Zastosowanie długotrwale hodowanego testu immunologicznego związanego z enzymem interferonu γ do oceny odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T u bydła

Podsumowanie

Długoterminowy test immunologiczny związany z interferonem γ enzymem jest używany jako miara odpowiedzi pamięci centralnej i koreluje z ochronnymi odpowiedziami na szczepionkę przeciw prątkom. Dzięki temu testowi komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są stymulowane antygenami prątkami i interleukiną-2 przez 14 dni, umożliwiając różnicowanie i ekspansję limfocytów T pamięci centralnej.

Streszczenie

Limfocyty T efektorowe i pamięciowe są generowane przez programowanie rozwojowe naiwnych komórek po rozpoznaniu antygenu. Jeśli zakażenie jest kontrolowane, do 95% limfocytów T wytworzonych w fazie ekspansji (tj. fazy skurczu) zostaje wyeliminowanych, a limfocyty T pamięci pozostają, czasami na całe życie. U ludzi opisano dwa funkcjonalnie odrębne podzbiory limfocytów T pamięci na podstawie ekspresji receptorów naprowadzających węzły chłonne. Limfocyty T pamięci centralnej wyrażają receptor chemokiny C-C 7 i CD45RO i są zlokalizowane głównie w obszarach komórek T wtórnych narządów limfatycznych. Limfocyty T pamięci efektorowej wyrażają CD45RO, brakuje CCR7 i wyświetlają receptory związane z naprowadzaniem limfocytów do tkanek obwodowych lub objętych stanem zapalnym. Limfocyty T efektorowe nie wykazują ekspresji ani CCR7, ani CD45RO, ale po zetknięciu z antygenem wytwarzają cytokiny efektorowe, takie jak interferon-γ. Testy uwalniania interferonu γ są stosowane w diagnostyce gruźlicy bydła i ludzi i wykrywają przede wszystkim odpowiedzi komórek T pamięci efektorowej i efektorowej. Z drugiej strony, odpowiedzi limfocytów T pamięci centralnej limfocytów T CD4 ⁺ na szczepienie mogą być wykorzystywane do przewidywania skuteczności szczepionki, jak wykazano w przypadku zakażenia małpim wirusem niedoboru odporności u naczelnych innych niż ludzie, gruźlicy u myszy i malarii u ludzi. Kilka badań na myszach i ludziach, a także niepublikowane dane dotyczące bydła wykazały, że testy ELISPOT γ interferonu mierzą odpowiedzi limfocytów T pamięci centralnej. W tym teście komórki jednojądrzaste krwi obwodowej są hodowane w zmniejszającym się stężeniu antygenu przez 10 do 14 dni (hodowla długoterminowa), co pozwala na osiągnięcie szczytu i zaniku odpowiedzi efektorowej; ułatwiając limfocytom T pamięci centralnej różnicowanie się i rozszerzanie w hodowli.

Wprowadzenie

Limfocyty T efektorowe i pamięciowe są generowane przez programowanie rozwojowe naiwnych limfocytów T CD4+ po rozpoznaniu antygenu. Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + w komórki wytwarzające cytokiny wymaga rozpoznania patogenu przez wrodzone komórki odpornościowe, prezentacji antygenu limfocytom T, kostymulacji i zmian transkrypcyjnych skutkujących spolaryzowaną produkcją cytokin. Na przykład: komórki prezentujące antygen wytwarzają interleukinę (IL)-12 w odpowiedzi na patogeny wewnątrzkomórkowe, co wraz z rozpoznawaniem antygenu sprzyja różnicowaniu się limfocytów T w komórki pomocnicze T 1 (Th1)^1,2 poprzez sygnalizację przez przetwornik sygnału i aktywator transkrypcji 4 (STAT4) oraz T-box ulegający ekspresji w komórkach T (T-bet), co prowadzi do aktywacji komórek, produkcji IL-2, ekspansji klonalnej i produkcji interferonu (IFN)-γ^3,4. Jeśli zakażenie jest kontrolowane, do 95% limfocytów T wytworzonych w fazie ekspansji (tj. fazy skurczu) zostaje wyeliminowanych, a limfocyty T pamięci pozostają, czasami na całe życie⁵. Sallusto i wsp. ⁶, ujawnił dwa funkcjonalnie odrębne podzbiory limfocytów T pamięci u ludzi w oparciu o ekspresję receptorów naprowadzających węzły chłonne. Limfocyty T pamięci centralnej (Tcm) wyrażają receptor chemokiny C-C (CCR)-7 i CD45RO i są zlokalizowane głównie w obszarach komórek T wtórnych narządów limfatycznych. Tcm mają ograniczoną funkcję efektorową, niski próg aktywacji i zachowują wysoką produkcję i zdolność proliferacyjną IL-2. Limfocyty T pamięci efektorowej (Tem) wyrażają CD45RO, brakuje CCR7 i wyświetlają receptory do naprowadzania na tkanki obwodowe lub objęte stanem zapalnym. Komórki efektorowe nie wyrażają ani CCR7, ani CD45RO, ale szybko wytwarzają cytokiny efektorowe, takie jak IFN-γ, po rozpoznaniu antygenu.

