Warunki przechowywania produktów płytkowych tworzą idealne środowisko do namnażania się zanieczyszczeń bakteryjnych do niebezpiecznych poziomów. Celem tego badania było wykorzystanie testu tworzenia kolonii do oceny procesu redukcji patogenów opartego na ryboflawinie w stosunku do zanieczyszczenia bakteryjnego o wysokim mianie w ludzkich produktach płytkowych.
Artykuł metodologiczny
Leczenie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV: skuteczność w walce z wysokim mianem bakterii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zanieczyszczenie płytek krwi przez bakterie od dawna jest uznawane za poważne ryzyko transfuzji ze względu na warunki ich przechowywania po oddaniu krwi. Produkty są rutynowo przechowywane w temperaturze 22 °C na mieszającym wytrząsarce, co może sprzyjać rozwojowi bakterii. Chociaż całkowita liczba bakterii, które mogą zostać wprowadzone do produktu płytkowego, jest bardzo niska, bakterie te mogą namnażać się do bardzo wysokiego miana przed transfuzją, co może prowadzić do poważnych zdarzeń niepożądanych. Celem tego badania była ocena procesu redukcji patogenów opartego na ryboflawinie w odniesieniu do panelu bakterii, które zostały zidentyfikowane jako powszechne zanieczyszczenia produktów płytkowych. W skład panelu wchodziły następujące organizmy: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa i K. pneumoniae. Każda jednostka płytek krwi została zaszczepiona dużym ładunkiem bakteryjnym, a próbki pobrano zarówno przed, jak i po leczeniu. Test tworzenia kolonii, wykorzystujący schemat rozcieńczania punktu końcowego, zastosowano do określenia miana bakterii przed i po zabiegu. Redukcję logarytmiczną obliczono poprzez odjęcie miana po zabiegu od miana przed zabiegiem. Zaobserwowano następujące redukcje logarytmu: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4,0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) i K. pneumoniae 2,8 log (99,8%). Wyniki tego badania sugerują, że proces ten może pomóc w obniżeniu ryzyka poważnych niepożądanych zdarzeń transfuzji związanych z zanieczyszczeniem bakteryjnym.
Wprowadzenie
Transfuzja płytek krwi, osocza, krwinek czerwonych i produktów z krwi pełnej odgrywa ważną rolę w nowoczesnej medycynie i może być stosowana do leczenia różnych schorzeń, zastępowania płynów niezbędnych do życia i ostatecznie ratowania życia. Płytki krwi są produktem komórkowym, który jest izolowany z krwi pełnej i łączony w dawkę nadającą się do transfuzji lub jest pobierany w procesie aferezy płytek krwi. Główną rolą płytek krwi w organizmie jest zatrzymanie krwawienia w miejscach ran i pomoc w utrzymaniu hemostazy. Pacjenci cierpiący na małą liczbę komórek płytkowych (małopłytkowość) są podatni na spontaniczne krwawienia i przetacza się im płytki krwi w celu przywrócenia liczby komórek krwiowych do normalnego zakresu. Pobrane płytki krwi są przechowywane maksymalnie przez 5-7 dni i są przechowywane w temperaturze 22 ± 2 °C w ciągłym mieszaniu.
Pomimo ratujących życie właściwości transfuzji płytek krwi, nadal istnieje niewielkie ryzyko dla osób otrzymujących transfuzję z powodu zanieczyszczenia tych produktów przez pasożyty, bakterie i wirusy11. Wdrożenie testów na obecność wirusowych kwasów nukleinowych (NAT) znacznie zmniejszyło ryzyko przenoszenia głównych czynników przenoszonych przez krew, takich jak wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus zapalenia wątroby typu B (HBV) i ludzki wirus niedoboru odporności (HIV)5. Niedawna publikacja Kanadyjskiej Służby Krwi szacuje, że ryzyko szczątkowe dla tych czynników wynosi 1 na 8 milionów donacji w przypadku HIV, 1 na 6,7 miliona donacji w przypadku HCV i 1 na 1,7 miliona donacji w przypadku HBV15.
