Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

12.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52885

⸱

5 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biomedicine, European Academy Bozen/Bolzano (EURAC), 2Laboratory of Medical Genetics, Fondazione IRCCS Ca´ Granda, Ospedale Maggiore Policlinico, 3Del E. Webb Center for Neuroscience, Aging & Stem Cell Research, Sanford-Burnham Medical Research Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Streszczenie

Komórki somatyczne mogą być przeprogramowane w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) poprzez wymuszenie ekspresji czterech czynników transkrypcyjnych (Oct-4, Sox-2, Klf-4 i c-Myc), zazwyczaj wyrażanych przez ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC). Ze względu na podobieństwo do komórek macierzystych (hESC), komórki iPS stały się ważnym narzędziem w potencjalnej medycynie regeneracyjnej specyficznej dla pacjenta, unikając problemów etycznych związanych z ludzkimi zarodkowymi komórkami macierzystymi. Aby uzyskać komórki nadające się do zastosowania klinicznego, należy wygenerować iPSC wolne od transgenów, aby uniknąć reaktywacji transgenu, zmienionej ekspresji genów i błędnego różnicowania. Co więcej, wysoce wydajna i niedroga metoda przeprogramowania jest niezbędna do uzyskania wystarczającej ilości iPSC do celów terapeutycznych. Biorąc pod uwagę tę potrzebę, preferowanym wyborem do oznaczania iPSC jest skuteczne podejście oparte na plazmidzie nieintegrującym się z episomalnym plazmidem. Obecnie najczęstszym typem komórek wykorzystywanym do celów przeprogramowania są fibroblasty, których izolacja wymaga biopsji tkanki, czyli inwazyjnego zabiegu chirurgicznego pacjenta. Dlatego ludzka krew obwodowa stanowi najbardziej dostępną i najmniej inwazyjną tkankę do wytwarzania iPSC.

W tym badaniu, ekonomiczny i wolny od wirusów protokół wykorzystujący nieintegrujące plazmidy episomalne jest raportowany do generowania iPSC z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów po odwirowaniu krwi pełnej i bez separacji gradientu gęstości.

Wprowadzenie

W 2006 roku grupa Shinya Yamanaka1 po raz pierwszy zademonstrowała, że komórki somatyczne od dorosłych myszy i ludzi mogą zostać przekształcone w stan pluripotencjalny poprzez ektopową ekspresję czterech czynników przeprogramowujących (Oct-4, Sox-2, Klf-4 i c-Myc), generując tak zwane Indukowane Pluripotencjalne Komórki Macierzyste (iPSC)2. Specyficzne dla pacjenta iPSC są bardzo podobne do ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pod względem morfologii, proliferacji i zdolności do różnicowania się w trzy typy komórek rozrodczych (mezodermę, endodermę i ektodermę), a jednocześnie nie mają obaw etycznych związanych ze stosowaniem hESC i omijaniem ewentualnego odrzucenia immunologicznego3. W związku z tym iPSC wydają się być jednym z najważniejszych źródeł komórek specyficznych dla pacjenta do badań podstawowych, badań przesiewowych leków, modelowania chorób, oceny toksyczności i celów medycyny regeneracyjnej4.

Do generowania iPSC zastosowano kilka podejść: wektory integrujące wirusa (retrowirus5, lentiwirus6), wektory nieintegrujące wirusa (adenowirus7), wirus Sendai8, transpozony BAC9, wektory epizodyczne10, białka11 lub dostarczanie RNA12. Chociaż zastosowanie metod za pośrednictwem wirusa może prowadzić do przeprogramowania o wysokiej wydajności, wektory wirusowe integrują się z genomem komórek gospodarza, a zatem nie można wykluczyć potencjalnej losowej mutagenezy insercyjnej, trwałej zmiany ekspresji genów i reaktywacji wyciszonych transgenów podczas różnicowania13.

Aby uczynić iPSC bezpieczniejszymi dla medycyny regeneracyjnej, podjęto wysiłki w celu uzyskania iPSC bez integracji egzogennego DNA z genomami komórkowymi. Chociaż opracowano wektory wirusowe i transpozony podlegające akcyzie, nadal nie jest jasne, czy krótkie sekwencje wektorów, które nieuchronnie pozostają w transdukowanych komórkach po wycięciu i ekspresji transpozazy, mogą wywołać zmiany w funkcji komórkowej13. Pomimo wysokiej wydajności przeprogramowywania, wirus Sendai stanowi kosztowne podejście, a problemy z uzyskaniem licencji w firmie, która opracowała ten system, mogą potencjalnie ograniczyć jego zastosowanie w badaniach translacyjnych. Co więcej, potrzeba bezpośredniego wprowadzania białek i RNA wymaga wielokrotnego dostarczania cząsteczek przeprogramowujących z nieodłącznymi ograniczeniami technicznymi, które to wprowadza, a ogólna wydajność przeprogramowania jest bardzoniska14. Warto zauważyć, że z powodzeniem opisano opłacalne, wolne od wirusów i nieintegrujące się metody oparte na wykorzystaniu plazmidów episomalnych do przeprogramowania fibroblastów skóry15. W szczególności w niniejszej pracy zdecydowaliśmy się użyć dostępnych komercyjnie plazmidów episomalnych wolnych od integracji, jak wcześniej informowano10,15.

