Artykuł metodologiczny

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52827

⸱

15 września 2015

 , 
1Department of Biology, Concordia University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Streszczenie

Technologie metaomiczne, takie jak metagenomika, metatranskryptomika i metaproteomika, mogą pomóc w zrozumieniu struktury i metabolizmu społeczności drobnoustrojów. Chociaż metagenomika jest potężna, sama w sobie może jedynie wyjaśnić potencjał funkcjonalny. Z drugiej strony, metaproteomika umożliwia opis wyrażonego in situ metabolizmu i funkcji zbiorowiska. W tym miejscu opisujemy protokół lizy komórek, izolacji białek i DNA, a także trawienia i ekstrakcji peptydów z morskich komórek drobnoustrojów zebranych na jednostce filtrującej z wkładem (takiej jak jednostka filtrująca Sterivex) i przechowywanej w roztworze stabilizującym RNA (takim jak RNAlater). W badaniach proteomicznych opartych na spektrometrii mas identyfikacja peptydów i białek odbywa się poprzez porównanie widm masowych tandemowych peptydów z bazą danych translowanych sekwencji nukleotydów. Uwzględnienie metagenomu próbki w bazie danych wyszukiwania zwiększa liczbę peptydów i białek, które można zidentyfikować na podstawie widm masowych. W związku z tym w tym protokole DNA jest izolowane z tego samego filtra, który może być następnie wykorzystany do analizy metagenomicznej.

Wprowadzenie

Mikroorganizmy są wszechobecne i odgrywają istotną rolę w cyklach biogeochemicznych Ziemi 1. Obecnie dostępnych jest wiele podejść molekularnych do charakteryzowania struktury i funkcji społeczności drobnoustrojów. Najczęściej spotykana jest analiza sekwencji genów 16S rRNA amplifikowanych metodą PCR ze środowiskowego DNA 2–4. Wadą analizy genu 16S rRNA jest to, że dostarcza ona jedynie informacji na temat tożsamości filogenetycznej i struktury społeczności, z niewielką ilością informacji na temat funkcji metabolicznej. Natomiast podejścia takie jak metagenomika, metatranskryptomika i metaproteomika dostarczają informacji na temat struktury społeczności i metabolizmu. Metagenomika, czyli analiza zawartości genów w zbiorowisku organizmów, dostarcza informacji o strukturze i potencjale funkcjonalnym zbiorowiska 5–8. Chociaż ten potencjał funkcjonalny jest silny, może nie odpowiadać aktywności metabolicznej organizmów. Genotyp organizmu jest reprezentowany przez jego geny, z których każdy może być transkrybowany do RNA i dalej tłumaczony na białko, co daje fenotyp. Dlatego, aby pomóc w zrozumieniu funkcjonalnej aktywności mikrobiologicznej w środowisku, należy przeprowadzić analizę postgenomiczną 9. Metatranskryptomika, czyli analiza transkryptów RNA, jest przydatna, ponieważ ujawnia, które geny są transkrybowane w danym środowisku. Jednak poziomy mRNA nie zawsze odpowiadają odpowiadającym im poziomom białka ze względu na regulację translacyjną, okres półtrwania RNA oraz fakt, że dla każdego mRNA 10 można wygenerować wiele kopii białka.

