Artykuł metodologiczny

Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu

13K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52862

⸱

11 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular and Vascular Biology, Department of Cardiovascular Sciences, KU Leuven

W tym artykule

Podsumowanie

Aby zbadać interakcję bakterii z naczyniami krwionośnymi pod wpływem naprężeń ścinających, opisano komorę przepływową oraz model mikroskopii przyżyciowej in vivo, które pozwalają na analizę czynników bakteryjnych i gospodarza przyczyniających się do adhezji naczyniowej.

Streszczenie

Aby wywołać infekcje wewnątrznaczyniowe i infekcyjne zapalenie wsierdzia, bakterie muszą być w stanie przylegać do ściany naczynia, będąc jednocześnie narażone na stres ścinający płynącej krwi.

Aby zidentyfikować czynniki bakteryjne i gospodarza, które przyczyniają się do adhezji naczyniowej mikroorganizmów, potrzebne są odpowiednie modele, które badają te interakcje w fizjologicznych warunkach ścinania. W tym miejscu opisujemy model komory przepływowej in vitro, który pozwala badać adhezję bakterii do różnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej lub do komórek śródbłonka, oraz model mikroskopii przyżyciowej, który został opracowany w celu bezpośredniej wizualizacji początkowej adhezji bakterii do krążenia splanchnicznego in vivo. Metody te można wykorzystać do identyfikacji czynników bakteryjnych i gospodarza wymaganych do adhezji bakterii pod przepływem. Ilustrujemy znaczenie naprężenia ścinającego i rolę czynnika von Willebranda dla adhezji Staphylococcus aureus zarówno za pomocą modelu in vitro, jak i in vivo.

Wprowadzenie

Aby wywołać infekcje wewnątrznaczyniowe, patogeny wymagają mechanizmu przylegającego do śródbłonka, który wyściela ścianę naczynia i wewnętrzną powierzchnię serca, oraz do utrzymywania się i tworzenia infekcji pomimo narażenia na stres ścinający szybko płynącej krwi. Najczęstszym patogenem powodującym zagrażające życiu zakażenia wewnątrznaczyniowe i infekcyjne zapalenie wsierdzia jest Staphylococcus aureus (S. aureus)1.

Różne bakteryjne cząsteczki adhezji pośredniczą w adhezji do tkanki gospodarza poprzez interakcję z komponentami macierzy zewnątrzkomórkowej. Te MSCRAMM (mikrobiologiczne składniki powierzchni rozpoznające cząsteczki macierzy adhezyjnej) rozpoznają cząsteczki takie jak fibronektyna, fibrynogen, kolagen i czynnik von Willebranda (VWF). MSCRAMM są ważnymi czynnikami wirulencji S. aureus i biorą udział w kolonizacji i inwazji gospodarza2. Większość badań nad tymi czynnikami wirulencji przeprowadzono w warunkach statycznych, a zatem mogą nie być reprezentatywne dla zakażeń u ludzi, w których początkowa adhezja bakterii występuje w przepływającej krwi.

W przypadku infekcji krwi, bakterie muszą pokonać siły ścinające płynącej krwi, aby przyczepić się do ściany naczynia. Szczególnie interesujące są zatem modele, które badają interakcję między bakteriami a śródbłonkiem lub podśródbłonkiem w warunkach przepływu.

Niedawne badanie wykazało, że adhezja S. aureus do naczyń krwionośnych pod wpływem naprężeń ścinających jest pośredniczona przez VWF3. VWF, białko operacyjne naprężeń ścinających, jest uwalniane z komórek śródbłonka po aktywacji. Krążący VWF wiąże się z włóknami kolagenowymi odsłoniętej macierzy podśródbłonkowej. Nasza grupa poinformowała, że białko wiążące czynnik von Willebranda (vWbp) S. aureus ma kluczowe znaczenie dla adhezji do VWF4 za pośrednictwem ścinania.

W tym artykule prezentujemy model komory przepływowej in vitro, w którym można ocenić adhezję bakterii do różnych składników macierzy zewnątrzkomórkowej lub do komórek śródbłonka. Aby zweryfikować wyniki z danych in vitro, opracowaliśmy model in vivo, który wizualizuje i określa ilościowo bezpośrednią interakcję bakterii ze ścianą naczynia oraz tworzenie skrzeplin bakteryjno-płytkowych w krążeniu krezkowym myszy, przy użyciu mikroskopii naczyniowej w czasie rzeczywistym.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny KU Leuven.

