Artykuł metodologiczny

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

DOI:

10.3791/52812

⸱

16 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Biomaterials and Bioengineering, Department Min-Met-Materials Eng & CHU de Québec Research Center, Canada Research Chair I for the Innovation in Surgery, Laval University, 2NSERC CREATE Program for Regenerative Medicine (NCPRM), Laval University, 3Department Electronics, Information and Bioengineering, Politecnico di Milano, 4Department of Chemical and Materials Engineering, University of Alberta, 5National Institute for Nanotechnology, National Research Council (Canada), 6Department of Chemical and Biochemical Engineering, University of Western Ontario

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Materiały syntetyczne są znane z inicjowania klinicznych powikłań, takich jak stany zapalne, zwężenia i infekcje, gdy są wszczepiane jako substytuty naczyń krwionośnych. Kolagen jest szeroko stosowany w szerokim zakresie zastosowań biomedycznych i jest uważany za ważną alternatywę dla materiałów syntetycznych ze względu na jego nieodłączną biokompatybilność (tj. niską antygenowość, stan zapalny i reakcje cytotoksyczne). Jednak ograniczone właściwości mechaniczne i związana z tym niska zdolność ręczna żeli kolagenowych utrudniły ich stosowanie jako materiałów rusztowań w inżynierii tkanki naczyniowej. Dlatego uzasadnieniem tej pracy było po pierwsze zaprojektowanie komórkowych żeli kolagenowych w geometrię w kształcie rurki, a po drugie, wzmocnienie komórek mięśni gładkich napędzanej reorganizacją macierzy kolagenowej w celu uzyskania tkanek wystarczająco sztywnych, aby można było się nimi posługiwać.

Opisana tutaj strategia opiera się na bezpośrednim łączeniu komórek kolagenu i mięśni gładkich (konstruktu) w cylindryczną geometrię 3D za pomocą techniki formowania. Proces ten wymaga okresu dojrzewania, podczas którego konstrukty są hodowane w bioreaktorze w warunkach statycznych (bez stosowania zewnętrznych dynamicznych ograniczeń mechanicznych) przez 1 lub 2 tygodnie. "Bioreaktor statyczny" zapewnia monitorowane i kontrolowane sterylne środowisko (pH, temperatura, wymiana gazowa, dostarczanie składników odżywczych i usuwanie odpadów) dla konstrukcji. W okresie hodowli przeprowadzono pomiary grubości w celu oceny sterowanej przez komórki przebudowy macierzy kolagenowej, a także zmierzono zużycie glukozy i tempo produkcji mleczanu w celu monitorowania aktywności metabolicznej komórek. Na koniec oceniono właściwości mechaniczne i lepkosprężyste powstałych konstrukcji rurowych. W tym celu opracowano specjalne protokoły i ukierunkowane know-how (manipulacja, chwytanie, praca w nawodnionym środowisku itp.), aby scharakteryzować zmodyfikowane tkanki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inżynieria tkanek naczyniowych przewiduje różne strategie mające na celu wytwarzanie naczyń inżynieryjnych, w tym przeszczepy oparte na syntetycznych rusztowaniach, naczynia krwionośne oparte na arkuszach komórkowych (TEBV) i TEBV oparte na komponentach macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM). Wśród tych podejść polimery syntetyczne wykazują dobre właściwości mechaniczne, ale mają wspólną wadę, jaką jest brak bioaktywności1. Metoda oparta na arkuszach komórkowych pozwala na wytwarzanie zmodyfikowanych substytutów naczyniowych o wysokich właściwościach mechanicznych, ale czas potrzebny do wytworzenia takich przeszczepów wynosi około 28 tygodni2. Naturalne biopolimery ECM, takie jak kolagen, elastyna, fibryna3lub ich kombinacja, pozostają złotym standardem w tworzeniu rusztowań inżynierii tkankowej. Dzieje się tak przede wszystkim z tego powodu, że materiały te mają ogólnie dobrą biokompatybilność, a jednocześnie są w stanie indukować funkcjonalne odpowiedzi komórkowe4-5. Wśród tych biopolimerów kolagen typu I jest jednym z najobficiej występujących i dominujących białek nośnych ECM w wielu tkankach, takich jak skóra, naczynia krwionośne i ścięgna. Przeprowadzono szeroko zakrojone prace nad właściwościami mechanicznymi kolagenu6–8, ale przeprowadzono tylko kilka badań dotyczących przebudowy komórkowej żeli kolagenowych podczas dojrzewania statycznego. Przebudowa komórkowa odnosi się do modyfikacji strukturalnych macierzy kolagenowej wywołanych przez komórki, które mogą wpływać na stabilność sieci włókien kolagenowych9. Jako naturalne rusztowanie, stosunkowo duże ilości kolagenu typu I mogą być izolowane, sterylizowane i przechowywane z różnych źródeł, takich jak ścięgna ogona szczura10. Zrozumienie interakcji komórkowych z kolagenem i związanych z nimi ogólnych zachowań mechanicznych komórkowych rusztowań kolagenowych (konstruktów) jest niezbędnym krokiem do budowy tkanek. TEBV na bazie kolagenu mogą być przetwarzane przez bezpośrednie mieszanie komórek z kolagenem podczas przygotowywania żelu i dalej formowane w określone kształty, takie jak rurowe i płaskie11. Komórki naczyniowe wewnątrz żeli namnażają się i przebudowują kolagen typu I12. W ten sposób metoda ta omija potrzebę specyficznej makroporowatości, która stanowi jeden z istotnych problemów w rozwoju rusztowań do zastosowań w inżynierii tkankowej. Jednak główną wadą żeli kolagenowych są ich niskie właściwości mechaniczne w porównaniu z materiałami syntetycznymi13.

W tym badaniu, żywa tkanka o jednorodnym rozmieszczeniu komórek została zaprojektowana przez bezpośrednie mieszanie kolagenu z komórkami w jednoetapowym procesie. "Bioreaktory statyczne" zostały użyte do 1 lub 2 tygodni statycznego dojrzewania ucelulolizowanych żeli kolagenowych (bez zastosowania zewnętrznych dynamicznych ograniczeń mechanicznych). Podczas hodowli nastąpiła przebudowa macierzy kolagenowej, zapewniając w ten sposób strukturalne wzmocnienie konstruktów. Co więcej, konstrukty te były gotowe do przeniesienia do bioreaktora o obrotowych ściankach i uzyskano jednorodny śródbłonek. Ponadto w niniejszej pracy zaproponowano również specjalny protokół badań mechanicznych w celu zapewnienia odpowiedniego nowatorskiego podejścia do charakteryzowania właściwości mechanicznych rurkowatych tkanek miękkich.

