Artykuł metodologiczny

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

DOI:

10.3791/52823

⸱

14 maja 2015

 , 
1Division of Cancer Research, College of Medicine, Dentistry and Nursing, University of Dundee

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność do różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy (ESC) do progenitorów nerwowych pozwala na badanie mechanizmów kontrolujących specyfikację neuronów, jak również generowanie dojrzałych typów komórek nerwowych do dalszych badań. W tym protokole opisujemy metodę różnicowania ESC do neuronalnych komórek progenitorowych przy użyciu monowarstwowej hodowli bez surowicy. Metoda jest skalowalna, wydajna i powoduje wytworzenie ~70% neuronalnych komórek progenitorowych w ciągu 4 - 6 dni. Może być stosowany do ESC z różnych odmian uprawianych w różnych warunkach. Neuronalne komórki progenitorowe mogą być dopuszczone do dalszego różnicowania się w funkcjonalne neurony i glej lub analizowane za pomocą mikroskopii, cytometrii przepływowej lub technik molekularnych. Proces różnicowania jest podatny na mikroskopię poklatkową i może być połączony z wykorzystaniem linii reporterowych do monitorowania procesu specyfikacji neuronalnej. Zapewniamy szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania pożywek i optymalizacji gęstości komórek, aby umożliwić zastosowanie procesu do większości linii ESC i różnych naczyń do hodowli komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embrionalne komórki macierzyste to pluripotencjalne komórki pochodzące z wczesnego zarodka, zdolne do rozmnażania się w nieskończoność in vitro, zachowując zdolność do różnicowania się we wszystkie typy dorosłych komórek po ponownym wprowadzeniu do odpowiedniego stadium zarodka (poprzez utworzenie chimery), wstrzyknięciu do syngenicznych lub z obniżoną odpornością gospodarzy (poprzez utworzenie potworniaka) lub in vitro pod warunkiem odpowiednich wskazówek1. Różnicowanie in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w linie nerwowe zostało po raz pierwszy opisane w 1995 roku i obejmowało tworzenie wielokomórkowych agregatów zawiesinowych (ciał zarodkowych, EB) w pożywkach zawierających surowicę uzupełnionych morfogenem kwasu retinowego2-4. Od tego czasu opracowano różne protokoły umożliwiające różnicowanie neuronalne5. Wiele z nich nadal wykorzystuje agregację, inne współhodują z indukującymi typami komórek, a niektóre wymagają użycia pożywek bez surowicy. Wszystkie protokoły mają zalety i wady, a dokładna natura wytwarzanych komórek nerwowych lub neuronalnych również różni się w zależności od zastosowanego protokołu.

Idealny protokół byłby solidny, skalowalny i wykorzystywałby w pełni zdefiniowane media i substraty, byłby podatny na nieinwazyjne monitorowanie procesu różnicowania i powodowałby generowanie czystych populacji neuronalnych progenitorów, które mogą być wzorcowane przez zewnętrzne sygnały i różnicować się we wszystkie podtypy neuronalne i glejowe z wysoką wydajnością i wydajnością w stosunkowo krótkim czasie. W ciągu ostatnich kilkunastu lat stosowaliśmy metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych i neuronów z mysiego ESC w niskiej gęstości, nieprzylegającej do surowicy hodowli jednowarstwowej6-10. Protokół ten spełnia wiele z wyżej wymienionych kryteriów: w naszych rękach skuteczność różnicowania jest dość stała od wielu lat, a różnorodność linii komórkowych może być skalowana w górę lub w dół (z powodzeniem używamy naczyń od płytek 96-dołkowych do szalek o średnicy 15 cm) oraz stosowane podłoża są dobrze zdefiniowane. Proces ten można poddać mikroskopii poklatkowej w celu monitorowania różnicowania, a różne wskazówki dotyczące wzorców mogą być dodawane w celu wywołania generowania różnych typów podtypów neuronów (np. Shh i Fgf8 dla neuronów dopaminergicznych6).

Niemniej jednak, istnieją pewne wyzwania dla pomyślnego zastosowania tego protokołu. Jednym z kluczowych aspektów jest staranne przygotowanie nośników. Media przygotowujemy zawsze we własnym zakresie, pomimo dostępności komercyjnych alternatyw. Jeden z zastosowanych suplementów (N2; patrz Protokół) ma modyfikacje w stosunku do standardowych wersji dostępnych na rynku. Wreszcie, jednym z najważniejszych kroków do skutecznego zastosowania tej metody jest optymalna gęstość komórek podczas posiewu. Dzieje się tak głównie dlatego, że podczas gdy autokrynny charakter jednego z sygnałów indukujących (Fgf411) wymaga, aby obecna była wystarczająca liczba komórek, aby umożliwić optymalną żywotność i różnicowanie, przy zbyt dużych gęstościach różnicowanie jest upośledzone (prawdopodobnie częściowo z powodu autokrynnej produkcji LIF12). Dlatego ważne jest, aby zarówno przygotowanie podłoża, jak i posiew komórek były wykonywane ostrożnie i konsekwentnie, aby zapewnić optymalne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie mediów

UWAGA: Protokół opiera się na użyciu mieszanki dwóch oddzielnych pożywek: DMEM/F12 uzupełnionego zmodyfikowanym suplementem N2 i Neurobasal uzupełnionego suplementem B27, zazwyczaj w stosunku 1:1.

