Artykuł metodologiczny

Metoda zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej u gryzoni podczas dyskretnych faz uczenia się

DOI:

10.3791/52859

⸱

22 czerwca 2015

 , 
1Department of Neuroscience, Oberlin College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak tymczasowo i zdalnie wyciszyć aktywność neuronalną w dyskretnych obszarach mózgu, podczas gdy szczury są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Podejście to łączy farmakogenetykę (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) z paradygmatem behawioralnym (sensoryczne warunkowanie wstępne), które ma na celu rozróżnienie różnych elementów uczenia się.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje, jak tymczasowo i zdalnie wyciszyć aktywność neuronalną w oddzielnych obszarach mózgu, podczas gdy zwierzęta są zaangażowane w zadania związane z uczeniem się i pamięcią. Podejście to łączy farmakogenetykę (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) z paradygmatem behawioralnym (sensoryczne warunkowanie wstępne), który ma na celu rozróżnienie różnych form uczenia się. W szczególności dostarczanie za pośrednictwem wirusa jest wykorzystywane do ekspresji genetycznie zmodyfikowanego hamującego receptora sprzężonego z białkiem G (receptora projektanta) do dyskretnego regionu mózgu gryzonia. Trzy tygodnie później, gdy poziom ekspresji receptora projektanta jest wysoki, środek farmakologiczny (Designer Drug) jest podawany ogólnoustrojowo 30 minut przed określoną sesją behawioralną. Lek ma powinowactwo do receptora projektanta, a zatem powoduje hamowanie neuronów, które wyrażają receptor projektanta, ale poza tym jest biologicznie obojętny. Obszar mózgu pozostaje wyciszony przez 2-5 godzin (w zależności od dawki i drogi podania). Po zakończeniu paradygmatu behawioralnego tkanka mózgowa jest oceniana pod kątem prawidłowego rozmieszczenia i ekspresji receptora. Podejście to jest szczególnie przydatne do określania wkładu poszczególnych regionów mózgu w określone komponenty zachowania i może być stosowane w dowolnej liczbie paradygmatów behawioralnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekscytującym wyzwaniem w dziedzinie neuronauki behawioralnej jest określenie neuronalnych substratów złożonych zachowań. Szereg technik, takich jak trwałe zmiany chorobowe, tymczasowa inaktywacja mózgu za pomocą implantów kaniul i optogenetyka, zostało wykorzystanych w celu zidentyfikowania wkładu dyskretnych regionów mózgu w podskładniki złożonych zachowań. Chociaż podejścia te wpływają na nasze zrozumienie specyfiki regionalnej podczas uczenia się, każda technika nie jest pozbawiona ograniczeń. W szczególności trwałe zmiany chorobowe są zwykle przeprowadzane przed testami behawioralnymi, dlatego ich efekty są obecne przez cały czas trwania paradygmatu. Badania kaniulacji, które obejmują prezentację krótkotrwałej inaktywatora neuronalnego (np. tetrodotoksyny), mogą powodować znaczne uszkodzenia tkanki mózgowej i mogą wywoływać stres u osób tuż przed testami behawioralnymi. Ponadto inaktywacja poprzez kaniulację jest ograniczona do obszaru tkanki otaczającego końcówkę kaniuli. Wreszcie, chociaż optogenetyka oferuje szereg elastyczności w zakresie czasowej kontroli aktywności w określonych obszarach mózgu, jest ona zbyt kosztowna i wymagająca technicznie.

Te ograniczenia można przezwyciężyć za pomocą podejścia farmakogenetycznego (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs, DREADDs)1,2. Co ważne, chociaż koncepcja farmakogenetyki jest wyrafinowana, wykonanie tej techniki jest proste. Podobnie jak tradycyjne stereotaktyczne metody chirurgiczne, które polegają na infuzji toksyny (np. NMDA, kwasu ibotenowego) do dyskretnych obszarów mózgu, technika ta polega na wstrzyknięciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV), który zawiera fragment DNA zmodyfikowanego hamującego receptora sprzężonego z białkiem G (hM4Di; receptor projektowany) do obszaru zainteresowania standardowych gryzoni laboratoryjnych (patrz ryc. 1). Wektor wirusowy zawiera również reporter fluorescencyjny (mcytrynę). Po włączeniu do komórek, receptor projektanta (i białko reporterowe) uzyskuje maksymalną ekspresję ~3 tygodnie po infuzji i może być selektywnie aktywowany przez 2-5 godzin przez ogólnoustrojowe podawanie biologicznie obojętnego, N-tlenku klozapiny (CNO)1,3. Ponieważ eksperymentator jest obdarzony precyzyjną, ale odległą kontrolą czasową nad aktywnością neuronalną w określonych obszarach mózgu, farmakogenetyka szczególnie dobrze łączy się z paradygmatami behawioralnymi, które są prowadzone w wielu fazach. W tym przykładzie wkład kory zaśledziony (RSC) w uczenie się bodziec-bodziec jest porównywany z jego rolą w uczeniu się Pawłowa, jednak ta kombinacja podejść dobrze nadaje się do dowolnej liczby pytań, które mają na celu określenie, w jaki sposób określone regiony mózgu przyczyniają się do złożonego zachowania.