Z tych powodów metaproteomika jest obecnie uznawana za ważne narzędzie mikrobiologii środowiskowej. Powszechne analizy metaproteomiczne wykorzystują podejście proteomiczne typu shotgun, w którym prawie pełny zestaw białek w złożonej próbce jest jednocześnie oczyszczany i analizowany, zwykle poprzez trawienie enzymatyczne do peptydów i analizę na spektrometrze masowym. Późniejsza tandemowa spektrometria mas (MS/MS) "odcisk palca peptydu" jest stosowana do określenia sekwencji peptydów i potencjalnego białka pochodzenia poprzez przeszukiwanie bazy danych białek (w celu zapoznania się z przeglądem patrz 11). Prace proteomiczne przeszły długą drogę w ciągu ostatnich 25 lat dzięki zwiększonej dostępności danych genomicznych oraz wzrostowi czułości i dokładności spektrometrów masowych, co pozwala na wysokoprzepustową identyfikację i kwantyfikację białek 11,12. Ponieważ białka są końcowym produktem ekspresji genów, dane metaproteomiczne mogą pomóc w ustaleniu, które organizmy są aktywne w danym środowisku i jakie białka eksprymują. Jest to korzystne przy próbie określenia, w jaki sposób określony zestaw zmiennych środowiskowych wpłynie na fenotyp organizmu lub społeczności. Na wczesnym etapie badania metaproteomiczne oparte na MS/MS w oceanie wykorzystano do identyfikacji określonych białek w docelowych liniach drobnoustrojów, przy czym pierwsze badanie koncentrowało się na napędzanej światłem proteorodopsyny pompy protonowej w bakteriach morskich SAR11 13. Niedawne analizy metaproteomiczne pozwoliły na wyjaśnienie zróżnicowanych wzorców ekspresji białek w złożonych społecznościach. Przykładem może być identyfikacja czasowych zmian w metabolizmie na wybrzeżu północno-zachodniego Oceanu Atlantyckiego 14 lub na Półwyspie Antarktycznym 5. Inne badania opisywały różnice we wzorcach ekspresji białek w różnych skalach przestrzennych, na przykład wzdłuż geograficznego transektu od wiru oceanicznego o niskiej zawartości składników odżywczych do wysoce produktywnego przybrzeżnego systemu upwellingu 15. W celu dalszych przeglądów metaproteomiki polecamy Schneider i in. (2010) 9 oraz Williams i wsp. (2014) 16. W ostatnich latach zastosowano również ukierunkowaną proteomikę w celu ilościowego określenia ekspresji określonych szlaków metabolicznych w środowisku 17,18.

Istnieją trzy główne fazy analizy metaproteomicznej. Pierwszą fazą jest przygotowanie próbki, która obejmuje pobranie próbki, lizę komórek i koncentrację białka. Pobieranie próbek w mikrobiologii morskiej często obejmuje filtrację wody morskiej przez filtr wstępny w celu usunięcia większych komórek eukariotycznych, cząstek i bakterii związanych z cząstkami, a następnie filtrację w celu wychwycenia wolno żyjących komórek drobnoustrojów, zwykle przy użyciu jednostki filtrującej z wkładem 0,22 μm 19,20. Filtry te są zamknięte w plastikowym cylindrze, a protokół lizy komórek i ekstrakcji białek, który można przeprowadzić w jednostce filtrującej, byłby cennym narzędziem. Po uzyskaniu biomasy komórki muszą zostać poddane lizie, aby umożliwić ekstrakcję białka. Można zastosować kilka metod, w tym lizę glizy na bazie chlorowodorku guanidyny 21 i metody lizy oparte na dodecylosiarczanie sodu (SDS). Chociaż detergenty, takie jak SDS, są bardzo skuteczne w niszczeniu błon i rozpuszczaniu wielu rodzajów białek, stężenia tak niskie jak 0,1% mogą zakłócać trawienie białek i analizę SM 22. Poważne zaniepokojenie budzi negatywny wpływ SDS na efektywność trawienia trypsyny, zdolność rozdzielczą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami oraz tłumienie lub akumulację jonów wewnątrz źródła jonów 23.

Druga faza to frakcjonowanie i analiza, gdzie białka są poddawane trawieniu enzymatycznemu, a następnie analizie LC MS/MS, co daje wzór fragmentacji m/z, który może być użyty do ustalenia podstawowej sekwencji aminokwasowej początkowego peptydu tryptycznego. Można przeprowadzić różne metody mineralizacji w zależności od rodzajów użytych detergentów, a także dalszego przebiegu spektrometrii mas. W naszym protokole elektroforeza 1-D PAGE, po której następuje usunięcie SDS z żelu, jest stosowana w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń detergentem. Analiza białek, które są trudne do rozpuszczenia, takich jak białka błonowe, wymaga użycia wysokich stężeń SDS lub innych detergentów. Prowadzi to do problemów z kompatybilnością z elektroforezą żelową SDS. Jeśli cel badania wymaga solubilizacji tych trudnych do rozpuszczania białek, można zastosować system rurka-żel 22,24. Metoda rurkowo-żelowa polega na włączeniu białek do matrycy żelowej bez użycia elektroforezy. Następnie wszelkie detergenty używane do rozpuszczania są usuwane przed trawieniem białka.