  1. Przygotować zmodyfikowany suplement N2, mieszając składniki w probówce o pojemności 15 ml. Nie wiruj tego ani nie filtruj; Mieszać, odwracając probówkę, aż roztwór będzie klarowny.
    1. Rozpocząć od odpipetowania 7,2 ml DMEM/F12, następnie dodać 1 ml insuliny o stężeniu 25 mg/ml (uzupełnionej w 0,01 M HCl) i dobrze wymieszać, odwracając probówkę. Mija kilka minut, zanim roztwór będzie klarowny.
    2. Dodać 1 ml 100 mg/ml apo-transferyny (sporządzonej w wodzie), 33 μl 0,6 mg/ml progesternonu (sporządzonej w etanolu), 100 μl 160 mg/ml (1 M) putrescyny (sporządzonej w wodzie), 10 μl 3 mM seleninu sodu (sporządzonej w wodzie) i 666 μl 7,5% albuminy surowicy bydlęcej i dobrze wymieszać probówkę. Porcję rozpuścić w 2,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 miesięcy.
  2. Przygotuj nośnik.
    1. Do 250 ml DMEM/F12 dodać 2,5 ml N2. Dobrze wymieszaj, ale nie potrząsaj ani nie filtruj.
    2. Do 250 ml pożywki neuropodstawowej dodać 5 ml suplementu witaminy B27. Dobrze wymieszaj, ale nie potrząsaj ani nie filtruj.
    3. Wymieszaj podłoża z kroków 1.2.1 i 1.2.2 w stosunku 1:1. W niektórych przypadkach może być wymagana mieszanka 1:3 (uzupełniona jako mieszanka 1:1 w kroku 1.2.4).
    4. Do mieszanki dodać 0,5 ml L-glutaminy (stężenie końcowe 0,2 mM) i 3,5 μl 2-merkaptoetanolu (stężenie końcowe 0,1 mM) i dobrze wymieszać bez wstrząsania. Przechowuj media w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni i unikaj wystawiania ich na działanie światła. Ta ostateczna mieszanka nazywa się N2B27.
  3. Przygotuj roztwór żelatyny.
    1. Przygotować 1% roztwór żelatyny w ultraczystej wodzie i sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C, 15 psi, przez 15 minut. Ważne jest, aby używana do tego butelka była całkowicie czysta od detergentów lub środków dezynfekujących, dlatego zaleca się, aby używać do tego nowej butelki i płukać ją tylko w ultraczystej wodzie między użyciami. Podwielokrotność 1% roztworu rozdzielić na 50 ml porcji i przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy.
    2. Podwielokrotność 1% żelatyny należy podgrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C aż do rozpuszczenia i dodać do 500 ml ciepłej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Dobrze wymieszaj i odpipetuj tyle, aby pokryć dno każdej studzienki lub płytki. Pozostaw żelatynę na powierzchni przez co najmniej 30 minut.

2. Powlekanie komórek

UWAGA: Ten protokół stosuje się jednakowo do mysich ESC hodowanych w 10% surowicy z czynnikiem hamującym białaczkę (LIF), zastępowania surowicy LIF lub pożywki bez surowicy z LIF i białkiem morfogenetycznym kości 4 (BMP4) lub inhibitorami MEK i GSK3 (pożywka 2i) z LIF lub bez. Jednak czas i skuteczność różnicowania mogą się różnić w zależności od pożywki i komórek (patrz dyskusja). Do pokazanych tutaj eksperymentów użyliśmy mysiej linii ESC 46C (która ma reporter EGFP wbity w jeden z endogennych alleli Sox1), wyhodowaną w GMEM z 10% surowicą i LIF. Aby uzyskać optymalne wyniki, ważne jest, aby komórki zostały zdysocjowane i ponownie posiane w pożywce N2B27; zwykła zmiana pożywki z GMEM/surowicy/LIF na N2B27 zawsze skutkuje zmniejszoną wydajnością różnicowania w porównaniu z ponownym powlekaniem komórek.