Chociaż bakterie zazwyczaj przyciągają mniej uwagi ogółu społeczeństwa, częstotliwość skażenia bakteryjnego w produktach płytkowych została oszacowana na tak wysoką jak 1:1,0007 i ponieważ miliony produktów płytkowych są przetaczane każdego roku, wielu biorców jest narażonych na potencjalnie zagrażające życiu powikłania, takie jak sepsa6. Badania sugerują, że obciążenie bakteryjne w momencie zanieczyszczenia jest niskie, <100 jednostek tworzących kolonie (CFU)/produkt2,16, jednak bogate w składniki odżywcze środowisko i przechowywanie w temperaturze pokojowej pozwala zanieczyszczającym bakteriom namnażać się do niebezpiecznie wysokich mian przed transfuzją. Obecnie jedynymi zatwierdzonymi dostępnymi metodami zapobiegania przedostawaniu się produktów skażonych bakteryjnie do biorcy płytek krwi jest stosowanie systemów opartych na hodowlach i szybkich testów w miejscu opieki nad pacjentem. Krótko mówiąc, w przypadku systemów opartych na hodowlach produkty płytkowe są przechowywane na mieszadle w temperaturze 22 °C przez 12-24 godziny, aby umożliwić namnażanie się bakterii w produkcie, po czym z produktu płytkowego usuwa się próbkę o objętości 4-8 ml i zaszczepia się w butelce zawierającej pożywkę. Butelkę umieszcza się w urządzeniu, które monitoruje butelkę pod kątem rozwoju bakterii. Jeśli przyrząd wykryje wzrost bakterii w butelce, zostanie on oznaczony, a odpowiednia jednostka płytek krwi zostanie wyrzucona. Chociaż proces ten jest dość skuteczny w wykrywaniu szybko rosnących organizmów, wiele wolno rosnących gatunków nie osiąga wystarczająco wysokiego miana, aby można je było wykryć, co stwarza możliwość uwolnienia jednostek fałszywie ujemnych do transfuzji7,12,14,16,22. W przeciwieństwie do systemów wykrywania opartych na hodowlach, szybkie testy w miejscu opieki nad pacjentem są zwykle wykonywane w późniejszym okresie przechowywania płytek krwi, gdy obciążenie bakteryjne znacznie wzrosło. Wyższe miana są wymagane, ponieważ testy przyłóżkowe są mniej czułe niż systemy oparte na hodowlach i niezawodnie wykrywają bakterie dopiero po osiągnięciu miana ≥1 x 103 jtk/ml17. Jednak takie testy mogą dostarczyć wyniki w ciągu 1 godziny od pobrania próbki. Zmienność w wykonywaniu tych testów doprowadziła do uwolnienia fałszywie ujemnego produktu, powodując śmiertelną reakcję septyczną u biorcy9.
Alternatywnym sposobem walki z problemem zanieczyszczenia bakteryjnego produktów płytkowych jest rutynowe stosowanie procesu redukcji patogenów, który może dezaktywować bakterie skażające zamiast próbować je wykryć. Wykazano, że stosowanie ryboflawiny jako fotouczulacza w połączeniu ze światłem UV zmniejsza zakaźność szerokiej gamy patogennych zanieczyszczeń przenoszonych przez krew, w tym bakterii3,4,8,10,19-21. Stosowanie ryboflawiny i światła UV do redukcji patogenów jest nietoksyczne i niemutagenne, a wykazano, że składniki poddane działaniu ryboflawiny i światła UV są bezpieczne dla biorców transfuzji, a także dla osób mających do czynienia z produktami krwiopochodnymi18. Krótko mówiąc, cząsteczki ryboflawiny mogą łączyć się z kwasami nukleinowymi (DNA i RNA) bakterii, pasożytów, wirusów i wszelkich komórek jądrzastych (np. białych krwinek). Ekspozycja na światło UV aktywuje ryboflawinę, powodując chemiczną zmianę grup funkcyjnych kwasów nukleinowych (głównie zasad guaninowych), zapobiegając w ten sposób replikacji i/lub transkrypcji kwasów nukleinowych i pozostawiając organizm w stanie inaktywowanym13. Komórki jądrzaste, takie jak płytki krwi i czerwone krwinki, nie są dotknięte chemią ryboflawiny z powodu braku kwasu nukleinowego.
