Projektowanie i budowa sztucznych białek macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) z Escherichia coli dla inżynierii tkanki skóry

Podsumowanie

Technologie rekombinowane umożliwiły projektantom materiałów tworzenie nowatorskich sztucznych białek z dostosowanymi funkcjami do zastosowań inżynierii tkankowej. Na przykład sztuczne białka macierzy zewnątrzkomórkowej można zaprojektować tak, aby zawierały domeny strukturalne i biologiczne pochodzące z natywnych ECM. W tym miejscu opisujemy budowę i oczyszczanie białek aECM zawierających powtórzenia podobne do elastyny.

Streszczenie

Technologia rekombinowana to wszechstronna platforma do tworzenia nowatorskich sztucznych białek o regulowanych właściwościach. W ciągu ostatniej dekady opisano wiele sztucznych białek, które zawierały funkcjonalne domeny pochodzące z natury (lub stworzone de novo). W szczególności opracowano białka sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM); te białka aECM składają się z domen biologicznych pobranych z fibronektyny, lamininy i kolagenu i są połączone z domenami strukturalnymi, w tym powtórzeniami podobnymi do elastyny, powtórzeniami jedwabiu i kolagenu. Do tej pory białka aECM były szeroko badane pod kątem zastosowań w inżynierii tkankowej i gojeniu ran. Niedawno Tjin i jego współpracownicy opracowali specyficzne dla integryny białka aECM, przeznaczone do promowania przyłączania i propagacji keratynocytów ludzkiej skóry. W swojej pracy białka aECM zawierają domeny wiążące komórki pobrane z fibronektyny, lamininy-5 i kolagenu IV, a także flankujące powtórzenia podobne do elastyny. Wykazali, że białka aECM opracowane w ramach ich prac są obiecującymi kandydatami do zastosowania jako substraty w sztucznej skórze. W tym miejscu przedstawiamy projekt i budowę takich białek aECM, a także proces ich oczyszczania z wykorzystaniem termoczułych właściwości elastyny.

Wprowadzenie

Przez kilka dziesięcioleci zarówno syntetyczne, jak i naturalne materiały były badane pod kątem wykorzystania jako rusztowania w inżynierii tkankowej^1,2. Podczas gdy materiały syntetyczne, takie jak polimery, oferują doskonałą integralność strukturalną i regulowane właściwości mechaniczne, często mają niewystarczającą bioaktywność, aby sprzyjać wzrostowi i infiltracji tkanek. Z drugiej strony, naturalne materiały, takie jak białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), mają doskonałą aktywność biologiczną, ale mają ograniczenia, takie jak zmienność między partiami, szybka degradacja i problemy z immunogennością. W związku z tym pożądane są białka rekombinowane, ponieważ można je zaprojektować tak, aby naśladowały tylko pożądane właściwości białek natywnych^3,4.

Inżynieria białek rekombinowanych wzbudziła szerokie zainteresowanie jako wszechstronna platforma do projektowania i produkcji nowych biopolimerów białek sztucznych. Kontrolując sekwencję genetyczną, funkcje sztucznych białek można dostosować do szerokiej gamy zastosowań^5,6. W szczególności białka sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej (aECM) można dostosować tak, aby miały wiele funkcji do zastosowań w inżynierii tkankowej, regeneracji i gojeniu ran^2,7. Co ważniejsze, postępy w technologiach klonowania i oczyszczania znacznie zwiększyły skalowalność i znacznie obniżyły koszty produkcji białek rekombinowanych. Możliwe jest wytwarzanie dużych ilości białek rekombinowanych przy niskich kosztach produkcji, które są ekonomiczne do stosowania w klinice⁵.

Sztuczne białka macierzy zewnątrzkomórkowej zostały opracowane do zastosowań w inżynierii tkankowej^8-11. Na przykład Tirrell i wsp. zaprojektowali przeszczep naczyniowy o małej średnicy, wykorzystując sztuczne białka zawierające sekwencję CS5 fibronektyny i powtórzenia podobne do elastyny (ELP-CS5). Wykazali, że ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) są w stanie przylegać i rosnąć na tych materiałach¹². Inni włączyli również krótkie sekwencje bioaktywne pobrane z fibronektyny, kolagenu, lamininy, fibrynogenu i witronektyny, a także domen strukturalnych, które naśladują elastynę, pajęczą nić i kolageny, aby stworzyć różnorodne białka fuzyjne¹⁰. Usieciowane folie wykonane z białek aECM na bazie elastyny wykazywały również właściwości mechaniczne podobne do natywnej elastyny (moduły sprężystości wahają się w zakresie 0,3-0,6 MPa)¹³. Następnie stwierdzono również, że białka aECM zawierające dłuższe fragmenty fibronektyny przyspieszają gojenie się ran in vitro ze względu na zwiększone powinowactwo wiązania integryn⁸.

