąć błony otaczające otrzewną, aby odsłonić klatkę piersiową.
    4. Aby uzyskać dostęp do śródpiersia, przetnij przebicie i dolną część żebra klatki. Znajdź i usuń 2 węzły chłonne śródpiersia (mLN), lekko grzbietowe i bocznie przylegające do grasicy, przyśrodkowo przylegające do tętnicy ramienno-głowowej, w pobliżu brzusznej strony tchawicy.
    5. Aby zebrać mLN, użyj zakrzywionych kleszczy. Umieść kleszcze pod węzłami chłonnymi i delikatnie je podciągnij. Umieść węzły chłonne w 6-dołkowej płytce zawierającej 1 ml DMEM i usuń tkankę łączną lub tłuszczową otaczającą węzeł.
      1. Dokładnie przetrzeć każdą próbkę za pomocą dwóch igieł o masie 26 g dołączonych do strzykawek o pojemności 1 ml. Aby drażnić węzeł chłonny, przytrzymaj go jedną igłą, jednocześnie otwierając węzeł chłonny drugą igłą. Gdy zostanie to zrobione prawidłowo, w pożywce łatwo można zaobserwować skoncentrowane komórki pękające z węzła chłonnego. Przepuść cały materiał tkankowy przez filtr nylonowy o grubości 70 μm, aby uzyskać zawiesiny jednokomórkowe.
    6. Odwirować zawiesiny jednokomórkowe przez 10 minut przy 260 x g w wirówce z chłodzeniem. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (RBCL) w celu lizy czerwonych krwinek. Pozwól lizie postępować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    7. Zneutralizować bufor RBCL poprzez odwirowanie i ponowne zawieszenie komórek w 2 ml lodowatego PBS.
    8. Komórki płytki w 96-dołkowych płytkach w kształcie litery U o stężeniu10-7 komórek/ml w końcowej objętości 100 μl.
    9. Do analizy cytometrii przepływowej należy zablokować receptory Fc komórek za pomocą 1 μg przeciwciał anty-mysich CD16 / CD32 na 106 komórek przez 15 minut na lodzie.
    10. Odwirować płytki i odrzucić supernatanty przez trzebanie płytki. Inkubować poszczególne dołki z wybraną kombinacją przeciwciał powierzchniowych. Zazwyczaj do wykrywania komórek dendrytycznych w węzłach chłonnych koktajl przeciwciał powinien zawierać: 0,25 μg anty-CD11c, 0,25 μg CD11b, 0,5 μg MHC klasy II, 0,25 μg CD103 i 0,15 μg CD8α w końcowej objętości 100 μl.
    11. W przypadku ujemnego bramkowania dodaj 0,25 μg anty-CD3, CD19, NK1.1 lub koktajlu linii (Figura 2A). Alternatywne strategie bramkowania, a także protokoły prawidłowej kompensacji wielu barwników fluorescencyjnych można znaleźć na stronie internetowej Projektu Genomu Immunologicznego. Oprócz wybranych markerów powierzchniowych dodać do koktajlu 1 μg przeciwciała przeciwko H-2Kb związanemu z produktem SIINFEKL. To komercyjnie dostępne przeciwciało pozwoli na wizualizację DC, w których peptyd SIINFEKL jest związany z powierzchniowym MHC klasy I.
    12. Inkubować komórki z przeciwciałami powierzchniowymi przez 30 minut na lodzie. Chroń płytę przed światłem. Odwirować płytki o masie 260 x g przez 5 minut i dwukrotnie przemyć 2 ml PBS. Przenieś komórki do probówek do cytometrii przepływowej w celu analizy.
  2. Ocena proliferacji limfocytów T specyficznych dla szczepionki
    1. Uzyskać limfocyty T dawcy od dostępnych na rynku myszy transgenicznych TCR (myszy OT-I) (C57BL / 6-Tg (Tcr aTcrb) 1100Mjb / J), w których wszystkie wygenerowane limfocyty T CD8 są specyficzne dla peptydu SIINFEKL. Eutanazja myszy w znieczuleniu izofluranem, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Zbierz śledzionę, wykonując nacięcie w jamie brzusznej. Umieść śledzionę w 2 ml DMEM/śledziony i usuń tkankę łączną i tłuszczową.
