Artykuł metodologiczny

Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych

13.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52854

⸱

11 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, San Diego State University, 2Computational Science Research Center, San Diego State University, 3Bioinformatics and Medical Informatics Research Center, San Diego State University, 4Department of Mathematics and Statistics, San Diego State University, 5Department of Computer Science, San Diego State University, 6Mathematics and Computer Science Division, Argonne National Laboratory, 7SPARC Committee, Broad Institute

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy fenomiczne podejścia do funkcjonalnej charakterystyki domniemanych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny.

Streszczenie

Obecne badania interakcji między fagami a gospodarzami są zależne od ekstrapolacji wiedzy z (meta)genomów. Co ciekawe, 60 - 95% wszystkich sekwencji fagowych nie ma homologii do obecnych białek opisanych. W rezultacie, duża część genów fagowych jest opisana jako hipotetyczne. Ta rzeczywistość ma duży wpływ na adnotację zarówno strukturalnych, jak i pomocniczych genów metabolicznych. W tym miejscu przedstawiamy metody fenomiczne mające na celu uchwycenie reakcji fizjologicznej wybranego gospodarza podczas ekspresji jednego z tych nieznanych genów fagowych. Płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP) służą do monitorowania różnorodności wykorzystania substratu gospodarza i późniejszego tworzenia biomasy, podczas gdy metabolomika zapewnia analizę produktów ubocznych poprzez monitorowanie obfitości i różnorodności metabolitów. Oba narzędzia są używane jednocześnie w celu zapewnienia profilu fenotypowego związanego z ekspresją pojedynczej przypuszczalnej ramki odczytu otwartego faga (ORF). Porównano reprezentatywne wyniki dla obu metod, podkreślając różnice w profilu fenotypowym gospodarza posiadającego przypuszczalne geny strukturalne lub metaboliczne fagów. Ponadto przedstawiono techniki wizualizacji i wysokowydajne potoki obliczeniowe, które ułatwiły analizę eksperymentalną.

Wprowadzenie

Wirusy, które infekują bakterie (a.k.a. bakteriofagi lub fagi) mają na celu więcej niż 1031 cząsteczek wirusopodobnych (VLP) na całym świecie i przewyższają liczebnie wszystkie inne organizmy w środowisku1,2. Pierwsze badanie metagenomiczne badające społeczności wirusów związane ze środowiskiem morskim koncentrowało się na ilościowym określeniu różnorodności obserwowanej we frakcjiwirusa 3. Ponadto Breitbart i współpracownicy odkryli, że ponad 65% sekwencji społeczności wirusów nie miało homologii z żadnymi sekwencjami dostępnymi w publicznych bazach danych. Późniejsze badania metagenomiczne wykazały podobne dowody: metagenomy z osadów morskich w San Diego w Kalifornii zawierają 75% nieznanych sekwencji wirusowych4; metagenomy z hipersolankowych jezior Morza Salton zawierają 98% nieznanych sekwencji wirusowych5; a metagenomy związane z koralowcami zawierają 95 - 98% nieznanych sekwencji wirusowych6. To nagromadzenie nieopatrzonych adnotacjami informacji spowodowało, że materiał genetyczny fagów jest "ciemną materią biologicznego wszechświata"7.

Charakterystyka genomiczna faga polega na identyfikacji podobieństwa sekwencji poprzez porównanie z istniejącymi bazami danych kwasów nukleinowych i białek. Ponieważ informacja genetyczna kodowana przez fagi jest w przeważającej mierze nieznana, metody oparte na homologii są nieskuteczne. W swoim genomie fagi zazwyczaj kodują trzy główne typy genów: geny transkrypcji i replikacji, geny metaboliczne i geny strukturalne. Geny transkrypcji i replikacji (geny klasyI/II 8) obejmują polimerazy, prymazy, endo/egzonukleazy i kinazy. Geny te są wysoce konserwatywne ze względu na ich znaczenie w zakażeniu fagami, transkrypcji i replikacji materiału genetycznego fagów. Polimerazy fagowe są łatwo identyfikowane przy użyciu tradycyjnych metod homologii sekwencji ze względu na ich globalną ochronę9 i wykazano, że służą jako skuteczne markery filogenetyczne10. Natomiast geny metaboliczne i strukturalne fagów (geny klasyII/III 8) są coraz bardziej rozbieżne i często opisywane jako geny hipotetyczne.

Geny metaboliczne fagów wpływają na zdolność metaboliczną gospodarza i niekoniecznie są niezbędne do replikacji wirusa. Geny te, często określane jako pomocnicze geny metaboliczne11 (AMG), wydają się modulować metabolizm gospodarza i umożliwiają optymalny postęp infekcji i powodzenie dojrzewania wirionu. AMG są związane z wykorzystaniem i pobieraniem ograniczających składników odżywczych lub ze szlakami produkcji energii. Niektóre przykłady obejmują geny fotosystemów znajdujące się w genomach różnych cyjanofagów12-16, geny połączone i regulowane przez metabolizm fosforanów17,18 oraz wykorzystanie szlaku pentozofosforanowego do biosyntezy fagów dNTP18,19. Dla porównania, geny strukturalne należą do średnich i późnych genów wytwarzanych podczas infekcji i różnią się w różnych systemach-gospodarz. Produkcja białek strukturalnych zależy od dostępności wirusowego dNTP i pul energii do ich transkrypcji, translacji i składania8. Białka strukturalne kapsydu i włókien ogonowych są uważane za najbardziej rozbieżne ze wszystkich genów kodujących białka wirusa i są niezbędne do pomyślnej produkcji wirionu. Ich rozbieżność jest zwykle przypisywana aktywnej roli, jaką odgrywają w kształtowaniu koewolucji wirus-gospodarz20. Rozbieżne białka, niezależnie od klasy genów, są łatwo pomijane przy użyciu tradycyjnych technik homologii i dopasowania sekwencji. Wysiłki mające na celu skorygowanie ograniczeń obserwowanych przy ścisłych porównaniach sekwencji zaowocowały narzędziami bioinformatycznymi zdolnymi do wykorzystania cech sekwencji do określenia asocjacji, takimi jak sztuczne sieci neuronowe21. Sztuczne sieci neuronowe (ANN) pozwalają na przewidywanie genów strukturalnych i metabolicznych, jednak wymagają dalszej walidacji eksperymentalnej w celu bezpośredniego scharakteryzowania funkcji genów.

Celem tego manuskryptu jest dostarczenie protokołów fenomicznych zdolnych do monitorowania zarówno katabolicznego, jak i anabolicznego metabolizmu bakterii gospodarza podczas ekspresji nowego genu fagowego, funkcjonalnie przewidywanego przez ANNs. Dziedzina fenomiki, biologia związana z fenotypami komórkowymi, jest dobrze ugruntowana w biologii systemowej, aby pomóc w badaniu białek o nieznanej lub plejotropowej funkcji. Narzędzia fenomiczne służą do łączenia informacji fenotypowych z informacjami genotypowymi. Stawiamy hipotezę dla przypuszczalnych genów fagowych, że ich funkcję (funkcje) można określić poprzez obserwację fizjologicznych skutków gospodarza podczas ekspresji genów fagowych. Aby zbadać tę hipotezę, wybrano dwie metody ilościowe. Płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP) wykorzystano do monitorowania wykorzystania substratu gospodarza i późniejszego tworzenia biomasy, podczas gdy metabolomika mierzyła różnorodność metabolitów gospodarza i względną obfitość podczas wzrostu w określonych warunkach środowiskowych. Przypuszczalne białka strukturalne i metaboliczne uległy nadekspresji w Escherichia coli i porównano reprezentatywne wyniki obu eksperymentów. Zaprezentowano liczne techniki wizualne i potoki przetwarzania o wysokiej przepustowości w celu ułatwienia replikacji eksperymentalnej. Na koniec omówiono odtwarzalność i dokładność przedstawionych metod w kontekście oczekiwanych skutków fizjologicznych dla opatrzonego adnotacją białka kapsydu i białka metabolicznego faga, tioredoksyny, oraz dwóch przypuszczalnych AMG.

Protokół

1. Przygotowanie podłoży do wielofenotypowej płyty analitycznej (MAP), pożywki bazowej, pożywki do wstępnego wzrostu oraz buforu

  1. Przygotować 50 ml roztworów zapasowych substratu o stężeniu 1,0 - 1,25%.
    1. Rozpuścić 1,0 - 1,25% (w/v) stałego substratu w sterylnej wodzie (podgrzać w razie potrzeby). Roztwory wysterylizować za pomocą jednostki filtrującej 0,22 µm i przechowywać roztwory zapasowe w temperaturze pokojowej (RT). Przykłady substratów użytych w tych eksperymentach podano w Tabeli 2.
  2. Przygotować 250 ml 3-krotnego (3x) pożywki bazowej dla wszystkich klas substratów (węgla, azotu, siarki i fosforu). Pożywka bazowa oparta na MOPS (3-morfolinopropano-1-sulfonianie)22 zawiera następujące składniki: 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricine), 0,4% glicerolu*, 9,5 mM NH4Cl*, 0,25 mM NaSO4*, 1,0 mM MgSO4*, 1,32 mM K2HPO4*, 10 mM KCl, 0,5 µM CaCl2, 5 mM NaCl, 6 µM FeCl3 oraz 0,1% (w/v) L-arabinozy** (Tabela 1 i 2).
    Uwaga: *Zależnie od rodzaju pożywki bazowej, niektóre z tych związków nie są dodawane. Na przykład 0,4% glicerolu nie stosuje się w pożywce bazowej z węglem, a w pożywce bazowej z siarką 1,0 mM MgSO4 zastępuje się 1,0 mM MgCl2. **L-arabinoza służy specyficznie do indukcji wektora promotora pBAD, pEMB11, który został wprowadzony do szczepu ara-E. coli K-12 (BW 27784)23.
    1. Dodać każdy składnik pożywki bazowej do sterylnej kolby i dopełnić objętości roztworu. Dobrze wymieszać. Każdą pożywkę bazową wysterylizować za pomocą jednostki filtrującej 0,22 µm, przelewając ją do sterylnej butelki.
  3. Przygotować 500 ml pożywki do wstępnego wzrostu MOPS. Pożywka do wstępnego wzrostu oparta na MOPS22 zawiera następujące składniki: 1x MOPS (40 mM MOPS + 10 mM Tricine), 0,4% glicerolu, 9,5 mM NH4Cl, 0,25 mM NaSO4, 1,0 mM MgSO4, 1,32 mM K2HPO4, 10 mM KCl, 0,5 µM CaCl2, 5 mM NaCl oraz 6 µM FeCl3.
    1. Dodać każdy składnik pożywki do wstępnego wzrostu do sterylnej kolby i dopełnić objętości. Wysterylizować za pomocą jednostki filtrującej 0,22 µm, a następnie dodać ampicylinę do końcowego stężenia 100 µg/ml. Roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Przygotować szalki z agarem Luria-Bertani (LB) o stężeniu 0,5x (objętość 500 ml). Do sterylnej kolby dodać składniki LB w ilościach odpowiadających stężeniu 0,5x (1,25 g ekstraktu drożdżowego, 2,5 g NaCl, 2,5 g tryptonu, 7,5 g agaru). Dobrze wymieszać i wysterylizować w autoklawie.
    1. Ostudzić agar, a następnie wymieszawszy, dodać antybiotyk ampicylinę w stężeniu 100 µg/ml. Wylać ok. 25 ml agaru do szalek Petriego, pozostawić do zastygnięcia i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
  5. Przygotować 250 ml roztworu buforowego 10 mM Tris (pH 7,4) oraz 10 mM MgSO4. Wysterylizować za pomocą jednostki filtrującej 0,22 µm i przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej (RT).