Podsumowując, ta praca przedstawia metodę szybkiego wytwarzania i dojrzewania in vitro tkanek naczyniowych, które są wystarczająco mocne, aby można je było obsługiwać nie tylko do charakterystyki biologicznej i mechanicznej, ale także do dalszego mechanicznego kondycjonowania w dynamicznym bioreaktorze, co jest uważane za kluczowy krok w regeneracji tkanek.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Produkcja i montaż bioreaktora statycznego

  1. Wykonanie zbiornika
    1. Przygotować probówki wirówkowe o pojemności 50 ml jako zbiornik pożywki hodowlanej dla bioreaktora.
    2. Wykonaj dwa porty, wiercąc dwa otwory o średnicy 5 mm odpowiednio w odległości 20 mm od dołu i od góry zbiornika. Następnie włóż dwie złączki typu luer w silikonowe rurki o długości 5 mm. Wciśnij te złączki luer przez otwory i uszczelnij wszystkie połączenia klejem silikonowym klasy medycznej.
    3. Włóż filtr 0,22 μm do górnego portu zbiornika (Rysunek 1A).
    4. Włóż przegrodę typu luer do dolnego portu zbiornika (Rysunek 1A).
  2. Zespół trzpienia i nasadki
    1. Wywierć otwór o średnicy 4.5 mm pośrodku wentylowanej nasadki rurki zbiornika, nie uszkadzając membrany filtra, która zakrywa otwory napowietrzające.
    2. Przygotuj mieszadło (średnica = 4,5 mm, długość = 100 mm) jako trzpień do konstrukcji.
    3. Przygotuj dwa silikonowe korki stożkowe (długość = 10 mm, średnica środkowego otworu = 4,5 mm).
    4. Zamontuj trzpień i nasadkę (kompleks trzpień-nasadka) zgodnie z opisem na rysunku 1B.
      1. Wciśnij trzpień w otwór. Włóż 2 korki na trzpień tak, aby nasadka była między nimi. Dostosuj położenie trzpienia tak, aby jego użyteczna długość wynosiła 78 mm.
      2. Nałóż podkład, a następnie klej silikonowy klasy medycznej na powierzchnie, które będą się stykać, przed połączeniem ze sobą nasadki i silikonowych stożkowych korków. Usuń nadmiar kleju z nasadki.
    5. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na 1-3 dni.
  3. Produkcja uchwytów z gazy
    1. Przygotuj 3 rurki silikonowe (rurka 1: średnica wewnętrzna = 6,4 mm, długość = 5 mm; rurka 2: średnica = 6,4 mm, długość = 10 mm i rurka 3: średnica = 3,1 mm, długość = 12 mm).
    2. Zamontuj uchwyty gazy zgodnie z opisem na rysunku 1C.
      1. Przeciąć rurkę 1 wzdłuż i otworzyć ją nad rurą 2. Sklej je ze sobą za pomocą kleju silikonowego.
      2. Przytnij sterylną gazę chirurgiczną na arkusz o wymiarach 5 cm x 7 cm, a następnie szczelnie zwiń gazę na rurkę 3 wzdłuż najdłuższego boku gazy. Włóż rurkę 1-rurkę 2 kompleks na gazę.
      3. Dodaj klej silikonowy, aby skleić gazę, tubę 1-tubkę 2 kompleks i tubkę 3. Przyciąć gazę na długość 8 mm.
  4. Montaż i sterylizacja
    1. Zamontuj kompleks trzpienia-nasadki i uchwyty gazy, jak opisano na rysunku 2.
      1. Pokryj trzpień smarem klasy medycznej (Rysunek 2A). Umieść uchwyty z gazy na trzpieniu (Rysunek 2B). Odsuń od siebie uchwyty o ustalonej wartości 35 mm.
      2. Przygotuj formę rurkową, wyjmując dolną część strzykawki o pojemności 10 ml za pomocą piły stołowej (długość końcowa = 8 mm) (Rysunek 2B).
    2. Włóż formę na zespół trzpienia-nasadki wyposażony w uchwyty z gazy (kompleks obudowy-formy), zatrzaskując formę na silikonowym korku (Rysunek 2C).
    3. Autoklaw zbiornika i kompleksu obudowy-formy.
      Uwaga: Uważaj, aby mocno trzymać silikonowy korek podczas wkładania formy, aby uniknąć jej oderwania.