    2. Wytworzyć zawiesiny jednokomórkowe ze śledziony zgodnie z procedurą opisaną w ppkt 2.1.2 i 2.1.3.
    3. Aby jeszcze bardziej wzbogacić zawiesinę pojedynczych komórek na limfocytach T, należy zastosować protokoły separacji kulek magnetycznych przy użyciu procedur selekcji pozytywnej lub negatywnej12. Aby odróżnić komórki dawcy od biorcy, użyj myszy kongenicznych, tak aby na przykład myszy biorcy wyrażały marker leukocytów CD45.1, podczas gdy limfocyty T dawcy wyrażały CD45.212.
    4. W celu znakowania limfocytów T inkubować je w 1 ml PBS zawierającym 5 μM estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE) w optymalnej gęstości komórek 5 x 106 komórek/ml. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc je przed ekspozycją na światło. Po inkubacji odwirować komórki w stężeniu 260 x g przez 5 minut, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 3 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w celu zneutralizowania CFSE.
    5. Odwirować komórki przy 260 x g przez 10 minut i ponownie zawiesić w odpowiedniej objętości PBS, tak aby 100 μl roztworu zawierało 2 x 106 komórek. Podaj biorcom myszy kongenicznych 2 x 106 komórek / mysz poprzez wstrzyknięcie do zatoki zaoczodołowej13.
    6. Eutanazja myszy biorcy w 3, 4 i 5 dniu po szczepieniu za pomocą znieczulenia izofluranem, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Pobrać węzły chłonne śródpiersia i przygotować zawiesiny pojedynczych komórek do cytometrii przepływowej, jak wskazano w pkt 2.1.2-2.1.5.
    7. Zidentyfikować komórki dawcy poprzez barwienie zawiesin pojedynczych komórek w 100 μl koktajlu przeciwciał zawierającego: 0,25 μg przeciwciał anty-mysich CD3, CD4 i CD8; 0,5 μg przeciwciała anty-mysiego CD45.1 lub CD45.2 (w zależności od fenotypu komórek dawcy). Pozostaw otwarty kanał FL-1 cytometru przepływowego (FITC), aby określić profil rozcieńczenia CFSE12 (rysunek 2B).

3. Chimeryczne myszy analizują specyficzne dla genów reakcje na szczepionki

UWAGA: Generowanie konkurencyjnych chimer szpiku kostnego przy użyciu mysich modeli opartych na DTR pozwala na rozróżnianie specyficznych funkcji komórek podczas odpowiedzi immunologicznej na szczepionki. Tutaj pokazujemy dodatkową strategię, dzięki której połączenie komórek dawcy wykazujących ekspresję DTR z komórkami myszy z nokautem pozwala na badanie funkcji specyficznych dla genów podczas odporności w określonych przedziałach komórkowych. W tym przykładzie generujemy myszy ze specyficzną delecją receptora toll-podobnego 3 (TLR3) w Langerin + CD103 + DC.

  1. Przygotowanie komórek dawcy szpiku kostnego
    1. Praca pod szafą bezpieczeństwa biologicznego II stopnia. Unikaj zanieczyszczenia, używając wyłącznie narzędzi sterylizowanych w autoklawie.
    2. Aby wygenerować chimeryczne myszy szpiku kostnego, użyj kongenicznych samic myszy CD45.1 + C57BL / 6 jako biorców i użyj myszy TLR3-/-, Langerin-DTR/EGFP lub wt eksprymujących CD45.2 + jako dawców. Zastosowanie kongenicznych myszy dawców i biorców umożliwia różnicowanie komórek dawcy i biorcy za pomocą cytometrii przepływowej, co pozwala na ocenę wszczepienia.
    3. Aby uzyskać komórki szpiku kostnego dawcy, należy poddać myszy dawcy eutanazji znieczuleniem izofluranem, a następnie zwichnięciu szyjki macicy. Ostrymi nożyczkami wykonaj nacięcia wokół kostek, aby odsłonić muskulaturę myszy.
    4. Za pomocą kleszczy delikatnie pociągnij skórę i sierść myszy od kostki w kierunku bioder, tak aby widoczne były mięśnie nóg.