Ostatnio, Tjin i jego^{współpracownicy} opracowali sztuczne białka ECM specyficzne dla integryny. Każde białko aECM zawiera bioaktywną domenę wiążącą komórki pobraną ze składników ECM rodzimej ludzkiej skóry^2,7,15, takich jak laminina-5, kolagen-IV i fibronektyna. Na przykład wykazano, że integryna α₃Β₁ wiąże sekwencję PPFLMLLKGSTR znajdującą się w domenie kulistej 3 łańcucha lamininy-5 alfa-3 (LG3)^16,17. W swoim raporcie wykazali, że pierwotne keratynocyty naskórkowe ludzkiej skóry preferencyjnie angażują różne integryny do wiązania się z każdym z białek aECM, w zależności od rodzaju obecnej domeny wiążącej komórki.

Białka aECM omówione w pracy Tjin et al. zawierają flankujące domeny podobne do elastyny {(VPGIG)₂VPGKG(VPGIG)₂}₈, które nadają elastyczność naśladującą mechaniczne właściwości ludzkiej skóry. Ponadto włączenie reszt lizyny do powtórzeń podobnych do elastyny zwiększa również ogólną rozpuszczalność białek w rozpuszczalnikach wodnych. Ponadto reszty lizyny służą również jako miejsca sieciowania, ułatwiając tworzenie usieciowanych warstw aECM¹². Włączenie powtórzeń podobnych do elastyny do sekwencji białka aECM umożliwia łatwe oczyszczanie białek za pomocą odwrotnego cyklu przejścia (ITC)¹⁴. Elastyny ulegają ostrej i odwracalnej przemianie fazowej w określonej temperaturze znanej jako dolna krytyczna temperatura roztworu (LCST) lub odwrotna temperatura przejścia (TT₎^18-20. Elastyny i powtórzenia podobne do elastyny przyjmują hydrofilowe losowe konformacje cewki poniżej ich LCST i stają się rozpuszczalne w wodzie, podczas gdy powyżej ich LCST elastyny szybko agregują się w cząstki wielkości mikronów. Takie przemiany fazowe są odwracalne, a zatem można je wykorzystać, aby umożliwić łatwe oczyszczanie białek aECM na bazie elastyny za pomocą techniki ITC²¹.

W tej pracy opisujemy uogólnioną procedurę projektowania, konstruowania i oczyszczania sztucznych białek ECM zawierających bioaktywne domeny wiążące komórki, połączone z powtórzeniami podobnymi do elastyny. Opisano proces projektowania i klonowania plazmidów, które kodują sekwencje aminokwasowe dla białek aECM. Przedstawiono etapy oczyszczania białek aECM za pomocą ITC. Na koniec omówiono metody oznaczania czystości białek aECM otrzymanych za pomocą elektroforezy SDS-PAGE i Western Blotting.