Do tej pory fibroblasty skóry reprezentują najpopularniejszy typ komórek dawcy5. Jednak inne źródła komórek zostały z powodzeniem przeprogramowane w iPSC, w tym keratynocyty16, mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego17, komórki zrębu tłuszczowego18, mieszki włosowe19 i komórki miazgi zębowej20. Izolacja tych komórek wymaga zabiegów chirurgicznych, a do ekspansji komórek in vitro potrzeba kilku tygodni w celu ustanowienia pierwotnej hodowli komórkowej.

W tym świetle, wybór początkowego typu komórki jest krytyczny i równie ważne jest możliwość produkcji iPSC z łatwo dostępnych i mniej inwazyjnych tkanek, takich jak krew. Zarówno komórki jednojądrzaste krwi pępowinowej (CBMNC)21,22, jak i komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMNC)14,22-24 stanowią odpowiednie źródła komórek do wyprowadzania iPSC.

Chociaż skuteczność przeprogramowania dorosłych PBMNC jest 20-50 razy niższa niż w przypadku CBMNC22, pozostają one najwygodniejszym typem komórek do celów próbkowania. W rzeczywistości próbkowanie PBMNC ma tę zaletę, że jest minimalnie inwazyjne, a ponadto komórki te nie wymagają rozległej ekspansji in vitro przed eksperymentami z przeprogramowaniem. Do tej pory różne protokoły donosiły, że PBMNC po separacji gradientu gęstości mogą być zamrażane i rozmrażane od kilku miesięcy po zamrożeniu i rozpędzane przez kilka dni przed przeprogramowaniem do iPSC22,23. Niemniej jednak, o ile nam wiadomo, żadne raporty nie opisywały przeprogramowania PBMNC z mrożonych kożuchów. Co ważne, zamrożone kożuchy pobrane bez separacji gradientu gęstości stanowią najczęstsze próbki krwi przechowywane w dużych biobankach z badań populacyjnych, stanowiąc w ten sposób łatwo dostępną pulę materiału do produkcji iPSC, która pozwala uniknąć dalszego pobierania próbek.

Tutaj po raz pierwszy przedstawiamy generację wolnych od wirusów iPSC z ludzkich mrożonych kożuchów, w oparciu o wcześniej opisany protokół22. Ponadto iPSC wygenerowano z zamrożonych PBMNC uzyskanych po separacji gradientu gęstości, jako protokół kontrolny dla wyników PBMNC oczyszczonych w gradinie bez gęstości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMNC) zostały wyizolowane z próbek ludzkiej krwi obwodowej od zdrowych dawców po podpisaniu świadomej zgody i aprobacie Komisji Etycznej Prowincji Południowego Tyrolu. Eksperymenty prowadzono zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej. Wszystkie dane zostały zebrane i przeanalizowane anonimowo.