Poprzednia praca z technologią ryboflawiny i światła UV oceniała wybraną grupę bakterii za pomocą eksperymentalnego projektu mającego na celu naśladowanie produktu płytkowego zanieczyszczonego klinicznie istotnym obciążeniem bakteryjnym (<20 CFU/produkt)8. Celem tego badania była ocena procesu leczenia ryboflawiną i światłem UV w odniesieniu do zanieczyszczenia bakteryjnego o wysokim mianie (>1,0 x 105 CFU/ml) w produktach płytkowych traktowanych osoczem w celu zmierzenia całkowitej zdolności redukcyjnej bakterii w systemie. Na podstawie danych zebranych w badaniach hemovigilance1 do oceny w tym badaniu wybrano panel powszechnie występujących organizmów Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, który obejmował następujące gatunki: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica, Brucella neotomae, Bacillus cereus (forma wegetatywna), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae. Wszystkie organizmy, z wyjątkiem B. cereus, uzyskano z ATCC, a priorytetem było uzyskanie szczepów bakteryjnych, które zostały zidentyfikowane jako wyizolowane ze składników krwi. B. cereus testowany w tym badaniu jest szczepem klinicznym wyizolowanym wewnętrznie z zanieczyszczonego produktu płytkowego.
Protokół
1. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej:
- Z posiewu na płytce, w warunkach aseptycznych, zaszczep pojedynczą kolonię do sterylnej butelki o pojemności 250 ml zawierającej 100 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej (Tabela 1), używając sterylnej pętli do szczepienia.
- Umieść butelkę w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną w odpowiednich warunkach (Tabela 1) na 1-2 dni, okresowo sprawdzając wzrost. Ustaw prędkość wytrząsania na 140 RPM.
- Aseptycznie przenieś zawiesinę bakteryjną do dwóch sterylnych probówek stożkowych o pojemności 50 ml i wiruj probówki przy 3,000 x g przez 20 min w temperaturze 23 °C.
- Odsącz nadsącz i resuspenduj każdy osad bakteryjny w 15 ml sterylnej wody peptonowej. W razie potrzeby wymieszaj na wirówce typu Vortex. Połącz zawiesinę kultury bakterii w jednej probówce/pojemniku.
- Wyznacz miano kultury wyjściowej w trzech powtórzeniach zgodnie z sekcją 4, aby określić miano kultury wyjściowej.
- Przechowuj w lodówce do 2 tygodni w temperaturze 4 ± 2 °C do czasu użycia. Ponownie wyznacz miano kultury w momencie użycia, patrz krok 4.8.
2. Przygotowanie produktu płytkowego:
- Pobrać standardowy produkt płytek krwi człowieka z aferezy w akredytowanym banku krwi. Produkt płytek musi spełniać następujące specyfikacje pobrania: objętość 90–360 ml oraz stężenie 0,8–3,8 x 106 platelets/µl.
- Upewnić się, że produkt płytek odpoczywał przez minimum 2 hr przed przetworzeniem w celu redukcji patogenów. Przechowywać produkty w temperaturze 22 ± 2 °C w inkubatorze do płytek bez agitacji przez te 2 hr. Po dwóch godzinach zapewnić agitację produktu płytek w temperaturze 22 ± 2 °C w inkubatorze do płytek. Wykorzystać produkt do 22 hr po pobraniu.