Protokół

1. Klonowanie rekombinowanych plazmidów kodujących białka aECM

1. Zaprojektuj sekwencję aminokwasową domeny funkcjonalnej (np. domena wiążąca komórki i powtórzenia podobne do elastyny). Zaprojektuj strony z ograniczeniami po bokach domen funkcjonalnych, aby ułatwić subklonowanie przy użyciu wolnego oprogramowania zgodnie z instrukcjami oprogramowania (np. http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/). W tym miejscu wybierz unikatowe miejsca ograniczenia, które nie są obecne w domenie funkcjonalnej, aby ograniczyć trawienie do zamierzonych miejsc. Wybierz miejsca ograniczeń, które pojawiają się w wielu miejscach klonowania (MCS) wektora gospodarza (np. pET22b(+)) do podklonowania.
2. Odwrotna translacja sekwencji aminokwasów na sekwencję nukleotydów za pomocą bezpłatnych stron internetowych zgodnie z instrukcjami oprogramowania. (np. http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). Upewnij się, że kodony są zoptymalizowane pod kątem gospodarzy E. coli.
3. Gen będący przedmiotem zainteresowania można kupić komercyjnie jako jednoniciowe oligonukleotydy (tj. jeśli oligonukleotydy < 100 par zasad (bp)) i przeprowadzić wyżarzanie DNA (patrz krok 1.4) w celu obniżenia kosztów. W przeciwnym razie, w przypadku genów większych niż 100 pz, można je nabyć za pośrednictwem firm komercyjnych.
4. Wyżarzanie DNA oligonukleotydów
   1. Wyżarzać oligomery DNA, aby uzyskać pożądaną sekwencję genów. Rozpuścić oligonukleotydy DNA w buforze oligomerów DNA (10 mM tris: 2-amino-2-(hydroksymetylo)-propan-1,3-diol, pH 8,0, przefiltrowany) do końcowego stężenia 1 μg/μl.
   2. Dodać 4 μl każdego oligomeru do 32 μl buforu do wyżarzania DNA (10 mM Tris, 100 mM NaCl i 100 nM MgCl₂), aby uzyskać całkowitą mieszaninę 40 μl.
   3. Zagotuj zlewkę z wodą na płycie grzejnej i zanurz mieszaninę na 5 minut, 95 °C. Wyjąć zlewkę i stopniowo schłodzić cały zestaw w styropianowym pudełku O/N. Oligomery zostały wyżarzone i są gotowe do trawienia.
5. Dodać odpowiednie enzymy restrykcyjne w celu oddzielnego trawienia wyżarzonych oligomerów (tj. określanych jako insert) i wektora gospodarza (tj. pET22b(+)) oddzielnie. Stosować według następującego przepisu (1-2 μg DNA, 2 μl każdego enzymu restrykcyjnego, 5 μl 10x buforu enzymu restrykcyjnego i woda do całkowitej ilości 50 μl mieszaniny) przez 3-4 godziny w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Wektor plazmidowy pET22b(+) jest oporny na antybiotyki ampicyliny i zawiera 6x-His znacznik na C-końcu. Znacznik 6x-His obecny w pET22b (+) pozwala nam użyć przeciwciał znakowanych przez Hisa do identyfikacji docelowego białka za pomocą western blotting w kroku 7.
6. Dodaj 6x barwnik ładujący do każdej mieszanki mineralnej. Uruchom mieszaniny wytrawiające oddzielnie, w tym drabinkę DNA, na 1,2% żelach z agarozy DNA zawierających fluorescencyjne promieniowanie UV DNA przez 1 godzinę przy napięciu 100 V. Wizualizuj 1,2% żel agarozowy DNA za pomocą oświetlacza światła UV.
7. Pokrój żel, aby wyekstrahować strawione produkty DNA za pomocą komercyjnych zestawów do oczyszczania żelu. Elutować przy użyciu minimalnej objętości kolumny, aby osiągnąć minimalne stężenie DNA 50-100 ng/μl.