2. Inżynieria konstruktów na bazie żelu kolagenowego z komórek mięśni gładkich i dojrzewanie statyczne

  1. Konstrukty inżynierskie
    1. Rozszerz komórki mięśni gładkich aorty świń (pSMC) w175 cm 2 kolbach hodowlanych wypełnionych 20 ml kompletnej pożywki hodowlanej składającej się ze zmodyfikowanego podłoża Eagle firmy Dulbecco uzupełnionego 10% (v/v) surowicy wieprzowej (PS), 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny (pen-strep).
    2. Przy ≈90% zbiegu odłączyć pSMC (przejście 2-4), wyjmując pożywkę hodowlaną z kolby pSMC, dodając 5 ml roztworu trypsyny (1x w buforowanym fosforanowym roztworze soli fizjologicznej, PBS) i inkubując przez 10 minut (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności).
    3. Zawiesić pSMC w stężeniu 4 x 106 komórek/ml w kompletnej pożywce hodowlanej.
    4. Przygotuj roztwór kolagenu zgodnie z wcześniejszym opisem10.
      1. Ekstrahuj i zbieraj wiązki kolagenu ze ścięgien ogona szczura w roztworze PBS.
      2. Następnie przenieść włókna kolagenowe do roztworów acetonu (5 min), izopropanolu 70% (v/v) (5 min) i kwasu octowego (0,02 N, 48 godz., 4 °C).
      3. Zmiksować lepki roztwór i zamrażać w temperaturze -20 °C przez 3 dni.
      4. Liofilizuj zamrożony roztwór, aby uzyskać gąbki kolagenowe.
      5. Rozpuścić gąbki kolagenowe w roztworze kwasu octowego (0,02 N) o stężeniu 4 g/l i wirować z siłą 29,581 g przez 45 minut.
      6. Sterylizuj roztwór kolagenu w procesie dializy z kolejnymi roztworami kwasu octowego (0,02 N, 1 godz.), chloroformu 1% (v/v, 1 godz.) i kwasu octowego (0,02 N, sterylny roztwór zmieniany co 2 dni przez 1 tydzień).
      7. Zebrać sterylny roztwór kolagenu (4 g/l) w sterylnym kapturze do hodowli komórek.
    5. Przygotuj komórkowe żele kolagenowe, jak pokazano na rysunku 3.
      1. Przygotować 50 ml sterylnego roztworu buforowego, mieszając 35 ml DMEM (5x), 4 ml HEPES (1 N), 3 ml NaOH (1 N) w 8 ml sterylnej wody dejonizowanej.
      2. Przygotować mieszaninę komórek i żelu kolagenowego w pojemniku umieszczonym w lodzie, mieszając 50% (v/v) sterylnego roztworu kolagenu (4 g/l kwasu octowego 0,02 N) z 25% (v/v) roztworu buforowego i 25% (v/v) zawiesiny pSMC w kompletnej pożywce hodowlanej.
    6. Zmierzyć pH mieszaniny i upewnić się, że wynosi od 7,0 do 7,4.
    7. Wlać delikatnie 9 ml mieszaniny komórek i kolagenu do wyżej wymienionego kompleksu obudowy/pleśni (krok 1.4.3, rysunek 3A-B).
    8. Pozostaw do zżelowania w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę pod kapturem hodowli komórkowej (ryc. 3B).
  2. Dojrzewanie w bioreaktorze statycznym
    1. Usuń pleśń (Rysunek 3C) i ostrożnie przenieś konstrukt do zbiornika zawierającego 35 ml pożywki hodowlanej (Rysunek 3D).
    2. Inkubować konstrukt (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności) w pozycji pionowej przez 1 lub 2 tygodnie dojrzewania statycznego.
    3. Zainstaluj kamerę internetową (uszczelnioną w celu zapewnienia izolacji) wewnątrz inkubatora przed konstrukcją.
    4. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co 2 dni, odsysając starą pożywkę z portu przegrody typu luer i ponownie napełniając zbiornik równoważną ilością świeżej pożywki hodowlanej.
  3. Pomiar grubości i aktywności metabolicznej konstruktów na bazie żelu SMCs-kolagen podczas hodowli statycznej
    1. Umieść skanujący interferometr laserowy w kapturze do hodowli komórkowej i obróć go z pozycji pionowej do poziomej za pomocą poziomicy.
    2. Przenieś bioreaktor do okapu do hodowli komórkowej i wyjmij konstrukt ze zbiornika.
    3. Przenieś konstrukcję (nadal zamontowaną na trzpieniu) na ścieżkę wiązki laserowej i umieść ją ściśle prostopadle w stosunku do osi wiązki (jak pokazano na rysunku 4).
    4. Odczytaj wartość wyświetlaną na ekranie skanującego interferometru laserowego, odpowiadającą średnicy zewnętrznej konstrukcji.
    5. Oblicz grubość ścianki konstrukcji na podstawie jej średnicy zewnętrznej i wewnętrznej (tj. średnicy trzpienia).
      Uwaga: Kroki od 2.3.1 do 2.3.5 należy powtarzać co godzinę przez pierwsze 12 godzin, a następnie co 24 godziny.
    6. Użyć 1 ml starej pożywki hodowlanej (próbka pobrana podczas zmiany pożywki, krok 2.2.4) do pomiaru stężenia mleczanu i glukozy za pomocą analizatora gazometrii.
    7. Użyć 1 ml świeżej pożywki hodowlanej jako poziomu wyjściowego dla pomiarów stężenia glukozy i mleczanu14,
      Uwaga: Kroki 2.3.6 i 2.3.7 powtarzać co 2 dni po zmianie pożywki.
  4. Konstruowanie zbiorów w celu dalszych charakterystyk mechanicznych i biologicznych
    1. Po 1 lub 2 tygodniach okresu dojrzewania statycznego przenieś bioreaktor statyczny do okapu do hodowli komórkowej.
    2. Delikatnie przenieść dojrzały konstrukt z trzpienia (Dodatkowy film 1) na szalkę Petriego o średnicy 100 mm zawierającą 40 ml świeżej pożywki hodowlanej (Rysunek 5 i Rysunek 7A).

3. Charakterystyka mechaniczna konstrukcji w kierunku podłużnym i obwodowym

  1. Zainstalować zestaw doświadczalny składający się z testera mikromechanicznego wyposażonego w ogniwo obciążnikowe o natężeniu 5 lub 10 N i kąpieli zawierającej PBS w temperaturze 37 °C, aby utrzymać próbki w warunkach pseudofizjologicznych (rysunek 6).
  2. Zrównoważyć ogniwo obciążnikowe i ekstensometr.
    Uwaga: Wyważanie to funkcja zintegrowana z testerem mikromechanicznym, polegająca na resetowaniu wyświetlanej wartości wysuwu i wyświetlanej wartości obciążenia, gdy na maszynie nie jest zamontowana żadna próbka. Funkcja ta umożliwia zdefiniowanie odniesienia dla obu pomiarów.
  3. Montaż konstrukcji rurowych na aparacie mechanicznym: kierunek wzdłużny.
    Uwaga: Wzdłużne testy zmęczeniowe należy wykonywać bezpośrednio na całych konstrukcjach rurowych. Użyj własnych urządzeń chwytających, aby połączyć uchwyty z gazy konstrukcji z ogniwem obciążnikowym i z podstawą wanny PBS.
    1. Zamontować konstrukcję rurową na urządzeniach chwytających (rysunek 7B), postępując zgodnie z procedurą zbioru (sekcja 2.4).
    2. Owiń urządzenia chwytające i uchwyty z gazy taśmą teflonową, aby zapobiec ślizganiu się uchwytów z gazy podczas testu. Zamontuj próbkę na testerze mikromechanicznym (rysunek 7C).
  4. Montaż konstrukcji pierścieniowych na aparacie mechanicznym: kierunek obwodowy.
    Uwaga: Przeprowadzić obwodowe testy zmęczeniowe na próbkach w kształcie pierścienia wyciętych z konstrukcji rurowych. Użyj dwóch prętów ze stali nierdzewnej jako uchwytów do przytrzymania próbek.
    1. Zamontuj konstrukcję rurową na rurze z tworzywa sztucznego jako wspornik oznaczony szczelinami 5 mm (Rysunek 7B), po zbiorze (sekcja 2.4).
    2. Wytnij pierścienie 10 mm z konstrukcji rurowej.
    3. Zmierzyć długość próbki za pomocą suwmiarki z noniuszem w celu przeprowadzenia dalszych analiz.
    4. Zamontuj próbkę w kształcie pierścienia na prętach ze stali nierdzewnej testera mikromechanicznego (Rysunek 7C). Upewnij się, że próbka jest umieszczona na środku prętów.
      Uwaga: Plastikowa rura w kroku 3.4.1 i system cięcia, jak pokazano na rysunku 7B, służą do uniknięcia uszkodzenia konstrukcji podczas cięcia.
  5. Próba zmęczeniowa na konstrukcjach w kierunku wzdłużnym lub obwodowym.
    1. Rozciągnij konstrukcję do początkowej długości skrajni.
    2. Utrzymuj konstrukt w tej pozycji przez 10 minut w pseudofizjologicznym środowisku.
    3. Zastosuj 10% cykliczne odkształcenie początkowej długości miernika (30 cykli) do konstrukcji z szybkością odkształcenia 5%/s.
    4. Powtórzyć krok 3.5.3 w krokach przyrostowych 10% odkształcenia cyklicznego, aż do uszkodzenia próbki.
      Uwaga: Zastosowanie środowiska pseudofizjologicznego wymaga uwzględnienia wyporu i bezwładności układu chwytającego, które mają wpływ na pomiar przyłożonego obciążenia.
    5. Nagraj tło w następujący sposób:
      1. Przesuń ramę ładunkową do początkowej długości skrajni.
      2. Powtórzyć kroki 3.5.3 i 3.5.4 bez zamontowanej próbki i utrzymując urządzenia chwytające podłączone do ogniwa obciążnikowego (wymagany jest tylko 1 cykl).