1. Przygotowanie bakterii do perfuzji in vitro i eksperymentów in vivo

  1. Użyliśmy szczepu S. aureus Newman do wszystkich eksperymentów opisanych w tym manuskrypcie. S. aureus (złocist) Newman był przechowywany w Brain Heart Infusion (BHI) z 10% glicerolem w temperaturze -80 °C.
  2. Za pomocą sterylnej pętli zeskrobać zamrożone bakterie i zaszczepić w 5 ml tryptycznego bulionu sojowego (TSB) O/N w temperaturze 37 °C (OD600 >3).
  3. Umyć bakterie przez odwirowanie (2 600 g, RT, 5 min) i ponownie zawiesić osad bakteryjny w 5 ml PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).
  4. Przygotować roztwór 1 mg/ml estru N-hydroksysukcynimidylu 5(6)-karboksysukcynimidylu (karboksyl-fluoresceiny) w etanolu. Rozcieńczyć roztwór karboksyfluoresceiny o stężeniu 150 μg/ml w wodzie o czystości laboratoryjnej (np. wodzie MilliQ). Chronić probówki przed światłem folią aluminiową i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Odwirować bakterie (2 600 x g, RT, 5 min). Zawiesić osad bakteryjny w 800 μl PBS i dodać 200 μl (końcowe stężenie 30 μg/ml w przypadku doświadczeń perfuzyjnych) lub 400 μl (końcowe stężenie 50 μg/ml w przypadku doświadczeń in vivo) roztworu karboksyfluoresceiny w 150 μg/ml. Chronić probówki przed światłem folią aluminiową i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.
  6. Po znakowaniu zablokować 6% roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS.
  7. Rozcieńczyć bakterie za pomocą densytometrii optycznej (OD), OD600 0,65 dla doświadczeń in vitro (co odpowiada około 3 x 108 jednostek tworzących kolonie (CFU)/ml dla S. aureus) i OD600 wynoszącej 1,8 dla eksperymentów in vivo (odpowiadającej około 1 x 109 CFU/ml dla S. aureus) w PBS. Chroń probówki przed światłem folią aluminiową i pozostaw na lodzie.

