Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

15.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52831

⸱

29 lipca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Würzburg, 2Institute of Reconstructive Neurobiology, University of Bonn, 3German Cancer Research Center, Heidelberg

W tym artykule

Podsumowanie

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Streszczenie

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z dorosłych fibroblastów skóry i późniejsze różnicowanie się w komórki somatyczne dostarcza fascynujących perspektyw dla uzyskania autologicznych przeszczepów, które omijają bariery zgodności tkankowej. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny, a następnie całkowite różnicowanie się w pożądane linie pozostaje przeszkodą w klinicznym przeniesieniu technologii iPSC ze względu na związany z tym potencjał nowotworowy i niestabilność genomu. Ostatnio my i inni wykazaliśmy, że komórki somatyczne nie mogą być przekształcane nie tylko w iPSC, ale także w różne typy multipotencjalnych somatycznych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanych czynników, omijając w ten sposób progresję przez stan pluripotencjalny. W szczególności bezpośrednia konwersja ludzkich fibroblastów w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC) zwiastuje możliwość stworzenia nowego autologicznego źródła komórek do różnych zastosowań, takich jak wymiana komórek, modelowanie chorób i badania przesiewowe leków. W tym miejscu opisujemy izolację pierwotnych fibroblastów dorosłego człowieka za pomocą biopsji skóry i ich skuteczną bezpośrednią konwersję do iNPC poprzez ograniczoną w czasie ekspresję Oct4, Sox2, Klf4, a także c-Myc. Sox2-dodatnie kolonie neuronabłonkowe pojawiają się po 17 dniach indukcji, a linie iNPC można skutecznie ustanowić poprzez izolację i ekspansję monoklonalną. Precyzyjne dostosowanie mnogości wirusa infekcji i suplementacja czynnika hamującego białaczkę w fazie indukcji stanowią kluczowe czynniki dla osiągnięcia wydajności konwersji do 0,2%. Do tej pory specyficzne dla pacjenta linie iNPC mogły być rozszerzane na ponad 12 przejść i jednolicie wykazywać cechy morfologiczne i molekularne nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych, takie jak ekspresja Nestin i Sox2. Linie iNPC można różnicować w neurony i astrocyty, co ocenia się przez barwienie odpowiednio względem TUJ1 i GFAP. Podsumowując, przedstawiamy solidny protokół wyprowadzania i bezpośredniej konwersji ludzkich fibroblastów w stabilnie rozszerzalne nerwowe komórki progenitorowe, które mogą stanowić źródło komórkowe do zastosowań biomedycznych, takich jak autologiczna wymiana komórek nerwowych i modelowanie chorób.

Wprowadzenie

W 2006 roku Yamanaka i jego koledzy mogli po raz pierwszy pokazać możliwość przeprogramowania komórek somatycznych do stanu pluripotencjalnego1. To odróżnicowanie osiągnięto przez nadekspresję czterech czynników transkrypcyjnych Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc w mysich fibroblastach. Uzyskane tak zwane indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) wykazują funkcjonalną równoważność z embrionalnymi komórkami macierzystymi (ESC), a zatem mogą być różnicowane we wszystkie typy komórek dorosłego organizmu. Rok później udało się również przeprogramować na iPSC ludzkie fibroblasty2. Eksperymenty na modelach zwierzęcych pokazują, że komórki pochodzące z iPSC mogą być ogólnie stosowane w terapii zastępczej komórek, np. w chorobie Parkinsona (PD) 3-5. Jednak kilka ograniczeń związanych ze stosowaniem iPSC stanowi przeszkodę na drodze do pełnego wykorzystania ich potencjału terapeutycznego. Po pierwsze, przeprogramowanie komórek do stanu pluripotencjalnego i późniejsza kontrola jakości jest na ogół czasochłonnym i nieefektywnym procesem, który prowadzi do rozległych, a tym samym kosztownych procedur hodowli komórkowych. Po drugie, iPSC muszą zostać ponownie zróżnicowane w pożądany typ komórek będących przedmiotem zainteresowania przed zastosowaniem biomedycznym, a prawdopodobieństwo istnienia szczątkowych komórek pluripotencjalnych w zróżnicowanej populacji ma znaczny potencjał rakotwórczy, a zatem wykazuje wysokie ryzyko po przeszczepieniu komórek6. Po trzecie, proces przeprogramowania jest zwykle osiągany poprzez indukcję czynników przeprogramowujących przez infekcję lenti- lub retrowirusową. Integracja tych wirusów z genomem gospodarza może prowadzić do mutagenezy insercyjnej i/lub niekontrolowanej reaktywacji transgenów7,8. Opracowano systemy nieintegracyjne w celu dostarczania czynników przeprogramowujących do komórek docelowych, co minimalizuje ryzyko mutagenezy insercyjnej i reaktywacji transgenu. Przykładami tych podejść bez transgenów są przeprogramowanie komórek przy użyciu nieintegrującego się wirusa Adeno lub Sendai9,10, wektorów opartych naDNA11 lub zastosowanie metod wolnych od DNA, takich jak transfekcja syntetycznego mRNA12 lub transdukcja rekombinowanych białek13,14. Inną obiecującą metodą wyprowadzania iPSC wolnego od transgenów jest zastosowanie modyfikowanych przez loxP konstruktów przeprogramowania lentiwirusa, a następnie delecja transgenów przy użyciu systemu rekombinacji DNA Cre-loxP15,16.