Testy uwalniania IFN-γ (IGRA) są używane do diagnozowania gruźlicy bydła i ludzi⁷. Mycobacterium bovis jest głównym czynnikiem wywołującym gruźlicę bydła (bTB), podczas gdy przypadki gruźlicy u ludzi są wywoływane głównie przez Mycobacterium tuberculosis. W tych testach krew pełna lub komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) są stymulowane antygenami prątków przez 16 do 24 godzin, a produkcja IFN-γ w supernatancie jest mierzona za pomocą testu ELISA lub poprzez wykrywanie komórek wytwarzających IFN-γ przy użyciu technik ELISPOT. W wyniku krótkiego okresu stymulacji (tj. od 16 do 24 godzin) i szybkiej produkcji cytokin, testy ex vivo wykrywają przede wszystkim odpowiedzi efektorowe i tem. Zostało to potwierdzone przez analizę populacji komórek w tych hodowlach metodą cytometrii ^{przepływowej 8-10}.

Odpowiedzi ex vivo IFN-γ są rutynowo włączane do oceny panelu odpowiedzi immunologicznej szczepionek przeciw gruźlicy, w tym tych używanych do oceny odpowiedzi bydła. Większość skutecznych szczepionek przeciwko gruźlicy bydła wywołuje specyficzną odpowiedź IFN-γ, ale nie wszystkie szczepionki wywołujące odpowiedź IFN-γ są ochronne. Ponadto poziomy IFN-γ wywołane przez szczepienie, mierzone przed zakażeniem, niekoniecznie korelują z ochroną. Na przykład różne szczepy BCG mogą mieć różną zdolność do wywoływania odpowiedzi ex vivo na IFN-γ, pomimo podobnych poziomów ochrony¹¹. W związku z tym IGRA ex vivo są cenne w diagnostyce gruźlicy i w dostępie do immunogenności szczepionki; Jednak ich zastosowanie jako predyktorów skuteczności szczepionki jest ograniczone. Z drugiej strony, odpowiedzi Tcm na szczepienie mogą być wykorzystywane do przewidywania skuteczności szczepionki, jak wykazano w przypadku zakażenia małpim wirusem niedoboru odporności (SIV) u naczelnych^12,13, gruźlicy u myszy¹⁴ i malarii u ludzi^15,16.

Po skutecznej odpowiedzi immunologicznej skutkującej usunięciem patogenu, Tcm są utrzymywane i zapewniają ochronę przed ewentualnym drugim zakażeniem tym samym czynnikiem. Godnym uwagi wyjątkiem od tego scenariusza jest zakażenie ludzi M. tuberculosis, w którym pacjenci otrzymujący leczniczą terapię przeciwprątkową są podatni na ponowne zakażenie^17,18. Dodatkowo, zdarzenia rządzące pamięcią immunologiczną podczas przewlekłych infekcji, w których stymulacja antygenowa utrzymuje się, nie są dobrze poznane¹⁹. Podczas przewlekłych zakażeń, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności (HIV) i gruźlica, znacząca odpowiedź Tcm wiąże się z korzystnym wynikiem (np. latencja z gruźlicą i subkliniczna choroba z HIV)^20,21. Kilka badań na myszach i ludziach wykazało, że długoterminowe testy ELISPOT z hodowlą IFN-γ mierzą odpowiedzi Tcm^16,20-22. W tym teście PBMC są hodowane w zmniejszającym się stężeniu antygenu przez 10 do 14 dni, co pozwala na szczyt i zanik odpowiedzi efektorowych; ułatwiając Tcm wyróżnienie się i ekspansję w kulturze.

Długoterminowe testy ELISPOT z hodowlą IFN-γ były również wykorzystywane w badaniach weterynaryjnych, jednak fenotyp komórek reagujących był trudny do oceny z powodu braku krytycznych odczynników, zwłaszcza przeciwciała przeciwko CCR7. Skuteczne szczepionki przeciwko gruźlicy bydła [np. z zastosowaniem pojedynczej dawki szczepionki przeciwko M. bovis Bacille Calmette Guerin (BCG), BCG, a następnie podszczepionki przeciw antygenowi 85A z wektorem wirusowym lub atenuowanej szczepionki M. bovisΔRD1] wywołują długotrwałą hodowlę IFN-γ odpowiedzi ELISPOT po szczepieniu, które korelują z ochroną (tj. Niższym obciążeniem prątkami i zmniejszoną patologią związaną z gruźlicą) przeciwko późniejszemu prowokacji zjadliwym M. bovis^23,24. Ponadto liczba komórek wydzielających IFN-γ specyficznych dla antygenu w długoterminowych hodowlach PBMC jest wyższa po 12 miesiącach, ale zmniejsza się po 24 miesiącach od szczepienia BCG noworodków cieląt, co koreluje ze stopniem ochrony wykrywalnym po prowokacji M. bovis ²⁵. W tym scenariuszu wyhodowany IFN-γ ELISPOT jest ważnym narzędziem do przewidywania skuteczności szczepionki, zapewniając środki do priorytetyzacji kandydatów na szczepionki do kosztownych badań skuteczności. Ponadto techniki hodowli ELISPOT można dostosować do różnych gospodarzy, patogenów i cytokin poprzez zmianę antygenów lub przeciwciał do różnych celów w różnych dziedzinach badań.