8. Połączyć interesujący gen sekwencyjnie, ligując strawioną wstawkę DNA (tj. powtórzenia elastyny lub domeny wiążące komórki uzyskane przez wyżarzanie DNA) do wektora plazmidowego za pomocą ligazy T4 przy użyciu następującej receptury: (2 μl wektora, 1 μl ligazy T4, 1,5 μl buforu ligacyjnego T4, x μl insertu, 10,5 x μl wody, co daje łącznie 15 μl mieszaniny). Mieszaninę do ligacji inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godz.
   UWAGA: Stężenie molowe wektora do wstawienia powinno być zróżnicowane, aby zoptymalizować wydajność ligacji. Objętość insertu opisana w recepturze jako x zależy od stężenia eluowanego DNA z kroku 1.7.
9. Rozmrozić chemicznie kompetentne komórki E. coli DH5α (lub dowolny szczep klonujący) na lodzie. Ogrzać 2xYT płytki agarowe (Tabela 1) zawierające ampicylinę (25 μg/ml) do temperatury 37 °C.
10. Przekształć ogniwa za pomocą szoku cieplnego:
    1. Porcjować 50 μl kompetentnych komórek do czystych, wstępnie schłodzonych mikroprobówek wirówkowych. Odpipetować 5 μl (między 100 pg a 100 ng) mieszaniny ligacyjnej do komórek, delikatnie pipetując w górę i w dół w celu wymieszania. Pozostaw mieszaninę na lodzie na 20 minut.
    2. Zanurzyć probówkę mikrowirówki zawierającą mieszaninę komórek w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 2 minuty i ponownie umieścić na lodzie na 2 minuty. Skróć czas zanurzenia, aby zminimalizować uszkodzenia ogniw spowodowane przez ciepło.
    3. Dodać 500 μl pożywki SOC (tabela 1) do probówki do mikrowirówki i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 1 godzinę.
    4. Rozprowadzić 50 500 μl mieszaniny komórek/ligacji na płytce agarowej 2xYT, która została wstępnie podgrzana do temperatury słonecznej, zawierającej ampicylinę (25 μg/ml) i inkubować płytki do góry nogami w temperaturze 37 °C O/N (12-16 godzin).
11. Następnego dnia pobierz kolonie DNA z płytki agarowej za pomocą czystych końcówek pipet. Hodować kolonie w 5 ml pożywki 2YT (Tabela 1) zawierającej ampicylinę (25 μg/ml) O/N w temperaturze 37 °C O/N (12-16 godzin) z wytrząsaniem (225 obr./min).
12. Następnego dnia użyj zestawu do izolacji plazmidu, aby wyekstrahować plazmidy DNA dla każdej kolonii pobranej zgodnie z protokołem producenta. Odeluuj DNA za pomocą 50 μl wody.
13. Przeprowadzić testowe trawienie enzymami restrykcyjnymi, stosując następującą recepturę: (5 μl DNA, 0,2 μl każdego enzymu restrykcyjnego, 1 μl 10x bufor enzymu restrykcyjnego i uzupełnić wodą, aby uzyskać łącznie 10 μl mieszaniny), inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w celu przesiewu kolonii, które prawdopodobnie zawierają wstawkę, i uruchomić na 1,2% żelu agarozowym DNA, jak w kroku 1.6.
    UWAGA: Po trawieniu, udana ligacja powinna skutkować powstaniem dwóch prążków, po jednym dla wektora i insertu, które odpowiadają ich odpowiedniej masie cząsteczkowej (ryc. 1).
14. Wyślij prawdopodobne kolonie do sekwencjonowania DNA za pomocą starterów promotora T7 do przodu i do tyłu do komercyjnych sekwenatorów.