  1. Hoduj komórki w GMEM z 10% surowicą, 1 mM pirogronianem sodu, 1x aminokwasami endogennymi, 0,1 M 2-merkaptoetanolem i 100 jednostkami/ml LIF13. Aby uzyskać subkonfluentną hodowlę mysiego ESC, umieść 1 x 106 komórek w kolbie hodowlanej T25, co zajmie 2-3 dni.
  2. Obserwuj komórki pod mikroskopem w jasnym polu. Gdy komórki są subkonfluentne i gotowe do przejścia, przepłucz je dwukrotnie w PBS. Dodać 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek i ponownie umieścić w inkubatorze na 2 - 5 minut. Chociaż trypsyna i inne enzymy mogą być również używane do dysocjacji komórek, mogą mieć negatywny wpływ na przyczepianie komórek, więc trzeba będzie dostosować gęstość posiewu.
  3. Gdy komórki zaczną się unosić z płytki, postukaj w naczynie, aby przemieścić je do zawiesiny pojedynczej komórki. Zebrać komórki do łącznie 10 ml pożywki i odczynnika do dysocjacji komórek, a następnie pipetować do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  4. Wiruj komórki w masie 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  5. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml wstępnie ogrzanego N2B27, pipetując w górę i w dół 3 - 5 razy. Podczas pipetowania zawiesiny należy pipetować do boku probówki, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub hemocytometru i zapisz stężenie.
  6. Przygotować zawiesinę komórek zawierającą żądaną liczbę komórek na jednostkę objętości, która ma być posiana na studzienkę we wstępnie ogrzanym N2B27. Optymalna jest gęstość 10 500 komórek nacm2 w naczyniu 6-dołkowym (tj. 1 x 105 komórek na dołek naczynia 6-dołkowego). W tabeli 1 przedstawiono sugerowaną liczbę komórek nacm2 oraz objętości pożywek galwacznych dla różnych naczyń do hodowli komórkowych.
  7. Odessać żelatynę z naczynia hodowlanego i umieścić zawiesinę komórek na płytce zgodnie z sugerowaną gęstością i objętością w tabeli 1. Nie obracaj płytek, ponieważ spowoduje to skoncentrowanie komórek do środka. Umieścić kultury w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  8. Zmieniaj pożywkę co 1-2 dni, wymieniając wszystkie nośniki na nowe N2B27. Pipetę należy delikatnie pipetować, ponieważ przepłukiwanie komórek może wpłynąć na gęstość i zmniejszyć efektywność różnicowania w ciągu następnych dni. Tam, gdzie początkowa żywotność po posiewie jest słaba, należy pokryć komórki mieszanką 1:3 pożywki uzupełnionej N2 i B27 i zmienić ją na N2B27 po pierwszych dwóch dniach. Komórki zaczną się różnicować i powinny wykazywać ekspresję Sox1 (widoczną przez zieloną fluorescencję reportera w zastosowanej tutaj linii komórkowej 46C) w ciągu 4 - 6 dni.

3. Barwienie immunofluorescencyjne

UWAGA: Protokół może być zastosowany do każdego typu statku. Objętość każdego odczynnika jest opisana na dołek płytki 6-dołkowej i może być skalowana do dowolnej powierzchni. Ponowne zakładanie nie jest zalecane ze względu na niską żywotność po zabiegu.