2. Przygotowanie zawiesiny komórek bakteryjnych

  1. Przygotuj świeże kolonie. Z mrożonego banku w 12,5% glicerolu wysej świeże klony E. coli na agar 0,5x LB zawierający 100 µg/ml ampicyliny. Inkubuj w 37 °C przez 24 hr.
  2. Przygotuj kultury w cieczy:
    1. Do probówek z kulturą pipetuj 3 ml pożywki do wstępnego wzrostu zawierającej 100 µg/ml ampicyliny. Dla każdego klonu zastosuj powtórzenia biologiczne w trzech kopiach.
    2. Zaszczep poszczególne kolonie z sekcji 2.1 do przygotowanych probówek z kulturą. Inkubuj w 37 °C z wytrząsaniem przez 22 hr.
  3. Zestrygułuj i wypłucz komórki bakteryjne:
    1. Przenieś kultury inkubowane przez noc (O/N) do probótek do mikrowirówki o pojemności 1,7 ml. Zestrygułuj komórki poprzez wirowanie z maksymalną prędkością (16 900 x g) przez 2 min w mikrowirówce. Odlej nadsącz i wypłucz komórki, resuspendując je w 500 µl buforu 10 mM Tris/10 mM MgSO4. Powtórz czynność.
    2. Ponownie zestrygułuj komórki, odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 1 ml buforu 10 mM Tris/10 mM MgSO4.
  4. Zmierz gęstość komórek i skoncentruj je (jeśli jest to konieczne):
    1. Komórki z sekcji 2.3.3 rozcieńcz 10-krotnie w buforze 10 mM Tris/10 mM MgSO4 i przenieś to rozcieńczenie do kuwety. Zmierz gęstość optyczną (OD600 nm) tego rozcieńczenia i zapisz wynik.
    2. Skoncentruj komórki, aby uzyskać końcowe stężenie 0,07 (OD600 nm) w MAPs (komórki zostaną rozcieńczone 15-krotnie po dodaniu do MAPs, zatem ich stężenie początkowe musi wynosić OD600 nm = 1,05). Przenieś skoncentrowaną zawiesinę komórek do rezerwuaru i przechowuj (w temperaturze pokojowej RT) do kroku 3.5 przygotowania MAPs.

3. Przygotowanie wielofenotypowych płytek analitycznych (MAPs)

  1. Oznakowanie płytek MAP. Należy oznakować sterylne 96-dołkowe płytki mikrotitracyjne numerem identyfikacyjnym klonu E. coli oraz typem schematu MAP.
  2. Nalewanie sterylnej wody do płytek MAP. Sterylną wodę należy aseptycznie przenieść do zbiornika z cieczą. Za pomocą pipety wielokanałowej należy nanieść 60 µl do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej.
  3. Nalewanie pożywek podstawowych do płytek MAP. 3x pożywkę podstawową należy aseptycznie przenieść do zbiornika z cieczą. Za pomocą pipety wielokanałowej należy nanieść 50 µl do każdego dołka płytki mikrotitracyjnej. Kroki 3.2 i 3.3 należy powtórzyć dla każdej pożywki podstawowej użytej w schemacie MAP.
  4. Nalewanie substratów do płytek MAP. Należy przenieść 30 µl każdego substratu do odpowiedniego dołka płytek MAP.
  5. Dodawanie zawiesiny bakteryjnej do płytek MAP. Za pomocą pipety wielokanałowej należy przenieść 10 µl komórek bakteryjnych z sekcji 2.4.2 do każdego dołka płytki MAP. Przed ponownym wprowadzeniem pipety do zapasu kultury należy zmienić końcówki.
  6. Zabezpieczenie płytek MAP folią przylepną. Każdą płytkę należy przykryć pojedynczą przylepną folią do płytek. Folię należy mocno docisnąć do dołków płytki oraz wzdłuż krawędzi, aby stworzyć równą i szczelną uszczelkę. Nadmiar folii z krawędzi płytki mikrotitracyjnej należy usunąć sterylnym ostrzem do golenia.
  7. Pomiar gęstości optycznej płytek MAP:
    1. Przygotowane płytki MAP należy umieścić w zasuwnicy „Input” wielopłytkowego spektrofotometru (czytnika płytek). Należy uruchomić oprogramowanie czytnika i utworzyć protokół pomiaru absorbancji (OD600 nm) co 30 min przez łącznie 32 hr, z 60 s wstrząsania pomiędzy odczytami.
    2. W urządzeniu należy ustawić temperaturę 37 °C. Protokół należy uruchomić po wyrównaniu temperatury w płytkach MAP do wartości zadanej.
    3. Po 32 hr należy wyjąć płytki MAP z zasuwnicy „Output” czytnika. Każdy plik tekstowy z danymi należy oznakować, podając: numer identyfikacyjny klonu E. coli, datę przeprowadzenia badania MAP oraz typ schematu MAP.

4. Przetwarzanie i parametryzacja wielofenotypowych płytek testowych (MAPs)

  1. Oceń krzywe wzrostu za pomocą zautomatyzowanego procesu kontroli jakości (QA), np. PMAnalyzer24.
    1. Zweryfikuj, czy krzywe wzrostu mają OD600 nm < 0.20 w ciągu pierwszych 2 hr. Nie używaj absorbancji w początkowym punkcie czasowym (t0) w filtrze ze względu na artefakty kondensacji, które zazwyczaj znikają w t1 (30 min).
    2. Usuń krzywe wzrostu, które nie spełniają kryteriów filtra QA. Zapisz informacje o krzywej (nazwę próbki, numer studzienki i wartości OD600 nm) w osobnym pliku wyjściowym do późniejszego wykorzystania. Kontynuuj analizę, jeśli krzywa wzrostu przejdzie przez filtr QA.
  2. Oblicz medianowe krzywe wzrostu. Wykorzystując dane z powtórzeń dla każdej studzienki, oblicz medianową krzywą wzrostu, przyjmując medianę gęstości optycznej (OD600 nm) w każdym punkcie czasowym. Zapisz wynikowe medianowe krzywe wzrostu w osobnym pliku wyjściowym do późniejszego wykorzystania.
  3. Oblicz najlepiej dopasowany model logistyczny dla każdej krzywej wzrostu, korzystając z adaptacji równania zaproponowanego przez Zwieteringa25. Równanie logistyczne obejmuje trzy parametry opisujące wzrost bakterii: czas lag, λ (hr), maksymalną szybkość wzrostu, µmax (OD600 nm 100 -1), oraz końcową wydajność biomasy, α (OD600 nm). Ze względu na artefakty kondensacji, jako wartość początkową przyjmij dane dla czasu = 30 min (y1).
    Schemat równania modelu wzrostu logistycznego; formuła matematyczna do analizy dynamiki populacji. [1]
    1. Oblicz maksymalną szybkość wzrostu za pomocą bezpośredniego przeszukiwania. Odnotuj największą szybkość zmian w odstępie 90 min w obrębie danych.
      ​Formuła logarytmicznej szybkości wzrostu, obliczanie μmax, równanie matematyczne do analizy danych. [2]
    2. Oszacuj końcową wydajność biomasy, szukając górnej wartości asymptotycznej dla największej średniej kroczącej w oknie 90 min. Dokładniej, zdefiniuj ją jako asymptotę krzywej wzrostu.
      Formuła matematyczna: A = max(sum yj/3), przedstawiająca obliczanie średnich w zbiorze danych. [3]
    3. Wykorzystując wartości µmax i A z punktów 4.3.1 i 4.3.2, wyznacz wartość λ, testując wszystkie wartości λ:
      Równania równowagi statycznej, λ=0.25K, K=1,2,...2n, formuła, koncepcja matematyczna, analiza. [4]
      1. Dla każdej wartości λ oblicz sumę kwadratów błędów (SSE). Jako SSE (λS) przyjmij najniższą wartość SSE:
        Równanie równowagi statycznej Σ dla SSE; formuła, metoda badawcza, analiza dopasowania danych. [5]