2. Przemiana rekombinowanego plazmidu w bakteryjnego gospodarza ekspresyjnego

1. Z wyniku sekwencjonowania wybierz kolonię, która została pomyślnie zligowana i użyj plazmidu DNA do transformacji w gospodarza ekspresji E. coli.
2. Rozmrozić szczep ekspresyjny E. coli (BL21(DE3)pLysS) na lodzie. W międzyczasie ciepłe płytki agarowe zawierające ampicylinę (25 μg/ml) i chloramfenikol (34 μg/ml) do RT.
   UWAGA: Plazmid pLysS obecny w szczepie bakteryjnym BL21(DE3)pLysS zawiera gen oporności na chloramfenikol. Plazmid pLysS zawiera gen represorowy T7, który ulega konstytutywnej ekspresji w celu ograniczenia nieszczelnej ekspresji białka aECM. Chloramfenikol jest niezbędny do selekcji komórek bakteryjnych, które zawierają pLysS podczas hodowli.
3. Powtórz krok 1.10, aby uzyskać przekształcone komórki E. coli, które są gotowe do ekspresji sztucznych białek. Owinąć płytki agarowe w Parafilm i przechowywać do góry nogami w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.

3. Bakteryjna ekspresja białek aECM

1. Patrz Rysunek 2, wybierz kolonię z przekształconej płytki agarowej za pomocą końcówki pipety i zaszczepij w 10 ml sterylnego podłoża Terrific Broth (TB) (Tabela 1) zawierającego zarówno ampicylinę, jak i antybiotyki chloramfenikolowe w probówce. Inkubować tę kulturę starterową w temperaturze 37 °C o/N (12-16 godzin) z wytrząsaniem przy 225 obr./min.
2. Przenieść 10 ml kultury starterowej do 1 l świeżej i sterylnej pożywki przeciw gruźlicy uzupełnionej tymi samymi antybiotykami w 3-litrowej kolbie Erlenmeyera. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem z prędkością 225 obr./min przez 2-3 godziny i obserwować, jak gęstość optyczna kultury (OD₆₀₀) osiągnęła 0,6-0,8, pipetując 1 ml kultury do pustej kuwety w celu odczytu. Zaoszczędź 1 ml kultury przed indukcją w celu scharakteryzowania SDS-PAGE.
   1. Aby zmierzyć OD₆₀₀ w hodowli komórkowej, przygotuj 1 fiolkę z pożywką TB w kuwecie do ślepego pomiaru. Oddzielnie przenieść 1 ml kultury z kolby hodowlanej do nowej pustej kuwety. Zmierzyć gęstość optyczną kultury za pomocą spektrofotometru w stosunku do ślepej próby kontrolnej przy absorbancji 600 nm.
   2. Zachować próbkę (do późniejszej analizy SDS-PAGE), przenosząc 1 ml próbki hodowlanej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, odwirować przy 12 000 x g przez 2 minuty i zdekantować supernatant.
3. Indukować kulturę za pomocą izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) do końcowego stężenia 1 mM i inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 225 obr./min przez kolejne 4 godziny. Zachować 1 ml kultury na koniec indukcji po 4 godzinach w celu charakterystyki SDS-PAGE.
4. Zebrać komórki, przenosząc kulturę do 1 litrowych butelek wirówkowych i odwirować przy 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant, zważyć granulki komórek i ponownie zawiesić w buforze TEN (1 M Tris, 0,01 M EDTA, 0,1 M NaCl, pH = 8,0) przy 0,5 g/ml.

4. Liza kultur bakteryjnych

1. Zamrozić ponownie zawieszoną hodowlę komórkową w temperaturze -80 °C O/N. Zamrożoną kulturę komórkową rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze pokojowej lub na lodzie w celu lizy komórek. Dodać 10 μg/ml dezoksyrybonukleazy I (DNazy I), 10 μg/ml rybonukleazy A (RNazy I) i 50 μg/ml fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF) podczas rozmrażania i homogenizować roztwór, powoli mieszając.
2. Po rozmrożeniu wszystkich zawieszonych komórek dostosuj roztwór do pH 9,0, aby zwiększyć rozpuszczalność białek w wodzie¹². Dodać kroplami 6 N NaOH, mieszając na lodzie, aby uzyskać jednorodną konsystencję. Liza przez rozdrobnienie ultradźwiękowe przez 20 minut na lodzie za pomocą płaskiej końcówki o średnicy 2 mm, impuls 5 sekund.
3. Odwirować roztwór komórkowy o stężeniu 12 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do czystej, pustej butelki i przechowywać w temperaturze 4 °C w celu późniejszego oczyszczenia.
4. W międzyczasie ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą buforu TEN i ponownie zamrozić w temperaturze -80 °C. Aby zakończyć lizę komórek, powtórz proces zamrażania/rozmrażania i sonikacji do trzech razy. Zaoszczędź 20 μl lizatu komórkowego do charakterystyki SDS-PAGE.