- Za pomocą strzykawki 3 ml pobrać próbkę 2 ml w celu pomiaru pH22C produktu płytek. Użyć analizatora gazometrii krwi, aby upewnić się, że produkt ma pH >6,6. Tą samą próbkę wykorzystać do pomiaru stężenia płytek w produkcie za pomocą analizatora hematologicznego. Upewnić się, że produkt spełnia wymóg stężenia pobrania 0,80–3,8 x 106 platelets/µl.
- Wizualnie ocenić efekt wirowania (swirl) produktu płytek. Jeśli produkt wykaże wirowanie „0”, zostanie on odrzucony.
- Przytrzymać worek z płytkami pod bezpośrednim źródłem białego światła i krótko go ścisnąć. Wizualnie zaobserwować wzór wirowania próbki płytek. Ocenić produkt w następującej skali.
UWAGA: 2 – Wirowanie pozytywne: niejednorodność wirowania widoczna w całym worku z silnym kontrastem. 1 – Wirowanie pośrednie: pewna niejednorodność widoczna, ale tylko w kilku miejscach i z słabym kontrastem. 0 – Wirowanie negatywne: mętna jednorodność utrzymująca się przed i po ścisnięciu worka z płytkami.
3. Proces z użyciem ryboflawiny i światła UV:
- Przenieść produkt płytkowy do worka do naświetlania UV i przechowywania z ryboflawiną, używając sterylnego urządzenia do łączenia przewodów. Po transferze odciąć pusty worek do pobierania jednostek płytek za pomocą zgrzewarki do przewodów i zutylizować pusty worek jako odpad biologiczny.
- Wyjąć 35 ml woreczek z roztworem stokowym ryboflawiny o stężeniu 500 μM z ochronnej osłony przed światłem. Sterylnie połączyć zestaw do podawania ryboflawiny z linią wlotową worka do obróbki i przechowywania. Pozostawić zawartość do spłynięcia do jednostki płytek.
- Zawiesić zestaw składający się z woreczka z ryboflawiną oraz worka do obróbki i przechowywania za woreczek z ryboflawiną i delikatnie wypchnąć resztki powietrza z worka do obróbki i przechowywania do woreczka z ryboflawiną. Upewnić się, że niewielka ilość produktu płytkowego została również wypchnięta do woreczka z ryboflawiną, aby wypłukać pozostałą ryboflawinę do produktu płytkowego. Pozwolić roztworowi ryboflawiny i płytek spłynąć z powrotem do worka do obróbki i przechowywania, a następnie zacisnąć linię wlotową. Usunąć pusty worek z ryboflawiną za pomocą zgrzewarki do przewodów i zutylizować pusty worek jako odpad biologiczny.
- Sterylnie połączyć 6-calowy przewód z żeleźnym łącznikiem do strzykawki z linią wlotową worka do naświetlania i przechowywania. Przymocować korpus strzykawki o pojemności 10 ml (po usunięciu tłoka) do żeleźnego łącznika do strzykawki.
- Aseptycznie dodać 5 ml zawiesiny bakterii do korpusu strzykawki za pomocą pipety. Otworzyć zacisk na linii wlotowej i pozwolić bakteriom spłynąć do produktu płytkowego. Wypłukać korpus strzykawki, pozwalając części produktu płytkowego spłynąć z powrotem do korpusu strzykawki 10 ml. Usunąć korpus strzykawki 10 ml.
- Aseptycznie podłączyć strzykawkę 30 ml i przepłukać port wlotowy co najmniej dwa razy, aby upewnić się, że zawiesina bakterii została wymieszana z produktem płytkowym. Po dokładnym wymieszaniu produktu użyć czystej strzykawki 5-10 ml i pobrać 2 ml próbki przed obróbką. Używając nowej strzykawki, upewnić się, że usunięto wszelkie powietrze wprowadzone podczas etapu inokulacji lub pobierania próbek.
- Wyznaczyć miano próbki przed obróbką zgodnie z sekcją 4.
- Odłączyć linię wlotową od worka do obróbki i przechowywania i zważyć produkt.