4. Śródbłonek luminalny konstruktów

Uwaga: Po przestrzeganiu protokołu zbioru (sekcja 2.4), konstrukcje wytrzymują przenoszenie w celu zamontowania w bioreaktorze o obrotowych ściankach w celu dalszej endotelializacji.

  1. Konstrukcja bioreaktora o obrotowych ściankach
    1. Wywierć otwór o średnicy 4.5 mm pośrodku wentylowanej nasadki rurki zbiornika, nie uszkadzając membrany filtra, która zakrywa otwory napowietrzające.
    2. Wcisnąć trzpień (średnica = 4,5 mm, długość = 40 mm) w otwór i zamocować trzpień zgodnie z opisem w kroku 1.1.2.
    3. Przygotuj dwie silikonowe podpory w kształcie litery C dla konstrukcji średnica zewnętrzna = 14 mm; średnica wewnętrzna = 8 mm).
    4. Umieść obracający się silnik na jednym końcu bioreaktora o obrotowych ściankach, a łożysko na drugim końcu (Rysunek 8B).
  2. Śródbłonek światła
    1. Namnażać ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) w kolbach hodowlanych o długości 25 cm2 z 5 ml pożywki hodowlanej M199 uzupełnionej 10% (v/v) PS, 10% (v/v) FBS, 1% (v/v) pen-strep na płytce Petriego w inkubatorze (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności) aż do 90% konfluencji.
    2. Przygotować 1,5 ml roztworu do powlekania białek na konstrukt wymagany dla optymalnej adhezji komórek, rozcieńczając mieszaninę koncentratu białkowego do 10,5 ng/ml w pożywce do hodowli komórek śródbłonka bez surowicy.
    3. Zmierz długość konstrukcji za pomocą suwmiarki z noniuszem.
    4. Oblicz objętość światła V i obszar świetlny A konstrukcji jako: V = Dw2 L/4 i A = Dw L odpowiednio (gdzie Din jest średnicą wewnętrzną odpowiadającą średnicy trzpienia, a L jest długością konstrukcji).
    5. Umieścić konstrukcję na środku zbiornika zgodnie z procedurą zbioru (sekcja 2.4). Użyj silikonowego wspornika w kształcie litery C, aby przymocować konstrukcję na obu końcach do zbiornika (Rysunek 8A).
    6. Napełnij zbiornik 35 ml pożywki hodowlanej.
    7. Wypełnić 75% obliczonej objętości światła konstruktu (V) roztworem białkowym przygotowanym w kroku 4.2.2. Zamknij oba końce konstruktu, aby uniknąć wycieku roztworu powlekającego białko (ryc. 8A).
    8. Zamontuj system bioreaktora o obrotowych ściankach wewnątrz okapu do hodowli komórkowych.
    9. Umieścić bioreaktor w inkubatorze o temperaturze 37 °C i rozpocząć obrót bioreaktora z siłą 4,02 x 10-5 g przez 1 godzinę, aby umożliwić powłokę luminalną, jak pokazano na rysunku 8B.
    10. Otwórz górną kończynę konstruktu i odessaj roztwór powłoki białkowej ze światła.
    11. Odłączyć HUVEC (przejście 2-3), wyjmując pożywkę hodowlaną z kolby HUVEC i dodając 3 ml roztworu trypsyny (1x w PBS). Inkubować przez 5 minut (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności).
    12. Zawiesić HUVEC w stężeniu 4 x 106 komórek/ml w pożywce z dodatkiem M199.
    13. Wewnątrz kaptura do hodowli komórkowej HUVEC wysiewa nasiona do światła konstruktu o gęstości 1,000 komórek/cm2 15. Zamknij górne końce konstrukcji, aby uniknąć wycieku roztworu HUVEC.
    14. Inkubować konstrukty (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności) umieszczone w bioreaktorze o obrotowych ściankach (rysunek 8B) i hodować przez 2 dni przy stałym obrocie o sile 4,02 x 10-5 g.
    15. Po 2 dniach hodowli w sterylnych warunkach zebrać konstrukt i przygotować go do dalszej charakterystyki biologicznej, jak opisano w sekcji 2.4.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca opisuje wytwarzanie konstruktów opartych na kolagenie rurkowym, zawierających komórki naczyniowe. Już po 1 godzinie wczesnego żelowania mieszanina komórek i kolagenu została bezpośrednio złożona w geometrię rurkową 3D, o średnicy zewnętrznej równej średnicy odpowiedniej formy (około 14 mm). Przez cały okres dojrzewania statycznego pomiary wykazały szybkie zmniejszanie się średnicy zewnętrznej rurowych struktur komórkowych, jak pokazano w tabeli 1. Średnica komórkowych żeli kolagenowych zmniejszyła się o około 60% wartości początkowej po 1 dniu hodowli statycznej i o prawie 85% w ciągu 7 dni (Dodatkowe wideo 2). SMC w konstruktach są odpowiedzialne za obserwowane kurczenie się i związane z tym wzmocnienie mechaniczne, ponieważ zjawisko to nie występuje w niekomórkowych rusztowaniach kolagenowych. Należy pamiętać, że nie zastosowano żadnego gradientu (termicznego, biochemicznego, mechanicznego ani innych). Zagęszczenie sterowane komórkami zaowocowało materiałem o większej gęstości kolagenu, który można było przetwarzać i podporządkowywać mechanicznym zabiegom (Filmy uzupełniające 3 i 4).