    5. Ostrymi nożyczkami odetnij nogi myszy na wysokości bioder i nad głową kości udowej.
    6. Nogi ułożyć na szalce Petriego i na lodzie. Pracuj szybko i usuń wszystkie mięśnie, aby odsłonić kości.
    7. Oddzielne kości udowe i piszczelowe. Umieść kości w roztworze 70% etanolu na 5 minut, aby usunąć ewentualne bakterie i natychmiast umieść je na innej szalce Petriego zawierającej 5 ml DMEM bez surowicy. Odetnij końce kości ostrymi nożyczkami i przepłucz szpik kostny do DMEM. W tym celu należy przepłukać 1 ml DMEM do kości, wprowadzając igłę 26 G dołączoną do strzykawki o pojemności 5 ml. Upewnij się, że kości wyglądają na białe (puste) po spłukaniu.
    8. Zbierz wszystkie komórki szpiku kostnego od myszy dawców w 10 ml DMEM. Wytwarzanie zawiesin pojedynczych komórek z komórek szpiku kostnego poprzez przepuszczanie zbioru przez sitko komórkowe o wielkości 70 μm.
    9. Klarowne zawiesiny jednokomórkowe komórek szpiku kostnego przez odwirowanie przy 260 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml PBS. Zubożyć liczbę czerwonych krwinek za pomocą roztworu RBCL, jak opisano w ppkt 2.1.3 i 2.1.4.
    10. Policz komórki szpiku kostnego za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Oceń żywotność komórek, oznaczając martwe komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym13. Optymalnie, jedno zwierzę daje około 3 x 107 białych krwinek na mysz o żywotności co najmniej 80%.
    11. W przypadku całkowitych chimer szpiku kostnego należy przygotować komórki dawcy TLR-3-/- lub wt. Optymalne stężenie komórek to 2 x 107 komórek/ml, ponieważ do przeszczepu zostaną użyte 2 x 106 komórek w 100 μl PBS. Jeśli nie zostanie natychmiast użyte, należy zachować komórki dawcy w temperaturze -80 °C przy użyciu technik powolnego zamrażania i FBS z 10% DMSO. W przypadku mieszanego modelu chimerycznego wymieszaj komórki donorowe Langerin-DTR i komórki donorowe TLR3-/- w stosunku 75:25. Przygotuj mieszankę 75 : 25 Langerin-DTR : wt komórek szpiku kostnego do wygenerowania myszy kontrolnych.
  2. Napromienianie i przeszczepianie myszy
    1. Napromieniuj samice myszy w wieku od 6 do 8 tygodni w promienniku ze źródłem cezu-137. Podaj myszom dwie dawki po 550 rad w odstępie 4 godzin. Podzielone napromienianie minimalizuje ostrą toksyczność wątrobową, a tym samym zmniejsza śmiertelność myszy ze względu na protokół napromieniania.
    2. Po napromienianiu myszy należy trzymać pod wpływem antybiotyków przez dwa tygodnie. Antybiotyki należy podawać z wodą do picia w ilości 2,5 - 5 mg Baytrilu/kg.
    3. 2 - 4 godziny po drugim napromienianiu przeszczepić dożylnie myszy z komórkami szpiku kostnego dawcy. Wykonać iniekcję komórek dawcy poprzez wstrzyknięcie do zatoki zaoczodołowej13 i w znieczuleniu izofluranem, używając maksymalnej objętości 100 μl PBS zawierającego 2 x 106 komórek.
    4. Cztery tygodnie po przeszczepie należy ocenić wszczepienie w próbce 100 μl krwi obwodowej za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu urządzenia zdolnego do odczytu co najmniej dwóch kolorów. Aby odróżnić komórki dawcy od komórek biorcy opornych na promieniowanie, należy użyć dostępnych na rynku znakowanych fluorescencyjnie przeciwciał anty-mysich CD45.1 i CD45.2 w rozcieńczeniach od 1/100 do 1/200. Optymalna ingrafacja komórek dawcy powinna wynosić co najmniej 80% całkowitej liczby komórek krwiotwórczych we krwi obwodowej.
  3. Szczepienia i ukierunkowane zmniejszanie mocy
    1. Zaszczepić myszy rekombinowaną żywym atenuowaną szczepionką przeciw grypie donosowo. W przypadku szczepienia myszy należy znieczulić myszy 5% izofluranem w tlenie za pomocą precyzyjnego waporyzatora. Za pomocą pipety o pojemności 200 μl podać 50 μl PBS zawierającego 103 jednostek tworzących płytki nazębne (pfu) szczepionki.