5. Analiza fenotypowa MAP

  1. Oblicz poziom wzrostu (GL) dla każdej krzywej wzrostu, aby ocenić ogólny wzrost na klon na podłoże. Zdefiniuj GL jako średnią harmoniczną przesuniętych wartości dopasowanych logistycznie:
    Wzór matematyczny, równanie GL, sumowanie, ułamek, schemat obliczeń statystycznych. [6]
  2. Przypisz fenotyp do każdej krzywej wzrostu na podstawie wartości GL. W tym przypadku zastosowano cztery fenotypy: wzrost oczekiwany, brak wzrostu, gain of function (przyrost funkcji) oraz loss of function (utrata funkcji).
    1. Określ fenotypy poprzez porównanie wzrostu wszystkich klonów na konkretnym podłożu pod kątem odchyleń standardowych od średniej. Użyj tej statystyki oraz minimalnego progu wzrostu, aby oznaczyć fenotyp reprezentowany przez krzywą wzrostu (Rycina 1A,B). Rycina 1C przedstawia przykłady przypisywania fenotypów.
    2. Zdefiniuj wzrost jako GL ≥ 0.4 (Rycina 1A,B). Zdefiniuj Gain of Function (Rycina 1C, kolor zielony) jako posiadanie GL > dwa odchylenia standardowe powyżej średniej oraz średnią > próg wzrostu. Loss of Function (Rycina 1C, kolor czerwony) definiuje się jako posiadanie GL < dwa odchylenia standardowe poniżej średniej oraz średnią > próg wzrostu.
  3. Utwórz wizualizacje zestawu danych na podstawie fenotypów i krzywych wzrostu.
    1. Przeanalizuj dynamikę wzrostu, przedstawiając wartości OD600 nm za pomocą kolorów, aby szybko porównać krzywe wzrostu wielu klonów (Rycina 2).
    2. Przeanalizuj rozkłady fenotypowe wszystkich klonów w zależności od warunków wzrostu (Rycina 3).

6. Budowa aparatu do hodowli ciągłej

  1. Konstrukcja portów reaktora (Rycina 4A,B). Wywierć trzy otwory o średnicy 1/4 in., w odstępach 3/4 in., w nakrętce reaktora do hodowli ciągłej.
    1. Dla portu α: od dołu nakrętki wkręć panelowy złącz koniec z gwintem Luer (żeński) z kolbą 1/16 in., tak aby kolba była skierowana w górę, na zewnątrz nakrętki. Zabezpiecz kolbę nakrętką blokującą panelową 1/4 in.
    2. Dla portu β: wkręć panelowy złącz koniec z gwintem Luer (żeński) z kolbą 1/16 in., tak aby kolba była skierowana w górę, na zewnątrz nakrętki. Zabezpiecz kolbę nakrętką blokującą panelową 1/4 in.
    3. Dla portu γ: od dołu nakrętki wkręć panelowy złącz koniec z gwintem Luer (żeński) z kolbą 1/16 in., tak aby kolba była skierowana w górę, na zewnątrz nakrętki. Zabezpiecz kolbę nakrętką blokującą panelową 1/4 in. Do złączki kolbowej od wewnątrz nakrętki wkręć złącz koniec Luer (męski) z zintegrowanym pierścieniem blokującym do węża o szerokim prześwicie 1/8 in.
    4. Dla portu odpływowego: wywierć otwór o średnicy 5/16 in. na poziomie oznaczenia 75 ml reaktora do hodowli ciągłej. Odetnij 3/4 in. od końca z nakrętką przelotowej złączki kolbowej 1/4 in. Wkręć przelotową złączkę kolbową 1/4 in. (uszczelka znajduje się na zewnątrz butelki, a nakrętka wewnątrz, Rycina 4B).
  2. Konstrukcja portów butelki z pożywką (Rycina 4C). Wywierć dwa otwory o średnicy 1/4 in. w odstępach 1 in. w nakrętce butelki z pożywką.
    1. Dla portu δ: wkręć panelowy złącz koniec z gwintem Luer (żeński) z kolbą 1/8 in., tak aby kolba była skierowana w górę, na zewnątrz nakrętki. Zabezpiecz kolbę nakrętką blokującą panelową 1/4 in.
    2. Dla portu ε: wkręć panelowy złącz koniec z gwintem Luer (żeński) z kolbą 1/16 in., tak aby kolba była skierowana w górę, na zewnątrz nakrętki. Zabezpiecz kolbę nakrętką blokującą panelową 1/4 in.
      1. Do złączki kolbowej, od wewnątrz nakrętki, wkręć złącz koniec Luer (męski) z zintegrowanym pierścieniem blokującym do węża o szerokim prześwicie 1/8 in.
  3. Przewody zasilające i przedłużki przewodów:
    1. Odetnij dwa odcinki przewodu o długości 1 in. (średnica zewnętrzna (OD) 1/8 in. x średnica wewnętrzna (ID) 1/16 in.). Nałóż odcinki na porty α i γ reaktora do hodowli ciągłej wykonanego w sekcji 5.2.
    2. Odetnij jeden odcinek przewodu o długości 1 in. (1/4 in. OD x 1/8 in. ID). Nałóż odcinek na port Β reaktora do hodowli ciągłej.
    3. Odetnij jeden odcinek przewodu o długości 3,5 in. (1/8 in. OD x 1/16 in. ID). Nałóż ten odcinek do wnętrza portu γ, na złącz koniec Luer (męski) z zintegrowanym pierścieniem blokującym do węża o szerokim prześwicie 1/8 in. Port γ jest portem pobierania próbek reaktora do hodowli ciągłej.
    4. Odetnij jeden odcinek przewodu o długości 1 in. (1/4 in. OD x 1/8 in. ID). Nałóż ten odcinek na port δ butelki z pożywką.
    5. Odetnij jeden odcinek przewodu o długości 11 in. (1/16 in. OD x 1/8 in. ID). Nałóż ten odcinek do wnętrza portu ε butelki z pożywką, na złącz koniec Luer (męski) z zintegrowanym pierścieniem blokującym do węża o szerokim prześwicie 1/8 in.
    6. Odetnij dwa odcinki przewodu o długości 18 in. (1/8 in. OD x 1/16 in. ID). Jeden odcinek nałóż na port ε butelki z pożywką. Drugi odcinek zachowaj do sekcji 7.

7. Prowadzenie hodowli ciągłych do analiz metabolomicznych

  1. Sterylizacja materiałów:
    1. Autoklawować materiały suche przez 30 min. Należy pamiętać o owinięciu zakrętki butelki zasilającej, wykonanej w sekcji 5, folią aluminiową. Dołączone rurki powinny pozostać wyprostowane.
      1. Owiniąć zakrętkę reaktora do hodowli ciągłej, wykonaną w sekcji 5, folią aluminiową. Dołączone rurki powinny pozostać wyprostowane. Owiniąć folią aluminiową 18-calową rurkę odciętą w sekcji 6.3.5 oraz najmniejszy adapter rurki pompy perystaltycznej. Rurki powinny pozostać wyprostowane. Autoklawować przez 30 min.
    2. Przygotować 2 L pożywki 0.5x LB. W butelce zasilającej przygotować pożywkę 0.5x LB. Przykryć butelkę zasilającą folią. Autoklawować przez 1 h.
    3. Przygotować 70 ml pożywki 0.5x LB. Wlać pożywkę do reaktora do hodowli ciągłej. Umieścić mieszadło magnetyczne w reaktorze do hodowli ciągłej. Przykryć reaktor folią i autoklawować przez 30 min.
  2. Konfiguracja hodowli ciągłej:
    1. Zawiesina komórek bakteryjnych.
      1. Z mrożonego banku w 12,5% glicerolu wysiać świeże klony E. coli na agar 0.5x LB zawierający 100 µg/ml ampicyliny. Inkubować w 37 °C przez 24 h.
      2. Zaszczepić pojedynczą kolonię do 3 ml pożywki 0.5x LB zawierającej 100 µg/ml ampicyliny. Dla każdego klonu zastosować powtórzenia biologiczne w triplikatach. Inkubować w 37 °C z wytrząsaniem przez 22 h.
    2. Połączyć poszczególne elementy.
      1. Umieścić wszystkie autoklawowane materiały w komorze z laminarnym przepływem powietrza i włączyć światło ultrafioletowe podczas chłodzenia mediów. Po ostygnięciu mediów dodać 0,1% L-arabinozy i 100 µg/ml ampicyliny do całej pożywki 0.5x LB.
      2. Rozwinąć zakrętkę reaktora do hodowli ciągłej i przykręcić do reaktora. Unikać dotykania rurki do pobierania próbek. Rozwinąć zakrętkę butelki zasilającej i przykręcić do butelki zasilającej. Unikać dotykania rurki do pobierania próbek.
      3. Utrzymać sterylność 18-calowej rurki podłączonej do portu ε. Rozwinąć 18-calową rurkę oraz adapter rurki pompy perystaltycznej.
      4. Nasunąć wolny koniec 18-calowej rurki na jeden koniec adaptera rurki pompy perystaltycznej. Drugi koniec adaptera rurki pompy perystaltycznej podłączyć do 18-calowej rurki przymocowanej do portu ε zakrętki butelki zasilającej.
      5. Przykręcić jednostki filtrujące 0,22 µm do portów β i δ reaktora do hodowli ciągłej. Przykręcić jednostkę filtrującą 0,22 µm do adaptera portu α. Do jednostki filtrującej 0,22 µm podłączyć wolny koniec 18-calowej rurki.
    3. Rozpoczęcie hodowli ciągłej.
      1. W komorze z laminarnym przepływem powietrza zaszczepić reaktor do hodowli ciągłej 100 µl kultury nocnej przygotowanej w sekcji 7.2.1.1.
      2. Zamknąć układ przed przeniesieniem hodowli ciągłej do inkubatora w 37 °C. W inkubatorze należy przygotować mieszadło magnetyczne i mini pompę perystaltyczną.
      3. Włożyć adapter rurki pompy perystaltycznej do pompy perystaltycznej. Rurka z butelki zasilającej zaczyna się od strony „In”, a rurka prowadząca do reaktora od strony „Out”.
      4. Ustawić pompę perystaltyczną na: „FAST”. Uruchomić pompę perystaltyczną, przełączając na „FORWARD”. Sprawdzić, czy pożywka zaczęła przepływać przez rurki.
      5. Umieścić reaktor na mieszadle magnetycznym i rozpocząć mieszanie. Reaktor do hodowli ciągłej musi się ustabilizować przez 24 h przed pobraniem próbek.
    4. Pobieranie próbek z hodowli ciągłej. Przykręcić strzykawkę Luer-Lok 5 ml do portu γ i pobrać 4,5 ml kultury.
      1. Wykorzystać 500 µl kultury do pomiaru gęstości (OD600 nm). Rozcieńczyć komórki, aby przygotować 4 x 1 ml kultury o OD600 nm = 0,35.
      2. Rozdzielić rozcieńczone kultury do probówek do wirowania 1,7 ml. Powtarzać pobieranie próbek co 12 h przez 4 dni.
    5. Przygotowanie próbek do GC-TOFMS:
      1. Osadzić komórki poprzez wirowanie z maksymalną prędkością (16 900 x g) przez 2 min. Odlać nadsącz. Przemyć komórki 500 µl soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Powtórzyć ten krok.
      2. Odlać nadsącz po raz ostatni, a następnie zanurzyć probówki z osadem komórkowym w ciekłym azocie, aż do ustania bąbelkowania. Przechowywać próbki w zamrażarce -80 °C.