Prostsze podejście do generowania komórek nerwowych do terapii wymiany komórek polega na bezpośredniej przemianie fibroblastów w neurony postmitotyczne17-20. Vierbuchen i wsp. stwierdzili, że nadekspresja czynników transkrypcyjnych Ascl1, Brn2 i Myt1l powoduje generowanie 20% neuronów z mysich fibroblastów17. W 2011 roku wykazano, że te same trzy czynniki transkrypcyjne w połączeniu z nadekspresją NeuroD1 umożliwiają transróżnicowanie ludzkich fibroblastów do neuronów19. Neurony indukowane przez człowieka mogą być również generowane przez nadekspresję Ascl1 i Ngn2 w podwójnym hamowaniu SMAD i GSK3β20. Warto zauważyć, że bezpośrednia konwersja fibroblastów w neurony generuje nieproliferacyjną, postmitotyczną populację komórek, która nie pozwala na dalszą ekspansję i biobankowanie.

Ostatnio, bezpośrednia konwersja fibroblastów w proliferującą populację nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych została zgłoszona21-26. Dla jasności, wszystkie te typy komórek zostaną nazwane w tym raporcie indukowanymi neuronalnymi komórkami progenitorowymi (iNPC). Han i wsp. nadekspresja Brn4, Sox2, c-Myc i Klf4 w celu wygenerowania iNPC. Podobnie jak ich neuronalne odpowiedniki komórek macierzystych pochodzące z tkanek pierwotnych lub komórek pluripotencjalnych, te iNPC są trójpotencjałowe i mogą być różnicowane w neurony, astrocyty i oligodendrocyty21. Nasza grupa zgłosiła nieco inny protokół konwersji obejmujący nadekspresję Sox2, Klf4 i c-Myc i indukował ekspresję Oct4 tylko przez 5 dni. Dzięki takiemu podejściu możemy wygenerować stabilnie proliferujące iNPC z mysich, embrionalnych i dorosłych fibroblastów, które wykazują całkowite wyciszenie czynników przeprogramowujących22. W przeciwieństwie do iPSC, iNPC nie wykazują potencjału rakotwórczego po przeszczepieniu27. Z powodzeniem wykorzystaliśmy przekształcone komórki w zwierzęcym modelu demielinizacji, szczurów z niedoborem mieliny, wykazując, że iNPC są klinicznie użyteczne22. Do tego czasu NPC mogły być generowane tylko z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub pierwotnej tkanki nerwowej28-32. iNPC to stabilnie rozprężalne komórki, które mogą być kriokonserwowane i są zdolne do różnicowania się w neurony, astrocyty i oligodendrocyty. Podjęto wiele wysiłku w celu dostosowania protokołu bezpośredniej konwersji z komórek myszy na komórki ludzkie23,26,33,34. W 2012 roku opublikowano, że nadekspresja pojedynczego czynnika Sox2 w fibroblastach jest wystarczająca do wytworzenia mysich i ludzkich iNPC33. Autorzy opisali generowanie ludzkich iNPC z fibroblastów napletka płodu i scharakteryzowali je poprzez barwienie przeciwko Sox2 i Nestin. Jednak komórki docelowe używane do przeprogramowania reprezentują bardzo szczególny typ komórek, który nie będzie dostępny w praktyce klinicznej i nie przeprowadzono funkcjonalnej charakterystyki przekształconych komórek przez przeszczep w modelu zwierzęcym. Nowsza publikacja opisuje generowanie ograniczonych neuronalnie komórek progenitorowych z ludzkich fibroblastów płodu przez nadekspresję Sox2, c-Myc i Brn2 lub Brn434. Wygenerowane linie komórkowe wykazały zdolność do samoodnawiania się i można je różnicować w różne typy neuronów końcowych. Niekorzystne jest jednak wykorzystanie fibroblastów płodowych, gdyż są to komórki niejednorodnego pochodzenia i nie można wykluczyć