Protokół

1. Przygotuj następujące rozwiązania

1. Przygotować pełne RPMI (cRMPI), dodając płodową surowicę bydlęcą (FBS) o stężeniu 10 % (objętość / objętość), glutaminę (2 μM), pirogronian sodu (1 μM), aminokwasy endogenne (0,1 μM), penicylinę-streptomycynę (100 jednostek / ml penicyliny i 0,1 mg / ml streptomycyny) i 2-merkaptoetanol (50 mM) do RPMI 1640.
2. Przygotować 2 X kwaśną dekstrozę cytrynianu, mieszając cytrynian sodu (77 μM), kwas cytrynowy (38 μM) i dekstrozę (122 μM) w wodzie destylowanej.
3. Przygotować Ca²⁺ Mg²⁺ sól fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS) o pH 7,2: NaCl (137 mM), KCl (2,7 mM), Na₂HPO₄ (dwuzasadowy, 10 mM), KH₂PO₄ (jednozasadowy, 2 mM) w wodzie destylowanej; dostosować pH do 7,2.
4. Przygotować PBS 1% (PBS 1% BSA) dodając albuminę surowicy bydlęcej do PBS (objętość / waga, 1 g / 100 ml PBS).
5. Przygotuj PBS + 0,05 % tween 20 (PBST), dodając 0,05 % tween 20 do PBS (objętość / objętość, 500 μl tween 20 / 1 l PBS).
6. Przygotować 100 mM bufor Tris HCL pH 8,2 mieszając Tris (100 mM), HCl (0,50 mM) w wodzie destylowanej.
7. Przygotować 35 % roztwór etanolu, rozcieńczając alkohol etylowy (czystość ≥99,5%) w wodzie destylowanej (objętość / objętość, 35 ml alkoholu etylowego / 100 ml wody destylowanej).
8. Filtr sterylizuje cRPMI, 2 x kwaśny cytrynian dekstrozy, PBS, PBS 1 % BSA przy użyciu filtrów 0,22 μm.

2. Długoterminowe hodowle komórek (protokół 14-dniowy)

(Dzień pierwszy)

1. Przygotować roztwory antygenowe o stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe stężenie w cRPMI. Wybór antygenu ma kluczowe znaczenie i powinien być dostosowany do celu badania.
2. Rozcieńczyć rekombinowane antygeny M. tuberculosis TB10.4 i antygen Ag85A do 2 μg / ml (każdego antygenu; końcowe stężenie wynosi 1 μg / ml).
3. Rozcieńczyć oczyszczoną pochodną białka M. bovis (PPD-B, Prionics Ag) do 10 μg / ml (końcowe stężenie wynosi 5 μg / ml).
4. Rozcieńczyć rekombinowany wczesny wydzielniczy cel antygenowy 6 (ESAT-6) i białko fuzyjne białka filtratu 10 (CFP-10) (rESAT-6:CFP10) do 2 μg / ml (końcowe stężenie 1 μg / ml).
   UWAGA: Antygeny te są immunodominującymi antygenami indukującymi IFN-γ prątków gruźlicy i mogą być włączone w celu stymulacji PBMC u zwierząt zakażonych M. bovis. Zwierzęta szczepione BCG lub M. bovis ΔRD1 nie reagują na rESAT-6:CFP10, ponieważ region kodujący te antygeny (tj. RD1) jest usunięty w tych szczepach. rESAT-6:CFP10 użyty w tych badaniach był miłym prezentem od dr C. Miniona z Uniwersytetu Stanowego Iowa. TB10.4 i antygen Ag85A są antygenami immunodominującymi obecnymi w zjadliwych i szczepionkowych szczepach M. bovis ³⁷. PPDB, jako oczyszczona pochodna białka, jest kompleksem kilku antygenów, w tym antygenów wspólnych z prątkami niegruźliczymi. Zakażone zwierzęta potencjalnie reagują na wszystkie antygeny (a mianowicie: TB10.4, Ag 85A, rESAT-6:CFP10 i PPDb), podczas gdy zwierzęta szczepione nie powinny reagować na rESAT-6:CFP10 ¹¹.
5. Płytka 500 μl / basenik roztworu antygenu w poczwórnych duplikatach dla każdego zwierzęcia na płytce 24-dołkowej. W tym protokole użyj antygenów jako puli; Dlatego na tym etapie należy użyć wszystkich studzienek zawierających wszystkie antygeny i nie ma żadnych kontroli (takich jak Null lub Mitogen). Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C / 5 % CO₂ . Normalna temperatura bydła wynosi 39 °C; w związku z tym niektórzy badacze wykorzystują 39 °C do hodowli komórek bydlęcych. Ponadto, w niektórych przypadkach w przypadku komórek ludzkich, hodowla komórkowa w temperaturze 39 °C zapewnia dodatkowe korzyści^26,30.
6. Strzykawki w połączeniu z 16 lub 18 g, igły podskórne z 6 ml 2 X dekstrozy kwasu cytrynianowego i pobrać 60 ml krwi bydlęcej przez nakłucie żyły szyjnej.
7. Wyizolować PBMC przez wirowanie w gradiencie standardowej gęstości frakcji kożucha krwi obwodowej, dostosowując stężenie komórek do 4 X 10⁶ komórek / ml, jak opisano przez Maue i wsp. ^{27 Rozdział 27}
8. Dodać komórki (500 μl / studzienkę) do wstępnie załadowanej 24-dołkowej płytki antygenu, poczwórnie dla każdego zwierzęcia (krok 2.5). Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C / 5 % CO₂ .

(Dzień trzeci i siódmy)

9. Stosując sterylną technikę, ostrożnie usunąć 500 μl supernatantu z każdej studzienki, nie naruszając warstwy komórkowej.
10. Uzupełnić objętość studzienki, dodając 500 μl / studzienkę cRPMI zawierającą IL-2 (30 U / μl, tj. 15 U / studzienkę; rekombinowana ludzka IL-2 Sigma I7908). Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C / 5 % CO₂ .

(dni 10 i 12)

11. Stosując sterylną technikę, usunąć 750 μl supernatantu z każdej studzienki. Uzupełnić objętość 750 μl / studzienkę cRPMI (bez IL-2). Inkubować płytkę w temperaturze 39 °C / 5 % CO₂ .