- Umieścić produkt w naświetlarzu i postępować zgodnie z poleceniami na ekranie, aby rozpocząć standardową obróbkę płytek.
- Wprowadzić ID operatora.
- Zabezpieczyć i zamocować worek do płyty naświetlarza.
- Wprowadzić ID próbki do naświetlarza za pomocą czytnika kodów kreskowych lub klawiatury wprowadzania ręcznego.
- Zeskanować typ produktu.
- Zamknąć zacisk kwarcowy.
- Urządzenie naświetlające automatycznie dostarczy energię o wartości 6.24 J/ml. Typowy czas obróbki wynosi 5-10 min.
- Po obróbce sterylnie połączyć 6-calowy przewód z żeleźnym łącznikiem do strzykawki z linią cebulki do pobierania próbek worka do obróbki i przechowywania. Upewnić się, że produkt jest dobrze wymieszany, a następnie podłączyć strzykawkę 5 ml i pobrać 2 ml próbki po obróbce.
- Wyznaczyć miano próbki po obróbce zgodnie z sekcją 4.
4. Miano bakterii
- Oszacuj miano próbek przed i po zabiegu, a następnie przygotuj odpowiednią liczbę probówek do rozcieńczeń o pojemności 5 ml, niezbędnych do wykonania seryjnych rozcieńczeń końcowych dla każdej próbki. W sposób aseptyczny napełnij wymagane probówki 1,8 ml wody peptonowej.
- Wyznacz miano każdej próbki, stosując schemat dziesięciokrotnych rozcieńczeń seryjnych. W sposób aseptyczny przenieś 0,2 ml nierozcieńczonej próbki do pierwszej probówki z rozcieńczeniem (10-1). Wymieszaj zawartość probówki wirówką typu vortex, a następnie przenieś 0,2 ml do kolejnej probówki. Kontynuuj rozcieńczanie seryjne do osiągnięcia wymaganej liczby rozcieńczeń.
- W sposób aseptyczny przenieś 100 µl każdego rozcieńczenia przeznaczonego do wysiewu na odpowiednią płytkę z agarem (Tabela 1).
- Za pomocą sterylnego rozpylacza równomiernie rozprowadź próbkę na każdej płytce z agarem.
- Odwróć płytki do góry dnem i inkubuj w odpowiednich warunkach (Tabela 1) przez 1–2 dni, okresowo sprawdzając występowanie wzrostu.
- Olicz płytki zawierające od 30 do 300 kolonii. Płytki zawierające więcej niż 300 kolonii uznaje się za zbyt gęste do zliczenia (TNTC). Płytki zawierające mniej niż 30 kolonii uznaje się za znajdujące się poniżej granicy oznaczalności (LOQ).
- Oblicz miano każdej badanej próbki i zapisz wyniki jako CFU/ml.
- Do obliczenia CFU/ml użyj następującego równania:
- Jeśli na płytce z najniższym rozcieńczeniem nie ma kolonii, użyj następującego równania do obliczenia granicy wykrywalności (LOD):
oraz
Gdzie:
N = najniższa liczba cząstek (CFU) w produkcie, która może zostać wykryta z pewnością.
P = prawdopodobieństwo, że mikroorganizm nie zostanie wykryty; dla 95% pewności wykrycia mikroorganizmu P = ,05.
V = całkowita objętość produktu w ml
v = objętość wysiana (ml) x stopień rozcieńczenia płytki
- Do obliczenia CFU/ml użyj następującego równania:
- W przypadku kontroli negatywnej wysiej 0,5 ml wody peptonowej użytej do rozcieńczeń seryjnych na każdą z dwóch płytek z agarem. Użyj tego samego rodzaju płytek co w przypadku badanych próbek. Odwróć płytki do góry dnem i inkubuj w odpowiednich warunkach przez 1–2 dni, okresowo sprawdzając występowanie wzrostu.
- Jeśli na którejkolwiek z płytek z agarem zaobserwowany zostanie wzrost, użyta butelka wody peptonowej musi zostać utylizowana; wyniki badania zostają uznane za nieważne.