Ponadto, chociaż nie jest to opisane w niniejszym protokole, wirusowe i transgeniczne podejścia mogą być używane do osiągnięcia specyficznej dla typu komórki ekspresjiDREADD 2. Jak to jest nieodłącznie związane z paradygmatami behawioralnymi, które obejmują manipulacje farmakologiczne i/lub inne rodzaje manipulacji eksperymentalnych, przy stosowaniu podejścia DREADD wymagane jest staranne rozważenie projektu eksperymentalnego i późniejsza analiza ilościowa. Eksperymentatorzy, którzy nie mają doświadczenia w podejściu DREADD, są kierowani do kompleksowego przeglądu obecnej technologii DREADD2.

Każdego dnia, organizmy uczą się o nowych bodźcach i wydarzeniach oraz ich wzajemnych relacjach. Nawet w znajomym środowisku, takim jak dom, można szybko wykryć zmiany w relacjach między bodźcami, ponieważ zmiany te mogą być predyktorem znaczących wydarzeń. Takie uczenie się bodziec-bodziec (tj. relacyjne) polega na łączeniu wielu bodźców i tradycyjnie jest związane z hipokampem, który znajduje się centralnie w przyśrodkowym płacie skroniowym4. Jednak hipokamp nie istnieje ani nie działa w izolacji; Obszary korowe, zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz przyśrodkowego płata skroniowego, dostarczają krytycznych informacji czuciowych do formacji hipokampa5-7. Tradycyjne badania nad trwałymi zmianami chorobowymi dostarczają przekonujących dowodów na udział wielu regionów kory mózgowej (np. kory zaśledzionowej, zanosowej i śródwęchowej) w uczeniu się zależnym od hipokampa, ale mają ograniczoną zdolność do rozpoznania roli określonego regionu podczas odrębnych faz uczenia się8-10.

Obecny protokół testuje hipotezę, że RSC jest niezbędny do uczenia się bodziec-bodziec, poprzez wyciszenie RSC podczas pojedynczej fazy 3-fazowego paradygmatu wstępnego warunkowania sensorycznego11,12. Krótko mówiąc, szczury otrzymują wlewy AAV, który zawiera receptor projektanta, a ~ 3 tygodnie później podaje się im (CNO) 30 minut przed rozpoczęciem testów behawioralnych. W niniejszym protokole szczury doświadczalne otrzymują CNO podczas pierwszej fazy testów (kiedy następuje uczenie się bodziec-bodziec) i otrzymują nośnik podczas następnych 2 faz testów. Aby kontrolować niezamierzony wpływ CNO na zachowanie, należy podać szczurom receptor projektanta (hM4Di) i wstrzyknąć nośnik zamiast CNO. Aby uwzględnić ogólne skutki infuzji wirusa i ekspresji receptora, należy podać wirusa kontrolnego, który nie zawiera receptora zaprojektowanego i podać CNO.

Do dostarczania materiału genetycznego używa się wielu różnych serotypów AAV. Obecne wytyczne NIH dotyczące badań nad cząsteczkami rekombinowanymi lub syntetycznymi utrzymują, że AAV (wszystkie serotypy) oraz rekombinowane lub syntetyczne konstrukty AAV, w których transgen nie koduje ani potencjalnie rakotwórczego produktu genowego, ani cząsteczki toksyny i są wytwarzane przy braku wirusa pomocniczego, wymagają środków ostrożności BSL-1 (Załącznik B-1. Czynniki grupy ryzyka 1 (RG1)13. Dostępnych jest wiele opinii dotyczących struktury, użyteczności i bezpieczeństwa AAV14,15. Warto jednak zauważyć, że ze względu na obawy związane z możliwymi mechanizmami reprodukcyjnymi16,17 i potencjalnymi mechanizmami rakotwórczymi18-20 u gryzoni, niektóre instytucje wymagają stosowania środków ostrożności BSL-2 podczas pracy z AAV. Sprawdź odpowiedni BSL przed użyciem, konsultując się z komitetami nadzorczymi w poszczególnych instytucjach, w których będą prowadzone badania, Centrami Kontroli Chorób i wytycznymi NIH dotyczącymi badań z udziałem rekombinowanych cząsteczek DNA13 w przypadku stosowania wektorów wirusowych do manipulacji genami w Stanach Zjednoczonych. Niniejsze wytyczne określają wymagania dotyczące ochrony osobistej, szkolenia badaczy, powstrzymywania rozprzestrzeniania się nosicieli, dekontaminacji, usuwania odkażonych materiałów oraz pomieszczeń dla zwierząt po wstrzyknięciu. Ponadto należy zapoznać się z odpowiednimi wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Zwierząt lub równoważnymi wytycznymi Komitetu Nadzoru Instytucjonalnego i postępować zgodnie z nimi, aby zapewnić bezpieczne obchodzenie się, podawanie i usuwanie AAV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie zwierząt jest zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Oberlin College i jest zgodne z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych21.