3. Test ELISPOT (protokół trzydniowy)

(Dzień pierwszy (12 ^dzień długoterminowego protokołu hodowli))

1. Płytkę ELISPOT należy odpowiednio oznaczyć dla każdego zestawu próbek, aby uniknąć błędów podczas powlekania komórek: komórki długoterminowe plus komórki prezentujące antygen (APC), komórki długoterminowe bez APC oraz komórki ex vivo / krótkotrwałe (ryc. 1). Powtórzenia dla każdego leczenia (tj. stymulacji antygenowej) powinny być wykonywane co najmniej dwukrotnie.
2. Przygotować roztwór przeciwciała wychwytującego, rozcieńczając mysie przeciwciało przeciw bydłu IFN-γ (MCA2112, klon CC330) w PBS (8 μg / ml).
3. Za pomocą pipety wielokanałowej należy wstępnie zwilżyć studzienki płytki ELISPOT 15 μl / studzienkę 35% etanolu przez 1 min. Aby zapobiec uszkodzeniu membrany, nie należy dotykać dna studzienek końcówkami pipet w żadnym momencie podczas testu.
4. Umyj płytkę sześciokrotnie 300 μl / studzienkę PBS. Płyn myjący należy wyrzucić przez odwrócenie płytki. Mycie należy wykonywać szybko, nie dopuszczając do wyschnięcia dołków płytkowych.
5. Odpipetować 100 μl / studzienkę wychwytu przeciwciała anty-IFN-γ (z kroku 1 powyżej). Inkubować w temperaturze 4 °C O/N (przechowywać płytkę w torbie do przechowywania zapinanej na zamek błyskawiczny).

(Dzień drugi (13 ^dzień długoterminowego protokołu hodowli))

6. Przygotować roztwory antygenu o stężeniu dwukrotnie wyższym niż końcowe. Zabiegi to: brak stymulacji (cRPMI), PPD-B (20 μg/ml, stężenie końcowe: 10 μg/ml), koktajl białkowy TB10,4 i Ag85A (2 μg/ml każdego białka, stężenie końcowe: 1 μg/ml każdego białka), rESAT-6:CFP10 (dla zakażenia M. bovis, 2 μg/ml, stężenie końcowe: 1 μg/ml), oraz kontrola pozytywna, takich jak szkarłatka (20 μg / ml, końcowe stężenie: 10 μg / ml). Zamiast PWM można stosować inne mitogeny (np. konkanawalinę A).
   UWAGA: na tym etapie antygeny składają się z czterech różnych metod leczenia i nie są używane jako pula (jak w kroku 2.5). Cztery zabiegi to: NS, PPDb, koktajl białkowy (TB10.4 i Ag85A stanowią jeden zabieg) oraz PWM.

4. Krótkoterminowa hodowla komórkowa i izolacja komórek przylegających (APC)

1. Pobrać 60 ml krwi od tych samych zwierząt, które wykrwawiły się w 1. dniu (pod: hodowla długoterminowa, protokół 14-dniowy) i wyizolować PBMC jak poprzednio.
2. Dostosuj stężenie komórek do 2 X 10⁶ komórek / ml. Wyraźnie oznacz probówki, aby zapobiec nieprawidłowej alokacji podczas powlekania komórek. Komórki te zostaną wykorzystane do izolacji APC, a także jako krótkoterminowa hodowla komórkowa (krok 6.5). Oznaczyć probówki zarówno numerem zwierzęcia, jak i rodzajem hodowli (w tym przypadku: ex vivo, krótkotrwałe lub świeże komórki).
3. Usunąć nadmiar przeciwciał wychwytujących z ELISPOT metodą odwrócenia płytki. Umyj płytki 6 razy za pomocą 300 μl PBST.
4. Usuń jak najwięcej PBST. Pobrać pipetą 50 μl zawiesin komórkowych do studzienek oznaczonych jako komórki długoterminowe plus APC. Zablokuj inne studzienki za pomocą 200 μl / studzienki cRPMI. Inkubować 90 minut w temperaturze lub 39 ^°C. Wstępnie podgrzać cRPMI do lub 39 ^°C (konieczne dla kolejnych etapów). Świeże PBMC nieużywane do izolacji komórek adherentnych (APC) będą potrzebne w kolejnych krokach i powinny być przechowywane.

5. Hodowane komórki

1. Podczas 90-minutowej inkubacji (etap 4.4, etap hodowli krótkoterminowej i etap izolacji komórek przylegających) należy zebrać komórki hodowane długoterminowo.
2. Używając pipet o pojemności 5 lub 10 μl, pipetuj media z komórkami w górę i w dół w celu odłączenia komórek, połącz poczwórne powtórzenia z każdego zwierzęcia w jedną probówkę o pojemności 15 ml. Odwirowywać probówki przez 5 minut przy 400 g.
3. Po odwirowaniu odrzucić supernatant przez odwrócenie probówki. Usunąć osad komórkowy. Dodać 5 ml PBS, w razie potrzeby delikatnie zawiesić osad. Powtórzyć wirowanie. Powtórz krok prania dwukrotnie. Odrzuć supernatant przez odwrócenie probówki i delikatnie ponownie zawieś komórki w 1 ml cRPMI. Dostosuj stężenie komórek do 2 X 10⁵ komórek / ml.