- W przypadku kontroli pozytywnej ponownie wyznacz miano użytej kultury bakterii. Odwróć płytki do góry dnem i inkubuj w odpowiednich warunkach przez 1–2 dni, okresowo sprawdzając występowanie wzrostu. Aby badanie zostało uznane za ważne, miano powinno wynosić ± 1,0 log CFU/ml w stosunku do zapisanego miana kultury wyjściowej (patrz sekcja 1.5).
Wyniki
Redukcję jedenastu różnych gatunków bakterii oceniono przy użyciu procesu PRT opartego na ryboflawinie i świetle UV. Agenci ci reprezentują niektóre z najczęstszych zanieczyszczeń produktów płytkowych i obejmują pięć organizmów Gram-dodatnich oraz sześć Gram-ujemnych. Dla każdego organizmu oceniono co najmniej sześć produktów płytkowych, a każdy produkt zaszczepiono taką ilością bakterii, aby uzyskać końcowy miano bakterii w produkcie płytkowym >1.0 x 105 CFU/ml. Przed zabiegiem pobrano próbkę w celu określenia miana przed zabiegiem, po czym produkt płytkowy niezwłocznie poddano procesowi z użyciem ryboflawiny i UV. Po potraktowaniu produktów płytkowych zaobserwowano następujące redukcje logarytmiczne: S. epidermidis 4.7 log (99.998%), S. aureus 4.8 log (99.998%), S. mitis 3.7 log (99.98%), S. pyogenes 2.6 log (99.7%), S. marcescens 4.0 log (99.99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99.95%), B. neotomae 5.4 log (99.9996%), B. cereus 2.6 log (99.7%), E. coli ≥ 5.4 log (99.9996%), P. aeruginosa 4.7 log (99.998%) oraz K. pneumoniae 2.8 log (99.8%) (Rycina 2). Wszystkie jednostki spełniły specyfikacje systemu określone powyżej dla procesu z użyciem ryboflawiny i UV. Dodatkowe testy redukcji przeprowadzono z S. pyogenes przy użyciu płytek pochodzących z warstwy leukocytarnej (buffy coat). Nie zaobserwowano istotnej różnicy w redukcji S. pyogenes w płytkach pochodzących z warstwy leukocytarnej w porównaniu z płytkami z aferezy (dane nie przedstawiono).
Tabela 1: Warunki wzrostu gatunków bakterii ocenianych z wykorzystaniem ryboflawiny i światła UV. Do badania wybrano panel bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, o których wykazano, że zanieczyszczają produkty płytkowe. Przedstawiono warunki wzrostu (temperaturę i rodzaj pożywki) zastosowane do namnażania i miareczkowania organizmów.
Rycina 1: Proces redukcji patogenów za pomocą ryboflawiny i światła UV. Ryboflawinę rozpuszczono w 0,9% soli fizjologicznej do nominalnego stężenia 500 µM. Roztwór wprowadzono sterylnie do każdego produktu płytkowego. Do każdej jednostki płytek aseptycznie dodano bakterie, a następnie poddano je działaniu energii UV o wartości 6,2 J/ml (około 6–10 min). W tym badaniu in vitro pobrano próbki z jednostki płytek po traktowaniu w celu określenia końcowego miana bakterii.
Rycina 2: Redukcja różnych gatunków bakterii po traktowaniu ryboflawiną i światłem UV. Ryboflawiny i światła UV użyto do redukcji ładunku bakteryjnego typowych zanieczyszczeń bakteryjnych produktów płytkowych. Redukcja log10 to różnica między średnim mianem przed traktowaniem a średnim mianem po traktowaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Badania przesiewowe na obecność bakterii stały się powszechną praktyką w bankach krwi, a w wielu miejscach służą jako podstawowa metoda zapobiegania transfuzji płytek krwi skażonych bakteriami. Chociaż badania przesiewowe bakterii zazwyczaj blokują większość szybko rosnących bakterii Gram-ujemnych, takich jak S. marcescens, E. coli i E. cloacae, mają trudności z wykryciem wolno rosnących bakterii Gram-dodatnich, takich jak S. aureus, Streptococcus spp. i S. epidermidis8. Niestety, te trzy bakterie Gram-dodatnie są zaangażowane w ponad 50% wszystkich skażonych jednostek płytek krwi, a transfuzja produktów płytkowych zawierających te trzy organizmy doprowadziła do śmiertelności pacjentów1.