Aby powiązać przebudowę sterowaną komórkami z ogólnymi właściwościami mechanicznymi i lepkosprężystością, przeprowadzono testy zmęczeniowe na konstruktach (Dodatkowe filmy 5 i 6). Testy te polegały na cyklicznym przełączaniu konstrukcji (30 razy) przy różnych stałych odkształceniach (10%, 20% i 30% początkowej długości skrajni) i rejestrowaniu naprężeń jako odpowiedzi konstrukcji na mechaniczne żądanie w czasie. Reprezentatywne wyniki dla jednego konstruktu przedstawiono na rysunku 9. Konstrukcja wytrzymywała większe naprężenia w kierunku wzdłużnym (75 kPa) niż w kierunku obwodowym (16 kPa) przy tym samym zakresie odkształceń (odkształcenie 30%). Tymczasem w każdym cyklu osiągnięta wartość szczytowa naprężenia dla docelowego maksymalnego odkształcenia zmniejszała się z czasem. To zachowanie jest typowe dla wysokich właściwości lepkosprężystych wykazywanych przez te konstrukty na bazie kolagenu.

Aktywność biologiczna konstruktów komórkowych została oceniona podczas statycznego dojrzewania. W związku z tym aktywność metaboliczną SMC oceniano, mierząc zużycie glukozy i produkcję mleczanu podczas hodowli statycznej. Próbki pożywki pobierano co 2 dni, a stężenia glukozy i mleczanu mierzono za pomocą analizatora gazometrii. Ciągły wzrost zużycia glukozy i produkcji mleczanu w połączeniu ze znacznym kurczeniem się konstruktów świadczy o aktywności SMC przez cały czas trwania hodowli statycznej (ryc. 10).

Zwiększona stabilność mechaniczna wynikająca z przebudowy sterowanej komórkami pozwoliła na manipulację konstruktami i późniejszy proces endotelializacji. Barwienie trichromowe Massona przeprowadzone na śródbłonkowych konstruktach wykazało wysoce jednorodny śródbłonek. SMC wykazywały wrzecionowatą morfologię i wydawały się jednorodnie rozproszone w ścianie, podczas gdy HUVEC wydawały się dobrze rozproszone po stronie światła (ryc. 11).

figure-results-1
Rysunek 1: Elementy bioreaktora statycznego. Bioreaktor statyczny składał się ze zmodyfikowanej probówki wirówkowej (A) o pojemności 50 ml i nasadki wyposażonej w trzpień (B). Rurka służyła jako zbiornik pożywki i była wyposażona w port na filtr 0,22 μm do wymiany gazowej oraz przegrodę do pobierania próbek i wymiany medium. Trzpień znajdujący się w wentylowanej nasadce pozwolił na wytwarzanie konstrukcji w kształcie rury. Uchwyty z gazy (C) zostały zaprojektowane i wyprodukowane tak, aby wspomagać żelowanie konstrukcji nad trzpieniem. Co więcej, uchwyty te pozwalały na przenoszenie konstrukcji po dojrzewaniu statycznym i mocowanie ich do aparatury mechanicznej. Średnica zewnętrzna trzpienia wynosiła 4,7 mm.

figure-results-2
Rysunek 2: Montaż bioreaktora statycznego. Fazy montażu bioreaktora przed sterylizacją. Uchwyty z gazy były zamontowane na trzpieniu (A) w ustalonej odległości. Wstawiono formę (B) i szczelnie przymocowano do silikonowego korka (C). Średnica zewnętrzna trzpienia wynosiła 4,7 mm.

figure-results-3
Rysunek 3: Wytwarzanie konstrukcji w sterylnych warunkach. Mieszaninę komórek i kolagenu wlano do kompleksu obudowy-pleśni (A) i pozostawiono na 1 godzinę w temperaturze pokojowej (B). Następnie pleśń została usunięta (C), bioreaktor statyczny został zmontowany (D) i przeniesiony do zbiornika w celu statycznego dojrzewania konstrukcji w inkubatorze (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności). Średnica zewnętrzna trzpienia wynosiła 4,7 mm.

figure-results-4
Rysunek 4: Pomiar grubości/średnicy zewnętrznej konstrukcji. Do wykonania pomiaru średnic zewnętrznych konstrukcji wykorzystano interferometr skaningowy laserowy. Konstrukt został umieszczony na ścieżce wiązki laserowej i wygenerował cień. Szerokość cienia, odpowiadająca zewnętrznej średnicy konstrukcji, była następnie mierzona i wyświetlana na ekranie.

figure-results-5
Ryc. 5: Wygląd morfologiczny pozyskanego konstruktu. (A) Zaraz po żelowaniu i (B) po przebudowie sterowanej komórkami podczas dojrzewania statycznego przez 2 tygodnie.

figure-results-6
Rysunek 6: Układ doświadczalny do charakterystyki mechanicznej. Składał się on z testera mikromechanicznego wyposażonego w ogniwo obciążnikowe o natężeniu 5 lub 10 N oraz kąpieli zawierającej PBS w temperaturze 37 °C w celu utrzymania próbek w warunkach pseudofizjologicznych.

figure-results-7
Rysunek 7: Przygotowanie próbki do charakterystyki mechanicznej. Pobieranie próbek (A) i przygotowanie (B) do badań zmęczeniowych przeprowadzanych w kierunku wzdłużnym i obwodowym (C). Średnica zewnętrzna trzpienia wynosiła 4,7 mm.

figure-results-8
Rysunek 8: Bioreaktor o obrotowych ściankach. (A) Konstrukcje rurowe zostały zmontowane w środku zbiornika za pomocą silikonowego wspornika w kształcie litery C. Oba końce konstrukcji zostały zamknięte, aby uniknąć wycieku roztworu HUVEC. (B) Konstrukty hodowano w inkubatorze (T = 37 °C, 5% CO2, 100% wilgotności) w rotacji pod siłą 4,02 x 10-5 g przez 2 dni.