2. Eksperymenty perfuzji in vitro

  1. Powlekanie szkiełek nakrywkowych szkła
    1. Rozcieńczyć czynnik von Willebranda (VWF) (hemat P, stężenie podstawowe 2 400 μg/ml) w wodzie laboratoryjnej (dejonizowanej destylowanej) do końcowego stężenia 50 μg/ml.
    2. Rozcieńczyć kolagen w izotonicznym roztworze glukozy (roztwór SKF, pH 2,7-2,9, zgodnie z dostarczeniem producenta) do końcowego stężenia 160 μg/ml.
    3. Szkiełka nakrywkowe (24 × 50 mm) pokryć VWF lub kolagenem, upuszczając 200 μl powłoki na parafolię i umieszczając szkiełko nakrywkowe na wierzchu kropli. Kropla rozprzestrzeni się po powierzchni szkiełka nakrywkowego.
    4. Inkubować szkiełko nakrywkowe w nawilżonym pojemniku przez 4 godziny w temperaturze pokojowej. Ostrożnie podnieść szkiełka nakrywkowe z parafilmu igłą. Zamontuj szkiełko nakrywkowe w dolnej części komory przepływowej.
  2. Powlekanie szkiełek plastikowych komórkami śródbłonka
    1. Pokryj plastikowe zrazy (1-dołkowa komora do hodowli komórkowych PCA, Sarstedt, Niemcy) 1 ml 1% roztworu żelatyny w PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37°C. Wysiewaj ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) na pokrytych żelatyną plastikowych szkiełkach i hoduj je do 70-80% zlewności. Zamontuj plastikową folię w dolnej części komory przepływowej.
  3. Eksperyment perfuzyjny
    UWAGA: Schematyczny przegląd modelu perfuzji in vitro przedstawiono na rysunku 1.
    1. Przeprowadzić badania adhezji bakteryjnej in vitro w mikrorównoległej komorze przepływowej przy laminarnym naprężeniu ścinającym między 2,5 dyn/cm2 a 20 dyn/cm2, aby symulować różne fizjologiczne warunki przepływu.
    2. Komora przepływowa (konstrukcja wewnętrzna) składa się z metalowej ramy i komory perfuzyjnej wykonanej z pleksiglasu (poli(metylo)metakrylanu (PMMA)). Podłączając go do pompy infuzyjnej o wysokiej dokładności (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA), możemy generować natężenia przepływu w zakresie od 0,0001 μl/min do 220,82 ml/min.
    3. Podłącz rurkę do górnej części komory przepływowej i wstrzyknij medium do rurki. Delikatnie umieść górną część komory przepływowej na górze dolnej części i zmontuj komorę przepływową. Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Wstrzyknąć 1 ml pożywki przez komorę, aby upewnić się, że komora nie przecieka i usunąć nadmiar roztworu powlekającego. Unikaj pęcherzyków powietrza.
    4. Umieść mysz na termoaktywnej poduszce grzewczej w temperaturze 37 °C na tacy mikroskopu. Ponieważ jest to procedura terminalna, nie ma potrzeby stosowania ścisłych procedur sceptycznych. Wykonaj nacięcie w pobliżu żyły szyjnej, delikatnie usuń prawą stronę mięśnia szyjnego i odizoluj żyłę szyjną od otaczającej tkanki.
    5. Ustawić pompę infuzyjną i mikroskop fluorescencyjny. Ustawienia pompy infuzyjnej zależą od średnicy strzykawki i pożądanego natężenia przepływu (patrz punkt 2.4). Od teraz pracuj w ciemnym pokoju.
    6. Powłoka VWF:
      1. Napełnij strzykawkę bakteriami znakowanymi fluorescencyjnie i podłącz ją do rurki wlotowej. Unikaj pęcherzyków powietrza. Uruchomić pompę infuzyjną na 10 minut. Czas infuzji zależy od szybkości ścinania i użytej powłoki, bakterii i podłoża i powinien reprezentować stały stan przyczepności.
      2. Po 10 minutach zmyć niezwiązane bakterie, podłączając strzykawkę z PBS do rurki wlotowej i uruchamiając pompę infuzyjną.
      3. Zrób co najmniej 15 zdjęć lub filmów w różnych miejscach po procesie prania. Bakterie są małe i potencjalnie trudno się na nich skupić. Przed eksperymentem przepływu in vitro można uzyskać odpowiednią płaszczyznę ogniskowej, umieszczając kroplę fluorescencyjnie znakowanych bakterii na szkiełku nakrywkowym i umieszczając szkiełko nakrywkowe w komorze przepływowej. Następnie wyszukaj odpowiednią płaszczyznę ogniskowej i zapisz ustawienia.
        UWAGA: Podczas eksperymentu przepływu in vitro, przechwytywanie obrazów podczas etapu mycia (± 5 minut po rozpoczęciu) zapewnia, że wychwytywany jest tylko sygnał dla przylegających bakterii.
    7. Powłoka kolagenowa:
      1. Dodać 60 μg/ml VWF do znakowanych fluorescencyjnie bakterii tuż przed rozpoczęciem perfuzji. Napełnić strzykawkę bakteriami znakowanymi fluorescencyjnie lub bakteriami znakowanymi fluorescencyjnie uzupełnionymi 60 μg/ml VWF i podłączyć ją do rurki wlotowej. Unikaj pęcherzyków powietrza. Powtórz kroki od 2.3.5.2 do 2.3.5.3
    8. Komórki śródbłonka:
      1. Aktywować komórki śródbłonka przez perfuzję 0,1 mM roztworem Ca2+-jonoforu A23187 (roztwór podstawowy 10 mM rozpuszczony w dimetylosulfotlenku (DMSO)) w DMEM przy tej samej szybkości ścinania co perfuzja bakteryjna przez 10 minut przez perfuzję z 0,1 mM. Powtórz kroki od 2.3.5.2 do 2.3.5.3.
  4. Oblicz szybkość ścinania i naprężenie ścinające w następujący sposób.
    Szybkość ścinania = 6Q/wh2
    Gdzie: Q: natężenie przepływu w ml/min, w: szerokość w cm, h: wysokość w cm
    Naprężenie ścinające (τ) = szybkość ścinania x lepkość (μ)
    Gdzie μ: średnie: 0,01 dyn x s/cm2, krew pełna: 0,04 dyn x s/cm2
     