1. Przygotowanie do infuzji wirusowej

Uwaga: Ten protokół wykorzystuje środki ostrożności BSL-1. W przypadku stosowania środków ostrożności BSL-2 wymagany jest jednorazowy fartuch laboratoryjny, rękawice, ochraniacze na buty, ochrona oczu i respirator cząstek stałych (typ N95). Wszystkie osoby mające kontakt ze związkami BSL-2 muszą zostać przetestowane pod kątem odporności na cząstki stałe przez lokalną agencję zdrowia publicznego. Patrz Lowery & Majewska (2010)22 w celu uzyskania dodatkowych informacji na temat obchodzenia się z wektorami wirusowymi i ich przechowywania.

  1. Przy pierwszym użyciu należy podwielokrotnić i przechowywać niewykorzystany wirus w probówkach do mikrowirówek o pojemności 20 μl, aby uniknąć wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
  2. Przygotuj powierzchnię roboczą, usuwając wszelkie niepotrzebne przedmioty i sterylizując powierzchnię 70% etanolem. Przygotuj 10% roztwór wybielacza do odkażania odpadów AAV. Umieść zlewkę pełną roztworu wybielacza i sterylną strzykawkę o pojemności 10 μl na powierzchni roboczej. Umieść probówkę mikrowirówki z AAV w pojemniku z pokruszonym lodem podczas ustawiania.
  3. Umieść probówkę wirówkową z wirusem w standardowym imadle laboratoryjnym. Załadować strzykawkę o pojemności 10 μl co najmniej 4 μl AAV. Należy uważać, aby nie zginać końcówki strzykawki o dno probówki mikrowirówki podczas ładowania. Upewnij się, że w 4 μl roztworu AAV w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.
  4. Pustą probówkę z wirusem wyrzucić do zlewki zawierającej 10% wybielacza. Niewykorzystane porcje wirusa należy przechowywać zgodnie z zaleceniami dostawcy.
  5. Dodaj dodatkowe 10% wybielacza do pojemnika na odpady i pozostaw odpady na 30 minut przed wyrzuceniem odkażonych odpadów płynnych.
  6. Zutylizuj cały sprzęt ochronny i odpady z tworzyw sztucznych w pojemniku na zagrożenie biologiczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Odkaż wszelkie urządzenia lub powierzchnie, które miały kontakt z wirusem, za pomocą 10% wybielacza.

2. Chirurgia

  1. Przygotować obszar operacyjny, umieszczając chłonną bibułę stołową pod aparatem stereotaktycznym i w przyległym miejscu wyznaczonym jako dedykowany obszar do walki z wirusem.
    1. Umieść pojemnik na odpady z 10% wybielacza w dedykowanym obszarze do obsługi wirusów w pobliżu aparatu chirurgicznego.
  2. Wywołaj stały poziom znieczulenia i przygotuj szczura do operacji.
    1. Umieść szczura w komorze indukcyjnej, która zawiera mieszaninę gazowego izofluranu (zakres od 1 do 3%) i tlenu (100% przy około 1 l/min), aż do utraty przytomności i braku rażących, celowych ruchów. Utrzymuj znieczulenie izofluranem przez cały czas trwania zabiegu chirurgicznego.
    2. Po osiągnięciu 6 głębokiego znieczulenia ogol szczura od spomiędzy oczu do nieco za uszami.
    3. Umieść szczura z powrotem w komorze indukcyjnej na dodatkowe 1-3 minuty.
    4. Upewnij się, że system znieczulenia izofluranem jest połączony ze stożkiem nosowym operacji stereotaktycznej. Otworzyć zawór odcinający na rurkach izofluranu, aby rozpocząć przepływ izofluranu do stereotaksu. Utrzymać izofluran i tlen na poziomach określonych powyżej.
    5. Umieść szczura w aparacie stereotaktycznym, mocując usta do pręta gryzącego i zabezpieczając nauszniki.
    6. Nałóż smar do oczu na oczy i betadynę na miejsce operacji przed nacięciem.
  3. Wykonaj 2,4 cm nacięcie w linii środkowej skóry na grzbietowej powierzchni czaszki, zaczynając około 2 mm ogonowo do oczu. Cofnij skórę, aby odsłonić czaszkę. Okresowo wkraplaj sterylną 0,9% sterylną sól fizjologiczną na brzegi pola operacyjnego, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.
  4. Oczysta tkanka błoniasta od czaszki do momentu, gdy bregma i lambda są wyraźnie widoczne.
  5. Upewnij się, że czaszka jest wypoziomowana, mierząc współrzędne grzbietowo-brzuszne w bregma i lambda. Odpowiednio wyreguluj urządzenie stereotaktyczne, aż współrzędne grzbietowo-brzuszne w bregma i lambda będą się różnić nie więcej niż o 0.04 mm.
  6. W tym czasie należy zredukować stężenie izofluranu do poziomu od 2 do 2,5%.
  7. Przywróć wiertło do bregma, ponownie wyzeruj współrzędne, a następnie przesuń wiertło do żądanej współrzędnej przyśrodkowej-bocznej i przednio-tylnej.
  8. Wywierć otwór na współrzędnej za pomocą wiertła 0,9 mm, ponieważ tworzy ono otwór o odpowiednim rozmiarze dla strzykawki infuzyjnej 28 G.
  9. Ustawić pompę infuzyjną tak, aby dostarczała wirusa z szybkością 0,2 μl/min. Umieścić strzykawkę w ramieniu infuzyjnym urządzenia stereotaktycznego i opuścić strzykawkę do żądanej współrzędnej. Dostarczyć żądaną ilość wirusa (zakres od 0,1 do 0,8 μl). Na przykład dostarcz 0,8 μl AAV przez 4 min.
    Uwaga: należy przeprowadzić badania pilotażowe w celu określenia idealnej objętości infuzji i typowego rozprzestrzeniania się wirusa w każdym regionie zainteresowania pacjenta.
    1. Po zakończeniu podawania wirusa należy pozostawić strzykawkę na miejscu na 10 minut, aby zapobiec cofaniu się do przewodu igły. Powoli podnosić strzykawkę z prędkością około 5 mm/min. Powtarzaj, aż wszystkie współrzędne zostaną nasycone AAV.
  10. Zamknij ranę za pomocą zszywek chirurgicznych i pokryj ranę miejscową maścią z antybiotykiem.
  11. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi dotyczącymi leczenia bólu pooperacyjnego.
  12. Umieść szczura w klatce z ściółką, pokrywką i odpowiednim oznakowaniem, a następnie zwróć szczura do obiektu dla zwierząt.
    1. Jeśli pracujesz zgodnie ze środkami ostrożności BSL-2, zbieraj pościel przez czas (zwykle 48-72 godziny) określony w wytycznych instytucjonalnych. Umieść ściółkę w pojemniku na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.
    2. Wszystkie materiały skażone AAV należy utylizować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi ich bezpiecznej utylizacji.