obecności w preparatach resztkowych np. komórek macierzystych grzebienia nerwowego. W 2014 roku Zhu i in. poinformowali o bezpośredniej konwersji fibroblastów u dorosłych i noworodków w trójpotencjałowe nerwowe komórki progenitorowe przez nadekspresję Sox2 wraz z samym Oct4 lub Oct4 i dodanie małych cząsteczek do pożywki do hodowli komórkowej. Warto zauważyć, że w oparciu o ich badania, sam Sox2 był niewystarczający do wywołania bezpośredniej konwersji26. Niedawno Lu i in. poinformowali, że nadekspresja czynników Yamanaka Oct4-, Sox2-, Klf4-, c-Myc przez wirusa Sendai przez 24 godziny, a następnie inaktywacja wirusa przez wzrost temperatury powoduje wytwarzanie ekspandowalnych trójpotencjałowych nerwowych komórek prekursorowych23. Podsumowując, chociaż opublikowane do tej pory protokoły konwersji dla komórek ludzkich mają wspólną cechę nadekspresji co najmniej jednego lub więcej czynników Yamanaka, często w sposób ograniczony w czasie, nie ma wyraźnych wskazówek co do minimalnych czynników molekularnych potrzebnych do bezpośredniej konwersji do iNPC. Ograniczona w odpowiednim czasie nadekspresja Oct4 za pomocą środków genetycznych, transfekcji syntetycznym mRNA lub białka przenikanego przez komórkę wraz z konstytutywną ekspresją Sox2, Klf-4 i c-Myc nie spowodowała jeszcze stabilnych ludzkich linii iNPC. Tak więc zastosowanie wirusa Sendai do nadekspresji wszystkich czynników Yamanaka i ograniczenia ich aktywności w odpowiednim czasie poprzez inaktywację termiczną wirusa23 wraz ze zoptymalizowanymi warunkami indukcji ośrodków nerwowych22,31 stanowi jak dotąd preferowaną strategię.

Kilka badań demonstruje funkcjonalność komórkową NSC lub ich zróżnicowanych odpowiedników w różnych modelach chorób zwierzęcych. Neuronalne komórki progenitorowe z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych zostały przeszczepione do mysich modeli zaburzenia neurozapalnego stwardnienia rozsianego35,36. Zastosowanie nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z hESC u myszy EAE (eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie mózgu i rdzenia) zostało po raz pierwszy wykazane w 2008 r. 35. Multipotencjalne nerwowe komórki prekursorowe wstrzyknięto do komór mózgu myszy, a przeszczep spowodował zmniejszenie objawów klinicznych EAE. Kim i in. wygenerowali prekursory oligodendroglialne z hESC i przeszczepili je śródmózgowo-komorowo myszom EAE. Chociaż przeszczepy nie przeżyły dłużej niż 10 dni, myszy wykazały znaczną poprawę funkcji neurologicznych i zmniejszenie prozapalnych komórek odpornościowych w istocie białej36. Terapia komórkami macierzystymi została również zastosowana do przedklinicznego celowania w chorobę Parkinsona, ponieważ NPC mogą być z powodzeniem stosowane w odpowiednich modelach zwierzęcych. W tym celu wykorzystano komórki progenitorowe pochodzące z tkanki mózgowej płodu37 zróżnicowane z pluripotencjalnych komórek macierzystych38-40 lub mezenchymalne komórki macierzyste41. W 2012 roku wykazaliśmy, że mysie iNPC są w stanie wytwarzać białko proteolipidowe, główny składnik białka mielinowego, po przeszczepieniu do mózgów szczurów z niedoborem mieliny (md)22. W tym eksperymencie udowodniono najpierw terapeutyczną przydatność iNPC i wkrótce potwierdzono ją w innymbadaniu32. Pełny potencjał terapeutycznego zastosowania ludzkich iNPC pozostaje jednak do zbadania.