  5. Analiza obrazu
    1. Uzyskaj obrazy na żywo za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z czarno-białą kamerą i wywołaj za pomocą oprogramowania do obrazowania. Użyj czasu naświetlania 1.5 sekundy. Wykonaj wiele zdjęć (co najmniej 15) losowo rozmieszczonych na powlekanej powierzchni komory przepływowej i zapisz je w odpowiednim formacie pliku.
    2. Przeprowadzanie analizy obrazu za pomocą narzędzia ImageJ. Odejmij tło, aby usunąć gładkie, ciągłe tła z obrazu (Proces – Odejmij tło) i zdefiniuj próg, aby ustawić dolne i górne wartości progowe, dzieląc obrazy w skali szarości na interesujące obiekty. Zmierz obszar ograniczony do progu.
    3. Porównaj adhezję bakteryjną, wyrażoną jako powierzchnia fluorescencyjna, np. za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej. Porównaj grupy, korzystając z jednoczynnikowego testu ANOVA lub dwustronnego testu t-Studenta. Należy podać wszystkie wartości jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Rozważmy, że wartość p <0,05 jest istotna (* p <0,05; ** p <0,01; *** p <0,001).

3. Model perfuzji krezki in vivo

  1. Przygotowanie/zabieg chirurgiczny myszy
    1. Pościć mysz w noc poprzedzającą eksperyment, aby ograniczyć wypróżnienia.
    2. Podać 6-8 tygodniowej myszy (C57Bl/6) przedoperacyjne znieczulenie poprzez podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,1 mg/kg masy ciała)) 20-30 minut przed zabiegiem.
    3. Znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (125 mg/kg m.c.) i ksylazyny (12,5 mg/kg m.c.). Sprawdź za pomocą odruchu pedału. Zastosuj maść weterynaryjną, aby zapobiec wysuszeniu.
    4. Umieść mysz na termoaktywnej poduszce grzewczej w temperaturze 37 °C na tacy mikroskopu. Ponieważ jest to procedura terminalna, nie ma potrzeby stosowania ścisłych procedur sceptycznych. Wykonaj nacięcie w pobliżu żyły szyjnej, delikatnie usuń prawą stronę mięśnia szyjnego i odizoluj żyłę szyjną od otaczającej tkanki.  
    5. Wprowadzić 2 francuskie cewniki dożylne do prawej żyły szyjnej w celu infuzji fluorescencyjnie znakowanych bakterii lub innych roztworów. Otwórz jamę otrzewnej przez nacięcie brzucha w linii środkowej i użyj bawełnianych wacików, aby rozprowadzić krezkę i uwidocznić tętniczkę krezkową i krążenie komorowe.
    6. Umieść mysz po prawej stronie na przezroczystej płytce i zabezpiecz kaniulę taśmą. Użyj gorącego okładu, aby zapobiec hipotermii. Aby zapobiec odwodnieniu tkanki, upuść 500 μl 0,9% NaCl na jelita.
  2. Mikroskopia fluorescencyjna adhezji bakteryjnej do krążenia krezkowego
    1. Praca w ciemnym pokoju. Użyj bawełnianych wacików, aby unieruchomić naczynia i uwidocznić je pod odwróconym mikroskopem.
    2. Stosować miejscowo 5 μl 10 mM roztworu Ca2+-jonoforu A23187 rozpuszczonego w DMSO. Po 10 sekundach wstrzyknąć 100 μl znakowanych bakterii (patrz krok 1) przez cewnik szyjny. Zrób zdjęcia poklatkowe. Po zakończeniu eksperymentu poddaj mysz eutanazji zgodnie z zatwierdzonymi przez instytucję wytycznymi.
  3. Analiza obrazu
    1. Uzyskaj obrazy na żywo za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, uchwycone za pomocą czarno-białej kamery i opracowane przy użyciu dowolnego oprogramowania do obrazowania. Zastosuj zautomatyzowaną optymalizację czasu ekspozycji i kontrastu specyficzną dla używanego sprzętu.
    2. Uzyskuj obrazy poklatkowe za pomocą narzędzia "Akwizycja" na pasku narzędzi (Akwizycja wielowymiarowa – Czas) przy użyciu 40 cykli po 1,000 obrazów/sek. Zapisz obrazy w odpowiednim formacie pliku obrazu.
    3. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania do analizy ImageJ w celu pomiaru obszaru sygnału fluorescencyjnego na obrazie. Zdefiniuj próg, aby ustawić dolną i górną wartość progową, segmentując obrazy w skali szarości na interesujące obiekty. Zidentyfikuj obszar zainteresowania (naczynie krwionośne) i zmierz obszar ograniczony do progu i obszaru zainteresowania. Porównaj adhezję bakteryjną, wyrażoną jako powierzchnia fluorescencyjna, za pomocą dowolnego oprogramowania statystycznego lub graficznego.