6. Posiewanie świeżych i hodowlanych PBMC

1. Po 90 minutach inkubacji wstrząsać płytkami na wytrząsarce przez 30 sekund. Usunąć nieprzylegające komórki przez odwrócenie płytki. Odpipetować 150 μl / studzienkę ciepłego cRPMI (od kroku 4, pod: Etap izolacji komórek krótkotrwałych i komórek adherentnych (APC)).
2. Wstrząśnij talerzami i wylej płyn do mycia. Powtórz pranie 3 razy. Dodaj 100 μl / studzienkę każdego antygenu do odpowiednich studzienek (wstępnie znakowanych).
3. Aby umieścić komórki na płytkach, należy pipetować 100 μl / studzienkę długotrwałej zawiesiny komórek hodowlanych (2 x 10⁵ komórek / ml) do studzienek oznaczonych jako komórki długoterminowe plus APC. Upewnij się, że długoterminowe komórki dodane na tym etapie pochodzą od tego samego zwierzęcia, co APC już znajdujące się w studni. Nie mieszaj APC i komórek hodowanych długoterminowo od różnych zwierząt.
4. Odpipetować 100 μl / basenik długotrwałej zawiesiny komórek hodowlanych (2 x 10⁵ komórek / ml) do studzienek bez APC w celu oceny zapotrzebowania APC na długoterminową odpowiedź hodowli.
5. Dodać 100 μl / studzienkę komórek krótkotrwałych (świeżo wyizolowanych i dostosowanych do 2 x 10⁶ komórek / ml) w celu oceny odpowiedzi ex vivo. Inkubować płytki O/N w inkubatorze o temperaturze 39 ^°C / 5 % CO₂ . Upewnij się, że talerze leżą płasko i nie układaj talerzy w stos.
   UWAGA: Jeśli pożądana jest analiza fenotypu komórki, cytometria przepływowa może być wykonana jako test pomocniczy. Komórki są siane na 96-dołkowych płytkach dolnych U (zamiast płytek ELISPOT), jak opisano dla testu ELISPOT. Adsorpcję przeciwciał wychwytujących (kroki od 3.4 do 3.5) należy pominąć. Komórki są następnie inkubowane O/N w temperaturze 39 °C / 5 % CO2 i przeprowadzany jest standardowy protokół barwienia komórek. Odczynniki do barwienia komórek znajdują się w tabeli odczynników.

Dzień trzeci (14 ^dzień długoterminowego protokołu hodowli)

6. Rozcieńczyć przeciwciało wykrywające (mysie przeciwciało przeciw bydłu IFN-γ, klon CC302) do 5 μg / ml w PBS 1 % BSA. Wylać płyny ze studzienek i płytek myjących: sześć razy za pomocą PBST (300 μl / studzienka), umieszczając na wytrząsarce za każdym razem na 10 sekund przed i pomiędzy płukaniami, raz z dH₂O (300 μl / studzienka), dodatkowo 6 razy z PBST (300 μl / studzienka) i dwa razy z PBS (300 μl / studzienka). Po wyjęciu komórek z płytek i jeżeli nie występują żadne obawy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego, procedury mogą być wykonywane poza komorami bezpieczeństwa biologicznego.
7. Wylej płyn do mycia. Usuń jak najwięcej płynu do mycia, stukając talerzem o ręczniki papierowe. Dodać przeciwciało detekcyjne (100 μl / studzienkę).
8. Inkubować płytki przez 120 minut w temperaturze lub 39 ^°C. Na tym etapie inkubacji przygotuj alkaliczny roztwór fosfatazy zgodnie z instrukcjami producenta. Trzydzieści minut przed użyciem (tj. 90 minut po dodaniu przeciwciała wykrywającego do studzienek) rozcieńczyć odczynnik w PBST. Delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać odczynniki i inkubować w temperaturze pokojowej.
9. Po 120 minutach inkubacji odrzucić nadmiar przeciwciał wykrywających przez odwrócenie płytki. Umyj płytkę 6 razy PBST (300 μl / dobrze). Usuń jak najwięcej płynu do mycia, stukając talerzem o ręczniki papierowe.
10. Dodaj 100 μl / studzienkę alkalicznego roztworu fosfatazy (z kroku 3 powyżej). Inkubować płytki przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Wylać płyn i umyć każdą płytkę 6 razy PBST (300 μl / studzienkę).
11. Przygotować roztwór substratu zgodnie z instrukcjami producenta (Vector Blue AP substrate III): Rozcieńczyć odczynniki w 100 mM buforze Tris HCL pH 8,2. Odpipetować 50 μl / studzienkę roztworu substratu.
12. Inkubować w temperaturze pokojowej, aż zacznie rozwijać się niebieski kolor (około 30 minut). Wylać płyn i umyć płytki dużą ilością dH₂O. Zdjąć dolną płytę, aby odsłonić membranę, umyć z powrotem studzienki i pozostawić płytkę do wyschnięcia na powietrzu.
13. Odczytać płytki w analizatorze obrazu immunospot lub czytniku ELISPOT (Tabela 1) lub ręcznie za pomocą mikroskopu stereoskopowego. Alternatywnie, trzymaj talerze w ciemności w temperaturze RT do czasu czytania. Ze względu na wysoką stabilność substratu reakcyjnego, jakość jest zachowana przez kilka lat.
    UWAGA: Stężenia komórek i antygenów zostały zoptymalizowane tak, aby uniknąć studzienek z niezliczonymi plamami ^23,24,27,37. Możliwe jest, że niepoliczalne plamy powstają w różnych warunkach lub z powodu zmienności biologicznej. W takim przypadku należy zoptymalizować stężenie komórek, aby uzyskać czytelną odpowiedź na zliczanie punktowe.

7. Odczyt tablic rejestracyjnych i analiza danych

1. Wykonaj analizę zgodnie z przewodnikiem czytnika płytek ELISPOT firmy Cellular Technology Limited (CTL) (Tabela 1). Po uzyskaniu liczby plam dla każdej ze studni oblicz średnią między duplikatami. Specyficzną odpowiedź immunologiczną na każdy bodziec antygenowy oblicza się, odejmując średnią liczbę plamek w studzienkach niestymulowanych od liczby dołków stymulowanych antygenem.