Tutaj pokazujemy solidny i zintegrowany proces (i) pozyskiwania ludzkich komórek pierwotnych od dorosłych pacjentów za pomocą biopsji skóry, (ii) bezpośredniej konwersji ludzkich fibroblastów w neuronalny stan progenitorowy oraz (iii) zdolności iNPC do różnicowania się w linie neuronalne i glejowe. Zastosowanie tego protokołu pomoże przyspieszyć wytwarzanie autologicznych komórek ludzkich do zastosowań terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ludzkie fibroblasty użyte w tym badaniu zostały uzyskane z biopsji metodą uderzenia w skórę po uzyskaniu świadomej zgody i zgody etycznej komisji etycznej Uniwersytetu w Würzburgu, Niemcy (raport etyczny nr: 96/11 z dnia 10.06.2011).

1. Biopsja dziurkacza

  1. Zdezynfekuj skórę pacjenta. Znieczulić część skóry, z której zostanie pobrana biopsja (najlepiej obszar mniej nasłoneczniony) przy użyciu 0,5 do 1 ml chlorowodorku mepiwakainy śródskórnie i przygotować biopsję skóry za pomocą sterylnego stempla do biopsji 3 mm, przepłukać biopsję DPBS + 1 μl/1 ml gentamycyny i usunąć tłuszcz. Przepłukać biopsję dwukrotnie DPBS + gentamycyną, całkowicie odessać DPBS i pokryć biopsję Dispase II (2,4 U/ml) i inkubować 16 - 18 godzin w temperaturze 4 °C.
  2. Odessać Całkowicie odsączyć, przemyć dwukrotnie DPBS i usunąć naskórek pęsetą. Przemyć biopsję dwukrotnie DPBS, dodać 2 ml kolagenazy typu 2 (500 U/ml CDU), przenieść do probówki o pojemności 15 ml i dodać kolagenazę do 5 ml całkowitej objętości. Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Odwirować przez 5 minut przy sile 180 x g, a następnie odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 10 ml pożywki DMEM-FCS-gentamycyny (10% FCS, 1 μl/ml gentamycyny) i ponownie odwirować przez 5 minut przy 180 x g. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1,5 ml DMEM-FCS-gentamycyna-pożywka. Przenieść do kolby do hodowli tkankowej przylegającej T25 i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Zmieniaj nośniki co 3 dni.
  5. Po około 2 tygodniach, gdy komórki zlewają się wokół części skóry, podzielić komórki za pomocą trypsyny/EDTA (0,05%): przemyć komórki raz DPBS, inkubować 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 po dodaniu 2 ml trypsyny/EDTA (0,05%), dodać 2 ml pożywki DMEM-FCS-gentamycyny, przenieść do probówki 15 ml i wirować przy 180 x g przez 5 minut; odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej ilości pożywki DMEM-FCS-gentamycyny.
  6. Dalsze rozszerzanie komórek poprzez zmianę pożywki co 3dni i dzielenie się zgodnie z powyższym opisem, gdy komórki zlewają się; dodawanie gentamycyny można zatrzymać po pasażu 2.
  7. Przed użyciem komórek do eksperymentów z bezpośrednią konwersją, należy wykluczyć zanieczyszczenie mykoplazmą za pomocą standardowych testów.
  8. Gdy komórki zostaną rozszerzone, możesz bezpośrednio rozpocząć konwersję lub zamrozić komórki za pomocą 10% DMSO i 90% FCS. Komórki należy przechowywać w temperaturze -80 °C przez 2 dni, a następnie przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  9. W celu przygotowania konwersji należy przemyć komórki raz DPBS, odessać DPBS i dodać 2,5 ml trypsyny/EDTA (0,05%). Przechowywać przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Delikatnie postukać w kolbę, aby odłączyć komórki, ponownie zawiesić w 2,5 ml pożywki z fibroblastami (DMEM w tym L-Glu + 10% FCS + 1% NEAA + 1% pirogronianu sodu) i przenieść do probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 180 x g przez 5 minut i odsysać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki z fibroblastami i pipetować w górę iw dół, aby wytworzyć zawiesinę pojedynczej komórki.
  10. Policz liczbę komórek za pomocą komory do liczenia komórek Fuchsa, Rosenthala lub Neubauera i płytki 3 x 104 komórki na basenie na płytce 24-dołkowej. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .

2. Zakażenie ludzkich fibroblastów wirusem Sendai i transdyferencjacja

UWAGA: Aby zapewnić bezpieczeństwo, następujące kroki związane z obsługą wirusa muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego i kapturze z przepływem laminarnym, a także przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, zwłaszcza maski chirurgicznej, aby zapobiec ekspozycji błony śluzowej.

  1. Przełącz komórki na pożywkę fibroblastową o pojemności 100 μl (krok 1.9). Rozmrozić podwielokrotności wirusa Oct4-, Klf4-, Sox2- i c-myc-Sendai i ponownie zawiesić każdy wirus w 1 ml pożywki fibroblastowej. Dodaj każdego wirusa o MOI wynoszącym 3 do komórek (miano wirusa różni się w zależności od partii, ale jedna porcja każdego wirusa może być ogólnie użyta do infekcji 10 dołków na płytce 24-dołkowej) i delikatnie wymieszaj. Inkubować O/N w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Po 24 godzinach odessać pożywkę i dodać 500 μl pożywki do neuroindukcji (1:1 DMEM/F-12 : Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng/ml hLIF, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) i hodowlę w temperaturze 39 °C, 5% CO2 od teraz. Zmieniaj nośnik co drugi dzień.
  3. W 6 dniu po zakażeniu przygotować płytki 6-dołkowe pokryte lamininą: rozcieńczyć lamininę do 1 μg/ml w DPBS, dodać 1 ml roztworu na 6 dołków i przechowywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
  4. W 7 dniu po zakażeniu rozdzielić komórki za pomocą DPBS/EDTA: odessać pożywkę i raz przemyć komórki DPBS, następnie dodać 500 μl DPBS/EDTA i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  5. Dodać 500 μl DMEM/F12 i usunąć zawiesinę z płytki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 180 x g przez 5 minut.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1,5 ml pożywki neuroindukcyjnej, płytkę na 6-dołkowych płytkach pokrytych lamininą i dodać inhibitor ROCK Y27632 w końcowym stężeniu 10 μM do komórek, hodowla w temperaturze 39 °C, 5% CO2 .
  7. Zmieniaj nośnik co drugi dzień.
  8. Od 14 dnia po zakażeniu hodować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Kolonie neuronabłonkowe stają się widoczne około 17 dnia po zakażeniu za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Powinny być na tyle duże, aby można je było zebrać około 20 dnia po zakażeniu.

3. Izolacja domniemanych kolonii iNPC

  1. Na dzień przed zbiorem pokryć jedną 48-dołkową płytkę lamininą: rozcieńczyć lamininę do 1 μg/ml w DPBS, dodać 300 μl roztworu na płytki i utrzymywać w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Dzień później odessać lamininę z płytek i dodać 200 μl pożywki neuroindukcyjnej do studzienek.
  2. Umyj 6 dołków zawierających kolonie, które mają być pobrane, jednorazowo za pomocą DPBS i dodaj 2 ml DPBS na dołek z 6-dołkową płytką. Zbieraj kolonie mechanicznie: zeskrob je wokół kolonii za pomocą cienkiej igły, aby pozbyć się otaczających komórek; Ustaw pipetarkę o pojemności 200 μl na 50 μl i pobierz kolonie za pomocą odpowiednich końcówek pipet.
  3. Przenieś po jednej kolonii do jednego dołka na 48-dołkowej płytce pokrytej lamininą i wygeneruj mechanicznie zawiesinę pojedynczej komórki, pipetując w górę iw dół 10 razy. Dodać inhibitor ROCK Y27632 w końcowym stężeniu 10 μM do komórek.
  4. Hodować komórki na 48-dołkowej płytce w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 dni. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aż komórki osiągną 80 - 90% zbiegu (ok. 3 - 4 dni).