Wyniki

S. aureus adhezja do VWF, macierzy podśródbłonowej i komórek śródbłonka jest zjawiskiem zależnym od naprężenia ścinającego

Aby podkreślić rolę naprężenia ścinającego w oddziaływaniu między S. aureus a VWF, przeprowadzono perfuzje nad szkiełkami kryjącymi powlekanymi VWF przy różnych szybkościach ścinania (schematyczny przegląd modelu perfuzji in vitro przedstawiono na Rysunku 1). Adhezja S. aureus do VWF wzrastała wraz ze wzrostem szybkości ścinania od 250 sec-1 do 2,000 sec-1 (Rysunek 2), co wskazuje, że wysokie siły ścinania nie hamują, lecz wzmacniają adhezję bakterii do VWF.

Aby zbadać wpływ VWF na adhezję bakterii do kolagenu, głównego składnika macierzy podśródbłonowej, przeprowadzono perfuzję fluorescencyjnie znakowanych S. aureus przez kolagen w obecności lub w nieobecności VWF. W przypadku braku VWF adhezja S. aureus do kolagenu zmniejszała się wraz ze wzrostem szybkości ścinania. Jednakże, gdy w medium obecny był VWF, adhezja S. aureus rosła wraz ze wzrostem szybkości ścinania (Rysunek 3).

Model przepływu in vitro pozwala nam również badać adhezję bakterii do komórek śródbłonka w warunkach przepływu. Przeprowadzono perfuzję HUVECs z użyciem fluorescencyjnie znakowanych S. aureus przy szybkościach ścinania od 500 do 2 000 sec-1. W wybranych przypadkach HUVECs aktywowano jonoforem Ca2+, aby wywołać uwalnianie VWF. Aktywacja komórek śródbłonka i następujące po niej uwalnianie VWF zwiększyły adhezję S. aureus (Rysunek 4A), które tworzyły typowe „nitkowate” wzory fluorescencyjnie znakowanych skupisk bakteryjnych ułożonych w kierunku siły ścinania (Rysunek 4B), co sugeruje wiązanie bakterii wzdłuż liniowo rozciągniętej cząsteczki VWF.

Wstępna adhezja bakteryjna in vivo w żyłach trzewnych jest mediowana przez VWF

Ponieważ S. aureus jest w stanie przylegać do VWF, wykorzystaliśmy myszy typu dzikiego (Vwf+/+) oraz myszy z niedoborem VWF (Vwf−/−), aby zbadać adhezję bakterii do aktywowanej ściany naczynia in vivo. Wideomikroskopia żył trzewnych w czasie rzeczywistym umożliwiła wizualizację in vivo krążących, znakowanych fluorescencyjnie S. aureus (Schematyczny przegląd modelu perfuzji in vivo przedstawiono na Rysunku 5).

Po farmakologicznej aktywacji śródbłonka jonoforem Ca2+ zaobserwowaliśmy szybką lokalną akumulację pojedynczych bakterii oraz agregatów bakteryjnych na ścianie naczynia myszy WT (filmy uzupełniające 1 i 2). Prawie nie stwierdzono adhezji bakterii na aktywowanej ścianie naczynia myszy z niedoborem Vwf (film uzupełniający 3) w porównaniu z adhezją u myszy WT (Rysunek 6). Brak VWF zmniejsza zdolność S. aureus do przylegania do aktywowanej ściany naczynia.

Schemat urządzenia mikrofluidycznego do sortowania komórek; obrazy mikroskopowe pokazują wyniki w kanale.
Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja modelu przepływu in vitro. Model przepływu in vitro jest modelem wielofunkcyjnym, który umożliwia badanie różnych mechanizmów zależnych od sił ścinania, takich jak adhezja bakterii do macierzy podśródbłonkowej, ale także tworzenie zakrzepów. Mikrokomora przepływu równoległego jest umieszczona na szkiełku nakrywce (plastikowym lub szklanym) z różnymi powłokami białek i komórek śródbłonka. Można analizować adhezję różnych bakterii (pomarańczowe i szare kropki) oraz oceniać wpływ obecności białek osocza, płytek krwi i krwi pełnej. Markery fluorescencyjne dla płytek krwi (niebieskie owale) lub fibrynogenu (niebieskie nici) mogą być stosowane w połączeniu z różnymi inhibitorami (czarne owale), aby rozróżnić czynniki bakteryjne i gospodarza. Przedstawiono reprezentatywne obrazy adhezji bakterii S. aureus do powłoki kolagenowej w obecności (na dole) lub w przypadku braku (na górze) VWF (pasek skali wynosi 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy adhezji bakteryjnej; adhezja względem szybkości ścinania (250-2000 s^-1); jednostki fluorescencji.
Rycina 2. Adhezja S. aureus do VWF wzrasta wraz ze wzrostem szybkości ścinania. Perfuzja w mikrokomorze przepływu równoległego nad warstwą VWF (50 µg/ml) z użyciem znakowanych fluorescencyjnie S. aureus Newman przy szybkościach ścinania od 250 do 2 000 sec-1 (sec-1) w medium (n >5). Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. *p <0,05, **p <0,01.