Badania przesiewowe bakterii opierają się na tym, że miano bakterii w produkcie płytkowym jest wystarczająco wysokie, aby co najmniej jeden organizm znajdował się w typowej próbce przesiewowej o objętości 4-8 ml. Jeśli miano bakterii nie jest wystarczająco wysokie, aby bakteria mogła zostać wychwycona w próbce o objętości 4-8 ml, urządzenie jest nieprawidłowo oznaczane jako ujemne i jest zwalniane do transfuzji. Alternatywnym podejściem do badań przesiewowych bakterii może być zastosowanie proaktywnego procesu, który można przeprowadzić na wszystkich jednostkach płytek krwi i który może spowodować, że organizmy zanieczyszczające staną się niefunkcjonalne.
W tym badaniu wysokie miana bakterii zostały celowo dodane do jednostek płytek krwi, aby przetestować całkowitą zdolność redukcji procesu redukcji ryboflawiny i patogenów światłem UV. Chociaż obciążenia bakteryjne testowane w tym badaniu znacznie przewyższają te, które normalnie występują w produktach krwiopochodnych w momencie dawstwa, badanie to pomaga wykazać, że proces ryboflawiny i światła UV jest w stanie znacznie obniżyć miano żywych bakterii w zanieczyszczonej jednostce płytek krwi o 2,6 do 5,4 log (99,7-99,9996% redukcja bakterii skażających) (Rysunek 2). Aby uzyskać dokładną wartość redukcji logarytmu, niezwykle ważne jest, aby operator posiadał dobrą technikę aseptyczną oraz precyzyjne umiejętności pipetowania podczas wykonywania etapów miana bakterii. Nieprecyzyjne pipetowanie podczas seryjnych rozcieńczeń może prowadzić do nawarstwiania się błędów, a tym samym do niedokładnego pomiaru miana.
Dane zebrane w tym badaniu potwierdzają wcześniejsze prace nad ryboflawiną i światłem UV, które stanowiły wyzwanie dla systemu w walce z bakteriemią o niskim poziomie, klinicznie istotną (<20 CFU/jednostkę). Poprzednie badanie miało na celu naśladowanie rzeczywistego zdarzenia zanieczyszczenia klinicznego, a wyniki wykazały, że ryboflawina i światło UV skutecznie zapobiegały rozwojowi bakterii w ciągu 7-dniowego okresu przechowywania płytek krwi. Modelowanie oparte na danych z poprzedniego badania sugeruje, że obecne szacunki ryzyka zanieczyszczenia bakteryjnego produktów płytkowych mogą zostać zmniejszone nawet o 98% w stosunku do obecnych poziomów8. Proces leczenia ryboflawiną i światłem UV wypada korzystnie w porównaniu z badaniami przesiewowymi bakterii, które wykazały jedynie 66% skuteczność w wykrywaniu zanieczyszczeń bakteryjnych w jednostkach płytek krwi w przypadku wyzwania z klinicznie istotnym obciążeniem bakteryjnym8.
Podobnie jak w przypadku wszystkich technologii, leczenie PRT produktów płytkowych w celu zapobiegania powikłaniom związanym z zanieczyszczonymi bakteryjnie jednostkami płytkowymi ma swoje ograniczenia. Systemy PRT nie są skuteczne przeciwko przetrwalnikom bakterii i nie dezaktywują endotoksyny, więc nawet jeśli system PRT może dezaktywować wysokie miana bakterii Gram-ujemnych, pozostała endotoksyna może nadal powodować wstrząs septyczny u biorcy. PRT najlepiej wykonywać na wczesnym etapie przechowywania, zanim bakterie będą mogły rozprzestrzenić się do wysokich mian.