Wyniki

Około miesiąc po zakażeniu aerozolem M. bovis (10⁴ jednostek tworzących kolonie), PBMC od zakażonych (n=8) i kontrolnych (n=8) hodowano w obecności antygenów i IL-2 przez 13 dni. Rozwój odpowiedzi Tcm po zakażeniu określono za pomocą testu IFN-γ ELISPOT. Reprezentatywne odpowiedzi Tcm (w obecności lub braku APC) i exvivo IFN-γ odpowiedzi ELISPOT od zakażonych zwierząt (trzy zwierzęta) i zwierzęcia niezakażonego (jedno zwierzę) przedstawiono na rysunku 1. Udany, długoterminowy test IFN-γ ELISPOT prowadzi do powstania komórek wytwarzających IFN-γ (Spot-Forming Cells, SFC) w warunkach stymulowanych i prawie bez odpowiedzi ze strony zwierząt niezakażonych i w warunkach niestymulowanych. Ponadto w odpowiedzi na PWM powinna wystąpić silna odpowiedź limfocytów T. Specyficzne odpowiedzi na M. bovis oceniano za pomocą stymulacji antygenowej PPD-B lub rESAT-6:CFP10. Jak pokazano na rycinie 1, u wszystkich trzech zwierząt zakażonych M. bovis wykryto silne odpowiedzi Tcm i ex vivo na PPD-B i rESAT-6:CFP10. U zwierzęcia kontrolnego wykryto minimalne lub żadne odpowiedzi Tcm i ex vivo. Ponadto obecność APC była wymagana dla optymalnej odpowiedzi Tcm przez zakażone zwierzęta, co wykazano w znacznie zmniejszonej odpowiedzi przez długoterminowe komórki hodowane przy braku autologicznych APC. Odpowiedź IFN-γ PBMC ze zwierząt zakażonych i niezakażonych M. bovis przedstawiono na rycinie 2. Liczbę SFC od każdego zwierzęcia obliczono jako średnią liczbę SFC w zduplikowanych próbkach w odpowiedzi na PPD-B pomniejszoną o odpowiednią reakcję na same pożywki. Odpowiedzi oszacowano dla 10⁶ komórek. Odpowiedzi różniły się (P < 0,05) w zależności od statusu zakażenia, obecności lub braku APC i czasu trwania posiewu (tj. posiew długoterminowy w porównaniu z posiewem ex vivo).

Pobieranie obrazu płyt
Rozdział 1.	Włącz maszynę
cyfra arabska.	Otwórz oprogramowanie "Immuno Capture" w wersji 6.3.
Rozdział 3.	Krok 1: wybierz typ płyty.
Rozdział 4.	Krok 2: płyta obciążeniowa.
Rozdział 5.	Krok 3: wybierz opcje skanowania.
Lokal mieszkalny	Krok 4: rozpocznij skanowanie.
Rozdział 7.	Uzyskaj obraz poglądowy płyty.
Rozdział 8.	Płyta wysuwająca.
Rozdział 9.	Zamknij oprogramowanie "Immuno Capture".
Liczenie jednostek tworzących plamki
Rozdział 1.	Otwórz oprogramowanie "Immuno Spot Capture" w wersji 5.0.
cyfra arabska.	Wybierz typ obiektu: normalny.
Rozdział 3.	Wybierz moduł zliczania: inteligentne liczenie.
Rozdział 4.	Krok 1: płyta obciążeniowa.
Rozdział 5.	Krok 2: zdefiniuj parametry zliczania: przetestuj dokładność rozpoznawania plamek na studniach z różnymi miejscami.
Lokal mieszkalny	Rozpocznij automatyczne liczenie.
Kontrola jakości
Rozdział 1.	Otwórz oprogramowanie "Immunospot Capture" w wersji 5.0.
cyfra arabska.	Wybierz moduł zliczania: kontrola jakości.
Rozdział 3.	Krok 1: płyta obciążeniowa.
Rozdział 4.	Krok 2: Przeanalizuj indywidualnie podświetlone dołki.
Rozdział 5.	Zakończ kontrolę jakości.

Tabela 1 - Akwizycja obrazu czytnika AutoImmun Diagnostika ELISPOT i procedura zliczania komórek.

Rysunek 1. Obraz studzienek z długoterminowego testu ELISPOT z hodowlą IFN-γ. Test ELISPOT z hodowlą IFN-γ przeprowadzono około miesiąc po prowokacji zjadliwym M. bovis (trzy zwierzęta). Zwierzęta niezakażone włączono do grupy kontrolnej (jedno zwierzę). Długoterminowe linie komórkowe wygenerowano poprzez stymulację PBMC koktajlem rekombinowanego Ag85A (1 μg / ml), TB10,4 (1 μg / ml), rESAT-6:CFP10 (1 μg / ml) i PPD-B (5 μg / ml) przez 13 dni, a następnie przeniesienie na płytki ELISPOT w obecności lub braku autologicznego APC. Krótkotrwałe komórki składały się z PBMC wyizolowanego w 13 dniu i posianego bezpośrednio na płytkach ELISPOT. Komórki długotrwałe i krótkoterminowe stymulowano PPD-B (10 μg / ml), rESAT-6:CFP10 (1 μg / ml), samą pożywką lub mitogenem z pokweedu (5 μg / ml) przez 24 godziny.

Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki długoterminowej hodowlanej odpowiedzi IFN-γ ELISPOT na oczyszczoną pochodną białka M. bovis (PPD-B). Test hodowlany IFN-γELISPOT przeprowadzono około miesiąc po prowokacji zjadliwymM. bovis (osiem zwierząt). Niezakażone zwierzęta włączono jako grupę kontrolną (osiem zwierząt) Długoterminowe komórki zostały wygenerowane przez stymulację PBMC koktajlem rekombinowanego Ag85A (1 μg / ml), TB10.4 (1 μg / ml), rESAT-6: CFP10 (1 μg / ml) i PPD-B (5 μg / ml) przez 13 dni, a następnie przeniesienie na płytki ELISPOT w obecności lub braku autologicznych APC. Krótkotrwałe komórki składały się z PBMC wyizolowanego w 13 dniu i posianego bezpośrednio na płytce ELISPOT. Komórki długotrwałe i krótkoterminowe stymulowano PPD-B (10 μg / ml) lub samą pożywką przez 24 godziny. Specyficzne odpowiedzi każdego zwierzęcia (SFC / 10⁶ komórek) są przedstawione jako odpowiedź na PPD-B (średnia z podwójnych próbek) pomniejszona o odpowiedź na samą pożywkę.

Dyskusja

Produkcja IFN-γ w długoterminowych testach ELISPOT jest na ogół spowodowana Tcm u ludzi, ale sposób, w jaki ta reakcja rozwija się w hodowli, jest słabo poznany. Nie wiadomo, czy Tcm są obecne w krążeniu i rozszerzają się in vitro, czy też odpowiedzi Tcm wynikają z różnicowania komórek efektorowych i Tem do Tcm podczas hodowli. Jednak badania z próbkami od ludzi wykazały, że limfocyty T CD4 ⁺ z testów ELISPOT ex vivo i długotrwale hodowanych IFN-γ mają niepowiązaną specyficzność epitopową, co oznacza, że odpowiedzi Tcm nie rozwijają się z komórek efektorowych²⁸. Oczywiście czas trwania odpowiedzi może się różnić, ale jeśli zostanie osiągnięty klirens patogenu, ostatecznie zarówno odpowiedź ex vivo , jak i Tcm spadają. Wykazano również, że reakcje długoterminowych hodowli mierzonych wcześnie i długo po torowaniu antygenowym (gdy odpowiedź efektorowa jest niższa) korelują, co wskazuje, że krążące populacje Tcm wcześnie i długo po torowaniu antygenowym pozostają powiązane in vivo. Z drugiej strony, wielkość odpowiedzi ex vivo nie wydaje się być związana z wielkością reakcji pamięciowej²⁹. Wyniki te sugerują, że długoterminowe hodowlane odpowiedzi IFN-γ ELISPOT wynikają z ekspansji Tcm in vitro i związanego z tym zaniku odpowiedzi efektorowych w próbce, a nie różnicowania komórek efektorowych do fenotypu TCM.

W przypadku bydła względny udział podzbiorów efektorowych i pamięciowych w odpowiedziach wykrywanych w długoterminowych testach IFN-γ ELISPOT nie jest znany. Ostatnie badania wskazują na korelację między długotrwałą odpowiedzią γELISPOT wywołaną szczepionką a ochroną przed późniejszym eksperymentalnym zakażeniem M. bovis^23-24. Doniesiono, że słaba długoterminowa odpowiedź IFN-γ ELISPOT na szczepienie jest związana z brakiem ochrony³⁰. Zarówno żywe, jak i zabite szczepionki wywołują podobne odpowiedzi ex vivo IFN-γ ELISPOT, ale szczepienie żywym BCG wywołuje silniejszą długotrwałą odpowiedź ELISPOT w hodowli IFN-γ niż w przypadku zabitych preparatów szczepionkowych. Co ciekawe, żywe szczepionki mają działanie ochronne, podczas gdy zabite preparaty nie zapewniają ochrony przed prowokacją zjadliwymi prątkami gruźlicy ^{31-32, 33}.

Ocena odpowiedzi Tcm jest również możliwa poprzez sortowanie tych komórek z PBMC. Bezpośrednie wzbogacenie Tcm z PBMC wymaga jednak drogich urządzeń, wysoko wykwalifikowanego personelu i jest trudne, ponieważ komórki te nie są liczne w krwiobiegu. Długotrwała hodowla PBMC zapewnia wzbogacenie Tcm nad Tem i komórkami efektorowymi bez kosztownych urządzeń; jednak ponieważ te populacje limfocytów T są rozszerzane in vitro , mogą być mniej reprezentatywne dla odpowiedzi pamięciowych in vivo . Możliwe jest uzyskanie dostępu do odpowiedzi pamięci IFN-γ (przy użyciu długoterminowej hodowli lub strategii sortowania TCM) za pomocą testów innych niż ELISPOT, takich jak: ELISA^{cytokin 34}, macierze kulek cytokin (CBA), barwienie wewnątrzkomórkowe (ICS) lub macierze białek cytokin (CPA). Te metody; są jednak na ogół mniej czułe niż testy ELISPOT³⁵.

Zaletą ELISPOT jest jego zdolność do wykrywania natychmiastowego wychwytywania cytokiny wkrótce po jej uwolnieniu, zapobiegając rozcieńczeniu w supernatancie i degradacji przez rozszczepienie enzymatyczne lub wychwyt cytokin przez inne komórki. Testy ELISPOT wykrywają pojedyncze komórki wytwarzające cytokiny, zapewniając precyzyjne wyniki nawet w scenariuszach niskiego stosunku sygnału do szumu (tj. niskich odpowiedzi swoistych)³⁵. Ponadto, w przypadku ICS, wykrycie cytokin przed uwolnieniem może skutkować fałszywą identyfikacją komórek wytwarzających cytokin (np. z powodu modulacji potranslacyjnej przed lub w trakcie procesu wydzielniczego)³⁴. Inhibitory transportu stosowane w testach ICS w celu zminimalizowania wydzielania cytokin podczas stymulacji antygenowej (znane jako białka zatrzymania Golgiego) ograniczają czas stymulacji komórek ze względu na toksyczność komórek tych białek, co ostatecznie wpływa na produkcję cytokin³⁵.