4. Ekspansja i kriokonserwacja iNPC

  1. Przechodzenie i ekspansja iNPC
    1. Odessać pożywkę i przemyć komórki DPBS. Odessać DPBS i dodać 200 μl DPBS/EDTA i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2, dodać 200 μl DMEM/F12 i usunąć zawiesinę z płytki do probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 180 x g przez 5 min.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 0,5 ml pożywki do neuroindukcji (etap 2.2), rozłożyć na płytkach 12-dołkowych pokrytych lamininą i dodać inhibitor ROCK Y27632 w końcowym stężeniu 10 μM do komórek, hodowla w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, mogą być dalej rozszerzane lub zamrażane w następujący sposób.
  2. Zamrażanie iNPC
    1. Odessać pożywkę i przemyć komórki DPBS. Zassać DPBS i dodać 300 μl DPBS/EDTA i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , dodać 300 μl DMEM/F12 i usunąć zawiesinę z płytki do probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 180 x g przez 5 min.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 0,5 ml dostępnego w handlu podłoża do zamrażania NSC. Przenieść zawiesinę do fiolek do zamrażania i umieścić w pojemniku do zamrażania komórek. Przechowywać w temperaturze -80 °C przez 2 dni, a następnie przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

5. Zróżnicowanie iNPC

  1. Różnicowanie w kierunku linii neuronalnej
    1. Hodowle komórek na płytkach pokrytych lamininą, jak opisano powyżej. Zmień pożywkę na neuro-diff-media (DMEM/F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng/ml cAMP, 200 μM witamina C, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF), gdy komórki są w około 70% zlewne. Zmieniaj multimedia co drugi dzień przez trzy tygodnie. Nie dziel komórek podczas różnicowania.
    2. Po trzech tygodniach komórki powinny wyrażać marker neuronalny TUJ1. Aby uzyskać bardziej dojrzałe neurony i podtypy neuronów, kontynuuj różnicowanie do 3 miesięcy.
  2. Różnicowanie w kierunku linii glejowej
    1. Zmień pożywkę na pożywkę do indukcji glejowej (1:1 DMEM/F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 μM β-merkaptoetanolu, 100 μM aminokwasów endogennych, 1,5 mM L-glutamina, 5 μg/ml insuliny, 40 ng/ml T3), w tym 20 ng/ml EGF, aby indukować różnicowanie w komórki prekursorowe gleju. Usuń połowę pożywki i zastępuj ją nowymi co drugi dzień przez około 2 tygodnie. W tym okresie komórki należy podzielić 1:3 w obecności inhibitora 10 μM ROCK Y27632 po osiągnięciu 100% konfluencji.
    2. Po 2 tygodniach zróżnicuj komórki dalej w astrocyty: gdy komórki są prawie zlewające się, zmień pożywkę na dostępną na rynku pożywkę astrocytów, zmieniaj pożywkę co drugi dzień. Po około 7 dniach komórki zaczynają wyrażać markery astrocytów (np. GFAP). Jeśli komórki uzyskają 100% zlewanie się podczas protokołu różnicowania, podziel je w stosunku 1:2 w obecności 10 μM inhibitora ROCK Y27632.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym pracy przedstawiamy opis zintegrowanego procesu, który umożliwia generowanie indukowanych komórek progenitorowych neuronów (iNPCs) z ludzkich fibroblastów uzyskanych poprzez biopsję punch skóry w czasie krótszym niż 8 tygodni (Rysunek 1). Specyficzne dla pacjenta iNPCs mogą być dalej różnicowane w linie neuronalne i glejowe oraz wykazują ogromny potencjał w terapii zastępczej komórek i modelowaniu chorób.