Wykres adhezji bakteryjnej; fluorescencja w funkcji szybkości ścinania; wpływ VWF na wykresie słupkowym.
Rysunek 3. Adhezja S. aureus do podścielenia śródbłonka zależy od sił ścinania i VWF. Perfuzja w mikrokomorze o przepływie równoległym nad powłoką kolagenową (160 µg/ml) z zastosowaniem fluorescencyjnie znakowanych S. aureus Newman przy szybkościach ścinania od 250 do 2 000 sec-1 w medium (n >5). VWF (60 µg/ml) był obecny w medium w miejscach zaznaczonych. Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. **p <0.01.

Wykres słupkowy adhezji bakteryjnej i obraz mikroskopowy porównujący stany aktywacji HUVEC w teście przepływowym.
Rysunek 4. Adhezja S. aureus do aktywowanych komórek śródbłonka jest zależna od sił ścinania. Perfusja w mikrokomorze o przepływie równoległym nad komórkami śródbłonka. (A) Ludzkie komórki śródbłonka pępka (HUVECs) aktywowano jonoforem Ca2+ A23187 (0,1 mM), po czym przeprowadzono 10-minutową perfuzję znakowanych fluorescencyjnie S. aureus Newman przy szybkościach ścinania od 500 do 2 000 sec-1 w medium (n >5). Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. *p <0,05. (B) Obraz z perfuzji w mikrokomorze o przepływie równoległym nad aktywowanymi HUVECs z S. aureus przy szybkości ścinania 1 000 sec-2. S. aureus tworzy łańcuchy o długości ok. 200 mikronów, co sugeruje adhezję do multimerów VWF (pasek skali to 100 µm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Farmakokinetyka, schemat procesu wstrzykiwania leku, dystrybucja naczyniowa, wynik analizy mikroskopowej.
Rysunek 5. Schematyczny przegląd modelu perfuzji krezowej in vivo. W prawą żyłę szyjną wprowadzono cewnik (żółta linia) do podawania bakterii znakowanych fluorescencyjnie (pomarańczowe kropki), dodatkowych środków znieczulających lub innych komponentów, takich jak inhibitory farmakologiczne i przeciwciała. Jama brzuszna została otwarta, a krezka rozpostarta, aby zwizualizować naczynia krwionośne (żylne i tętnicze) pod mikroskopem fluorescencyjnym. Po farmakologicznej aktywacji śródbłonka za pomocą jonoforu Ca2+, która indukuje uwalnianie VWF, bakterie mogą zostać wstrzyknięte przez cewnik żyły szyjnej. Wideomikroskopia wewnątrznaczyniowa w czasie rzeczywistym umożliwia wizualizację in vivo krążących bakterii znakowanych fluorescencyjnie oraz wynikającą z tego formację zakrzepów bakteryjno-płytkowych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy adhezji bakteryjnej; porównanie Vwf+/+ i Vwf-/-; analiza jednostek fluorescencji.
Rycina 6. Wstępna adhezja S. aureus do aktywowanego śródbłonia in vivo jest zapośredniczona przez VWF. In vivo model perfuzji żylnej krezki u myszy C57Bl/6-Vwf+/+ oraz C57Bl/6-Vwf-/- . Adhezja znakowanych fluorescencyjnie S. aureus do miejscowo aktywowanej ściany naczynia jest znacząco niższa u myszy Vwf-/-. Wszystkie wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. ***p <0.001, n >7.

Obraz mikroskopowy struktur komórkowych; mikrografia elektronowa pokazuje szczegółową organizację błon.
Wideo 1: Adhezja S. aureus do aktywowanej ściany naczyniowej w czasie rzeczywistym u myszy Vwf+/+. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.