Trzecia faza to analiza bioinformatyczna. W tej fazie dane dotyczące peptydów MS/MS są przeszukiwane w bazie danych translowanych sekwencji nukleotydów w celu określenia, które peptydy i białka są obecne w próbce. Identyfikacja peptydów zależy od bazy danych, w której są przeszukiwane. Dane metaproteomiczne morskie są często przeszukiwane w bazach danych składających się z genomów referencyjnych, danych metagenomicznych, takich jak zestaw danych Global Ocean Sampling 25, a także genomów amplifikowanych pojedynczymi komórkami z nieuprawianych linii 26,27. Identyfikacja białek może być również zwiększona poprzez włączenie sekwencji metagenomicznych z tej samej próbki, z której uzyskano dane metaproteomiczne 5.

Tutaj udostępniamy protokół generowania peptydów odpowiednich do analizy opartej na MS/MS z biomasy mikrobiologicznej zebranej przez filtrację i przechowywanej w roztworze stabilizującym RNA. Opisany tutaj protokół pozwala na wyizolowanie DNA i białka z tej samej próbki, tak aby wszystkie etapy prowadzące do wytrącenia białka i DNA były identyczne. Z praktycznego punktu widzenia wymagana jest mniejsza filtracja, ponieważ do ekstrakcji białek i DNA wymagany jest tylko jeden filtr. Pragniemy również potwierdzić, że protokół ten powstał w wyniku połączenia, adaptacji i modyfikacji dwóch wcześniej opublikowanych protokołów. Etapy lizy komórek są zaadaptowane z Saito i in. (2011) 28, a składnik trawienia trypsyny w żelu jest zaadaptowany z Shevchenko i in. (2007) 29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotuj odczynniki

  1. Przygotować roztwór ekstrakcyjny SDS: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5 % glicerol, 10 mM EDTA i 1 % SDS. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotować podstawowe odczynniki potrzebne do żelu poliakrylamidowego.
    1. Przygotować 1,5 M Tris-HCL pH 8,8. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. 0,5 M Tris-HCL pH 6,8. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować 10 % SDS. Filtr sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  3. Przygotuj roztwory potrzebne do trawienia trypsyny w żelu i ekstrakcji peptydów.
    1. Przygotować 100 mM wodorowęglanu amonu. Filtrować-sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotuj akcje 1 mln DTT. Zawieszony w 100 mM wodorowęglanie amonu i przechowywany w temperaturze -80 °C.
    3. Przygotuj 550 mM zapasów jodoacetamidu. Zawieszony w 100 mM wodorowęglanie amonu i przechowywany w temperaturze -80 °C.
    4. Przygotuj zapasy trypsyny 100 ng/μl. Porcję 60 μl rozlać do 1,5 ml probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    5. Przygotować roztwór ekstrakcyjny: 1% kwas mrówkowy, 2% acetonitryl.
    6. Przygotować roztwór do ponownego spożycia: 5% acetonitrylu i 0,1% kwasu mrówkowego.