3. Aparat behawioralny

Uwaga: Aparat do wstępnego kondycjonowania sensorycznego składa się ze standardowej komory kondycjonowania (12" dł. x 9,5" szer. x 11,5" wys.) z podłogą z siatki ze stali nierdzewnej, 2 ścian bocznych z pleksiglasu i 2 ścian metalowych.

  1. Zamontuj światło o mocy 2,8 W na jednej z aluminiowych ścian, aby służyło jako światło domu i jako bodziec wizualny, gdy jest migane z częstotliwością 2 Hz. Zamontuj głośnik na komorze, aby dostarczać bodźce słuchowe (10 sekund, 1500 Hz, 78 dB czystego tonu i 10 sekund 78 dB białego szumu).
    1. Użyj zasobnika na żywność, aby dostarczyć 45 mg granulek żywności do kubka na żywność. Wewnątrz kubka z jedzeniem fotokomórki na podczerwień wykrywają całkowity czas spędzony w kubku z jedzeniem przed, w trakcie i po prezentacjach bodźców i nagród w postaci jedzenia.
    2. Komory umieszczono w szafach wygłuszających (22" szer. x 22" wys. x 16" gł.) wyposażonych w wentylatory wyciągowe (~68 dB).
    3. Użyj komputera PC z oprogramowaniem Med Associates do sterowania komorą operacyjną i pozyskiwania danych. Podczas sesji kondycjonowania zbierz dane na temat całkowitego czasu spędzonego z głową w kubku z jedzeniem podczas prezentacji bodźca świetlnego (epoka 5 sekund) i podczas prezentacji nagrody w postaci jedzenia (epoka 5 sekund). Podczas sesji testowej zbierz dane na temat całkowitego czasu spędzonego w kubku z jedzeniem w odpowiedzi na prezentacje bodźców słuchowych (10 sekund okres rozpoczynający się w momencie zakończenia bodźców słuchowych).