Podsumowując, jak wykazano w połączeniu tych dwóch badań, proces ryboflawiny i światła UV skutecznie zmniejsza obciążenie bakteryjne zarówno organizmów Gram-ujemnych, jak i Gram-dodatnich i może stanowić realną alternatywę dla badań przesiewowych bakterii. Rutynowe traktowanie produktów płytkowych ryboflawiną i światłem UV ma również dodatkową zaletę w postaci zmniejszenia potencjalnej transmisji innych czynników przenoszonych przez krew, takich jak wirusy i pasożyty.
Oświadczenia
Wszyscy autorzy tego artykułu są obecnie zatrudnieni przez Terumo BCT, twórcę i producenta systemu Mirasol PRT. Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez Terumo BCT.
Podziękowania
Autorzy nie mają żadnych podziękowań.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mirasol Illuminator | Terumo BCT | N/A | |
| Mirasol Torba do leczenia/przechowywania | Terumo BCT | N/A | |
| Analizator hematologiczny | Beckman-Coulter | Ac• T różnica | |
| Analizator parametrów krytycznych | Siemens | RapidLab 1265 | |
| Sterylne urządzenie dokujące | Terumo BCT | TSCD | |
| Helmer | PC2200 | ||
| Inkubator orbitalny Shaker | Lab-Line | 4628 | |
| Suchy inkubator | Fisher | Iso-temp | |
| Class II A/B3 Szafa bezpieczeństwa biologicznego | Thermo-forma | 1286 | |
| Uszczelniacz do rurek | Sebra | ||
| IEC | Centra GP8R | ||
| Strzykawka 10 ml | BD | 309604 | |
| 30 ml Strzykawka | BD | 309650 | |
| Probówka do rozcieńczania 5 ml | VWR | 211-0058 | |
| Probówka stożkowa 50 ml | Corning | 430290 | |
| Mikropipeta | Gilson | P-200 | |
| Mikropipeta | Rainin | R-200 | |
| Pipeta wielokrotna | Eppendorf | 4780 | |
| 1-200 µ l Końcówka filtra | Costar | 4810 | |
| 25 ml Jednorazowa pipeta serologiczna | Costar | 4489 | |
| 5 ml Jednorazowa pipeta serologiczna | Costar | 4487 | |
| 35 ml 500 µ M Ryboflawina | Terumo BCT | 35 ml 500 &mikro; M | |
| Brucella Agar z 5% krwią końską | BBL | 221547 | |
| Napar z serca mózgu | Teknova | B9993 | |
| Woda peptonowa | BD | 257087 | |
| Tryptykaza Rosół sojowy | BD | 299113 | |
| Tryptykaza Agar sojowy | Remel | R01917 | |
| Inaktywowane termicznie serum końskie | Gibco | 26050 |
Bibliografia
- Brecher, M. E., Hay, S. N. Bacterial contamination of blood components. Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).
- Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage. Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).
- Cardo, L. J., et al. Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).
- Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).
- Dodd, R. Y. Current viral risks of blood and blood products. Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).
- Dodd, R. Y. Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States. Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).
- Dumont, L. J., et al. Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results. Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).
- Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns. Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).
- Greco-Stewart, V. S., et al. Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture. Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).
- Keil, S. D., et al. Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light. Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).
- Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada. Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).
- Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. Six years' experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results. Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).
- Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies. Photochem. Photobiol. , (2014).
- Murphy, W. G., et al. Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety. Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).
- Brien, S. F., et al. Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services. Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).
- Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service. Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).
- Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components. Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).
- Reddy, H. L., et al. Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation. Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).
- Ruane, P. H., et al. Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light. Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).
- Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma. Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).
- Vanlandingham, D. L., et al. Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system. Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).
- Walther-Wenke, G., et al. Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures. Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).
Przedruki i uprawnienia