5. Oczyszczanie białek aECM za pomocą odwrotnego cyklu przejścia

1. Zsortuj lizat komórkowy z kroku 4.3 i przystąp do oczyszczania białek aECM za pomocą ITC, podobnie jak w przypadku oczyszczania białek na bazie elastyny²¹. Cykle będą wykonywane w różnych temperaturach, które wynoszą odpowiednio 4 °C (określane jako "zimne") i 37 °C (określane jako "ciepłe").
2. Podzielić lizat komórkowy na 50 ml butelki wirówkowe i odwirować przy 40 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 4 °C. Wygląd osadu komórkowego powinien być ciemnobrązowy i wyglądać na rzadki.
3. Usunąć supernatant przez pipetowanie, aby uzyskać czyste oddzielenie od osadu. Zebrać supernatant do czystych butelek wirówkowych i dodać NaCl do końcowego stężenia 1 M (maksymalnie do 3 M). Podgrzewać roztwór do temperatury 37 °C przez 2 godziny, wstrząsając z prędkością 225 obr./min.
   UWAGA: Dodanie NaCl spowoduje przejście składnika elastyny aECM, powodując agregację. Supernatant zmieni kolor na mętny. Jeśli stężenie białka jest wystarczająco wysokie, po bokach butelki wirówki można zobaczyć białe, pieniste białko
.
4. Odwirować supernatant z kroku 5.3 przy 40 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Zdekantować supernatant. Rozdrobnić granulki za pomocą metalowej szpatułki i ponownie zawiesić kawałki osadów w lodowatej autoklalawowanej wodzie destylowanej (50 mg/ml), energicznie mieszając O/N w temperaturze 4 °C za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki. Osad powinien być całkowicie rozpuszczony.
5. Powtórz kroki od 5.2 do 5.4 przez kolejne trzy do pięciu razy, aby uzyskać wyższą czystość białka.
6. Po ostatnim cyklu oczyszczania odsolić roztwór białkowy, dializując go w wodzie destylowanej o temperaturze 4 °C. Roztwór białka należy dializować z wodą przez 2-3 dni ze zmianami w wodzie co 4 godziny lub 8 godzin w przypadku O/N. Zachowaj 20 μl oczyszczonego białka dla SDS-PAGE i liofilizuj resztę oczyszczonego białka i przechowuj w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.

6. Charakterystyka białek aECM za pomocą elektroforezy SDS-PAGE

1. Przygotuj 12% żel SDS-PAGE (jeśli masa cząsteczkowa jest duża, użyj 8% żeli SDS-PAGE dla lepszej separacji). Dodać 2x bufor ładujący SDS do każdej próbki, podgrzewać próbki przez 10 minut w temperaturze 100 °C i badać próbki w żelu przez 1 godzinę przy napięciu 100 V lub do momentu, gdy drabinka białkowa odpowiadająca masie cząsteczkowej białka aECM osiągnie środek żelu.
2. Pobierz żel z zestawu SDS-PAGE i dodaj barwnik Coomassie Brilliant Blue (Tabela 2) z objętością, aby zanurzyć żel na 1 godzinę na szalce Petriego. Płucz żel w roztworze odbarwiającym (Tabela 2) przez 5 minut na bujaku. Zmień roztwór odbarwiający i kontynuuj odbarwianie żelu z kołysaniem, aż tło żelu stanie się czyste. Pasma białkowe powinny być wyraźnie widoczne.
3. Porównaj położenie białka docelowego z drabinką białkową, aby określić masę cząsteczkową białka docelowego.
4. Aby dodatkowo potwierdzić obecność białka docelowego, wykonaj western blotting, jak w kroku 7.