4. Przegląd paradygmatu wstępnego warunkowania sensorycznego

  1. Po powrocie do zdrowia po operacji, stopniowo pokarm ogranicza szczury do 85% ich masy ciała podczas karmienia. Skonsultuj się z personelem weterynaryjnym w celu uzyskania odpowiedniego paradygmatu ograniczeń żywieniowych.
    Uwaga: 3-fazowy paradygmat wstępnego kondycjonowania sensorycznego zilustrowano na rysunku 2.
  2. Sesje przygotowania do treningu (Faza 1; Codzienne 64-minutowe sesje treningowe prowadzone przez 4 kolejne dni):
    1. Przedstaw szczurom 12 mieszanych prób, które polegają na dostarczaniu bodźców słuchowych i wzrokowych. Uwzględnij interwały między próbami, które wynoszą średnio 4,5 minuty (zakres od 4,0 do 5,0 min) po każdej prezentacji słuchowej.
    2. W 6 próbach prezentuj ton (bodziec warunkowany) przez 10 sekund, a następnie natychmiast 5-sekundową prezentację bodźca światła.
    3. W pozostałych 6 próbach prezentuj sam biały szum (niesparowany bodziec) przez 10 sekund.
  3. Sesje kondycjonujące (Faza 2; Codzienne 64-minutowe sesje treningowe prowadzone przez 5 kolejnych dni):
    1. Przedstaw szczurom 8 prób, które polegają na dostarczeniu bodźca wzrokowego (bodźca światła) przez 5 sekund, a następnie natychmiast podaniu dwóch granulek pokarmu po 45 mg. Uwzględnij interwały między próbami, które wynoszą średnio 7 minut (zakres od 6,0 do 8,0 min) po każdej próbie. Czasami szczury potrzebują więcej niż 5 sesji kondycjonowania, aby nauczyć się skojarzeń z lekkim jedzeniem.
  4. Sesja testowa (Faza 3; pojedyncza sesja trwająca 78 minut):
    1. Przedstaw szczurom 12 mieszanych prób, które polegają na dostarczaniu samych bodźców słuchowych. Uwzględnij interwały między próbami, które wynoszą średnio 4,5 minuty (zakres od 4,0 do 5,0 min) po każdej prezentacji słuchowej.
    2. W 6 próbach prezentuj sam bodziec tonowy (bodziec warunkowany) przez 10 sekund.
    3. W pozostałych 6 próbach prezentuj sam biały szum (niesparowany bodziec) przez 10 sekund.
  5. Zrównoważ bodźce, kończąc badanie drugim zestawem szczurów, które odbierają biały szum jako bodziec warunkowany, a ton jako bodziec niesparowany.

5. Procedura farmakologiczna i behawioralna

  1. Włącz zasilanie aparatu behawioralnego i załaduj kod Med-PC do odpowiedniej sesji behawioralnej. Podłącz i zaprogramuj aparaturę behawioralną w taki sposób, aby wentylatory zamontowane na szafach tłumiących dźwięk włączały się po włączeniu zasilania.
  2. Aby przygotować roztwór N-tlenku klozapiny (CNO) o stężeniu 1 mg/ml, należy odważyć 5,0 mg CNO do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 5 ml jałowej wody lub 5 ml jałowego 0,9% roztworu soli fizjologicznej. Wirować, aż roztwór będzie klarowny.
    1. Jeśli CNO nie rozpuszcza się w roztworze lub jeśli pożądane są bardziej stężone roztwory CNO, dodaj środek rozpuszczający, taki jak DMSO23. W szczególności, aby przygotować roztwór 1 mg/ml CNO z 0,5% DMSO, odważyć 5,0 mg CNO i dodać 25 μl DMSO do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie potrząśnij, upewniając się, że zawartość pozostała u podstawy tuby. Gdy roztwór stanie się klarowny, dodaj 5 ml sterylnej wody lub 5 ml sterylnego 0,9% soli fizjologicznej. Dalsze instrukcje dotyczące przygotowania rozwiązań CNO są dostępne na stronie25 zasobów wiki DREADD.
    2. Przygotuj nowy roztwór CNO każdego dnia, w którym jest podawany.
  3. Wstrzykiwać CNO dootrzewnowo w dawce 1 mg/kg mc. około 30 minut przed testami behawioralnymi. Na przykład należy wstrzyknąć szczurowi o masie 200 g 0,2 ml roztworu CNO o stężeniu 1 mg/ml. Dawka i czas podawania CNO zostały dobrane na podstawie wcześniej opublikowanych doniesień2,12.
    1. Wstrzyknąć CNO 30 minut przed każdą sesją kondycjonowania wstępnego (Faza 1; łącznie 4 dni wstrzyknięć), ale podawać pojazd przed wszystkimi kolejnymi sesjami behawioralnymi.
  4. Po 30 minutach umieść szczury w komorach do testów behawioralnych i zainicjuj kod komputerowy do odpowiedniej sesji behawioralnej.
  5. Po zakończeniu zadania behawioralnego natychmiast usuń szczury z komór i zwróć szczury do kolonii zwierząt.

6. Analizy danych behawioralnych

Uwaga: Zmienną zależną dla wszystkich sesji behawioralnych jest czas, w którym głowa szczura znajduje się w kubku z jedzeniem, wykryty przez przerwanie działania fotokomórek podczerwieni w kubku z jedzeniem. Dane (w sekundach) są gromadzone i rejestrowane przez oprogramowanie komputerowe.