8. Prowadzenie seryjnych pasażowań kultur w systemie wsadowym do analiz metabolomicznych

  1. Przygotowanie zawiesiny komórek bakteryjnych. Z zamrożonego banku w 12,5% glicerolu wysejać świeże E. coli klony na agar LB 0,5x zawierający 100 µg/ml ampicylina. Inkubować w 37 °C przez 24 h.
    1. Zaszczep pojedyncze kolonie do 3 ml pożywki LB 0,5x zawierającej 100 µg/ml ampicylina. Dla każdego klonu należy zastosować trojaki powtórzenia biologiczne.
  2. Seryjne pasażowanie kultur okresowych.
    1. Przeszczepić kulturę z punktu 8.1.1 w przelocie nocnym poprzez rozcieńczenie 500-krotne w 3 ml bulionu LB zawierającego 50 µg/ml ampicylinę i 0,1% L-arabinozy. Subkultura powinna mieć wartość OD600 nm < 0.005. Inkubować w 37 °C z wytrząsaniem.
    2. Sprawdź gęstość optyczną (OD)600 nm) w 2. i 2,5 h. Hodować komórki do uzyskania OD600 nm = 0.35.
      1. Przeszczep poprzez 500-krotne rozcieńczenie w 3 ml bulionu LB zawierającego 50 µg/ml ampicylinę oraz 0,1% L-arabinozy. Subkultura powinna mieć gęstość optyczną (OD)600 nm < 0.005.
    3. Sprawdź gęstość optyczną (OD)600 nm) w 2. i 2,5 godzinie. Hodować komórki do uzyskania OD600 nm = 0.35.
  3. Pobieranie próbek z hodowli okresowych w pasażach seryjnych.
    1. Za pomocą sterylnej pęsety umieść 0.22 µm filtr membranowy na górze kolektora filtracyjnego. Nanieść 1 ml fosforanu buforu solnego (PBS) na papier filtracyjny, a następnie włączyć pompę próżniową.
    2. Powtórnie dodaj 1 ml PBS. Przenieś 1 ml subkultury z sekcji 8.2.3 na papier filtracyjny. Od tego momentu działaj szybko, aby niezwłocznie umieścić próbki w ciekłym azocie. Cały proces należy przeprowadzić w ciągu 1 min.
    3. Nanieś 1 ml PBS na papier filtrujący w celu przemycia próbki. Szybko przepłucz, uważając, aby próbka nie wyciekła poza krawędzie papieru filtrującego. Powtórz czynność.
    4. Za pomocą sterylnej pęsety umieścić filtr w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 ml, ostrożnie go składając. Zanurzyć probówkę w ciekłym azocie do momentu ustania pęcherzykowania. Przechowywać próbkę w temperaturze -80 °C zamrażarka

9. Analiza i przetwarzanie metabolitów

  1. Przesłać 3 próbki na klon w suchym lodzie do jednostki centralnej metabolomiki w celu przetworzenia próbek, analizy i normalizacji GC-TOFMS.
  2. Dla każdej próbki wyznaczyć średnią, medianę, odchylenie standardowe i współczynnik zmienności dla wszystkich metabolitów, wykorzystując dane z powtórzeń.
  3. Do analizy statystycznej ręcznie zaprogramować potok QA, wykorzystując instrukcje warunkowe i pętle26, aby usunąć metabolity, które nie spełniają określonych warunków.
    1. W przypadku Warunku 1 usunąć metabolity, dla których więcej niż 2 próbki wykazuje zerową obfitość. Usunąć standardy wewnętrzne z profili metabolomicznych.
    2. W przypadku Warunku 2 usunąć te metabolity, które nie występują w analizowanych komórkach. Tutaj usunąć następujące metabolity: indole 3 acetate, dihydroabietic acid, nonadecanoic acid, salicylic acid, salicylaldehyde, cholesterol, phenol, 1-monostearin, octadecanol, 1-monopalmitin, dodecane, dodecanol, 1-hexadecanol, 5-methoxytryptamine, benzoic acid, pentadecanoic acid, phosphoric acid, pelargonic acid, palmitic acid, capric acid, hydroxylamine, stearic acid, myristic acid, maleimide, levoglucosan oraz 4-hydroxybutyric acid.
    3. W przypadku Warunku 3 usunąć te metabolity, których współczynnik zmienności jest większy niż 1.
  4. Uchwycić globalne efekty metabolomiczne poprzez analizę względnych obfitości metabolitów.
    1. Stworzyć wizualną reprezentację mediany obfitości metabolitów na klon dla każdego metabolitu (Rysunek 6).
  5. Zidentyfikować wartości odstające poprzez obserwację częstotliwości par klon-metabolit.
    1. Obliczyć wynik Z dla każdej wartości mediany każdego metabolitu w klonie. Obliczyć wyniki Z, korzystając z następującego równania:
      Równanie wyniku Z, Zmx, schemat analizy danych statystycznych i obliczania odchylenia standardowego. [7]
      Uwaga: Termin XMC oznacza poziom obfitości konkretnego metabolitu dla konkretnego klonu. Termin µC oznacza średnią ze wszystkich klonów dla konkretnego metabolitu. Termin σC to powiązane odchylenie standardowe.
    2. Stworzyć wizualną reprezentację danych, w której wyróżnione są wartości odstające (dane nie zostały dostarczone).

Wyniki

Wszystkie próbki wykorzystane do wyznaczenia otwartych ramek odczytu (ORFs) wybranych w niniejszym badaniu zostały pobrane z wyspy Starbuck, stanowisko 7 (STAR7) oraz z atolu Caroline, stanowisko 9 (CAR9) w południowej części wysp Line. Szacunkowo 100 L wody morskiej z tych stanowisk pobrano poniżej warstwy przydennej koralowców za pomocą pomp zęzowych, zgodnie z wcześniejszym opisem5. Zawartość pomp poddano frakcjonowaniu za pomocą filtrów o dużych porach w celu usunięcia małych eukariontów, a następnie skonsolidowano przy użyciu filtrów przepływu stycznego 100 kDa, pozostawiając jedynie mikroby i cząstki przypominające wirusy (VLPs). Aby wyizolować VLPs, pozostałą wodę morską przepuszczono przez filtry 0,45 µm, otrzymując wirom. Do tej frakcji wirusowej dodano chloroform w celu zahamowania wzrostu wszelkich pozostałych komórek, a następnie przechowywano ją w temperaturze 4 °C.

VLPs oczyszczono metodą z użyciem chlorku cezu, w której gradienty gęstości rozdzielają się podczas wirowania, co umożliwia odzyskanie wirionów o gęstości od ~1,35 g/ml do 1,5 g/ml 3. DNA wirusowe wyekstrahowano przy użyciu protokołu CTAB/fenol:chloroform i namnożono metodą wielokrotnej amplifikacji wypierającej (MDA) z zastosowaniem odczynników Phi29. Sekwencjonowanie wiromu przeprowadzono z wykorzystaniem komercyjnie dostępnej technologii pirosekwencjonowania.

Bioinformatyka wykorzystana w przetwarzaniu i selekcji wirusowych ORF w niniejszym badaniu przebiegała w następujący sposób. W odniesieniu do wirusowych metagenomów CAR9 i STAR7 zastosowano trzy etapy wstępnego przetwarzania. Po pierwsze, użyto publicznego oprogramowania do usunięcia sekwencji adapterów, które powstały w wyniku amplifikacji wirusowego DNA przed sekwencjonowaniem27. Po drugie, za pomocą dodatkowego programu bioinformatycznego z zestawu danych odfiltrowano powszechne artefakty sekwencjonowania, takie jak duplikaty sekwencji oraz sekwencje o niskiej liczbie kopii28. Na koniec przeprowadzono usuwanie kontaminacji sekwencjami obcymi29 w przypadku tych sekwencji, które wykazywały ≥ 90% pokrycia i ≥ 94% identyczności z sekwencjami w następujących bazach danych: genomy wirusowe RefSeq; Human — Reference GRCh37; Human — Celera Genomics; Human — Craig Venter (HuRef); Human — Seong-Jin Kim (Korean); Human — Chromosome 7 version 2 (TCAG); oraz sekwencje referencyjne Human — James Watson, YanHuang (YH; Asian), Yoruba (NA18507; African)21. Po tych procesach liczba sekwencji z próbek CAR9 wyniosła 591 600, a sekwencji STAR7 wyniosła 939 311. Sekwencje te przesłano do MGRAST i zmontowano za pomocą oprogramowania do asemblacji z wykorzystaniem ustawień domyślnych. Kontigi przetłumaczono na 6 ramek odczytu, a domniemane otwarte ramki odczytu (pORF) zidentyfikowano za pomocą skryptów, zgodnie z wcześniejszym opisem21.