2. Przeprowadź lizę komórek w jednostce filtrującej z wkładem z komórkami zachowanymi w roztworze stabilizacji RNA

  1. Usunąć roztwór stabilizujący RNA z zespołu filtrującego z wkładem filtrującym (1,5 ml) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml dołączonej na końcu filtra typu luer-lock.
  2. Odwirować probówkę mikrowirówkową o pojemności 2 ml przez 10 minut przy 17 000 x g, aby osadzać wszelkie resztki komórkowe. Odbywa się to tak, aby filtr w kroku 2.3 nie zatykał się.
  3. Przenieść supernatant do ultraodśrodkowego filtra o temperaturze 10 K w celu wychwycenia wszelkich białek pochodzących z komórek, które uległy lizie w wyniku zamrożenia/rozmrożenia próbki. Nie wyrzucaj granulek. Zostanie on użyty w kroku 2.5. Odwirować ultraodśrodkową jednostkę filtracyjną przy 3 270 x g przez 30 minut lub do momentu, gdy objętość zmniejszy się do około 600 μl.
  4. Stopić końcówkę końcówki p10 i zablokować stronę filtra nabojowego bez luer-lock otwartym końcem końcówki. Zapewni to, że bufor ekstrakcyjny i biomasa nie wydostaną się na zewnątrz podczas etapów 2.5-2.7.
  5. Zawiesić granulkę w 1 ml roztworu ekstrakcyjnego SDS i pipetować ją do oryginalnego wkładu filtrującego. Najprostszym sposobem pipetowania do zespołu filtrującego z wkładem jest ułożenie końcówki p200 na końcówce p1000 i używanie tej podwójnej końcówki do pipetowania.
  6. Dodać 1 ml roztworu ekstrakcyjnego SDS do jednostki filtrującej z wkładem, tak aby całkowita objętość wynosiła około 2 ml i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, obracając w piecu do hybrydyzacji. Umieść 3 pogniecione chusteczki laboratoryjne na dnie stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Parafilm oba końce wkładu filtracyjnego zamknęły się i włożyły wkład filtrujący do probówki o pojemności 50 ml. Zamknij pokrywkę i włóż rurkę do pieca do hybrydyzacji.
  7. Po 10 minutach umieść filtr Sterivex na piankowym pływaku i zabezpiecz go strzykawką o pojemności 5 ml na końcu typu luer-lock. Pływać i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 95 °C przez 15 minut.
  8. Pozwól jednostce filtrującej z wkładem ostygnąć i obracaj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę (jak w kroku 2.6).
  9. Za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml usunąć roztwór ekstrakcyjny SDS/lizat komórkowy z filtra do tego samego ultraodśrodkowego zespołu filtracyjnego, co poprzednio (krok 2.3). Dodać 1 ml świeżego roztworu ekstrakcyjnego SDS do jednostki filtrującej z wkładem i mieszać ręcznie przez 30 sekund, a następnie wytłoczyć do ultraodśrodkowego zespołu filtrującego za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml. Ma to na celu przepłukanie jednostki filtrującej wkład, aby upewnić się, że wszystkie białka zostały usunięte.
  10. Odwirować na ultraodśrodkowym zespole filtrującym przez 45 minut przy 3 270 x g lub do momentu, gdy objętość w jednostce filtrującej będzie mniejsza niż 600 μl.
  11. Wyrzuć przepływowy i uzupełnij ultraodśrodkową jednostkę filtracyjną świeżym roztworem ekstrakcyjnym SDS.
  12. Odwirować jednostkę filtrującą przez kolejne 45 minut przy 3,270 x g.
  13. Powtórz kroki 2.11 i 2.12 jeszcze dwa razy. Upewnij się, że końcowa objętość w ultraodśrodkowym zespole filtrującym wynosi co najwyżej 600 μl na koniec ostatniego wirowania.
  14. W tym momencie podziel koncentrat na dwie części. Jedna frakcja zostanie wykorzystana do wytrącania DNA, a druga do wytrącania białek.
    Uwaga: Ilość frakcjonowania zależy od ilości biomasy, która została przefiltrowana i zamierzonych zastosowań produktów. W naszym przypadku dzielimy koncentrat z 10% w kierunku wytrącania DNA i 90% w kierunku wytrącania białka.

3. Wytrącanie białka

  1. Dodać 4 objętości metanolu:acetonu (50:50) do jednej objętości koncentratu i wirować przez 10 sekund. Inkubować przez noc w temperaturze -20 °C.
  2. Wirować z prędkością 17 000 x g przez 30 minut. Zdekantować supernatant i pozostawić granulkę (może być niewidoczna) do wyschnięcia w speedvacu przez 1 godzinę (lub do wyschnięcia).
    Uwaga: Nie należy nadmiernie suszyć granulek, ponieważ może to utrudnić jego ponowne zawieszenie.
  3. Zawiesić osad w 25 μl roztworu ekstrakcyjnego SDS. Odstawić na godzinę, a następnie ponownie zawiesić, pipetując w górę i w dół.
  4. Określ ilościowo białko za pomocą zestawu do oznaczania białek i instrukcji producenta.