  1. Usunąć pożywkę różnicującą i utrwalić komórki, dodając 500 μl 4% (v/v) paraformaldehydu, pozostawić na 15 minut.
  2. Dwukrotnie przemyć i przepuścić komórki za pomocą 2 ml PBS-T (buforowana fosforanem soli fizjologicznej z 0,5% (v/v) tween-20). Komórki mogą być przechowywane w PBS-T przez okres do 2 miesięcy w temperaturze 4 °C.
  3. Zastąp PBS-T 1 ml PBS-T z 10% (v/v) surowicą (tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe). Inkubuj przez 1 godzinę na wahaczu płyty w punkcie RT, aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania.
  4. Po 1 godzinie przemyć komórki dwukrotnie 2 ml PBS-T i inkubować w 500 μl mysiej IgG przeciwko βIII-tubulinie (rozcieńczonej 1:1000 w PBS-T z 10% surowicą). Założyć na talerz kołyskowy i pozostawić O/N w temperaturze 4 °C.
  5. Na tym etapie zawsze chroń naczynie przed światłem. Przemyj komórki dwukrotnie PBS-T, a następnie dodaj 500 μl znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała anty-mysiego IgG (rozcieńczonego do 2 μg/ml w PBS-T z 10% surowicą). Połóż go na kołysce talerza na 1 godzinę przy RT.
  6. Przepłucz komórki dwukrotnie PBS-T, a następnie dodaj 500 μl DAPI (rozcieńczonego do 0,5 μg/ml w PBS-T) i pozostaw na 5 minut.
  7. Ponownie umyj komórki i przechowuj je w PBS-T. Komórki są gotowe do sfotografowania i mogą być przechowywane przez okres do 2 tygodni w temperaturze 4 °C. Należy pamiętać, że sygnał GFP zanika z czasem, dlatego niewłaściwe jest porównywanie intensywności GFP komórek stałych i żywych lub komórek utrwalonych w różnym czasie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym eksperymencie użyliśmy liniikomórkowej 46C 14, embrionalnych komórek macierzystych myszy z endogennym reporterem Sox1-GFP, do śledzenia różnicowania neuronów. Korzystając z tej linii komórkowej, ekspresję Sox1, markera progenitora neuronalnego, można wykryć za pomocą zielonej fluorescencji. Gęstość posiewu jest kluczowym czynnikiem umożliwiającym różnicowanie neuronów. Embrionalne komórki macierzyste myszy umieszczono na 6-dołkowej płytce o różnej gęstości od 10 500 do 88 500 komórek/cm2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Monowarstwowy protokół różnicowania neuronalnego jest stosowany od ponad dekady6. Protokół jest wysoce wydajny, składa się ze zdefiniowanej pożywki i jest wykonany w systemie jednowarstwowym, co sprawia, że system jest bardziej odpowiedni do zastosowań przedklinicznych (np. badań przesiewowych leków). Istnieje jednak kilka krytycznych czynników, które decydują o skuteczności różnicowania. W tym artykule wskazano te czynniki i rozwiązanie dla każdej przeszkody.

Gęstość komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca została sfinansowana ze stypendium na rzecz Rozwoju i Promocji Nauki i Technologii od Ministerstwa Edukacji Tajlandii dla W.W. oraz grantów od Tenovus i Anonymous Trust dla M.P.S.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płodowa surowica bydlęcaLife Technologies10270-106
DMEM/F12Life Technologies11320-074
Neuropodstawowa średniaLife Technologies21103-049
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórekLife TechnologiesA11105-01
B-27 Suplement, bez surowicyLife Technologies17504-044
InsulinaSigmaI6634Rozpuścić za pomocą sterylnego 0,01 M HCl
Apo-transferynySigmaT1147Rozpuścić w sterylnej wodzie
ProgesteronSigmaP8783Rozpuścić w etanolu
PutrescynaSigmaP5780Rozpuścić w sterylnej wodzie
Selenin soduSigmaS5261Rozpuścić w jałowej wodzie
Frakcja albuminy bydlęcej VLife Technologies15260-037
L-GlutaminaLife Technologies25030-081Upewnij się, że jest całkowicie rozpuszczona przed użyciem, ponieważ glutamina jest zwykle sedymentowana
ŻelatynaSigmaG1890
6-dołkowe naczynie do hodowli tkankowychThermo Scientific140675
24-dołkowe naczynie do hodowli tkankowychThermo Scientific142475
96-dołkowe naczynie do hodowli tkankowychThermo Scientific167008
GMEMLife Technologies11710-035
MEM Roztwór aminokwasów endogennychLife Technologies11140-050
Pirogronian soduLife Technologies11360-070
2-merkaptoetanolSigmaM7522
Czynnik hamujący białaczkęprzygotowany we własnym zakresie, jak w Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods
Tween-20SigmaP1379
4′,6-dichlorowodorek dichlorowodorku 6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI)SigmaD9542Chronić przed światłem
Mysz anty β III tubulina Przeciwciało IgGCovanceMMS-435P
Znakowane fluorescencyjnie przeciwciało anty-mysie IgGLife TechnologiesA31571Chronić przed światłem
25 cm2 kolba do hodowli tkankowychThermo Scientific156367

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, A. G. Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).
  2. Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
  3. Fraichard, A., et al. In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons. J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).
  4. Strubing, C., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons. Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).
  5. Stavridis, M. P., Smith, A. G. Neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).
  6. Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).
  7. Ying, Q. L., Smith, A. G. Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).
  8. Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification. Development. 134, 2889-2894 (2007).
  9. Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation. Development. 137, 881-890 (2010).
  10. Speakman, C. M., et al. Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition. Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).
  11. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134, 2895-2902 (2007).
  12. Dani, C., et al. Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway. Dev Biol. 203, 149-162 (1998).
  13. Smith, A. G. Culture and differentiation of embryonic stem cells. Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).
  14. Aubert, J., et al. Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).
  15. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).
  16. Silva, J., Smith, A. Capturing pluripotency. Cell. 132, 532-536 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hodowla bezsurowiczapowlekanie elatynoptymalizacja g sto ci kom rekmikroskopia immunofluorescencyjnacytometria przep ywowareporter GFP SOX1beta III tubulina

Powiązane artykuły