1. Izolacja komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC)

  1. PBMNC otrzymywane z kożuchów po odwirowaniu krwi pełnej, bez rozdzielania w gradinie gęstości.
    1. Zebrać 8 ml żylnej krwi obwodowej do plastikowej probówki z buforem cytrynianu sodu i przechowywać w temperaturze pokojowej (25 °C). Przetwarzaj krew w ciągu 12 godzin po pobraniu.
    2. Odwirować probówkę o sile 2 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w obracającym się wirniku kubełkowym, wyłączając hamulce wirówki.
    3. Zebrać mętną kożuchową powłokę (warstwa między górną fazą osocza a dolną fazą zawierającą większość erytrocytów), zawierającą wzbogaconą frakcję PBMNC (500 μl) do probówki kriowialnej.
    4. Zawiesić 500 μl kożucha z 500 μl 2x pożywki zamrażającej zawierającej 90% FBS i 20% DMSO, w celu uzyskania całkowitej objętości 1 ml przy stężeniu 10% DMSO.
    5. Zamrozić fiolkę w pojemniku do zamrażania z kontrolowaną szybkością w temperaturze -80 °C. Komórki należy przechowywać w ciekłym azocie przez dłuższy czas.
  2. PBMNC otrzymane po rozdzieleniu w gradimencie gęstości
    1. Zebrać 12 ml żylnej krwi obwodowej do plastikowej probówki z buforem cytrynianu sodu i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przetwarzać krew w ciągu 12 godzin po pobraniu.
    2. Rozcieńczyć krew jałowym PBS do końcowej objętości 35 ml.
    3. Ostrożnie i powoli nałożyć 35 ml rozcieńczonej krwi na 15 ml roztworu polisacharozy (używanego do rozdzielania w gradinie gęstości) (p = 1,077) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml (stosunek 3:1).
    4. Odwirować probówkę o stężeniu 800 x g przez 30 minut przy wilgotności względnej w obracającym się wirniku kubełkowym, wyłączając hamulce wirówki.
    5. Odessać górną, żółtą fazę zawierającą osocze i wyrzucić ją. Ostrożnie przenieść nieprzezroczystą białą warstwę interfazową zawierającą PBMNC do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    6. Doprowadzić całkowitą objętość do 30 ml za pomocą sterylnego PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki za pomocą 30 ml PBS. Policz liczbę żywotnych komórek na podstawie wykluczenia błękitu trypanowego25.
    8. Odwirować PBMNC przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i wyrzucić go.
    9. Zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości pożywki zamrażającej zawierającej 90% FBS i 10% DMSO, w celu uzyskania stężenia 5 x 106 komórek/ml.
    10. Podwielokrotność 1 ml na fiolkę (około 5 x 106 komórek/ml) i zamrozić fiolkę w pojemniku do zamrażania o kontrolowanej szybkości w temperaturze – 80 °C. Przechowywać komórki w ciekłym azocie przez dłuższy czas.

2. Rozmrażanie i powlekanie PBMNC (DZIEŃ 0)

  1. PBMNC otrzymywane z kożuchów po odwirowaniu krwi pełnej, bez rozdzielania w gradinie gęstości.
    1. Aby rozpocząć protokół z użyciem PBMNC z zamrożonych kożuchów, należy rozmrozić 1 fiolkę z komórkami w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i rozcieńczyć otoczkę bażemną jałową PBS do końcowej objętości 2 ml.
    2. Przenieść rozcieńczoną otoczkę kożuchową do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, dodać 10 ml buforu do lizy krwinek czerwonych i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Aby przygotować 500 ml buforu do lizy krwinek czerwonych, dodaj 0,5 g wodorowęglanu potasu, 4,145 g chlorku amonu, 100 μl 0,5 M roztworu EDTA do 500 ml ultraczystej wody o pH 7,2-7,4.
    4. Doprowadzić całkowitą objętość do 50 ml za pomocą sterylnego PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odrzucić sklarat i przemyć osad 50 ml sterylnego PBS, odwirować kożuchową powłokę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki PBMNC, jak opisanowcześniej 22, składającej się z: IMDM i F-12 Hama (stosunek 1:1), 1% insuliny-transferyny-selenu-etanoloaminy (ITS-X), 1% chemicznie zdefiniowanego koncentratu lipidów (CDL), 1% penicyliny/streptomycyny, 0,005% kwasu L-askorbinowego, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1-tioglicerolu (stężenie końcowe 200 μM), czynnika komórek macierzystych SCF (100 ng/ml), Interleukina-3 IL-3 (10 ng / ml), erytropoetyna EPO (2 U / ml), insulinopodobny czynnik wzrostu IGF-1 (40 ng / ml), deksametazon (1 μM) i holotransferyna (100 μg / ml).
    7. Przenieść je do jednego dołka na 12-dołkowej płytce ze standardową powierzchnią poddaną działaniu hodowli tkankowej, bez powlekania, o gęstości 2 x 106 komórek/ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez 48 godzin, aż do etapu zmiany pożywki (patrz sekcja 3).
  2. PBMNC otrzymane po rozdzieleniu w gradimencie gęstości
    1. Aby rozpocząć protokół z użyciem zamrożonych PBMNC po rozdzieleniu gradientu gęstości, rozmrozić 1 fiolkę z komórkami w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C, przenieść komórki do 5 ml pożywki PBMNC. Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Zawiesić komórki w 1 ml pożywki PBMNC i przenieść je do jednego dołka na płytce 12-dołkowej, o gęstości 2 x 106 komórek/ml. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze przez 48 godzin, aż do etapu zmiany pożywki (patrz sekcja 3).

3. Kultura i ekspansja PBMNC (DZIEŃ 2-13)

  1. Zebrać PBMNC w kulturze zawiesinowej za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml świeżej pożywki PBMNC.
  3. Przenieść komórki do 1 dołka na 12-dołkowej płytce ze standardową powierzchnią poddaną działaniu kultur tkankowych, bez powłoki, i inkubować je w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  4. Powtarzaj te kroki co dwa dni i dziel komórki w stosunku 1:2, gdy osiągną odpowiednią konfluencję (około 80%).