Równowaga statyczna, diagram ΣFx=0, przedstawiający bilans sił w analizie układu mechanicznego.
Wideo 2: Formowanie agregatów i embolizacja S. aureus w czasie rzeczywistym u myszy Vwf+/+. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.

Obraz mikroskopowy struktury komórkowej; zastosowano mikroskopię w ciemnym polu w celu zwiększenia kontrastu wizualizacji.
Wideo 3: Adhezja S. aureus w czasie rzeczywistym do aktywowanej ściany naczynia u myszy Vwf-/-. Model perfuzji krezkowej in vivo z wykorzystaniem myszy Vwf+/+ oraz Vwf-/-. Do obszaru wizualizowanego łoża naczyniowego podano 5 µl jonofora Ca2+ (10 mM). Poprzez cewnik żylny wstrzyknięto zawiesinę S. aureus znakowaną karboksyfluoresceiną. Krążenie krezkowe wizualizowano pod mikroskopem odwróconym. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo.

Dyskusja

Naprężenie ścinające jest kluczowym czynnikiem dla wczesnej adhezji bakterii do ściany naczynia oraz dla późniejszego generowania wegetacji wewnątrznaczyniowej lub wsierdziowej i zakażeń przerzutowych4,5. Opisaliśmy komplementarne modele in vitro i in vivo do badania patogenezy zakażeń wewnątrznaczyniowych pod wpływem fizjologicznego stresu ścinającego. Modele te pozwoliły nam zidentyfikować białko wiążące czynnik von Willebranda (vWbp) jako główne białko S. aureus , które oddziałuje pod przepływem z uszkodzoną ścianą naczyniową, odsłaniając VWF4.

Zakażenia wewnątrznaczyniowe, a w szczególności infekcyjne zapalenie wsierdzia, budzą obawy nie tylko z powodu niewydolności narządów i śmierci wywołanej sepsą, ale także z powodu powikłań miejscowych i odległych ("przerzutowych"). Aby wywołać infekcyjne zapalenie wsierdzia i infekcje przerzutowe, bakterie muszą przylegać do ściany naczynia, a tym samym opierać się naprężeniom ścinającym płynącej krwi. Większość badań nad czynnikami wirulencji bakterii przeprowadzono w warunkach statycznych. Jednak te ustalone interakcje mogą nie wytrzymać sił ścinających, a badania w warunkach przepływu mogą ujawnić nowe, wcześniej nierozpoznane czynniki w interakcji bakteria-gospodarz.

Korzystając z komory z przepływem mikrorównoległym, my i inni wykazaliśmy znaczenie VWF dla adhezji naczyniowej. Pod wpływem naprężeń ścinających VWF stopniowo rozwija się ze swojej spoczynkowej struktury kulistej i odsłania domenę A1, która oddziałuje z płytkami krwi za pośrednictwem receptora GPIb6. Komory przepływowe są szeroko stosowane do badania funkcji płytek krwi7.

Co ciekawe, również adhezja S. aureus pod przepływem wymaga VWF, a w szczególności domeny A1, która jest odsłonięta przy ścinaniu. Zidentyfikowaliśmy vWbp, aby pośredniczyć w wiązaniu VWF. vWbp jest koagulazą, która przyczynia się do patofizjologii S. aureus poprzez aktywację protrombiny gospodarza. Stafylotrombina, powstały kompleks koagulazy bakteryjnej i protrombiny, przekształca fibrynogen w nierozpuszczalną fibrynę8,9. Nasze badania wykazały, że vWbp nie tylko aktywuje protrombinę, ale wyzwala tworzenie agregatów bakteryjno-fibrynowo-płytkowych, które zwiększają adhezję do naczyń krwionośnych pod przepływem4,10,11.

Model komory przepływowej in vitro pozwala na badanie różnych czynników w adhezji bakterii do składników komórkowych lub matrycowych. Czynniki wirulencji bakterii można badać przy użyciu mutantów lub nieszkodliwych bakterii wykazujących ekspresję określonych białek powierzchniowych. Alternatywnie inhibitory farmakologiczne lub przeciwciała blokujące można dodać do pożywki w komorze przepływowej. Rolę czynników gospodarza, takich jak różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, można badać za pomocą szkiełek nakrywkowych z różnymi powłokami. Szkiełka nakrywkowe mogą być również pokryte komórkami śródbłonka, których stan aktywacji może być modulowany poprzez dodanie określonych stymulatorów. Oprócz ściany naczyniowej, udział komórek krwi gospodarza i białek osocza można badać, dodając te czynniki do przepływającego podłoża. W ten sposób różne warunki o rosnącej złożoności mogą być badane w znormalizowanych warunkach przepływu laminarnego, aby rozwikłać interakcje, które pozwalają bakteriom przylegać do ściany naczynia in vivo.