    2. Aby wygenerować ostateczny model myszy, potraktuj myszy 50 ng DT rozcieńczonego donosowo w 50 μl PBS. Podawać DT kropla po kropli bezpośrednio do nozdrzy znieczulonych myszy, jak opisano w ppkt 3.3.1. Myszy należy leczyć dawkami dobowymi, rozpoczynając leczenie w dniu -2 przed szczepieniem do dnia 2 po szczepieniu (ryc. 3B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Generowanie rekombinowanych atenuowanych szczepionek przeciw grypie można osiągnąć poprzez transfekcję plazmidów kodujących osiem segmentów wirusa grypy pod kontrolą promotorów bidirekcjonalnych5. Szczepionka przeciw grypie przystosowana do niskich temperatur zazwyczaj zawiera sześć segmentów szczepu zimnoadaptowanego oraz HA i NA wybranego szczepu grypy (np. H1N1) (Ryc. 1A). Zasada zimnej adaptacji opiera się na ograniczonej replikacji wirusa w temperaturze 33 °C, która jest temperat...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu opisujemy, w jaki sposób genetyka odwrotna i chimeryczne modele myszy mogą być wykorzystane do wyjaśnienia fizjologicznych i molekularnych mechanizmów odporności wywołanej szczepionką. Genetyka odwrotna grypy została ustalona w wielu laboratoriach i odegrała główną rolę w zrozumieniu patogenezy, replikacji i transmisji grypy17. Kluczowym punktem naszego protokołu jest uratowanie szczepionek przeciw grypie przystosowanych do zimna, wykazujących ekspresję obcych epitopów. Chociaż strategia wprowadz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Sergio Gómez-Medinie za doskonałe wsparcie techniczne przy eksperymentach na myszach. Prace te były wspierane przez fundusze Stowarzyszenia Leibniza i Centrum Infekcji Leibniza. A.L. jest stypendystką Leibniz Graduate School.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dulbecco´ s Zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM 1x)Gibco RL-Life Technologies41965-039
OptiMEMGibco RL-Life Technologies31985-047
Lipofektamina 2000Invitrogen-Life Technologies11668-027
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)PAAp11-010
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
Jaja zarodkoweValo biomedia Gmbh
PBS (1x)Sigma-AldrichD8537
70 μ M Nylon FiltersGreiner-Biorad542-070
Bufor lizujący czerwone krwinki (RBCL) 10xBD Bioscience555899
CD16/CD32 Mysz BD Fc Block (2.4G2)BD Pharmigen553142
APC-Anti-Mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)Biolegend141605
PE-Anti-Mouse CD11c (HLA3)BD Biosciences553802
eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)eBioscience48-5321-82
Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)Biolegend101216
PerCp/Cy5.5-Anti-Mouse CD103 (2E7)Biolegend121416
PE-Anti-Mouse CD45.1 (A20)eBioscience12-0453-82
V500-Anti-Mouse CD45.2 (1O4)BD Bioscience562130
PerCp-eFluor710 -Anty-mysz CD8a (53-6.7)eBioscience46-0081-80
APC-Cy7-Anty-mysz CD3ε (145-2611)Biolegend100325
eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)eBioscience48-0041-80
CFSE Barwnik proliferacyjnyeBioscience65-0850-85
Baytril 2,5%Bayer65-0850-85
Dymetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650
Albumina jaja kurzego Sondy molekularne O23020
Toksyna dyfteryjna (DT)Sigma-AldrichD0564
Trypsyna-TPCKSigma-AldrichT1426
BD FACsCanto II Cytometrprzepływowy BD Biosciences
Oprogramowanie do analizy komórek FlowJo 9.5Flowjo inc.
Niebieska plama trypanowa (0,4%) Life technologiesT10282
Hrabina Automatyczny licznik komórekInvitrogen-Life TechnologiesC10227

Bibliografia

  1. Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
  2. Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
  3. Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
  4. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  5. Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
  6. Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
  7. Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
  8. Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
  9. Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
  10. Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
  11. Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
  12. Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
  13. Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
  14. Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
  15. Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Donosowe podawanie szczepionkiywa atenuowana szczepionka przeciw grypiegenetyka odwrotnakonkurencyjna chimera szpiku kostnegoanaliza cytometrycznamigracja kom rek dendrytycznychproliferacja limfocyt w T CD8amplifikacja wirusa w zarodkach kurzychizolacja kom rek w z w ch onnychdeplecja szpiku kostnego
Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.