figure-results-9
Rysunek 9: Charakterystyki mechaniczne. Wyniki badań zmęczeniowych przeprowadzonych na konstruktach w kierunku podłużnym (A) i obwodowym (B) po przebudowie sterowanej komórkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rycina 10: Aktywność metaboliczna SMC w żelach kolagenowych. Pomiary wskaźnika zużycia glukozy i tempa produkcji mleczanu wykonywano analizatorem parametrów krytycznych krwi co 2 dni, po zmianie pożywki hodowlanej. Jako poziom wyjściowy do pomiarów stężenia glukozy i mleczanu zastosowano świeżą pożywkę hodowlaną.

figure-results-11
Rycina 11: Śródbłonek światła. Obrazy histologiczne promienistych przekrojów poprzecznych konstrukcji rurowych. Barwienie trichomami Massona konstruktów rurkowych hodowanych statycznie przez 1 tydzień (A) i 2 tygodnie (B). Barwienie H & E konstrukcji rurowej (C).

.
GodzinaGrubość (mm)Zagęszczenie (%)
0 godz4,83 ± 0,020 ± 0
2 godz4,26 ± 0,0212 ± 0
4 godz4,21 ± 0,0313 ± 1
godz. 64,06 ± 0,1016 ± 2
12 godz3,16 ± 0,0735 ± 1
1 dzień2,08 ± 0,1157 ± 2
1 tydzień0,68 ± 0,0786 ± 1
2 tygodnie0,36 ± 0,0093 ± 0

Tabela 1: Szybkie zagęszczenie średnicy konstrukcji podczas dojrzewania statycznego. Grubość ścianek konstrukcji i szybkość zagęszczenia w funkcji czasu hodowli statycznej. Zagęszczenie mierzono poprzez określenie średnicy zewnętrznej konstrukcji rurowych za pomocą interferometru laserowego skaningowego (seria 183B, LaserMike 136). Po 24 godzinach konstrukcje zagęściły się do 57% ± 2% swoich wymiarów formy. Dane są wyrażone jako średnia ± SD (n = 3). Obecność i aktywność żywych komórek mięśni gładkich była jedyną odpowiedzialną za tak duże zmiany.

Dodatkowe wideo 1: Zbieranie nieprzebudowanych żeli kolagenowych w rurkach. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film.

Uzupełniające wideo 2: Napędzane komórkami zagęszczanie rurowych żeli kolagenowych. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Dodatkowe wideo 3: Manipulacja nieprzebudowanymi żelami kolagenowymi w rurkach. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Dodatkowe wideo 4: Manipulacja przemodelowanymi przez komórki rurkowymi żelami kolagenowymi. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Dodatkowe wideo 5: Test zmęczenia podłużnego (na poziomie 30%) na przemodelowanych komórkach rurkowych żelach kolagenowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić ten film.

Uzupełniające wideo 6: Test zmęczenia obwodowego (na poziomie 30%) na przemodelowanych komórkach rurkowych żelach kolagenowych. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W środowisku inżynierów tkanek naczyniowych podjęto ogromne wysiłki, aby odtworzyć warstwę osłonki środkowej odpowiedzialną za stabilność mechaniczną naczyń krwionośnych16. Od czasu pionierskiej pracy Weinberga i Bella17, kolagen jest szeroko stosowany jako rusztowanie w inżynierii tkanki naczyniowej ze względu na jego biokompatybilność, właściwości nieimmunogenne i dostępność. Jednak zastosowanie kolagenu stanowi duże wyzwanie dla naukowców, ponieważ materiał ten nie jest łatwy w obsłudze ze względu na nieodłączny brak sztywności mechanicznej. Manipulacje podczas przygotowania rusztowania mogą uszkodzić rusztowania, narażając je na szwank do dalszego użytkowania.

Technika opisana w tej pracy pozwala: i) na inżynierię komórkowych żeli kolagenowych w geometrię w kształcie rurki; ii) inżynieria tkanek biologicznych wystarczająco mocnych, aby można było z nimi obchodzić się po krótkim okresie dojrzewania statycznego (1 lub 2 tygodnie); iii) ocena właściwości mechanicznych i lepkosprężystych takich rurkowatych tkanek biologicznych w 2 kierunkach. Komórki zawarte w żelu odgrywają kluczową rolę w przebudowie macierzy kolagenowej. W okresie dojrzewania kurczliwe SMC doprowadziły do zagęszczenia żeli, dając konstrukcję o wyższej stabilności mechanicznej, którą można było ocenić w kierunku wzdłużnym i obwodowym. Następnie, HUVEC umieszczone po stronie luminalnej konstruktów wytworzyły jednorodny i żywotny śródbłonek, demonstrując w ten sposób przydatność żeli kolagenowych do zastosowań w inżynierii tkanek naczyniowych.

Bioreaktor zaprezentowany w tej pracy został specjalnie zaprojektowany, aby zapewnić optymalne środowisko dla wzrostu komórek podczas dojrzewania statycznego. Ponadto urządzenia opracowane do charakteryzowania właściwości mechanicznych i lepkosprężystych konstrukcji zostały zaprojektowane w celu zmniejszenia wszelkich potencjalnych uszkodzeń związanych z manipulacją tak delikatnymi materiałami. W związku z tym bioreaktor statyczny został wyposażony w filtr 0,22 μm i membranę filtracyjną na nasadce (krok 1.1.2, rysunki 1A i B), które umożliwiały wymianę gazową między pożywką hodowlaną wewnątrz zbiornika a inkubatorem, przy jednoczesnym utrzymaniu sterylnego środowiska hodowli. Przegroda typu luer na dnie została wykorzystana jako port do pobierania próbek pożywki hodowlanej i zmiany podczas hodowli statycznej. Podczas produkcji konstrukcji i charakterystyki należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych etapów. Wszystkie manipulacje (wykonane w kroku 2.1.1 i w kolejnych krokach), które mogły zmienić sterylność systemu, zostały przeprowadzone w sterylnym kapturze biologicznym. Przygotowanie mieszaniny komórek i żelu kolagenowego przeprowadzono na lodzie w celu opóźnienia procesu żelowania (kroki 2.1.4 do 2.1.7). Na etapie 2.1.7 wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione w mieszaninie przed żelowaniem są potencjalnymi obszarami koncentracji naprężeń, które mogą zagrozić stabilności konstrukcji. Dlatego usunięcie takich pęcherzyków powietrza wymaga lekkiego potrząśnięcia zespołem lub użycia podciśnienia medycznego przez 3 minuty w celu odgazowania w sterylnych warunkach. Wreszcie, uchwyty zostały specjalnie zaprojektowane do utrzymywania osi trzpienia centralnie w formie rurowej podczas żelowania oraz do umożliwienia delikatnej manipulacji konstruktami podczas zbioru (usunięcie trzpienia, sekcja 2.4), do śródbłonka oraz do ułatwienia montażu na układzie mechanicznym (testy wzdłużne).