4. Transfekcja PBMNC z plazmidami episomalnymi (DZIEŃ 14)

Uwaga: Przeprowadź izolację czterech komercyjnych plazmidów episomalnych bez intergacji, zawierających geny pluripotencji, używając komercyjnego zestawu do oczyszczania plazmidów i oceń jakość oczyszczonych plazmidów za pomocą analizy żelu agarozowego, zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Zebrać PBMNC w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i policzyć liczbę żywotnych komórek (na podstawie wykluczenia błękitu trypanowego)25.
  2. Odwirować 2 x 106 komórek przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Ponownie zawiesić 2 x 106 komórek w mieszance transfekcyjnej zawierającej 100 μl buforu do rezawieszania T i 1 μg każdego plazmidu DNA (jeden plazmid przenoszący OCT3/4 i shRNA przeciwko p53, jeden plazmid przenoszący SOX2 i KLF4, jeden plazmid przenoszący L-MYC i LIN28 oraz jeden plazmid przenoszący EGFP, w celu sprawdzenia skuteczności transfekcji).
  4. Odessać mieszaninę transfekcyjną zawierającą komórki do końcówki o pojemności 100 μl i włożyć pipetę z próbką pionowo do probówki wypełnionej 3 ml buforu elektrolitycznego E2, umieszczonej w stacji pipetowej maszyny do elektroporacji, zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Efektywnie elektroportuj ogniwa za pomocą następującego programu: 1 650 V, 10 ms, 3 impulsy.
  6. Ponownie zawiesić elektroporowane ogniwa (2 x 106 ogniw) w 2 ml wstępnie podgrzanego podłoża PBMNC, dodając 0,25 mM maślanu sodu (NaB) i policzyć liczbę żywotnych komórek po protokole elektroporacji (na podstawie wykluczenia błękitu trypanowego)25.
  7. Przenieść komórki do jednego dołka na 6-dołkowej płytce bez powłoki, delikatnie kołysać płytką i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  8. Dzień po elektroporacji policz liczbę komórek GFP-dodatnich pod mikroskopią fluorescencyjną z 8-10 losowych pól, aby ocenić skuteczność transfekcji.
  9. Utrzymuj transfekowane komórki bez pękania przez 3 dni, aż do posiewu ich na MEF-ach (patrz sekcja 6).
  10. Wymieniaj 2 ml świeżej pożywki PBMNC plus 0,25 mM NaB co dwa dni.

5. Przygotuj potrawy z komórkami zasilającymi dla kokultury (DZIEŃ 16)

  1. Pokryć studzienki 6-dołkowej płytki 1 ml matrycy błony podstawnej przez 15 minut w temperaturze 37 °C i płytkować mysie fibroblasty embrionalne (MEF) o gęstości 2 x 105 komórek/studzienkę 2 ml 10% DMEM zawartego w FBS (pożywka MEF) na jeden dzień przed pasażowaniem elektroporowanych PBMNC do komórek zasilających MEF.

6. Powlekanie transfekowanych PBMNC na MEF (DZIEŃ 17-19)

  1. Zebrać PBMNC w kulturze zawiesinowej za pomocą pipety z końcówką o pojemności 1 ml do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować transfekowane PBMNC przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml świeżej pożywki PBMNC plus 0,25 mM NaB.
  3. Umieścić komórki na 6-dołkowej płytce pokrytej MEF i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
  4. Po dwóch dniach odessać pożywkę i zastąpić ją 2 ml pożywki iPSC składającej się z nokautującego DMEM (KO-DMEM), 20% zamiennika surowicy KO (KOSR), 1 mM NEAAs, 1% penicyliny/streptomycyny, 20 mM L-glutaminy, 0,1 mM β-merkaptoetanolu, 10 ng/ml FGF (zasada bFGF) i 0,25 mM NaB.
  5. Wymieniaj 2 ml świeżej pożywki iPSC każdego dnia i codziennie sprawdzaj komórki.
    Uwaga: Około 22-25 dnia powinny być widoczne pierwsze kolonie iPSC.

7. Wybieranie i ekspansja klonów indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) (DZIEŃ 30-35)

Uwaga: Około 30-35 dni po transfekcji, kolonie iPSC powinny być gotowe do pobrania i ponownego poszycia. Skuteczność przeprogramowania należy oszacować jako procentowy stosunek liczby kolonii iPSC do całkowitej liczby ogniw poddanych elektroporacji, jak podano wcześniej26.