4. Wytrącanie DNA

  1. Dodać roztwór ekstrakcyjny SDS do frakcji koncentratu, która ma być użyta do wytrącania DNA do oznaczenia 500 μl. Ten krok ma po prostu na celu zwiększenie objętości roztworu, co ułatwi pracę z nim.
  2. Dodać 0,583 objętości odczynnika do wytrącania białek (takiego jak odczynnik do wytrącania białek MPC) i wirować przez 10 sekund. Powinieneś zobaczyć białą formę osadu.
    Uwaga: Zastosowaliśmy również metody ekstrakcji DNA fenolu: chloroformu, ale jest to trudniejsze ze względu na małe objętości. Uzyskaliśmy lepszą wydajność DNA przy użyciu odczynnika do wytrącania białek MPC.
  3. Wirować przy 17 000 x g i 4 °C przez 10 min.
  4. Przenieść supernatant do kolejnej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i dodać 0,95 objętości izopropanolu. Odwróć 30-40 razy.
  5. Wirować przez 10 minut w temperaturze 4 °C z maksymalną prędkością.
  6. Ostrożnie zdekantować i wyrzucić supernatant.
  7. Spłukać dwukrotnie 750 μl 70% etanolu.
  8. Usunąć jak najwięcej etanolu za pomocą pipetowania, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.
    Uwaga: Nie należy przesuszać DNA, ponieważ może to utrudnić jego ponowne zawieszenie.
  9. Zawiesić w 25 μl buforu o niskim poziomie TE, pH 8 (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA).
  10. Określ ilościowo DNA za pomocą zestawu do oznaczania dsDNA i instrukcji producenta. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym (1%) na 3 μl DNA, aby sprawdzić jego jakość.

5. SDS-PAGE Żel z białek

  1. Przygotować bufor do próbek (950 μl buforu do próbek Laemmliego i 50 μl β-merkaptoetanolu).
  2. Dodać odpowiednią objętość na 15 μg białka lub maksymalnie 20 μl do równej objętości buforu próbki i gotować przez 4 minuty. Próbki można teraz przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu wykonania SDS-PAGE.
  3. Przygotuj 10% żel rozpuszczający akryloamid z 5% żelem do układania w stosy.
  4. Załadować żel próbkami i 4 μl drabinki białkowej. Uruchom żel przy stałym napięciu 120 V, aż znacznik drabinkowy 250 kDa dotrze do żelu rozdzielczego.
  5. Zabarwić żel za pomocą bejcy na bazie coomassie zgodnie z instrukcjami producenta.

6. Trawienie trypsyny w żelu i ekstrakcja peptydów

Uwaga: Wszystkie kroki od tego momentu do 6.10 są wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować zanieczyszczenie.