  1. Nie należy przeprowadzać analiz danych wygenerowanych podczas fazy kondycjonowania wstępnego.
  2. W przypadku sesji kondycjonowania: przeanalizuj zdolność każdego szczura do uczenia się skojarzeń z lekkim jedzeniem, porównując zachowanie kubka z jedzeniem podczas prezentacji bodźca wizualnego w 5 sesjach behawioralnych. W szczególności oblicz średni czas spędzony w kubku z jedzeniem podczas 5-sekundowej epoki światła dla każdej z 8 prób/sesję (tj. średnio 8 prób, z których każda trwa 5 sekund na szczura). Porównaj średnie wartości kontrolne i eksperymentalne dla każdej z 5 codziennych sesji (patrz Rysunek 3A).
    1. Przeanalizuj motywację szczurów do uzyskania nagrody w postaci jedzenia, porównując zachowanie kubka z jedzeniem podczas dostarczania nagrody w postaci jedzenia (epoka 5 sekund) w 5 sesjach behawioralnych, używając tych samych obliczeń, jak określono dla 5-sekundowej epoki światła powyżej. Wartości te będą konsekwentnie wyższe niż te uzyskane podczas prezentacji bodźca wzrokowego (patrz ryc. 3B).
  3. Dla sesji testowej: oblicz współczynnik dyskryminacji, który opisuje zachowanie szczurów w kubku z jedzeniem w odpowiedzi na prezentacje każdego bodźca słuchowego.
    1. W szczególności dla każdego szczura podziel średni czas spędzony w kubku z jedzeniem po każdej z 6 prezentacji bodźca uwarunkowanego sensorycznie (tj. tonu) przez sumę średniego czasu spędzonego w kubku z jedzeniem po każdej z 6 prezentacji bodźca warunkowanego sensorycznie (tj. bodźca tonalnego) plus średni czas spędzony w kubku z jedzeniem po każdej z 6 prezentacji bodźca niesparowanego (tj. bodziec białego szumu). Każda epoka trwa 10 sekund.
      Uwaga: Wynik dyskryminacji wynoszący 0,5 lub więcej pokazuje, że szczury nauczyły się skojarzeń nieodłącznie związanych z paradygmatem wstępnego warunkowania sensorycznego.

7. Weryfikacja umiejscowienia i wyrażenia AAV

  1. Znieczulić i perfuzję przeskórnie szczurów przy użyciu 4% paraformaldehydu. Ze względu na stosowanie etykiet fluorescencyjnych nie należy przekraczać czasu po utrwaleniu wynoszącego 2 godziny, aby zminimalizować utratę antygenowości i zachować sygnał fluorescencyjny.
  2. Odwodnić perfuzję mózgu, przenosząc je do słoika na mózg zawierającego 30 ml 20% roztworu sacharozy w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (1x) przez co najmniej 2 dni lub do momentu, gdy mózg opadnie na dno słoika mózgowego.
  3. Użyj zamrażającego mikrotomu przesuwnego, aby wykonać koronalne odcinki mózgu (20-40 μm) w całym obszarze ogonowym obszaru zainteresowania.
  4. Przeprowadzić immunohistochemię skierowaną przeciwko znakowanemu receptorowi lub białku reporterowemu, aby ustalić lokalizację i ekspresję receptora projektanta i/lub receptora reporterowego12. Protokół barwienia immunohistochemicznego znajduje się na stronie25 zasobu wiki DREADD.
  5. Zamontuj sekcje na szkiełkach superfrost-plus i szkiełku nakrywkowym za pomocą 100-200 μl wodnego medium montażowego.
  6. Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną na tkance mózgowej, aby zweryfikować rozmieszczenie AAV i ekspresję białka12,24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wyniki behawioralne