  1. Dzień przed pasażowaniem kolonii iPSC przygotuj karmnik MEF na 12-dołkowej płytce (1,25 x 105 komórek/dołek).
  2. Odessać pożywkę MEF i zamienić na 1 ml pożywki iPSC na 10 ng/ml bFGF i 10 μM Y-27632. Ręcznie rozciąć za pomocą igły jedną kolonię za każdym razem pod mikroskopem preparacyjnym w kapturze badawczym w celu uzyskania siatki, zebrać mniejsze grudki przez pipetowanie i przenieść je pojedynczo do jednego dołka na 12-dołkowej płytce pokrytej MEF.
  3. Przejść i rozszerzyć każdą 12-dołkową płytkę do 6-dołkowej płytki w stosunku 1:2, a następnie każdą 6-dołkową płytkę w stosunku 1:4 w celu dalszego rozmnażania. Ręcznie rozwiń i rozszczep iPSC przez pierwsze 2-3 pasaże (zgodnie z dokładnym opisem w kroku 7.2), a następnie zastosuj procedurę dysocjacji enzymatycznej (zacznij od kroku 7.4).
  4. W przypadku protokołu dysocjacji enzymów należy oczyścić kolonie iPSC poprzez zasysanie zróżnicowanych porcji pod mikroskopem preparacyjnym w kombinacie.
  5. Inkubować iPSC z 1 ml kolagenazy dożylnej (1 mg/ml) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Odessać roztwór enzymu, przepłukać komórki 1 ml KO-DMEM i zebrać kolonie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 100 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
  7. Odessać supernatant, ponownie zawiesić kolonie w 2 ml pożywki iPSC z 10 ng/ml bFGF i 10 μM Y-27632 i umieścić je na płytce 6-dołkowej pokrytej MEF (stosunek 1:4).