W celu zidentyfikowania nieznanych ORF przeprowadzono szereg wyszukiwań opartych na podobieństwie, aby wyeliminować ORF o znanej funkcji. W skrócie, wykonano następujące wyszukiwania zgodnie z odpowiadającymi im kryteriami wyszukiwania21:

  1. Istotne podobieństwo na poziomie ≥ 95% tożsamości na odcinku ≥ 40 par zasad (bp) za pomocą MGRAST BLAT w bazie danych M5NR.
  2. Istotne podobieństwo (e-value ≤ 0.001) za pomocą TBLASTN w odniesieniu do wszystkich publicznych metagenomów w zasobie My Metagenome Database Resource.
  3. Istotne podobieństwo (e-value ≤ 0.001) za pomocą BLASTP i TBLASTN w odniesieniu do bazy danych NR.
  4. Istotne podobieństwo (e-value ≤ 0.001) za pomocą RPS-BLAST w odniesieniu do Conserved Domain Database.
  5. Translacje białkowe z wybranej frakcji każdego zestawu danych porównane z rozwiązanymi strukturami białek w Protein Data Bank.
  6. Obliczanie częstości dinukleotydów przy użyciu pakietu Dinucleotide Signatures.

Wynikowe pORF zostały zaprojektowane do ekspresji w E. coli przy użyciu ogólnodostępnego oprogramowania do projektowania genów. W procesie odwrotnej translacji sekwencji aminokwasowych zastosowano Uniwersalną Tabelę Częstotliwości Kodonów, opracowaną w celu umożliwienia ekspresji w E. coli z minimalnym progiem wykorzystania wynoszącym 2%. Aby ułatwić klonowanie, z sekwencji wykluczono miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne BamHI i HindIII. Zewnętrzna firma zsyntetyzowała zaprojektowane sekwencje genów30, a następnie ORF sklonowano do wektora z promotorem pBAD o średniej liczbie kopii, pEMB11, za pomocą standardowego klonowania enzymami restrykcyjnymi. Wszystkie klony przetransformowano do szczepu BW 2778423 E. coli K-12.

Wielofenotypowe płytki analityczne (MAPs)

Do analizy MAP wykorzystano wysokoprzepustowy i odporny potok programistyczny PMAnalyzer24. Potok został opracowany w środowisku serwera Linux i wykonuje szereg etapów, w tym: parsowanie plików gęstości optycznej, formatowanie danych do postaci czytelnych plików tekstowych, wstępne przetwarzanie krzywych wzrostu w celu zapewnienia jakości (QA) oraz stosowanie technik modelowania matematycznego do analizy krzywych wzrostu. Główne skrypty modelujące zostały opracowane w języku Python w wersji 2.7.5 z wykorzystaniem modułu PyLab.

Powtarzalność MAPs została oceniona przy użyciu błędu standardowego (SE) dla danych powtórzonych (Rysunek 2A). Surowe krzywe wzrostu porównano z logistycznymi krzywymi wzrostu, aby ustalić, czy program PMAnalyzer prawidłowo sparametryzował i zamodelował wzrost klonów podczas eksperymentu (dane nie zostały przedstawione). Dalsze informacje na temat dokładności i poprawności MAPs oraz PMAnalyzer znajdują się w publikacji Cuevas et al.24

Po walidacji metody dane MAPs zostały przeanalizowane przy użyciu wielu parametrów, takich jak maksymalna szybkość wzrostu (µmax) i poziom wzrostu (GL), dostarczonych przez potok przetwarzania danych. Porównawcza wizualizacja krzywych wzrostu jest często stosowana do interpretacji danych o wzroście; jednak liczba krzywych, które można jednocześnie zwizualizować w celu porównania, jest ograniczona. Aby przeanalizować wiele krzywych wzrostu jednocześnie, wykorzystano wykresy pochodne z map ciepła w celu porównania dziesiątek klonów hodowanych na pojedynczym podłożu z odpowiedzią średnią dla tych warunków (Rysunek 2B). Wpływ nadekspresji nowego białka fagowego obserwuje się poprzez zmiany parametrów krzywej, a konkretnie: fazy lag, fazy wykładniczej oraz maksymalnej wydajności biomasy (asymptoty). Przykładowo, gwałtowny wzrost z fazy lag do fazy wykładniczej zamodelowany na krzywej wzrostu dla białka kapsydu (Rysunek 2A) jest odwzorowany przez szybką zmianę intensywności koloru z czarnego na biały dla tego samego klonu na dynamicznym wykresie na Rysunku 2B.

Aby uzyskać ogólny obraz rozkładu klonów na różnych substratach, wykorzystano klasyfikacje fenotypowe wyprowadzone z GL (Rysunek 3). Tutaj cztery fenotypy zostały rozdzielone na cztery wykresy, gdzie wysokość każdego słupka reprezentuje liczbę klonów wykazujących dany fenotyp dla konkretnego substratu. Wartości odstające w danych są rozpoznawane jako klony należące do kategorii „gain of function” lub „loss of function”. Wartości odstające mogą być następnie wyszukiwane indywidualnie i poddane dokładniejszym badaniom eksperymentalnym. Ponadto analiza globalna pozwala zidentyfikować błędy systematyczne związane z substratami w teście. Substraty takie jak fenyloalanina, kwas jabłkowy i glicyna skutkowały klasyfikacją „no growth”. Substraty, które konsekwentnie wpadają w klasyfikację „no growth” we wszystkich klonach, nie są brane pod uwagę w dalszej charakterystyce funkcjonalnej.

Metabolomika

Produkty kataboliczne z klonów wykazujących ekspresję nieznanych genów fagowych zidentyfikowano za pomocą metabolomiki. W skrócie, klony hodowano w warunkach ciągłej kultury lub seryjnych pasaży w kulturze okresowej przed przekazaniem ich do analizy GC-TOFMS w centralnym laboratorium metabolomiki. Szczegółowe informacje na temat przygotowania próbek, analizy i normalizacji dla GC-TOFMS zastosowanych przez wybrane laboratorium znajdują się w pracy Fiehn et al.31 W skrócie, do każdej próbki dodano 1 ml zimnego rozpuszczalnika do ekstrakcji, po czym próbki wymieszano w wirówce typu vortex i poddano sonikacji w zimnej kąpieli przez 5 min. Na koniec próbki odwirowano, a połowę z nich zdekantowano i osuszono do analizy. Ekstrakty oczyszczono i wzbogacono wewnętrznymi markerami indeksu retencji przed wprowadzeniem do chromatografu gazowego, a następnie przekazano do spektrometru mas. Dane z każdej próbki analizowano w taki sposób, aby raportowane były intensywności sygnałów dla wszystkich wykrytych sygnałów na chromatogramie. W celu normalizacji zsumowano obfitość pików dla każdej próbki, a całkowite obfitości pików uśredniono dla wszystkich próbek w zestawie. Obfitość metabolitów na próbkę podzielono przez obfitość pików danej próbki, a następnie pomnożono przez średnią obfitość pików całego zestawu próbek. Uzyskane dane wykorzystano do analizy metabolomiki w omawianym badaniu.

W celu określenia odpowiedniej liczby próbek dla każdej metody hodowli wymagana była walidacja powtarzalności metabolomiki. Aby wykryć precyzję obserwowaną w obrębie próbek oraz zmienność występującą dla różnych liczebności grup, przeanalizowano błąd standardowy średniej (SM) dla zbiorów danych n = 3 oraz n = 6 (Rysunek 5B). Niezależnie od liczby próbek w hodowli ciągłej (CC), mniej niż 1% danych miało SM ≤ 1,5. Mediany SM wynosiły odpowiednio 221 oraz 300, a wartości mieściły się w zakresie od 0 do 7,55 x 105 dla n = 3 oraz od 0 do 3,74 x 105 dla n = 6. Wartości SM obliczono również dla każdego zestawu powtórzeń próbek w metodzie hodowli seryjnej (SC). Ponownie, mniej niż 1% danych miało SM ≤ 1,5, mediana SM wyniosła 137, a zakres od 0 do 3,51 x 105. W celu porównania rozkładów SM pomiędzy poszczególnymi zestawami próbek (CC n = 3 vs. CC n = 6, CC n = 3 vs. SC n = 3 oraz CC n = 6 vs. SC n = 3) przeprowadzono test permutacji. Rozkład wartości SM dla obu zbiorów danych z hodowli ciągłej nie różnił się istotnie od rozkładu wartości SM dla hodowli seryjnej (p-value = 0,0). Jednak rozkład wartości SM dla danych z hodowli ciągłej przy n = 3 różnił się istotnie od rozkładu wartości SM dla danych z hodowli ciągłej przy n = 6 (p-value = 1,908804 x 10-49). Na koniec porównano współczynnik zmienności dla każdego metabolitu przed i po wdrożeniu etapu zapewnienia jakości (QA) (Rysunek 5C). Łącznie po zastosowaniu procedury QA usunięto 210 metabolitów (40% danych). Mniej niż 1% usuniętych danych charakteryzowało się zerową obfitością metabolitu, ok. 2% stanowiły dane standardu wewnętrznego, ok. 5% były to dane z metabolitów nigdy wcześniej niezaobserwowanych u E. coli, a pozostałe metabolity (> 30%) miały współczynnik zmienności większy niż 1.

Podobnie jak w analizie MAPs, obserwacje globalne pozwoliły na wstępne zrozumienie zakresu informacji, jakie oferuje metabolomika. Aby uzyskać obraz globalny, klony poddano klastrowaniu hierarchicznemu na podstawie względnej zawartości metabolitów, co dostarczyło informacji o profilach klon-metabolit, potencjalnych klonach o powiązanych funkcjach oraz wartościach odstających w parach klon-metabolit (Rysunek 6). W celu uwydatnienia funkcji białek, metabolity zostały rozdzielone i pogrupowane na podstawie wspólnych szlaków metabolicznych. Wykorzystanie tej analizy wraz z wstępnymi wynikami wykazało, że metabolomika jest w stanie rozdzielić geny z różnych klas (Rysunek 6, zaznaczone klony). Dodatkowo, identyfikację wartości odstających w danych metabolomicznych przeprowadzono poprzez obliczenie wyników standaryzowanych (z-scores) dla każdej pary klon-metabolit. Aby zapewnić istotność statystyczną, za wartości odstające uznano pary klon-metabolit o wartości Z score wynoszącej 2, co stanowiło jedynie 5 procent danych (dane nie pokazano).