Niniejszy protokół proponuje oryginalne, łatwe do opracowania alternatywne podejście do wzmacniania konstruktów żeli kolagenowych w oparciu o naturalny wrodzony potencjał kurczliwy SMC. Powszechne techniki wzmacniania matryc kolagenowych obejmują stosowanie fizycznych i chemicznych środków sieciujących, które mogą mieć szkodliwy wpływ na interakcje komórka-macierz18–20. Technika wytwarzania przedstawiona w tej pracy pozwala na kierowanie tym napędzanym komórkami procesem przebudowy w celu uzyskania konstruktu inżynierii tkankowej o ukierunkowanych właściwościach mechanicznych bez żadnej obróbki fizycznej lub chemicznej.

Scharakteryzowanie właściwości mechanicznych i lepkosprężystych uwodnionych żeli kolagenowych jest dużym wyzwaniem. W tym ujęciu niniejszy protokół opisuje oryginalną, prostą i skuteczną metodę oceny właściwości mechanicznych rurkowatych tkanek miękkich. Charakterystykę tę można przeprowadzić nie tylko w kierunku obwodowym, ale także w kierunku wzdłużnym, bezpośrednio na całej konstrukcji rurowej. Podczas charakterystyki mechanicznej, temperatura, środowisko wodne, pH i siła jonowa to tylko niektóre z czynników środowiskowych, o których wiadomo, że drastycznie wpływają na mechaniczne zachowanie tkanek biologicznych21. W związku z tym niniejsza praca sugeruje oryginalną konfigurację i protokół mechanicznej charakterystyki tkanek biologicznych w wysoce odtwarzalnym środowisku pseudofizjologicznym (roztwór soli w temperaturze 37 °C i pH 7,4). O ile nam wiadomo, tego rodzaju charakterystyka nigdy nie została opisana nigdzie indziej.

Podsumowując, technika zaproponowana w tej pracy wykazuje wysoki potencjał bezpośredniego mieszania komórek z kolagenem w zastosowaniach inżynierii tkanki naczyniowej. Metoda ta, wraz z charakterystyką mechaniczną i procesem endotelializacji, stanowią protokoły o wysokiej wartości wielowartościowej. W związku z tym, dzięki niewielkim modyfikacjom ustawień i protokołów przy zachowaniu tego samego uzasadnienia, można spełnić główne wymagania dotyczące inżynierii ekwiwalentów tkanki naczyniowej, takie jak szybkie i nieskomplikowane przetwarzanie, w tym endotelializacja, oraz możliwość transpozycji do szerokiego zakresu tkanek miękkich o różnych długościach i średnicach. Co więcej, różne przylegające typy komórek, białka ECM i formowane geometrie mogą być badane pod kątem wielu ukierunkowanych zastosowań, takich jak między innymi ścięgna inżynieryjne, przeszczepy skóry, łaty sercowe, nerwy. Chociaż właściwości mechaniczne konstruktów są zachęcające, nadal są one niższe niż w przypadku tkanek rodzimych. W tym kontekście jesteśmy przekonani, że bardzo krótki okres dojrzewania statycznego jest kluczowym krokiem w kierunku dynamicznej stymulacji w bioreaktorze, prowadząc w ten sposób do wyższej integralności strukturalnej i stabilności mechanicznej. Jednak możliwość szybkiego wytwarzania inżynierii tkankowej komórkowych konstruktów na bazie kolagenu, nadających się do analiz mechanicznych i histologicznych, sprawia, że opisany tutaj bioreaktor statyczny jest użytecznym i obiecującym narzędziem zapewniającym wgląd w wzajemne oddziaływanie między komórkami a ECM podczas wzrostu i przebudowy, a nawet do wykorzystania jako model dla terapii i systemów dostarczania leków.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie otrzymano żadnego finansowania od organizacji lub agencji, które mogą wystąpić w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie zostało sfinansowane przez Kanadyjską Radę Badań nad Naukami Przyrodniczymi i Inżynierią, Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem oraz Centrum Badawcze CHU de Québec.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CellTreat 50 ml Probówki do bioterapiiCELLTREAT Scientific Products229-475Probówka wirówkowa
Męski luer z pierścieniem blokującym x 1/8" króciec węża. PP. 25/pkCole ParmerRK-45503-04Złączki Luer do "portu wymiany gazu"
Żeński adapter króćca węża luer x 1/8". PP. 25/pkCole ParmerRK-45500-04Złączki Luer do "portu pobierania próbek medium"
Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex L/S 17. 25 stópCole ParmerRK-96410-17Rurka 1 i 2 do chwytaków z gazy
Rurka silikonowa utwardzana platyną Masterflex L/S 16. 25 ft.Cole ParmerRK-96410-16Rurka 3 do chwytaków z gazy
Klej silikonowy Silastic Medical, typ AKlej Dow Corning-Silicondo produkcji bioreaktora statycznego
Polyvent 4 Filtry odpowietrzające naczyniaWhatman6713-0425Filtr do "portu wymiany gazu"
Pręt. PP. mieszanie. 8' 'Scienceware377660008Korek trzpienia
guma silikonowa 00 PK12VWR59590-084Korek do wkładania trzpienia do wentylowanej nasadki probówki wirówkowej
Smary Krytox PFPE/PTFE DupontGPL 202Smar klasy medycznej do pokrywania trzpienia
Trypsyna-EDTA (0,5%)Gibco15400-054Hodowla komórkowa
Xiameter RTV-4130-J podstawa i utwardzaczDowCorning-Cw kształcie silikonu do śródbłonka
Dulbecco' s zmodyfikowane podłoże Eagle, DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronianGibco (Life Technology)11995-065Hodowla komórkowa
Czysty aceton (99%)Laboratoire Mat Inc.AP0102Substancja chemiczna do ekstrakcji kolagenu
Alkohol izopropylowy (klasa HPLC, 99,9%) Fisher ScientificAC610080040Substancja chemiczna do ekstrakcji kolagenu
0,02 N kwas octowy (lodowaty kwas octowy, klasa HPLC, 99%)Fisher ScientificFL070494Substancja chemiczna do ekstrakcji kolagenu
Roztwór chloroformu (99%) Laboratoire Mat Inc.CR 0179Substancja chemiczna do ekstrakcji kolagenu
HepesSigma-Aldrich163716Substancja chemiczna do przygotowania konstrukcji
NaOHLaboratoire Mat Inc.SR-0169Substancja chemiczna do przygotowania konstrukcji
LaserMike 136LaserMikeSeries 183BSkaningowy interferometr laserowy 
ElectroPulse MicroTesterInstronCorporation-Testermikromechaniczny
HyClone Media M199/EBSS, 500  mlGE Healthcare Life SciencesSH30253.01Składnik pożywki do hodowli komórkowych
Surowica bydlęca płodu HI - 500  mlGibcoSH 30396.03Składnik pożywki do hodowli komórkowych
Surowica świńska (PS)Sigma-AldrichP9783Składnik pożywki do hodowli komórkowych
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122Składnik pożywki do hodowli komórkowych
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Fisher ScientificBP661-50Roztwór soli
Kolba do hodowli tkankowych T17CN Nasadka odpowietrzająca CzerwonySarstedt Inc.83.1812.002Hodowla komórkowa
ColorpHast- paski wskaźnikowe pH (pH = 6,5-10,0)EMD9583Pomiary pH
Matrigel Matrigel Błona podstawna Matrix Matrix Matrix Factor Reduced (Zmniejszona liczba czynników wzrostu błony podstawnej), fiolka 5 mlBD Biosciences - Discovery Labware356230Koncentrat mieszanki białkowej do procesu endotelializacji
LifeCam VX-3000Pomiar
grubości firmy MicrosoftAnalizator biochemiczny, DxC600Beckman Coulter UnicellSynchron-Pomiarystężeń glukozy i mleczanu
Włókna kolagenoweOgony szczurów-Kolagenwyekstrahowano w laboratorium
Komórki mięśni gładkich świń (pSMC)Aortyświń-pSMCwyizolowano w laboratorium
Ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC)Ludzkie żyły pępowinowe- HUVEC wyizolowano w laboratorium