8. Charakterystyka iPSC (od 5 do 15 pasaży)

  1. Barwienie fosfatazą alkaliczną
    1. Hodować kolonie iPSC przez 3-5 dni w pożywce iPSC z 10 ng / ml bFGF.
    2. Aby rozpocząć protokół barwienia fosfatazą alkaliczną, należy przepłukać iPSC raz PBS, a następnie utrwalić je 1 ml 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć resztki PFA.
    4. Wybarwić utrwalone komórki za pomocą dostępnego w handlu zestawu do barwienia fosfatazą alkaliczną zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Immunofluorescencji
    1. Hodować kolonie iPSC przez 3-5 dni w pożywce iPSC z 10 ng / ml bFGF.
    2. Aby rozpocząć test immunofluorescencyjny, należy przemyć iPSC raz PBS, a następnie utrwalić je 1 ml 4% PFA przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj komórki trzykrotnie PBS, aby usunąć resztki PFA.
    4. Utrwalone iPSC należy traktować 1 ml roztworu przepuszczalnego/blokującego zawierającego 4% surowicy koziej, 0,1% BSA, 0,1% Triton X-100 i 0,05% azydku sodu (NaN3) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać roztwór blokujący i inkubować utrwalone komórki z pierwszorzędowymi przeciwciałami w 3% BSA i 0,05% roztworze NaN3 O/N w temperaturze 4 °C (sprawdź tabelę materiałów dla listy przeciwciał pierwszorzędowych i sugerowanego współczynnika rozcieńczenia przeciwciał).
    6. Następnego dnia przemyj iPSC trzykrotnie PBS, a następnie inkubuj komórki z kozimi przeciwciałami anty-mysimi Alexa Fluor 488 i kozich anty-królików Alexa Fluor 555, rozcieńczonymi w stosunku 1:1,000 w 3% BSA i 0,05% roztworze NaN3, przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    7. Wybarwić jądra DAPI (1 μg / ml) przez 10 minut w temperaturze pokojowej w ciemności, a następnie trzykrotnie przepłukać PBS.
  3. Różnicowanie iPSC w ciałach zarodkowych (EB)
    1. Hodować kolonie iPSC przez 5-6 dni w pożywce iPSC z 10 ng / ml bFGF.
    2. Usunąć zróżnicowane porcje z kolonii iPSC przez zasysanie, pod mikroskopem preparacyjnym w kapturze.
    3. Inkubować iPSC z 1 ml kolagenazy dożylnej (1 mg/ml) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Odessać roztwór enzymu, przepłukać komórki 1 ml KO-DMEM i zebrać kolonie do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 100 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.
    5. Odessać supernatant i ponownie zawiesić kolonie w 2 ml pożywki EB składającej się z KO-DMEM, 20% zdefiniowanej płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1 mM NEAAs, 1% penicyliny/streptomycyny, 20 mM L-glutaminy, 0,1 mM β-merkaptoetanolu.
    6. Umieść kolonie iPSC w zawiesinie przez 6 dni na 6-dołkowych płytkach o bardzo niskim przyłączeniu, aby umożliwić tworzenie sferoidalnych trójwymiarowych ciał zarodkowych (EB). Zmieniaj 2 ml świeżej pożywki EB co dwa dni.
    7. W dniu 7 należy zebrać EB i umieścić je na 0,1% 6-dołkowych płytkach pokrytych żelatyną w 2 ml pożywki EB i utrzymywać EB w różnicowaniu przez 20 dni.
    8. Zmieniaj 2 ml świeżej pożywki EB co dwa dni.
  4. qRT-PCR do analizy ekspresji genów
    1. Hodować kolonie iPSC przez 5-6 dni w pożywce iPSC z 10 ng / ml bFGF.
    2. Ekstrahować całkowite RNA z PBMNC, iPSC lub EB za pomocą 1 ml dostępnego w handlu odczynnika zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Ocenić stężenie i czystość RNA za pomocą odpowiednich metod, takich jak użycie spektrofotometru (wysokiej jakości RNA o proporcjach A260/A280 i A260/A230 > 1,8)27.
    4. Sprawdź integralność RNA za pomocą komercyjnego zestawu zgodnie z protokołem producenta (wysokiej jakości RNA RQI >9.5)28.
    5. Przeprowadź reakcję odwrotnej transkrypcji na 1 μg całkowitego RNA przy użyciu komercyjnego zestawu do odwrotnej transkryptazy zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Przygotować mieszaniny qPCR zawierające 5 ng matrycy cDNA, 7,5 μl SYBR GREEN Supermix, 2 μl starterów 5 μM (do przodu: 1 μl i odwrotnie: 1 μl) i 6 μl wody wolnej od RNazy/DNaz dla każdej reakcji29.
    7. Wykonaj qRT-PCR przy użyciu następującego programu: początkowy etap denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli podzielonych na etap denaturacji w temperaturze 95 °C przez 15 sekund oraz etap wyżarzania i przedłużania podkładu w temperaturze 60°C przez 45 sekund29.
    8. Normalizuj ekspresję innych genów za pomocą GAPDH jako genu porządkowego28 (patrz startery wymienione w Tabeli 1).
  5. qPCR w celu wykluczenia transgenu
    1. Ekstrahować DNA z PBMNC lub iPSC za pomocą 1 ml buforu do lizy zawierającego 50 mM Tris, 100 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% dodecylosiarczanu sodu (SDS) i 20 μg/ml proteinazy K.
    2. Dodać równą objętość (1 ml) 100% izopropanolu, trzykrotnie wymieszać przez odwrócenie w celu umożliwienia wytrącenia DNA i odwirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Odrzucić supernatant, przemyć osad DNA 1 ml 70% etanolu i odwirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze suchej masy. Odessać i wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić go w wodzie wolnej od RNazy/DNazy.
    4. Ocenić stężenie i czystość DNA za pomocą odpowiednich metod, takich jak użycie spektrofotometru (wysokiej jakości RNA o proporcjach A260/A 280 i A260/A230 >1,8)27.
    5. Przygotować mieszaniny qPCR zawierające 5 ng matrycy DNA, 7,5 μl SYBR GREEN Supermix, 2 μl starterów 5 μM (do przodu: 1 μl i do tyłu: 1 μl) i 6 μl wody wolnej od RNaz/DNaz dla każdej reakcji29.
    6. Normalizuj ekspresję specyficznego genu plazmidu episomalnego EBNA-1 za pomocą FBX-15 jako genu porządkowego29 (patrz startery wymienione w Tabeli 1).
  6. Analiza kariotypu
    1. Hoduj kolonie iPSC przez 5-6 dni na płytce pokrytej matrycą membrany podstawnej bez podawania z komercyjnie, zdefiniowanym, niewymagającym podajnika pożywką do konserwacji iPSC, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Aby rozpocząć protokół analizy kariotypu, należy odłączyć kolonie iPSC z 1 ml roztworu do odrywania komórek na 5 minut w temperaturze 37 °C, aż do uzyskania dysocjacji pojedynczej komórki.
    3. Zebrać komórki i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Zawiesić iPSC w 2 ml pożywki opracowanej specjalnie do hodowli komórek do technik diagnostyki prenatalnej. Umieścić jednokomórkowe iPSC na szklanych naczyniach pokrytych matrycą błony podstawnej i inkubować je w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    5. Po 2-4 dniach dodać 10 μl/ml kolchicyny bezpośrednio do kultur i inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.