Wykresy rozrzutu i pudełkowe tempa wzrostu względem poziomu wzrostu; analiza fenotypu na wykresie z eksperymentu z D-galaktozą.
Rysunek 1. Definicje klasyfikacji fenotypów. (A) Zależność między poziomem wzrostu (GL) a maksymalnym tempem wzrostu. Punkty danych okrążone na czerwono reprezentują krzywe wzrostu wykazujące niewielkie lub brak wykorzystania substratu. (B) Przedstawienie za pomocą wykresu pudełkowego definiujące próg wzrostu na podstawie rozkładu krzywych wzrostu z minimalnym tempem wzrostu (< 0,15 OD/hr). (C) Wariancja i odchylenie standardowe GL obliczone dla substratu D-galaktoza. Krótkie linie przerywane reprezentują dwa odchylenia standardowe od średniej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wykresy analizy wzrostu; OD600 nm względem czasu; sacharoza, D-galaktoza, D-mannoza; mapa ciepła absorbancji.
Rycina 2. Walidacja MAPs poprzez precyzję i różnicowanie. (A) Krzywe wzrostu dla adnotowanych klonów strukturalnych (Kapsyd) i metabolicznych (Tioredoksyna), dwóch nowych klonów metabolicznych (EDT2440, EDT2441) oraz średnia odpowiedź klonów hodowanych na sacharozie, D-galaktozie i D-mannozie w MAPs. Niebieskie linie wskazują błąd standardowy między powtórzeniami danych (n = 3). (B) Krzywe wzrostu dla 47 różnych klonów przedstawiono w formie map ciepła dla sacharozy, D-galaktozy i D-mannozy. Wyróżniono adnotowane klony strukturalne (zielone koło) i metaboliczne (pomarańczowe koło), dwa nowe klony metaboliczne (ciemnoniebieskie i jasnoniebieskie koła) oraz średnią odpowiedź (czerwone koło). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy analizy ekspresji genów przedstawiający liczbę klonów dla oczekiwanego wzrostu, przyrostu lub utraty funkcji.
Rycina 3. Rozkład klonów dla każdego fenotypu na wielu podłożach. Liczba klonów o określonym fenotypie dla 47 klonów w 72 warunkach wzrostu specyficznych dla węgla. Tabela zawiera bezpośrednie zliczenia dla każdego fenotypu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat wiercenia nakrętki reaktora; przedstawia rozmiary otworów 1/4", 5/16", 1/8", 1/16" dla konfiguracji sprzętu.
Rysunek 4. Schemat szczegółowo przedstawiający konstrukcję aparatury do hodowli ciągłej. (A) Etapy budowy portów α-γ reaktora do hodowli ciągłej, (B) etapy budowy portu odpływowego reaktora do hodowli ciągłej oraz (C) etapy budowy portów δ i ε butelki zasilającej do hodowli ciągłej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat układu testu wielofenotypowego; wykresy czasu trwania testu, analiza zmienności metabolitów.
Rycina 5. Porównanie przedstawionych metod fenomicznych. (A) Schemat przygotowania płytek do testów wielofenotypowych (MAPs), kultur ciągłych i kultur seryjnych. (B) Procentowy błąd standardowy średniej (SM) dla wielkości próbek n = 3 oraz n = 6 dla metod przygotowania kultur ciągłych (CC) i kultur seryjnych (SC) w metabolomice. Oś Y jest w skali logarytmicznej. (C) Rozkłady współczynników zmienności (CV) na metabolit przed i po wdrożeniu potoku kontroli jakości (QA) dla metody kultur ciągłych (CC). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mapa ciepła obfitości metabolitów, schemat szlaków metabolicznych, glikoliza, cykl TCA, dane dotyczące aminokwasów.
Rycina 6. Profile metabolomiczne klonów hodowanych w kulturze ciągłej. Przedstawiono mediany obfitości zestawu metabolitów dla 84 klonów hodowanych w kulturach ciągłych. Profile metabolitów dla adnotowanych klonów strukturalnych (Kapsyd) i metabolicznych (Tioredoksyna), dwóch nowych klonów metabolicznych (EDT2440, EDT2441) oraz średnią odpowiedź metaboliczną wyróżniono kolorem czerwonym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

ZwiązekWęgielAzotSiarkaFosfor
Glicerol−0.40%0.40%0.40%
Chlorek amonu9.5 mM−9.5 mM9.5 mM
Siarczan sodu0.250 mM0.250 mM−0.250 mM
Siarczan magnezu1.0 mM1.0 mM−1.0 mM
Fosforan potasu1.32 mM1.32 mM1.32 mM−
Chlorek magnezu−−*−
Chlorek potasu10 mM10 mM10 mM10 mM
Chlorek wapnia0.5 µM0.5 µM0.5 µM0.5 µM
Chlorek sodu5 mM5 mM5 mM5 mM
Chlorek żelaza(III)6 µM6 µM6 µM6 µM
L-arabinoza0.10%0.10%0.10%0.10%
MOPS pH 7.41x1x1x1x

Tabela 1. Skład i stężenia związków w różnych mediach podstawowych stosowanych w MAPs. *Zastąpiono 1,0 mM chlorku magnezu. 1x MOPS = 40 mM MOPS, 4 mM tricyny.

Podłoża węglowePodłoża azotowePodłoża siarkoweSubstraty fosforowe
2-dezooksy-D-ryboza2-dezoksy-D-rybozakwas 1-butanosulfonowyadenozyno-5'-monofosforan
kwas 4-hydroksyfenylooctowyacetamidN-acetylocysteinabeta-glicerynofosforan
kwas octowyadeninaD-cysteinafosforan kreatyny
adenozyno-5'-monofosforanadenozynaD-metioninaD-glukozo-6-fosforan
adonitolallantoinadietylo-ditiofosforandietyloditiofosforan
alfa-D-glukozabeta-fenyloetylaminaDL-etioninaDL-alfa-glicerynofosforan
alfa-D-laktozabiuretglutationfosforan potasu
alfa-D-melebiozacytydynakwas izetionowypirofosforan sodu
kwas cytrynowycytozynaKwas L-cysteinowytiofosforan sodu
D-alaninaD-alaninaL-cysteina
D-arabinozaD-asparaginaKwas L-djenkolicowy
D-arabitolD-asparaginianL-metionina
D-asparaginaD-cysteinasiarczan magnezu
D-asparaginianD-glukozaminakwas metanosulfonowy
D-celobiozakwas D-glutaminowyN-acetyl-DL-metionina
D-cysteinakwas DL-alpha-amino-N-maślanowyN-acetyl-L-cysteina
D-fruktozaD-metioninatetrationian potasu
D-galaktozaD-serynatiosiarczan sodu
D-glukozaminaD-walinakwas sulfanowy
D-glukozakwas gamma-aminomasłowytauryna
D-glukozo-6-fosforanglicynakwas taurocholowy
D-glutaminianguanidynatiomocznik
D-mannozahistamina
D-rafinozainozyna
D-rybozaL-alanina
D-salicynaL-arginina
D-serynaL-asparagina
D-trehalozaL-cytrulina
D-ksylozaL-cysteina
dulcytolKwas L-glutaminowy
glicerolL-glutamina
glicynaL-glutation
i-erytrytolL-histydyna
inozynaL-izoleucyna
L-alaninaL-leucyna
L-arabinozaL-lizyna
L-arabitolL-metionina
L-asparaginaL-ornityna
L-asparagianL-fenyloalanina
Kwas L-cysteinowyL-prolina
L-cysteinaKwas L-piroglutaminowy
L-fukozaL-seryna; L-treonina
Kwas L-glutaminowyL-tryptofan
L-glutaminaL-walina
L-izoleucynaN-acetyl-D-glukozamina
L-leucynaputrescyna
L-lizynatiomocznik
L-metioninatymidyna
L-fenyloalaninatymina
kwas L-piroglutaminowytyramina
L-ramnozatyrozyna
L-serynaurydyna
L-sorboza
L-treonina
L-tryptofan
L-walina
L-ksyloza
mleczan
laktuloza
malonian
myo-inozytol
kwas szczawiowy
sorbinian potasu
kwas propionowy
putrescyna
kwas chinowy
pirowinian sodu
succynian sodu
sacharoza
tymidyna
ksylitol

Tabela 2. Lista substratów użytych w eksperymentach MAP.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy podejścia fenomiczne do funkcjonalnej charakterystyki przypuszczalnych genów fagowych. Techniki obejmują opracowany test zdolny do monitorowania metabolizmu anabolicznego gospodarza, płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP), oprócz uznanej metody metabolomiki, zdolnej do pomiaru wpływu na metabolizm kataboliczny. Dostarczyliśmy dodatkowe narzędzia do zarządzania dużymi zbiorami danych wynikającymi z tych technologii, pozwalające na wysokoprzepustowe przetwarzanie i analizę24. Wreszcie, poprzez porównanie opisanego białka kapsydu fagowego, tioredoksyny fagowej, dwóch przypuszczalnych metabolicznych genów fagowych i średniej odpowiedzi eksperymentalnej, proponujemy różne strategie interpretacji zarówno zestawów danych, jak i klas genów, z naciskiem na identyfikację trendów fenotypowych i identyfikację wartości odstających.

Jak wspomniano, oba podejścia mierzą ilościowo tylko połowę metabolizmu gospodarza. Aby zinterpretować względną funkcję któregokolwiek z badanych nowych białek, wymagane są dane z obu metod, które dostarczyły dowodów na ich funkcję. Chociaż nie jest to przedmiotem naszego obecnego manuskryptu, dane wyjściowe z każdej metody fenomicznej są poddawane analizom kombinacyjnym, które koncentrują się na technikach grupowania, takich jak analiza lasów losowych i głównych komponentów. Ponadto hipotezy wynikające z połączonej analizy muszą być następnie zweryfikowane za pomocą tradycyjnych metodologii genetycznych.