Zakażenie fibroblastów wirusami Sendai Oct4-, Klf4-, Sox2- ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj pokazujemy izolację i bezpośrednią konwersję ludzkich fibroblastów w ekspandowalne, wolne od transgenów nerwowe komórki progenitorowe i ich zróżnicowane potomstwo jako przypuszczalną podstawę terapii zastępczej komórek lub zastosowanie w analizach przesiewowych leków. Bezpośrednia konwersja komórek somatycznych w NPC została osiągnięta poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych specyficznych dla linii 26,33,34. Niemniej jednak w wielu przypadkach fibroblasty płodowe wykorzystano do eksperymen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom Grupy Komórek Macierzystych i Medycyny Regeneracyjnej Uniwersytetu w Würzburgu za pomocne sugestie oraz Martinie Gebhardt i Heike Arthen za doskonałe wsparcie techniczne. Prace te były wspierane przez granty z Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (ED79/1-2), niemieckiego Ministerstwa Edukacji i Badań BMBF (01 GN 0813), Bawarskiej Sieci Badawczej ds. Indukowanych Pluripotencjalnych Komórek Macierzystych "forIPS" oraz "Stiftung Sibylle Assmus". Rycina 1 została wykonana przy użyciu narzędzia Servier Medical Art, dostępnego w www.servier.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pożywka dla astrocytówScienCell1801
B27LifeTechnologies17504-044
BDNFPeprotech450-02
Dziurkacz do biopsjipfm medical48301
cAMPSigmaA6885
CHIR99021Axon medchem1386
Kolagenaza Type2WorthingtonBiochemical LS004177
DispasePAN P10-032100
DMEMLifeTechnologies41966-029
DMEM F12LifeTechnologies11320-033
DMSORoth4720
DPBSLifeTechnologies14190-094
EGFLife TechnologiesPHG0313
FCSBiochrom AG50115
GDNFPeprotech450-10
GentamycynaSigmaG1397
Przeciwciało GFAPDakoZ0334
GlutaMAXLifeTechnologies35050-038
hLIFPeprotech300-05
InsulinaSeralabGEM-700-112-P
Przeciwciało Ki67NeoMarkersRM-9106-S
L-GlutaminaLifeTechnologies25030-024
LamininSigmaL2020
N2LifeTechnologies17502-048
Przeciwciało NestinaR& D SystemsMAB1259
NeurobasalLifeTechnologies21103-049
Aminokwasy endogenneLifeTechnologies11140-050
Zamrażarki NSCSigmaC6295
Oct4-przeciwciałoSanta Cruzsc9081
Przeciwciało Pax6CovancePRB-278P
SB431542Wirus Invivogeninh-sb43
Sendai: Zestaw do przeprogramowania CytoTune Sendai  LifeTechnologiesA1378001
Pirogronian soduLife Technologies11360-039
Przeciwciało Sox1R& D SystemsAF3369
Przeciwciało Sox2R& D SystemsMAB2018
T3Santa Cruzsc-205725
Trypsin/EDTALife Technologies15400-054
Przeciwciało TUJ1CovanceMMS-435P-250
Witamina CSigmaA4544
Y27632CalbiochemCAS 146986-50-7
β-MerkaptoetanolLifeTechnologies21985023