    6. Odessać pożywkę i inkubować iPSC w 1 ml roztworu hipotonicznego (0,6% cytrynian sodu i 0,13% chlorek potasu) przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Przepłukać komórki 1 ml 5% roztworu kwasu octowego i utrwalić iPSC roztworem metanolu/kwasu octowego (w stosunku 3:1) w maszynie o kontrolowanej temperaturze i wilgotności (28 °C, 42% wilgotności względnej).
    8. Zanurz i zabarwij utrwalone ogniwa roztworem chinakryny na 15-20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności (aby uzyskać pasmo Q)30.
    9. Uzyskaj metafazy komórek pod mikroskopem fluorescencyjnym przy 100-krotnym powiększeniu29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszym badaniu przedstawiono prosty i skuteczny protokół generowania wolnych od wirusów iPSC poprzez reprogramowanie PBMNC wyizolowanych z mrożonych warstw leukocytarnych (buffy coats) po wirowaniu krwi pełnej oraz porównano go z reprogramowaniem PBMNC uzyskanych po separacji w gradiencie gęstości. Rysunek 1A przedstawia schematyczny przebieg szczegółowego protokołu. Po rozmrożeniu wyizolowane PBMNC, wykazujące typowy zaokrąglony kształt, są namnażane w specyficznej pożywce do hodowli krwi przez 14...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W przeszłości jedynym sposobem na uzyskanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych niosących określoną mutację genetyczną była rekrutacja rodziców poddawanych preimplantacyjnej diagnostyce genetycznej i generowanie embrionalnych komórek macierzystych z ich odrzuconych blastocyst31,32. Korzystając z podejścia opartego na przeprogramowaniu, naukowcy mogą teraz generować iPSC od pacjentów będących nosicielami praktycznie dowolnego genotypu. Możliwość rozpoczęcia od specyficznej dla pacjenta linii komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez Ministerstwo Zdrowia i Departament Pomocy Edukacyjnej, Uniwersytet i Badania Autonomicznej Prowincji Bolzano oraz Fundację Południowotyrolskiej Sparkasse.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plastikowa rurka Venosafe buforowana cytrynianem soduTerumoVF-054SBCS07
Chlorek amoduSigma-AldrichA9434
Wodorowęglan potasuSigma-Aldrich60339
EDTA disodowy proszekSigma-AldrichE51340,5 M roztwór
Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Life Sciences17-5442-02Roztwór polisacharozy do wirowania w gradicynie gradientu gęstości
Zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMDM) Gibco21056-023Bez czerwonego fenolu
Ham's F-12Mediatech10-080-CV
Insulina-Transferyna-Selen-Etanoloamina (ITS -X)Gibco51500-056 1X (Standard: 100X)
Chemicznie zdefiniowany koncentrat lipidowyGibco119050311X (Stock: 100X)
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA9418
Kwas L-askorbinowy 2-fosforan sól seskwimagnezowa hydratSigma-AldrichA8960
1-tioglicerolSigma-AldrichM6145Końcowe stężenie przy 200 &mikro;
M Rekombinowany czynnik ludzkich komórek macierzystych (SCF)PeproTech300-07100 ng / ml (Magazyn: 100 &mikro; g/ml) 
Rekombinowana ludzka interleukina-3 (IL-3)PeproTech200-0310 ng/ml (Magazyn: 10 &mikro; g / ml)
Rekombinowany ludzki insulinopodobny czynnik wzrostu (IGF-1)PeproTech100-1140 ng / ml (Magazyn: 40 i mikro; g/ml)
Rekombinowana ludzka erytropoetyna (EPO)R& D Systems 287-TC-5002 U/ml (Stan magazynowy: 50 U/ml)
Deksametazon Sigma-AldrichD29151 μ M (Stock: 1 mM)
Ludzka holo-transferynaR& D Systems 2914-HT100 μ g/ml (Podstawa: 20 mg/ml)
Amniomax IIGibco11269016Pożywka do analizy cytogenetycznej
mTeSR1StemCell Technologies5850Pożywka do hodowli iPSC bez karmnika
Nokaut DMEMGibco10829-018
Zamiennik surowicy nokautującejGibco10828-028
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15140-122
L-glutamina (200 mM)Gibco25030-024
MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)Gibco11140-050
2-merkaptoetanol Gibco31350-0100,1 mM (Magazyn: 50 mM)
Maślan soduSigma-AldrichB58870,25 mM (Magazyn: 0,5 m)
Rekombinowany ludzki FGF zasadowy, 145 aa R& D Systems 4114-TC10 ng/ml (Stan magazynowy: 10 &mikro; g/ml)
Y-27632 dichlorowodorekSigma-AldrichY0503 10 &mikro; M (Magazyn: 10 mM)
Zdefiniowana przez płód surowica bydlęcaHyclonSH 30070.03
EmbryoMax 0,1% roztwór żelatynyMerck-MilliporeES-006-B
Matrigel Matryca błony podstawnej Zredukowany czynnik wzrostuBD Biosciences354230
Kolagenaza, typ IVGibco17104-0191 mg / ml (Magazyn: 10 mg / ml)
AccutasePAA Laboratories GmbHL11-007Roztwór do odłączania komórek
Mysi fibroblast embrionalny (CF1)Global StemGSC-6201G1*106 cells/płytka 6-dołkowa
Plazmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-FAddgene 270771 &mikro; g (Magazyn: 1 i mikro; g/&mikro; l)
Plazmid pCXLE-hSKAddgene 270781 &mikro; g (Magazyn: 1 i mikro; g/&mikro; l)
Plazmid pCXLE-hULAddgene 270801 &mikro; g (Magazyn: 1 i mikro; g/&mikro; l)
Plazmid pCXLE-EGFPAddgene 270821 &mikro; g (Magazyn: 1 i mikro; g/&mikro; l)
Zestaw do barwienia fosfatazy alkalicznejStemgent00-0009
Przeciwciało anty-swoistego antygenu embrionalnego 4 (SSEA-4)Przeciwciało Merck-MilliporeMAB43041/250
Przeciwciało anty-TRA-1-60Merck-MilliporeMAB43601/250
Przeciwciało anty-TRA-1-81Merck-MilliporeMAB43811/250
Anti-Oct-3/4Santa Cruz Biotechnologysc-90811/500
Przeciwciało anty-NanogSanta Cruz Biotechnologysc-337591/500
Przeciwciało anty-troponiny ISanta Cruz Biotechnologysc-153681/500
Przeciwciało anty-&alfa;-aktyninowe (sarkomeryczne)Sigma-AldrichA77321/250
Neuronalna klasa III ß-tubulina (TUJ1)Przeciwciało Covance Produkty badawcze Inc MMS-435P-1001/500
Przeciwciało przeciw hydroksylazie tyrozynowej (TH)Calbiochem6570121/200
Alexa Fluor 488 Koza Anty-Mysz Sondy molekularneA-110291/1000
Alexa Fluor 555 Kozie sondymolekularneA-214291/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-dołkowa płytkaCorning3471
TrizolOdczynnik Ambion15596-018 odczynnik do ekstrakcji RNA
SuperScript VILO Zestaw do syntezy cDNAInvitrogen11754050Zestaw do odwrotnej transkryptazy
iTaq Uniwersalny SYBR Green SupermixBio-Rad172-5124
CFX96 System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad185-5195
Automatyczny system elektroforezy ExperionBio-Rad700-7000Przyrząd do sprawdzania integralności RNA
Experion RNA Zestaw do analizy HighsenseBio-Rad7007105do sprawdzania integralności RNA
Mikroskop preparacyjny (SteREO Discovery V12)Zeiss495007
NeonTransfection System 100 µ l Zestawodczynników InvitrogenMPK10025do elektroporacji
System transfekcji neonowejInvitrogenMPK5000Przyrząd do elektroporacji
Spektrofotometr NanoDrop UV/VisThermo ScientificND-2000Przyrząd do kwantyfikacji DNA/RNA
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362Zestaw do oczyszczania plazmidu
przeciw królikom Zestaw odczynników