Wreszcie, przedstawione metody są pod silnym wpływem fizjologii bakterii i dlatego są zgodne z tymi samymi standardami. Podejmując którąkolwiek z tych metod, należy wziąć pod uwagę fakt, że eksperymentuje się z niezależnymi grupami klonów; zapobiega się zanieczyszczeniu; testowana jest pojedyncza zmienna; i równolegle prowadzone są odpowiednie kontrole. Nieuwzględnienie tych punktów spowoduje niejasne wyniki, podobne do każdego testu fizjologicznego.

Płytki do oznaczania wielu fenotypów (MAP)

Opracowanie MAP zapewnia wysoką przepustowość i elastyczność testu w porównaniu z obecnie dostępnymi technologiami (rysunek 5A i tabele 1,2). Test wykorzystuje materiały, sprzęt i podstawowe techniki dostępne we wszystkich laboratoriach mikrobiologicznych. Włączenie potoku obliczeniowego PMAnalyzer24 do późniejszego przetwarzania i analizy danych zapewnia szybką interpretację danych. Ponadto zarówno eksperymentalne, jak i analityczne aspekty podejścia można łatwo dostosować lub dostroić do niestandardowych celów. Na przykład, jeśli duża część danych nie przejdzie filtrowania opisanego w sekcji 4, można ręcznie przesiać krzywe wzrostu, aby zidentyfikować problemy. Jeśli problem pojawi się z powodu rygorystycznych parametrów filtra, można wprowadzić poprawki do skryptu. Alternatywnie, jeśli problemy są związane z procesem eksperymentalnym (np. przedłużona kondensacja, niewłaściwe przenoszenie komórek bakteryjnych itp.), wówczas dodatkowe powtórzenia można łatwo powtórzyć.

Jak opisano w Cuevas i wsp.24, PMAnalyzer jest pojedynczym programem bash napisanym jako skrypt opakowujący, który wykonuje skrypty parsowania i analizy jako spójny, zautomatyzowany potok. Wszystkie skrypty są swobodnie dostępne z repozytorium Git przy 25 , biorąc wartość mediany dla każdego punktu czasowego w trzech danych, a następnie parametryzując krzywą logistyczną w celu uzyskania czasu opóźnienia, maksymalnej szybkości wzrostu, asymptoty i nowego terminu, poziomu wzrostu. W naszym badaniu wartość mediany została wybrana zamiast średniej, aby zmniejszyć wpływ dużych wartości odstających, jednak skrypt można łatwo dostosować do obliczenia średniej danych replikowanych. Ze względu na zmniejszoną zmienność (SE) obserwowaną w powtórzonych danych (Rysunek 2A) utrzymaliśmy użycie mediany w PMAnalyzerze do dopasowania krzywej logistycznej. Ponadto wartość odcięcia wzrostu w tym badaniu (GL ≥ 0,4) została określona poprzez porównanie, w jaki sposób dane rozdzielają się na poziomie wzrostu i maksymalnej stopie wzrostu (rysunek 1A,B). W zależności od zastosowanych instrumentów i modelu systemu, termin ten może się różnić, co wymaga ponownego zdefiniowania tej wartości odcięcia.

Główną zaletą naszego testu jest możliwość porównania fenotypów za pomocą jednego parametru charakteryzującego ogólny wzrost drobnoustrojów, który określamy jako Poziom Wzrostu (GL). Wskaźnik GL jest średnią harmoniczną i dlatego łagodzi skutki dużych wartości odstających w danych. Metodą prób i błędów uzyskano zastosowanie średniej harmonicznej z przesuniętymi wartościami dopasowanymi logistycznie w celu uzyskania podsumowania wzrostu. Inne metody próbujące zróżnicować wzrost obejmowały: czas potrzebny do osiągnięcia określonych parametrów krzywej (połowaμ maksimum, μmaksimum i nośność), współczynnik determinacji (R2) oraz kombinacje R2 pomnożone przez określone parametry krzywej. Użycie średniej harmonicznej z przesuniętymi wartościami dopasowania logistycznego dla GL zapewniło największy zakres oceny wzrostu, dlatego stało się metodą z wyboru. Należy zwrócić uwagę na to, że dynamiczne wzorce krzywych wzrostu mogą zostać utracone w przypadku korzystania z pojedynczego parametru lub dopasowanego modelu. Na przykład poszczególne parametry krzywej logistycznej i GL nie są w stanie odzwierciedlić wzrostu dwufazowego. W środowisku z pojedynczym węglem ten wpływ na wzrost implikuje pośrednictwo białka wirusa w konwersji substratu lub zmianie w wykorzystaniu substratu. Dodatkowe efekty, które mogą zostać utracone w przypadku braku uwzględnienia wielu parametrów wzrostu, obejmują: wydłużony czas opóźnienia, co sugeruje zwiększone obciążenie maszynerią lub produktami wirusowymi; gwałtownie przyspieszająca faza wykładnicza, co sugeruje sprzężenie białek wirusowych ze szlakami produkcji energii gospodarza; lub wyższe poziomy tworzenia biomasy, co sugeruje wsparcie wirusa w pobieraniu składników odżywczych gospodarza i anabolizmie (dane nie pokazane). W związku z tym wykreślenie powstających krzywych wzrostu (rysunek 2A,B) dostarcza informacji dotyczących trendów w czasie, podczas gdy GL uwzględnia główne zmienne modelu logistycznego, dostarczając pojedynczą liczbę ilościową reprezentującą ogólny sukces klonu.

Biorąc pod uwagę różne reakcje zapewniane przez geny strukturalne i metaboliczne w MAP, obserwuje się, że różne klasy substratów, o których mowa, dostarczają największych dowodów na funkcję białek. Na przykład białka metaboliczne są często związane z pozyskiwaniem ograniczających składników odżywczych, które są niespecyficzne dla centralnego metabolizmu gospodarza16,32. Wstępne eksperymenty MAP ujawniają, że klony zawierające przypuszczalne metaboliczne geny fagowe mają zwiększoną fazę opóźnienia, gdy są hodowane na centralnych źródłach węgla metabolicznego (Figura 2A). I odwrotnie, klony przenoszące przypuszczalne geny strukturalne, które wymagają dużych proporcji energii gospodarza i puli dNTP, powodują fałszywie dodatnią odpowiedź na wzrost substratów węglowych centralnego i metabolizmu aminokwasów. Jest to prawdopodobnie spowodowane akumulacją nierozpuszczalnych białek, co prowadzi do filamentacji i / lub inkluzji ciała gospodarza, co zaobserwowano za pomocą mikroskopii (Figura 2A i dane nie pokazane). Chociaż do potwierdzenia tych wstępnych wyników wymagana jest dalsza analiza, MAP są w stanie uzyskać odpowiedzi fenotypowe, które korelują z hipotetycznymi funkcjami określonych klas genów fagowych.

Oprócz wyjaśnienia nieznanych białek wirusowych, MAP są nowym zasobem do badania różnorodności funkcjonalnej i metabolicznej poszczególnych bakterii lub społeczności bakterii. Komponenty MAP są zaprojektowane z myślą o łatwej modyfikacji w celu wspierania wzrostu szeregu bakterii; w tym drobnoustroje morskie, auksotroficzne i beztlenowe. Aby ułatwić te wysiłki, zdefiniowane podłoża podstawowe i przedwzrostowe wymagają dodatkowych lub dostosowanych gatunków chemicznych, zanim inny rodzaj bakterii będzie mógł być wspierany w MAP. Jedną z uwag związanych z tym stosowaniem MAP jest utrzymanie określonych pożywek, zakazując stosowania składników takich jak trypton, ekstrakt drożdżowy i pepton.

Metabolomika

Dziedzina metabolomiki jest zależna od baz danych metabolitów, które obejmują izolowane metabolity identyfikowane za pomocą spektrometrii mas. Wybrana tutaj główna placówka posiada jedną z największych baz danych metabolomicznych. Co ciekawe, ponad połowa metabolitów powstałych w wyniku naszych eksperymentów była niemożliwa do zidentyfikowania (~65%), podczas gdy inne nigdy wcześniej nie zostały zarejestrowane u naszego gospodarza, Escherichia coli (przykłady obejmują: kwas octowy indolo-333, kwas salicylowy34 i kwas dihydroabietynowy35). Fakt ten można przypisać albo silnemu odchyleniu bazy danych w kierunku metabolitów roślinnych, albo konkretnym białkom będącym przedmiotem badań. Niezależnie od tego, wynikiem jest ograniczona liczba znanych metabolitów dostępnych do reprezentacji i analizy danych. W przyszłości wiele metod metabolomicznych wykorzystujących różne bazy danych pozwoli na większe pokrycie metabolitów.