  1. Odetnij nadmiar żelu pod znakiem drabiny 10 kDa dla każdego pasa. Każdy pas ruchu będzie analizowany na MS/MS osobno. Pokrój każdą linię na kwadraty o wymiarach 1 mm x 1 mm, aby zwiększyć powierzchnię, a następnie umieść wszystkie kwadraty z pasa w nisko wiążącej probówce do mikrowirówki. Powtórz to dla wszystkich pasów ruchu. (Można użyć 1% kwasu octowego, aby zapobiec wysychaniu żelu i trudnościom w cięciu).
    Uwaga: Minimalizacja zanieczyszczenia ma kluczowe znaczenie na tym etapie, dlatego krojenie żelu odbywa się w komorze bezpieczeństwa biologicznego na szklanej formie żelowej SDS-PAGE używanej do produkcji żelu.
  2. Usuwanie plam
    1. Dozować 50 μl 100 mM wodorowęglanu amonu do każdej probówki o niskim stopniu wiązania, zamknąć nakrętkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
    2. Dozować 50 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
    3. Odessać i wyrzucić 150 μl.
    4. Powtórz kroki 6.2.1 i 6.2.2.
    5. Odessać i wyrzucić 95 μl.
  3. odwodnienie
    1. Dozować 50 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i odczekać 5 min. Odessać i wyrzucić 45 μl i odczekać 10 min.
  4. redukcja
    1. Dozować 50 μl naziemnej telewizji cyfrowej (10 mM, rozcieńczony w 100 mM wodorowęglanu amonu), zamknąć nakrętkę i odczekać 30 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Alkilowania
    1. Dozować 50 μl jodoacetamidu (55 mM, rozcieńczonego w 100 mM wodorowęglanu amonu), zamknąć nakrętkę i odczekać 20 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dozować 100 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Odessać i wyrzucić 195 μl.
  6. myć
    1. Dozować 50 μl wodorowęglanu amonu, zamknąć nakrętkę i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dozować 50 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min. Odessać i wyrzucić 120 μl.
  7. odwodnienie
    1. Dozować 50 μl acetonitrylu, zamknąć nakrętkę i odczekać 5 min. Odessać i wyrzucić 45 μl.
    2. Dozować 50 μl acetonitrylu, odczekać 5 minut.
    3. Odessać i wyrzucić 75 μl i odczekać 5 minut.
  8. trawienie
    1. Dozuj 25-30 μl 6 ng/μl trypsyny (aż wszystkie fragmenty żelu zostaną pokryte). Zamknij nakrętkę i odczekaj 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Inkubować przez noc (minimum 4,5 godziny) w temperaturze 37 °C.
    3. Odstawić w temperaturze pokojowej na 30 minut.
  9. Ekstrakcja i transfer peptydów
    1. Dozować 30 μl roztworu ekstrakcyjnego i przykryć pokrywką na 30 minut na lodzie.
    2. Odessać 30 μl i dozować zasysaną objętość do nowej, oznakowanej probówki o niskiej zawartości wiązania.
    3. Dozować 12 μl roztworu ekstrakcyjnego i 12 μl acetonitrylu do oryginalnej probówki (z żelem). Zamknij nakrętkę i inkubuj przez 30 minut na lodzie.
    4. Odessać 15 μl i umieścić w nowej probówce.
    5. Powtórz kroki (6.9.3 i 6.9.4).
  10. Umieść nowe rurki w SpeedVac do wyschnięcia.
  11. Zawiesić w 50 μl roztworu do refuzji. Wirować na podłożu przez 10 minut, aby ponownie zawiesić.
  12. Odpipetować roztwór peptydu do fiolek nano/LC lub płytek 96-dołkowych odpowiednich do pracy nano/LC MS/MS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W ramach demonstracji przeprowadziliśmy protokół na dwóch próbkach wody morskiej pobranych z powierzchni oraz z maksimum chlorofilu w oceanie przybrzeżnym w północnej Kanadzie. Podczas rejsu 6-7 L wody morskiej przepuszczono przez filtr wstępny GF/D 3 µm, a następnie komórki mikrobowe zebrano na wkład filtracyjny 0,22 µm zgodnie z protokołem Walsh et al. 20. Komórki natychmiast przechowywano w roztworze stabilizującym RNA do czasu dalszej obróbki. Po powrocie do laboratorium przeprowadziliśmy protokół...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Konserwacja próbki jest kluczem do badań metaproteomicznych, a wcześniejsze prace wykazały, że roztwór stabilizujący RNA jest użytecznym buforem do przechowywania komórek przed ekstrakcją białka 28. Idealnie byłoby, gdyby próbki były przechowywane in situ , aby zanegować zmiany w ekspresji białek podczas obchodzenia się z 33,34. W rzeczywistości opracowano technologie pobierania próbek i utrwalania in situ , które pozwalają na autonomiczne pobieranie i przechowywanie próbek za pomo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Marcosowi Di Falco za jego wiedzę i porady dotyczące przygotowania próbek do nano-LC MS/MS, a także dr Zoranowi Musikowi z University of Regina za analizę LC MS/MS. Prace te były wspierane przez NSERC (DG402214-2011) i CRC (950-221184). Waszyngton był wspierany przez Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems oraz FQRNT.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sterivex -GP 0,22 μ m jednostka filtrującaMilliporeSVGP01050Próbkowanie
RNAlater Roztwór stabilizacyjnyAmbionAM7021Próbkowanie
Tris Bio Basic77-86-1 lub TB0196-500G Ekstrakcjabiałka / SDS PAGE żel
DTTSigma-AldrichD0632-1GEkstrakcja białka
SDSBio Basic15-21-3Ekstrakcja białka / SDS PAGE żel
EDTABio Basic6381-92-6Ekstrakcja białka
GlicerolFisher Scientific56-81-5Ekstrakcja białka
10K Amicon FilterMilliporeUFC801024Ekstrakcja białek
MetanolSigma-Aldrich179337-4L
Aceton AcetonFisher Scientific67-64-1Odczynnik do wytrącania
białek MPCEpicentermmP03750Wytrącanie DNA
2-propanolFisher Scientific67-63-0Wytrącanie DNA
Zestaw do oznaczania ilościowego DNA Qubit dsDNA BRLife TechnologiesQ32850Zestaw do oznaczania ilościowego DNA
Qubit Protein Zestaw do oznaczania białekLife TechnologiesQ33211Kwantyfikacja białek
SacharozaBio Basic57-50-1SDS PAGE żel
TEMBio Rad161-0800SDS PAGE
APSBio Rad161-0700SDS PAGE żel
30% AkrylamidBio Rad161-0158Żel SDS PAGE
SimplyBlue SafeStainInvitrogenLC6060Żel SDS PAGE
GlicynaBio Rad161-0718SDS PAGE
B-merkaptoetanolBio Basic60-24-2SDS PAGE
żel Laemmli Bufor do próbekBio Rad161-0737SDS PAGE żel
Precision Plus Białko Kalejdoskop DrabinkaBio Rad161-0375EDUSDS PAGE żel
AcetonitrylVWRCABDH6044-4W żelu Trypsyna
NH4HCO3Bio Basic1066-33-7Płyn do trawienia trypsyny w żelu
DTTSigma-AldrichD0632-1GTrawienie trypsyny w żelu
Kwas mrówkowySigma-AldrichF0507-500MLTrawienie
HPLC klasa H2OSigma-Aldrich270733-4LW żelu Trawienie trypsyny
JodoacetamidBio Basic144-48-9Trawienie trypsyny w żelu
TrypsynaPromegaV5111Trawienie trypsyny w żelu
Białko LoBind Tube 1,5 mlEppendorf22431081Trawienie trypsyny w żelu
2 ml Fiolka ROBO 9 mmCandian Life ScienceVT009/C395SBTrawienie trypsyny w żelu
Wkładka PP BM, bez sprężynyCandian Life Science4025P-631Trawienie trypsyny w żelu
żel żel trypsyny w żelu