Interakcje zidentyfikowane w modelu in vitro są następnie badane na modelu zwierzęcym w celu sprawdzenia ich znaczenia w złożonym organizmie. Opisano inne modele in vivo do badania dynamicznych oddziaływań pod wpływem przepływu, takie jak komora grzbietowego fałdu skórnego chomika12 i model cremaster13. Dla porównania, opisany tutaj model perfuzji krezkowej oferuje kilka zalet ze względu na łatwość użycia, możliwość zmiany tła genetycznego gospodarza myszy i ocenę interwencji farmakologicznych.

Podsumowując, opisane modele dają możliwość badania białek powierzchniowych nie tylko S. aureus, ale wielu innych mikroorganizmów o różnym pochodzeniu gospodarza, aby lepiej zrozumieć patogenezę zakażeń naczyniowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; "Eddy Merckx Research Grant" i "Sporta research Grant" dla Pediatric Cardiology, UZ Leuven, Belgia (J.C.); Centrum Biologii Molekularnej i Naczyniowej jest wspierane przez Programmafinanciering KU Leuven (PF/10/014), przez "Geconcentreerde Onderzoeksacties" (GOA 2009/13) z Uniwersytetu w Leuven oraz grant badawczy firmy Boehringer-Ingelheim.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Napar z mózgu i serca (BHI)BD Plastipak 237500
Tryptyczny bulion sojowy (TSB)OxoidCM0129
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Invitrogen14190-169D-PBS
5(6)-karboksyl-fluoresceina N-hydroksysukcynimidyl ester Oznakowanie fluorescencyjneSigma-Aldrich21878-25MG-F
Surowica bydlęca Albumina Frakcja V (BSA)Roch10 735 086 001
Haemate-PCSL BehringPL 15036/0010VWF
Horm kolagenTakeda10500kolagen
1-dołkowe komory do hodowli komórkowych PCASarstedt94.6140.102plastikowe płytki
TemgesicReckitt Benckiser283716bruprenorfina
Znieczulenie (chlorowodorek ketaminy 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminy))EurovetBE-V136516ketamin
XYL-M 2% (chlorowodorek ksylazyny 23,32 mg/ml (20 mg/ml ksylazyny))VMD ArendonkBE-V170581ksylazyna
2 francuski cewnik dożylny zielonyPortex200/300/010
0,9% Chlorek sodu (NaCl)Baxter HealthcareW7124
bawełna wacikiMiędzynarodowy produkt medyczny300230
Roztwór jonoforu Ca2+ A23187Sigma-AldrichC7522-10 MG
26 strzykawka 1 ml   BD Plastipak 
Strzykawka 1 ml o rozmiarze 26  z igłąBD Plastipak 300015iniekcji dootrzewnowej
5810-REppendorf5811 000.320
Szkiełka nakrywkowe szklane (24x50)VWRBB02405A11Grubość nr, 1
Aparat do infuzji PHD 2000702100Pompa infuzyjna Harvard o wysokiej dokładności
Aksjo-obserwator DICarl-ZeissOdwrócony mikroskop
fluorescencyjnyOprogramowanie ImageJNational Institute of HealthAnalysis
czarno-biały
 300013 Wirówka do Graphpad Prism 5,0 Oprogramowanie Graphpad Oprogramowanie analityczne AxioCam MRm Carl-Zeiss Aparat

Bibliografia

  1. Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis. Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).
  2. Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells. Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).
  3. Pappelbaum, K. I., et al. Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress. Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).
  4. Claes, J., et al. Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor–binding protein. Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).
  5. Thiene, G., Basso, C. Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves. Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).
  6. Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin. Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).
  7. Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress. Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).
  8. Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase. FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).
  9. Friedrich, R., et al. Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation. Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).
  10. Vanassche, T., et al. Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation. Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).
  11. Vanassche, T., et al. The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections. J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).
  12. Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Krötz, F. Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo. Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).
  13. Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. J Vis Exp. 2 (74), (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Komora przepływowamikroskopia witalnanaprężenie ścinająceStaphylococcus aureusczynnik von Willebrandakomórki śródbłonkamacierz zewnątrzkomórkowaznakowanie fluorescencyjnemikroskopia wideo
Model in vitro i in vivo do badania adhezji bakterii do ściany naczynia w warunkach przepływu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.