Po zakończeniu eksperymentu, skuteczność czasowej inaktywacji specyficznej dla regionu powinna być oceniona ilościowo i jakościowo. Prezentowany przykład obejmuje 3-fazowy paradygmat behawioralny (wstępne warunkowanie sensoryczne), w którym CNO podawano w celu osłabienia aktywności neuronalnej w RSC podczas sesji warunkowania wstępnego w celu przetestowania hipotezy, że RSC jest niezbędny do tworzenia skojarzeń między neutralnymi bodźcami12. Co ważne, eksperymentato...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje, w jaki sposób zastosować podejście farmakogenetyczne (DREADD) w celu zbadania, w jaki sposób określony region mózgu przyczynia się do wielofazowego, złożonego zadania uczenia się. Dzięki możliwości tymczasowego i zdalnego wyciszania aktywności neuronalnej w dyskretnych regionach mózgu we wszystkich fazach uczenia się, ta kombinacja podejść zapewnia platformę do badania szerokiego zakresu zachowań, w tym bardziej zniuansowanych lub zamaskowanych form uczenia się. W przykładzie opisanym w tym protokol...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy autorom Robinson et al.12 za ich wkład w powstanie rękopisu, na podstawie którego częściowo powstał niniejszy protokół.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Samiec, długie szczury Evans, 55-60 dniHilltop Lab Animals Inc
rAAV8 / hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrineVirus Vector CoreUwaga: Jest to rdzeń
wektorarAAV8 / hSyn-GFPBSL-1 Uwaga: Jest to związek BSL-1
N-tlenek klozapinyR& D Systems4936-10dla narkotyków
(poliwęglan)Alternatywny projekt FT 8XL-PCSłuży do przykrywania klatek dla zwierząt 48-72 godziny po infuzji
Bibuła filtracyjna (zamiennik)Alternatywna konstrukcjaFP-R-1018XADBibuła filtracyjna, która pasuje do pokryw klatek
Imadło stołoweJETS2201-265Do przechowywania probówek mikroscentrifugowych zawierających AAV w kapturze
Worki na śmieci BiohazardZszywki113444Wkładki Medline Biohazard
Kosz na śmieci BiohazardUnited Solutions 34-galonowy prostokątny kosz na śmieci na kółkach z haczykiem i uchwytem zamka
Isoflurane, 100 mlPatterson Veterinary Supply Inc.07-890-8540Anestezjologiczny
Podwójny stereotaktyczny dla małych zwierząt z konsolą odczytu z cyfrowym wyświetlaczemDavid KopfModel 942Sprzęt chirurgiczny
Niepękające nauszniki uszne, zestaw 2 sztuk (szczur)David KopfModel 955Sprzęt chirurgiczny
Maska anestezjologiczna (szczur)David KopfModel 906Sprzęt
chirurgicznySzybkobieżna wiertarka stereotaktyczna zawiera sterownik silnika stołowego, pedał nożny, rękojeść, stereotaktyczny uchwyt rękojeściDavid KopfModel 1474Sprzęt chirurgiczny
Frezy do mikrowierteł, 0,9 mmFine Science Tools Inc19007-09Zaopatrzenie chirurgiczne
Automatyczna pompa strzykawkowa ze sterownikiem micro4David KopfModel UMP3-1Sprzęt chirurgiczny
Odłączane ostrze ceramiczne Pro-animal zestaw maszynki do strzyżeniaAhdis21420Zaopatrzenie chirurgiczne
Betadine środek do oczyszczania skóryPerdue Products L.P67618-149-04Zaopatrzenie chirurgiczne
Maść z potrójnym antybiotykiemMedline Supply53329-087-01Zaopatrzenie chirurgiczne
Maść weterynaryjna PuralubeTylko zaopatrzenie weterynaryjne17033-211-38Zaopatrzenie chirurgiczne
Dino-liteAD7013MTLAlternatywa dla tradycyjnej lunety sekcyjnej
Dino-lite sztywny stojak na wysięgnik stołowyMikroskopMS36BSprzęt chirurgiczny
28 G 10 μ l strzykawkaHamilton80308-701SNSprzęt chirurgiczny
Bardzo wysoka kabina dźwiękochłonna MDFMed Associates, IncENV-018MD22' szer. x 22" wys. x 16" gł
Bardzo wysoka modułowa komoratestowa Med Associates, IncENV-007Sprzęt behawioralny
Podłoga z siatki ze stali nierdzewnejMed Associates, IncENV-005Sprzęt
behawioralnyOświetlenie domoweMed Associates, IncENV-215MUżywane jako światło domowe i bodźce
Modułowy dozownikpelletu Med Associates, IncENV-203M-45Sprzęt behawioralny
Pojemnik na pelety, typ kubkaMed Associates, IncENV-200R1MSprzęt behawioralny
Detektor wejścia głowy dla szczuraMed Associates, IncENV-254-CBSprzęt behawioralny
Bezpyłowe precyzyjne granulki spożywcze, 45 mgBio-ServF0165Zasilanie behawioralne
Głośnik klatkowy do komory dlaszczurów Med Associates, IncENV-224AMSprzęt behawioralny
Programowalny generator audioMed Associates, IncANL-926Sprzęt behawioralny
Smart ctrl 8 wejść/16 wyjśćMed Associates, IncDIG-716P2Sprzęt behawioralny
Duża szafka stołowa i zasilaczMed Associates, IncSG-6510DSprzęt behawioralny
Pakiet interfejsu PCIMed Associates, IncDIG-700P2-R2Sprzęt behawioralny
MED Pakiet komputerowy Intel Core z monitorem X Pro 19"Med Associates, IncCOM-103VSprzęt behawioralny
Paraformaldehyd (grannularny), 1 kgMikrosopia elektronowa Nauki19210Zagrożenie: rakotwórcze, ważenie w kapturze
Przeciwciało monoklonalne królika (HA-Tag)Technologie sygnalizacji komórkowej3724SOdczynnik histologiczny
XP Przeciwciało monoklonalne królika (GFP)Technologie sygnalizacji komórkowej2956SOdczynnik histologiczny
Technologie sygnalizacji komórkowejIgG Anty-królicze Technologie4412SHistologia dostarcza
slajdy Superfrost plusVWR international483111-703Materiały histologiczne
wirusa ze związkiem Wieko klatki dla szczurów Amazon.com Mikroskop. sygnalizacji komórkowej