Mając to na uwadze - CBA, CPA i ICS są przydatnymi technikami do jednoczesnego pomiaru wielu cytokin i / lub do określania ekspresji markerów powierzchniowych komórek (tj. za pomocą ICS). W związku z tym metody te mogą być stosowane w połączeniu z testem IFN-γ ELISPOT³⁶. Podczas gdy poprzednie badania skuteczności szczepionki przeciwko gruźlicy bydła mierzyły odpowiedź Tcm za pomocą testu ELISPOT, wykrycie odpowiedzi Tcm za pomocą innych technik prawdopodobnie przyniesie porównywalne wyniki. Co ważne, test ELISPOT jest tańszy i prostszy do wykonania niż techniki analizy CBA, CPA i ICS³⁴. Ręczne liczenie SFC jest alternatywą dla automatycznego liczenia, a płytki ELISPOT mogą być przechowywane w RT przez długi czas przy minimalnej utracie jakości, przed lub po zliczaniu punktowym³⁷.

Długoterminowa hodowlana odpowiedź IFN-γ ELISPOT została zastosowana do oceny odpowiedzi pamięciowych u ludzi i bydła podczas oceny odpowiedzi na szczepionkę przeciw gruźlicy^{14-16,31-32,33.} Zakłada się również, że odpowiedzi Tcm odgrywają znaczącą rolę w odpowiedziach gospodarza na kilka innych czynników zakaźnych bydła, takich jak: Mycoplasma mycoides subsp. mycoides⁴², Anaplasma marginale³⁸ i syncytialny wirus oddechowy^{bydła 39}. Potencjalnie, długoterminowy test ELISPOT może zostać dostosowany do innych gatunków zwierząt, cytokin i infekcji. Te szersze zastosowania będą szczególnie przydatne w zastosowaniach immunologii weterynaryjnej ze względu na obecną ograniczoną dostępność określonych odczynników.

Odpowiedzi TCM mają kluczowe znaczenie dla ochrony przed wieloma infekcjami, ale ich pomiar na wczesnym etapie po zakażeniu / szczepieniu (w celu przewidywania wyników choroby lub skuteczności szczepionki) może być kłopotliwy. Analiza odpowiedzi immunologicznej w warunkach ex vivo i krótkiej stymulacji antygenowej będzie częściej reprezentować odpowiedzi efektorowe, ze względu na nakładanie się odpowiedzi pamięciowych i efektorowych, zwłaszcza na początku tworzenia pamięci immunologicznej. W kontekście chorób przewlekłych, w których ładunek antygenu jest ciągły, odpowiedzi ex vivo będą oceniać odpowiedzi komórek efektorowych lub kombinację odpowiedzi komórek efektorowych i efektorowych. Opisany tutaj test ELISPOT z długoterminową hodowlą IFN-γ prawdopodobnie umożliwia pomiar odpowiedzi Tcm, a nie efektorowych limfocytów T lub połączonych odpowiedzi limfocytów T CD4 ⁺ . Podsumowując, test ELISPOT z długoterminową hodowlą IFN-γ stanowi cenne podejście do szacowania odpowiedzi pamięciowych limfocytów T i został z powodzeniem zastosowany do oceny odpowiedzi pamięciowych kilku gatunków na różne czynniki infekcji^{12-16, 20-25,29,31,33,34,38,39}.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytrynian sodu (dihydrat)	Różne
Kwas cytrynowy (monohydrat)	Różne
Dekstroza	Różne
płytki ELISPOT PVDF	Różne
Vectastain ABC – AP KIT Standard	Vector Laboratories	AK-5000
Vector Zestaw substratów fosfatazy alkalicznej	niebieskiej Vector Laboratories	SK-5300
Ag85A	Lionex	LRP-0004.3	23, 24, 25, 37
TB 10.4	Lionex	LRP-0061.6	23, 24, 25, 37
PPDb	Prionics AG	7600055
rESAT-6:CFP10	Miły prezent Dr. Minion, Iastate		23, 24, 25, 27,  37
Mysz anty-bydlęca IFN-γ Klon CC302	Serotec	MCA1783B	23, 24, 25, 27,  37
Mysz anty-bydlęca IFN-γ Biotynylowany klon CC330	Serotec	MCA2112	23, 24, 25, 27,  37
Mysz anty-bydlęcy klon CD4 CC8	Serotec	MCA1653GA
Mysz anty-bydlęca CD45RO Klon IL116A	Serotec	MCA2434GA
Szczur anty-ludzki Klon CCR7 3D12	Abcam	ab95665
Mysz anty-bydlęca IFN-γ-Pe Klon CC302	Serotec	MCA1783PE
Koza anty-mysia IgG2a- Alexa Fluor 350	Invitrogen	A-21130
Koza anty-mysia IgG3 APC-CY7	SouthernBiotechnology	1080-193
Koza anty-szczura IgG-APC	Invitrogen	A10540
BD Cytofix/Cytoperm™	BD Biosciences	554714
BrefeldinA	Sigma-Aldrich	B7651
Pokeweed Mitogen	Sigma-Aldrich	L8777
Recombinat ludzka interleukina 2	Sigma-Aldrich	I7908