Ten artykuł opisuje szczegółowy protokół do wywołania urazu kłutym przodomózgowia u dorosłych myszy. Rana kłuta indukuje ciężką reaktywną glejozę i tworzenie się blizn glejowych, które można następnie zbadać za pomocą standardowych metod immunohistochemicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wywoływanie reaktywnej glejozy in vivo przez uraz kłuty przodomózgowia
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Po uszkodzeniu OUN, astrocyty przechodzą szeroki zakres zmian biochemicznych, morfologicznych i molekularnych, określanych zbiorczo jako astroglejoza reaktywna. Reaktywne astrocyty wywierają zarówno działanie zapalne, jak i ochronne, które odpowiednio hamują i promują naprawę neuronów. Mechanizmy leżące u podstaw różnorodnych właściwości funkcjonalnych astroglejozy reaktywnej nie są dobrze poznane. Lepsze zrozumienie tych mechanizmów ma kluczowe znaczenie dla opracowania strategii terapeutycznych w leczeniu uszkodzonego OUN. Tutaj pokazujemy metodę wywoływania reaktywnej astroglejozy w przodomózgowiu dorosłej myszy za pomocą zmiany kłutej w przodomózgowiu. Ten model zmiany jest prosty, niezawodny i wymaga jedynie urządzenia stereotaktycznego i ostrza skalpela, aby spowodować uraz. Wykorzystanie zmian kłutych jako modelu urazu w przodomózgowiu jest dobrze ugruntowane i podatne na badania dotyczące szerokiego zakresu skutków neuropatologicznych, takich jak zwyrodnienie neuronów, zapalenie nerwów i zaburzenia bariery krew-mózg (BBB). W związku z tym model urazu kłutego przodomózgowia służy jako potężne narzędzie, które można zastosować w szerokim zakresie badań nad reakcją OUN na uraz.
Wprowadzenie
Głównym wyzwaniem dla opracowania skutecznych terapii leczenia uszkodzonego OUN jest niepełne zrozumienie złożonych zdarzeń wielokomórkowych, które są wywoływane przez uraz. Reaktywne astrocyty zyskują coraz większe uznanie jako obiecujący cel dla nowych terapii1. Chociaż historycznie uważane za wrogie naprawie neuronów, reaktywne astrocyty są obecnie uznawane za krytyczne składniki złożonej, wielokomórkowej odpowiedzi neuroprotekcyjnej, która obejmuje tłumienie procesów zapalnych i ograniczanie wtórnych uszkodzeń i neurodegeneracji2-6. Chociaż neuropatologiczne cechy glejozy reaktywnej są już dawno dobrze zdefiniowane, mechanizmy komórkowe i mol....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Dorosłe (3-4 miesiące) samce myszy na mieszanym tle C57BL/6 zostały użyte w tym protokole. Zwierzęta były trzymane w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i miały swobodny dostęp do jedzenia i wody. Wszystkie procedury wykonane w tym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Drexel.
1. Przygotowanie pola operacyjnego
- Zdezynfekuj stół chirurgiczny 70% etanolem, następnie przykryj cały stół operacyjny wkładkami chłonnymi i ułóż narzędzia chirurgiczne w sąsiedztwie stereotaksji.
- Skonfiguruj sprzęt stereotaktyczny bez ramienia manipulato....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Ponieważ zwierzęta poddawane tej procedurze nie wymagają specjalistycznej opieki pooperacyjnej, w badaniu można łatwo uwzględnić krótkie lub długie okresy przeżycia, w zależności od potrzeby zbadania patologii ostrej lub przewlekłej po urazie. Główne cechy glejozy reaktywnej, takie jak zwiększona ekspresja GFAP i hipertrofia somy, mogą być obserwowane już 2-3 dni po urazie. Szczytowa faza proliferacji astrocytów reaktywnych przypada na dni 3-5 po urazie10. Przedstawione poniżej reprezentatywne wyniki pochodzą .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Bardzo ważne jest, aby czaszka lub leżąca pod nią opona twarda nie zostały uszkodzone podczas wiercenia. Podczas wiercenia należy lekko naciskać, aby upewnić się, że czaszka nie jest przebita. Ponadto należy zachować ostrożność podczas podnoszenia części czaszki, aby upewnić się, że opona twarda nie zostanie oderwana wraz z kością.
Opisany tutaj uraz kłuty przodomózgowia modeluje penetrujący uraz OUN. Chociaż mniej przekładalny klinicznie niż modele TBI, takie jak FPI lub CCI, model zmiany ukł.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy Katherine Clark za pomoc techniczną. A.D.R.G. jest częściowo finansowany przez 5K01MH097957-03
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Stereotax | Harvard Apparatus | 726049 | |
| Szybkobieżne mikrowiertło | Ostrze | 724950 | |
| #11 | MedVet | JOR581S | |
| 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Gąbka żelpiankowa 12 cm x 7 mm | Fisher | NC9841478 | |
| Rb anty-GFAP | DAKO | Z033429-2 | Rozcieńczenie - 1:20 000 (jasne pole); 1:1,000 (fluorescencja) |
| Shp anty-BrdU | Abcam | ab1893 | Rozcieńczenie - 1:20,000 (jasne pole); 1:500 (fluorescencja) |
| Biotynylowany kozioł anty-królik | Vector Laboratories | BA-1000 | Rozcieńczenie - 1:400 (jasne pole) |
| Biotynylowany królik anty-owce | Vector Laboratories | BA-6000 | Rozcieńczenie - 1:400 (jasne pole) |
| Alexafluor 488 koza anty-królik | Life Technologies | A-11008 | Rozcieńczenie - 1:400 (jasne pole) |
| Alexafluor 568 osły anty-owce | Life Technologies | A-21099 | Rozcieńczenie - 1:1,000 (fluorescencja) |
| DAPI Kwas nukleinowy Stain | Life Technologies | D3571 | Rozcieńczenie - 1:1,000 (fluorescencja) |
| Octan fioletu krezylowego | Sigma Aldrich | C5042-10G | Rozcieńczenie - 1% (jasne pole) |
Bibliografia
- Hamby, M. E., Sofroniew, M. V. Reactive astrocytes as therapeutic targets for CNS disorders. Neurotherapeutics. 7 (4), 494-506 (2010).
- Bush, T. G., et al. Leukocyte infiltration, neuronal degenerati....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