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G-protein coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  2. Urban, D. J., Roth, B. L. DREADDs (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs): Chemogenetic tools with therapeutic utility. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 55, 399-417 (2015).
  3. Weiner, D. M. The role of M1 muscarinic receptor agonism of N-desmethylclozapine in the unique clinical effects of clozapine. Psychopharm. (Berl. 177 (1-2), 1-2 (2004).
  4. Cohen, N. J., Memory Eichenbaum, H. amnesia and the hippocampal system. , MIT Press. Cambridge, MA. (1993).
  5. Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network). Nat. Rev. Neurosci. 10 (4), 272-282 (2009).
  6. Agster, K. L., Burwell, R. D. Cortical efferents of the perirhinal, postrhinal and entorhinal cortices of the rat. Hippocampus. 19 (12), 1159-1186 (2009).
  7. Aggleton, J. P. Multiple anatomical systems embedded within the primate medial temporal lobe: implications for hippocampal function. Neurosci. Biobehav. Rev. 36, 1579-1596 (2012).
  8. Robinson, S., Poorman, C. E., Marder, T. J., Bucci, D. J. Identification of functional circuitry between retrosplenial and postrhinal cortices during fear conditioning. J. Neurosci. 32 (35), 12076-12086 (2012).
  9. Bucci, D. J., Saddoris, M. P., Burwell, R. D. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24 (15), 3826-3836 (2004).
  10. Kaut, K. P., Bunsey, M. D. The effects of lesions to the rat hippocampus or rhinal cortex on olfactory and spatial memory: retrograde and anterograde findings. Cogn. Affect. Behav. Neurosci. 1 (3), 270-286 (2001).
  11. Brogden, W. J. Sensory preconditioning. J. Exp. Psychol. 25, 323-332 (1939).
  12. Robinson, S. Chemogenetic silencing of neurons in retrosplenial cortex disrupts sensory preconditioning. J. Neurosci. 34 (33), 10982-10988 (2014).
  13. NIH guidelines for research involving recombinant or synthetic nucleic acid molecules. Available from: http://oba.od.nih.gov/rdna/nih_guidelines_oba.html. , (2013).
  14. Samulski, R. J., Muzyczka, N. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annu. Rev. Virol. 1, 427-451 (2014).
  15. Tenenbaum, L., Lehtonen, E., Monahan, P. E. Evaluation of risks related to the use of adeno-associated virus-based vectors. Gene Ther. 3, 545-565 (2003).
  16. Arechavaleta-Velasco, F., Ma, Y., Zhang, J., McGrath, C. M., Parry, S. Adeno-associated virus-2 (AAV-2) causes trophoblast dysfunction, and placental AAV-2 infection is associated with preeclampsia. Am J Path. 168 (6), 1951-1959 (2006).
  17. Erles, K., Rohde, V., Thaele, M., Roth, S., Edler, L., Schlehofer, J. R. DNA of adeno-associated virus (AAV) in testicular tissue and in abnormal semen samples. Hum. Reprod. 16 (11), 2333-2337 (2001).
  18. Donsante, A. AAV vector integration sites in mouse hepatocellular carcinoma. Science. 317 (5837), 477-47 (2007).
  19. Donsante, A. Observed incidence of tumorigenesis in long-term rodent studies of rAAV vectors. Gene Ther. 8 (17), 1343-1346 (2001).
  20. Wu, K. Enhanced expression of Pctk1, Tcf12 and Ccnd in hippocampus of rats: impact on cognitive function, synaptic plasticity and. 97 (1), 69-80 (2011).
  21. National Academy Press. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. National Academy Press. , Washington, DC. (1996).
  22. Lowery, R. L., Majewska, A. K. Intracranial injection of adeno-associated viral vectors. J. Vis. Exp. (45), (2010).
  23. Cavaletti, G. Effect in the peripheral nervous system of systemically administered dimethylsulfoxide in the rat: a neurophysiological and pathological. 119 (1-2), 1-2 (2000).
  24. Parnaudeau, S., et al. Mediodorsal thalamus hypofunction impairs flexible goal-directed behavior. Biol. Psychiatry. 77 (5), 445-453 (2014).
  25. wiki, D. R. E. A. D. D. , Available from: http://www.dreadd.org (2014).
  26. Ferguson, S. M., Phillips, P. E. M., Roth, B. L., Wess, J., Neumaier, J. F. Direct-pathway striatal neurons regulate the retention of decision-making strategies. J. Neurosci. 33 (28), 11668-11676 (2013).
  27. Cassatarro, D. Reverse pharmacogenetic modulation of the nucleus accumbens reduces ethanol consumption in a limited access paradigm. Neuropsychopharm. 39, 283-290 (2014).
  28. Krashes, M. J., Shah, B. P., Koda, S., Lowell, B. B. Rapid versus delayed stimulation of feeding by the endogenously released AgRP neuron mediators. GABA, NPY and AgRP. Cell Metab. 18 (4), 588-595 (2014).
  29. Gage, F. H., Bjorklund, A., Stenevi, U., Dunnett, S. B. Functional correlates of compensatory collateral sprouting by aminergic and cholinergic afferents in the hippocampal formation. Brain Res. 268 (1), 39-47 (1983).
  30. Nelson, R. J., Young, K. A. Behavior in mice with targeted disruption of single genes. Neurosci. Biobehav. Rev. 22 (3), 453-462 (1998).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Projektowane receptorywyciszanie chemogenetyczneprekondycjonowanie sensorycznedostarczanie za pomoc wirus wN tlenek klozapinymikroskopia immunofluorescencyjnainfuzja stereotaktycznaneuronauka behawioralnawyciszanie aktywno ci neuronalnejwirus towarzysz cy adenowirusom

Powiązane artykuły