7. Charakterystyka białek aECM za pomocą Western Blotting

1. Próbki należy umieścić w 12% żelu SDS-PAGE, jak w rozdziale 6, bez barwienia.
2. Przytnij membranę nitrocelulozową do rozmiaru nieco większego niż żel SDS-PAGE. Wytnij 4 kawałki bibuły filtracyjnej do tego samego rozmiaru.
3. Zwilż jeden kawałek bibuły filtracyjnej buforem Western Transfer Buffer (20% v/v metanolu, 25 mM Tris, 190 mM glicyny, pH 8,3), umieść żel SDS-PAGE na bibule filtracyjnej, a następnie kolejny kawałek bibuły filtracyjnej, następnie membranę nitrocelulozową i ostatnie dwa pozostałe kawałki bibuły filtracyjnej. Upewnij się, że cała konfiguracja jest zanurzona w wystarczającym zachodnim buforze transferowym.
   UWAGA: Żel i membrana nie powinny się stykać w tym momencie, ponieważ białka mogą związać się z błoną w kontakcie.
4. Przenieś białka na membranę nitrocelulozową, umieszczając dwie bibuły filtracyjne w zachodniej półsuchej jednostce transferowej, a następnie membranę nitrocelulozową i ostrożnie umieść żel SDS-PAGE wewnątrz i na membranie, na koniec umieść dwie ostatnie mokre bibuły filtracyjne na żelu SDS-PAGE. Uruchom zachodni transfer na 45 mA, 30 min. Dodaj bufor, jeśli napięcie jest wyższe niż 30 V.
   UWAGA: Najlepiej umieścić żel SDS-PAGE na membranie za jednym razem i unikać niepotrzebnego przesuwania żelu po membranie, ponieważ białka mogą związać się z membraną w kontakcie.
5. Pobrać i zablokować membranę nitrocelulozową roztworem blokującym (5% beztłuszczowe mleko o PBS pH 7,4, przefiltrowane bibułą filtracyjną) na 2 godziny w temperaturze pokojowej. Usunąć bufor blokujący i dodać PBS do płukania.
   UWAGA: Zmień rękawice na nowe, aby uniknąć zanieczyszczenia błony niepożądanymi białkami.
6. Inkubować pierwszorzędowe przeciwciało anty-He z rozcieńczeniem w PBS w stosunku 1:1,000 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z kołysaniem. Przygotować mieszaninę w objętości, która mogłaby zanurzyć całą membranę, na przykład w stosunku rozcieńczenia 1:1000, dodać 1 μl przeciwciała (stężenie podstawowe: 1 mg/ml) do 999 μl PBS na 1 ml mieszaniny całkowitej.
7. Przepłukać membranę 5 ml PBST (PBS z 0,1% Tween20).
8. Inkubować z drugorzędowym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową (HRP) z rozcieńczeniem w PBS w stosunku 1:5 000 w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę z kołysaniem. Przygotować mieszaninę w objętości, która mogłaby zanurzyć całą membranę, na przykład w stosunku rozcieńczenia 1:5 000, dodać 1 μl przeciwciała (stężenie podstawowe: 1 mg/ml) do 4,999 μl PBS na 5 ml całkowitej mieszaniny.
9. Umyć membranę 5 ml PBST i powtórzyć dwukrotnie.
10. Nałóż substrat chemiluminescencyjny na membranę z objętością pokrywającą membranę i inkubuj, postępując zgodnie z instrukcjami dla użytego substratu.
    UWAGA: Czułość substratu na wykrywanie białek może się różnić, zalecamy substrat o maksymalnej czułości dla bardzo niskich sygnałów w przypadku, gdy wzrost stężenia przeciwciał nie zwiększa sygnałów.
11. Uchwyć sygnały chemiluminescencyjne za pomocą imagera opartego na kamerze CCD. Dostosuj stosunek rozcieńczenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, jeśli sygnały są słabe i nieswoiste. Inkubować dłużej w roztworze blokującym, jeśli sygnał tła jest wysoki.

Wyniki

Przy projektowaniu białek fuzyjnych zawierających powtórzenia podobne do elastyny, ważne jest utrzymanie ogólnej zawartości elastyny, wystarczająco dużej frakcji białka fuzyjnego¹⁸. Ma to na celu zapewnienie, że konstrukt białka fuzyjnego zachowa swoje właściwości podobne do elastyny, w celu wykorzystania ITC do oczyszczania. Projekt i sekwencje białek aECM opisane w tej sekcji zostały specjalnie zaczerpnięte z pracy Tjina i wsp. ^{Rozdział 14}. W tej pracy trzy białka aECM zostały z ...

Dyskusja

Inżynieria białek rekombinowanych to wszechstronna technika tworzenia nowych materiałów białkowych przy użyciu podejścia oddolnego. Materiały na bazie białek mogą być zaprojektowane tak, aby miały wiele funkcji, dostosowanych do danego zastosowania. Ze względu na rosnący postęp w technologiach klonowania i ekspresji białek, tworzenie różnorodnych sztucznych białek w powtarzalny i skalowalny sposób stało się stosunkowo proste (i opłacalne). Domena podobna do elastyny została włączona do wielu sztucznych białek, aby służyć...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wektory ekspresyjne pET22b (+)	Novagen	69744	T7 z opornością na ampicylinę
BL21(DE3)pLysS	Invitrogen	C6060-03	dodatkowe antybiotyki - chloramfenikol
Izopropylo-beta-D-tiogalaktozyd (IPTG)	Gold Biotechnology	I2481C	1 M roztwór podstawowy z autoklawowaną wodą, świeży przed indukcją.
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106	do izolacji plazmidu
Ligaza T4	New England Biolabs	M0202S
Ampicylina	Affymetrix	11259
Chloramfenikol	Affymetrix	23660
Zymoclean™ żelowy zestaw do odzyskiwania DNA	Zymo Research	D4001
XL10-złoty szczep	Agilent Technologies	200315