Bibliografia

  1. Madsen, E. L. Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles. Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).
  2. El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton. Environmental microbiology. , (2014).
  3. Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean. The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).
  4. Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972(1986).
  5. Williams, T. J., Long, E., et al. A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters. The ISME journal. 6 (10), (2012).
  6. Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics. Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).
  7. Venter, J. C., Remington, K., et al. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea. Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).
  8. Tyson, G. W., Chapman, J., et al. Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment. Nature. 428, 37-43 (2004).
  9. Schneider, T., Riedel, K. Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities. Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).
  10. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).
  11. Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities. Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).
  12. Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology. The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).
  13. Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11. Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).
  14. Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton. The ISME journal. , 1-13 (2014).
  15. Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction. The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).
  16. Williams, T. J., Cavicchioli, R. Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web. Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).
  17. Saito, M. a, McIlvin, M. R., et al. Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers. Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).
  18. Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton. Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).
  19. Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters. Methods in enzymology. 531, Elsevier Inc. 305-329 (2013).
  20. Da Walsh,, Zaikova, E., Hallam, S. J. Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples. Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).
  21. Thompson, M., Chourey, K. Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples. Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).
  22. Lu, X., Digestion Zhu, H. Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).
  23. Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization. Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).
  24. Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).
  25. Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific. PLoS biology. 5 (3), e77(2007).
  26. Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean. Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).
  27. Rinke, C., Schwientek, P., et al. Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter. Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).
  28. Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection. Frontiers in microbiology. 2, 215(2011).
  29. Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).
  30. Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3(2012).
  31. Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. MEGAN analysis of metagenomic data. Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).
  32. Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4. Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).
  33. Ea Ottesen,, Marin, R., et al. Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton. The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).
  34. Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system. The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja bia ekizolacja DNAgenerowanie peptyd w tryptycznychfiltr ultracentryfu owyprecypitacja bia ekprecypitacja DNAtrawienie trypsynowe w eluanaliza metagenomiczna

Powiązane artykuły