Obecnie zarówno znane, jak i nieznane metabolity są wykorzystywane do porównywania i kontrastowania naszych nowych białek wirusowych. Stosując to podejście, stawiamy hipotezę, że klony zawierające funkcjonalnie podobne białka będą miały zwiększone podobieństwo w swoim pełnym profilu metabolomicznym. Wstępna analiza metabolomiczna wykazała, że chociaż geny strukturalne i metaboliczne nie oddzielają się wyraźnie od siebie, geny wykazujące podobny wpływ na gospodarza w przypadku nadekspresji korelują (ryc. 6). Na przykład, oznaczony adnotacją gen kapsydu grupuje się ściśle z domniemanymi genami metabolicznymi podkreślonymi w tym badaniu, EDT2440 i EDT2441. Badania z wykorzystaniem publicznie dostępnej topologii transbłonowej i programu predykcyjnego peptydów sygnałowych wykazały dowody na to, że oba domniemane geny metaboliczne zawierają pojedynczą domenę transbłonową. Co ciekawe, 5 z 9 klonów w pierwszej grupie klastrów (najbardziej lewa część dendrogramu) przewidywało domeny transbłonowe przy użyciu tego samego programu topologicznego. Potrzebne są dalsze badania, jednak prawdopodobne jest, że metabolity obecne podczas nadekspresji tych klonów są związane z reakcją na stres komórkowy wynikającą z obciążeń błonowych lub strukturalnych. Dowody te potwierdzają, że chociaż dane metabolomiczne zawierają zwiększoną ilość szumu, metoda jest w stanie podkreślić sygnały, które różnicują ogólne efekty genów, zarówno w obrębie klasy genów, jak i w poprzek niej. Aby ustalić, czy metoda jest w stanie wyodrębnić określone informacje o funkcji genów, metabolity pogrupowano w określone szlaki metaboliczne. Hipoteza jest taka, że jeśli klon wpływa na metabolity specyficzne dla pojedynczego szlaku, to gen z nadekspresją jest aktywny w tym szlaku. Przed ustanowieniem naszego procesu zapewniania jakości metabolomiki wstępne dane ujawniły, że nadmierne i niedostatecznie reprezentowane metabolity były zazwyczaj "nieznane", dostarczając niewiele informacji na temat szlaków, z którymi są związane (dane nie pokazane). Wstępnie przetworzone dane metabolomiczne ujawniają jednak, że większość profili metabolitów jest podobna, a tylko wybrana liczba nieznanych i znanych obfitości metabolitów różni się między klonami, na przykład putrescyna i uracyl (Figura 6). Aby zapewnić większą rozdzielczość funkcji białek, podejmowane są wysiłki w celu eksperymentalnego porównania nowych genów fagowych ze znanymi genami fagowymi, które można wykorzystać do wypełnienia "" w charakterystyce funkcjonalnej opartej na metabolitach. Korzystając z tej techniki, przypisana funkcja znanych genów wirusowych stanowi odniesienie dla funkcji nieznanych genów. Niemniej jednak czynnikiem ograniczającym analizę metabolomiczną jest rozmiar i znaczenie bazy danych. Aby skorygować te ograniczenia, należy opracować metabolomiczne bazy danych związane z tymi badaniami; takie jak baza danych metabolitów i ich obfitości specyficznych dla kolekcji ASKA klonów E. coli , w której dochodzi do nadekspresji pojedynczego ORF36. Dowody na potrzebę istnienia takich baz danych zostały dostarczone w 2013 roku, kiedy naukowcy z Lawerence Berkeley National Laboratory skompilowali pierwszą kompleksową bazę danych metabolitów specyficznych dla całych zmutowanych bibliotek bakterii modelowych37. Badania te dostarczyły nowych informacji na temat genów niezbędnych do wykorzystania określonych metabolitów, ujawniając wyraźny związek między fenotypem a genotypem.

Rozważając metabolomikę jako narzędzie, ważne jest, aby określić reżim przetwarzania stosowany w głównym obiekcie. Artefaktem większości procedur eksperymentalnych jest codzienna zmienność związana z instrumentami użycia. Do tej pory we wszystkich analizach GC-MS stosuje się wewnętrzne standardy, które są zawarte w każdym przebiegu analitycznym; Jednak dodanie wewnętrznych próbek specyficznych dla projektu, które były uruchamiane każdego dnia eksperymentów, usuwa dodatkowe odchylenia. Kwestie te należy rozwiązać wcześnie, aby uniknąć problemów z normalizacją i uprzedzeń. Innym rozwiązaniem jest przetwarzanie wszystkich próbek w zakładzie podstawowym na tej samej maszynie i jako pojedynczą partię, co jest opcją dostępną w każdym zakładzie podstawowym.

Różne narzędzia, zarówno przedstawione, jak i ponownie zbadane w tym manuskrypcie, dostarczają nowatorskich środków do badań przesiewowych i charakteryzowania funkcjonalnie nieznanych genów fagów. Prostota i zdolność adaptacji technik eksperymentalnych przy usprawnionym wykorzystaniu potoków obliczeniowych zapewnia, że metody te mają zastosowanie w szerokim zakresie przedsięwzięć badawczych i dziedzin. Naszym celem jest, aby przedstawione tutaj podejścia fenomiczne pomogły w dalszych badaniach nad nowymi białkami fagowymi, a także nad systemami, które są równie funkcjonalnie niezdefiniowane.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Benjaminowi Knowlesowi, Yan Wei Limowi, Andreasowi Haasowi i członkom konsorcjum Viral Dark Matter za ich pomoc i konstruktywny wkład w ten manuskrypt. Badania te są finansowane przez National Science Foundation (DEB-1046413) i są częścią projektu Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 &mikro; m Filtr SterivexFisher ScientificSVGP01050Millipore
0,22 i mikro; m Filtry MillexFisher ScientificSLGV033RSMillipore
0,22 i mikro; m Filtr SteriCapFisher ScientificSCGPS02REMillipore
0,22 i mikro; m Filtry membranowe OmniporeMilliporeJHWP02500Millipore
96-dołkowe płytki do mikromiareczkowaniaVWR82050-764Standard F-Bottom 96-dołkowe Mikropłytki
ml 96-dołkoweFisher Scientific
Samoprzylepna folia uszczelniającaSigma-AldrichZ369667
2 L Nalgene kwadratoweCole ParmerT-06040-70
125 ml Nalgene kwadratowe butelkiCole ParmerT-06040-50
1/4 cala Nakrętka zabezpieczająca do montażu panelowego, nylonCole ParmerEW-45509-04
Gwint wewnętrzny Luer do montażu panelowego do 200 Series Barb, 1/16 in.Cole ParmerEW-45500-30
Żeński gwint Luer do montażu panelowego do zadziorów serii 200, 1/8 cala.Cole ParmerEW-45500-34
Męski zintegrowany pierścień blokujący Luer do zadzioru serii 500, 1/16 cala. Rurka IDCole ParmerEW-45505-31
Męski Luer z pierścieniem blokującym x żeński łącznik LuerCole ParmerT-45508-80
Złączki grodziowe z zadziorami, 1/4 cala. ODFisher Scientific6149-0002
Rurka Sanipure, 1/16 cala Identyfikator x 1/8 cala ODSaniPureAR400002
Rurka Sanipure, 1/4 cala OD x 1/8 cala IDSaniPureAR400007
Mini pompa o zmiennym przepływie (pompa perystaltyczna)Fisher Scientific13-876-1
Mieszadło magnetyczneVelp ScientificaF203A0160
KleszczeFisher Scientific14-512-141Millipore* Kleszcze filtracyjne
Wielopłytkowy czytnik płytek spektrofotometruAnalityk urządzeń molekularnych GT
Rozdzielacz filtraFisher ScientificXX10 025 02
Oprogramowanie:
Python wersja 2.7.5http://www.python.org/
PyLab modulehttp://wiki.scipy.org/PyLab
R wersja 3.0.1http://www.r-project.org/
reshape2 libraryhttp://had.co.nz/reshape
ggplot2 libraryhttp://ggplot2.org/
Gene ComposerPSI Tech Portalhttp://www.genecomposer.net
Usługi:
Centrum Metabolomiki Zachodniego WybrzeżaUC Davishttp://metabolomics.ucdavis.edu
DNA 2.0https://www.dna20.com
2

Bibliografia

  1. Wommack, K. E., Colwell, R. R. Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).
  2. Hendrix, R. W. Recoding in Bacteriophages. Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).
  3. Breitbart, M., et al. Genomic analysis of uncultured marine viral communities. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).
  4. Breitbart, M., et al. Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community. Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).
  5. Dinsdale, E. A., et al. Functional metagenomic profiling of nine biomes. Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).
  6. Vega Thurber, R. L., et al. Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).
  7. Pedulla, M. L., et al. Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes. Cell. 113 (2), 171-182 (2003).
  8. Calendar, R., Abedon, S. T. The bacteriophages. , Oxford Univeresity Press. (2006).
  9. Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences. FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).
  10. Klenk, H. -P., Palm, P., Zillig, W. DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules. Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).
  11. Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses. Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).
  12. Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus. Nature. 424 (6950), 741(2003).
  13. Mann, N. H., et al. The genome of S-PM2, a “photosynthetic” T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains. Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).
  14. Lindell, D., et al. Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).
  15. Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).
  16. Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations. PLoS biology. 3 (5), e144(2005).
  17. Rohwer, F., et al. The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages. Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).
  18. Miller, E. S., et al. Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage. Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).
  19. Thompson, L. R., et al. Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).
  20. Paterson, S., et al. Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution. Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).
  21. Seguritan, V., et al. Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins. PLoS computational biology. 8 (8), e1002657(2012).
  22. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture Medium for Enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  23. Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter. Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).
  24. Cuevas, D. A., et al. Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles. F1000Research. , (2014).
  25. Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van’t Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).
  26. Venables, W. N., Smith, D. M. An introduction to R. , Available from: http://cran.r-project.org/doc/manuals/R-intro.pdf (2014).
  27. Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets. BMC bioinformatics. 11, 341(2010).
  28. Schmieder, R., Edwards, R. Quality control and preprocessing of metagenomic datasets. Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).
  29. Schmieder, R., Edwards, R. Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets. PloS One. 6 (3), e17288(2011).
  30. Welch, M., et al. Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli. PloS One. 4 (9), e7002(2009).
  31. Fiehn, O., et al. Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies. The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).
  32. Zeng, Q., Chisholm, S. W. Marine viruses exploit their host’s two-component regulatory system in response to resource limitation. Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).
  33. Shindy, W. W., Smith, O. E. Identification of plant hormones from cotton ovules. Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).
  34. Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. Biosynthesis and metabolism of salicylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).
  35. Chappell, J. The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism. Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).
  36. Kitagawa, M., et al. Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research. DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).
  37. Baran, R., et al. Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype. ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Charakterystyka bia ek wirusowychp ytki do analiz wielofenotypowychanaliza metabolomicznachromatografia gazowa sprz ona z szybk spektrometri mas GC TOFMSreaktor do hodowli ci g ejseryjna hodowla okresowawykorzystanie substrat w przez gospodarzapomiar tworzenia biomasyanaliza profilu fenotypowego
Fenomika fagów: fizjologiczne podejścia do charakterystyki nowych białek wirusowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.