Bibliografia

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Cai, J., Yang, M., Poremsky, E., Kidd, S., Schneider, J. S., Iacovitti, L. Dopaminergic neurons derived from human induced pluripotent stem cells survive and integrate into 6-OHDA-lesioned rats. Stem Cells Dev. 19 (7), 1017-1023 (2010).
  4. Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson’s disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
  5. Rhee, Y. H., et al. Protein-based human iPS cells efficiently generate functional dopamine neurons and can treat a rat model of Parkinson disease. J Clin Invest. 121 (6), 2326-2335 (2011).
  6. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  7. Soldner, F., et al. Parkinson’s disease patient-derived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors. Cell. 136 (5), 964-977 (2009).
  8. Sommer, C. A., Stadtfeld, M., Murphy, G. J., Hochedlinger, K., Kotton, D. N., Mostoslavsky, G. Induced pluripotent stem cell generation using a single lentiviral stem cell cassette. Stem Cells. 27 (3), 543-549 (2009).
  9. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2667-2674 (2009).
  10. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, 348-362 (2009).
  11. Montserrat, N., et al. Simple generation of human induced pluripotent stem cells using poly-beta-amino esters as the non-viral gene delivery system. J Biol Chem. 286 (14), 12417-12428 (2011).
  12. Warren, L., Nu, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci Rep. 2, 657(2012).
  13. Bosnali, M., Edenhofer, F. Generation of transducible factors. Biol Chem. 389 (7), 851-861 (2008).
  14. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  15. Awe, J. P., et al. Generation and characterization of transgene-free human induced pluripotent stem cells and conversion to putative clinical-grade state. Stem Cell Res Ther. 4 (4), 87(2013).
  16. Kadari, A., et al. Excision of viral reprogramming cassettes by Cre protein transduction enables rapid, robust and efficient derivation of transgene-free human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res Ther. 5 (2), 47(2014).
  17. Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  18. Caiazzo, M., et al. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476 (7359), 224-227 (2011).
  19. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  20. Ladewig, J., et al. Small molecules enable highly efficient neuronal conversion of human fibroblasts. Nat Methods. 9 (6), 575-578 (2012).
  21. Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell. 10 (4), 465-472 (2012).
  22. Thier, M., et al. Direct conversion of fibroblasts into stably expandable neural stem cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  23. Lu, J., et al. Generation of integration-free and region-specific neural progenitors from primate fibroblasts. Cell Rep. 3 (5), 1580-1591 (2013).
  24. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Werning, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (7), 2527-2532 (2012).
  25. Tian, C., et al. Direct conversion of dermal fibroblasts into neural progenitor cells by a novel cocktail of defined factors. Curr Mol Med. 12 (2), 126-137 (2012).
  26. Zhu, S., et al. Small molecules enable OCT4-mediated direct reprogramming into expandable human neural stem cells. Cell Res. 24 (1), 126-129 (2014).
  27. Hemmer, K., et al. Induced neural stem cells achieve long-term survival and functional integration in the adult mouse brain. Stem Cell Reports. 3 (3), 423-431 (2014).
  28. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3 (9), e283(2005).
  29. Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy,, Socci, G., Tabar, N. D., Studer, V., L, Human ES cell-derived rosettes reveal a functional distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).
  30. Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (9), 3225-3230 (2009).
  31. Li, W., et al. Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (20), 8299-8304 (2011).
  32. Reinhardt, P., et al. Derivation and expansion using only small molecules of human neural progenitors for neurodegenerative disease modeling. PLoS One. 8 (3), c59252(2013).
  33. Ring, K. L., et al. Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell. 11 (1), 100-109 (2012).
  34. Zou, Q., et al. Direct conversion of human fibroblasts into neuronal restricted progenitors. J Biol Chem. 289 (8), 5250-5260 (2014).
  35. Aharonowiz, M., Einstein, O., Fainstein, N., Lassmann, H., Reubinoff, B., Ben-Hur, T. Neuroprotective effect of transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor in an animal model of multiple sclerosis. PLoS One. 3 (9), e3145(2008).
  36. Kim, H., et al. Immunomodulation by transplanted human embryonic stem cell-derived oligodendroglial progenitors in experimental autoimmune encephalomyelitis. Stem Cells. 30 (12), 2810-2829 (2012).
  37. Kondoh, T., Pundt, L. L., Blount, J. P., Conrad, J. A., Low, W. C. Transplantation of human fetal tissue from spontaneous abortions to a rodent model of Parkinson’s disease. Cell Transplant. 5 (1), 69-75 (1996).
  38. Takagi, Y., et al. Dopaminergic neurons generated from monkey embryonic stem cells function in a Parkinson primate model. J Clin Invest. 115 (1), 102-109 (2005).
  39. Kikuchi, T., et al. Survival of human induced pluripotent stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons in the brain of a primate model of Parkinson’s disease. J Parkinson’s Dis. 1 (4), 395-412 (2011).
  40. Kirkeby, A., et al. Generation of regionally specified neural progenitors and functional neurons from human embryonic stem cells under defined conditions. Cell Rep. 1 (6), 703-714 (2012).
  41. Dezawa, M., et al. Specific induction of neuronal cells from bone marrow stromal cells and application for autologous transplantation. J Clin Invest. 113, 1701-1710 (2004).
  42. Izrael, M., et al. Human oligodendrocytes derived from embryonic stem cells: Effect of noggin on phenotypic differentiation in vitro and on myelination in vivo. Mol Cell Neurosci. 34 (3), 310-323 (2007).
  43. Cassady, J. P., et al. Direct lineage conversion of adult mouse liver cells and B lymphocytes to neural stem cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 948-956 (2014).
  44. Castano, J., et al. Fast and efficient neural conversion of human hematopoietic cells. Stem Cell Rep. 3 (6), 1118-1131 (2014).
  45. Thoma, E. C., et al. Chemical conversion of human fibroblasts into functional Schwann cells. Stem Cell Rep. 3 (4), 539-547 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja fibroblast wczynniki reprogramuj ceinfekcja wirusowaekspansja monoklonalnamikroskopia immunofluorescencyjnar nicowanie neuronalner nicowanie glialnekom rki specyficzne dla pacjenta
Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.