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Smiley, E., Mooney, D. J. Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Experimental cell research. 251, 318-328 (1999).
  2. Heureux, N., McAllister, T. N., de la Fuente, H. L. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. The New England journal of medicine. 357 (14), 1451-1453 (2007).
  3. Syedain, Z. H., Meier, L. A., Bjork, J. W., Lee, A., Tranquillo, R. T. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials. 32 (3), 714-722 (2011).
  4. Lee, C., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. International journal of pharmaceutics. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  5. Couet, F., Rajan, N., Mantovani, D. Macromolecular biomaterials for scaffold-based vascular tissue engineering. Macromolecular bioscience. 7 (5), 701-718 (2007).
  6. Christiansen, D. L., Huang, E. K., Silver, F. H. Assembly of type I collagen: fusion of fibril subunits and the influence of fibril diameter on mechanical properties. Matrix Biology. 19 (5), 409-420 (2000).
  7. Eppell, S. J., Smith, B. N., Kahn, H., Ballarini, R. Nano measurements with micro-devices: mechanical properties of hydrated collagen fibrils. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society. 3 (6), 117-121 (2006).
  8. Lai, V. K., Lake, S. P., Frey, C. R., Tranquillo, R. T., Barocas, V. H. Mechanical behavior of collagen-fibrin co-gels reflects transition from series to parallel interactions with increasing collagen content. Journal of biomechanical engineering. 134 (1), 011004(2012).
  9. Seliktar, D., Nerem, R. M., Galis, Z. S. The Role of Matrix Metalloproteinase-2 in the Remodeling of Cell-Seeded Vascular Constructs Subjected to Cyclic Strain. Annals of Biomedical Engineering. 29 (11), 923-934 (2001).
  10. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature protocols. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  11. Kumar, V. A., Caves, J. M., et al. Collagen-Based Substrates with Tunable Strength for Soft Tissue Engineering. Biomaterials science. 1 (11), 1193-1202 (2013).
  12. Li, S., Van Den Diepstraten, C., D’Souza, S. J., Chan, B. M. C., Pickering, J. G. Vascular smooth muscle cells orchestrate the assembly of type I collagen via alpha2beta1 integrin, RhoA, and fibronectin polymerization. The American journal of pathology. 163 (3), 1045-1056 (2003).
  13. Badylak, S. F., Freytes, D. O., Gilbert, T. W. Extracellular matrix as a biological scaffold material: Structure and function. Acta biomaterialia. 5 (1), 1-13 (2009).
  14. Engbers-Buijtenhuijs, P., Buttafoco, L., et al. Biological characterisation of vascular grafts cultured in a bioreactor. Biomaterials. 27 (11), 2390-2397 (2006).
  15. Cheung, A. L. Isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Current protocols in microbiology. 4, 4B(2007).
  16. Seifu, D. G., Purnama, A., Mequanint, K., Mantovani, D. Small-diameter vascular tissue engineering. Nature reviews. Cardiology. , (2013).
  17. Weinberg, C., Bell, E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science. 231 (4736), 397-400 (1986).
  18. Meghezi, S., Chevallier, P., Mantovani, D. Why Mechanical Properties of Collagen Scaffolds Should Be Tested in a Pseudo-Physiological Environment. Advanced Materials Research. 409, 158-163 (2011).
  19. Tirella, A., Liberto, T., Ahluwalia, A. Riboflavin and collagen: New crosslinking methods to tailor the stiffness of hydrogels. Materials Letters. 74, 58-61 (2012).
  20. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. Journal of biomedical materials research. Part A. , 16-26 (2011).
  21. Meghezi, S., Couet, F., Chevallier, P., Mantovani, D. Effects of a pseudophysiological environment on the elastic and viscoelastic properties of collagen gels. International journal of biomaterials. 2012, 319290(2012).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kom rki mi ni g adkichstatyczny bioreaktorin ynieria tkanki naczyniowejkonstrukty rurkowatebadania mechanicznesianie kom rek r db onkaobrotowy bioreaktor ciennyprzebudowa macierzy kolagenowejdojrzewanie tkanki

Powiązane artykuły