Bibliografia

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat. Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  3. Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications. J. Mol. Med. (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).
  4. Bayart, E., Cohen-Haguenauer, O. Technological overview of iPS induction from human adult somatic cells). Curr. Gene Ther. 13 (2), 73-92 (2013).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Sommer, A. G., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from peripheral blood using the STEMCCA lentiviral vector. J. Vis. Exp. (68), e4327(2012).
  7. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  8. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  9. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  10. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat. Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  11. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell. Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  12. Warren, L., Ni, Y., Wang, J., Guo, X. Feeder-free derivation of human induced pluripotent stem cells with messenger RNA. Sci. Rep. 2, 657(2012).
  13. Stadtfeld, M., Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes Dev. 24 (20), 2239-2263 (2010).
  14. Chou, B. K., et al. Efficient human iPS cell derivation by a non-integrating plasmid from blood cells with unique epigenetic and gene expression signatures. Cell Res. 21 (3), 518-529 (2011).
  15. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  16. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nat. Biotechnol. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  17. Streckfuss-Bomeke, K., et al. Comparative study of human-induced pluripotent stem cells derived from bone marrow cells, hair keratinocytes, and skin fibroblasts. Eur. Heart J. 34 (33), 2618-2629 (2013).
  18. Miyoshi, N., et al. Reprogramming of mouse and human cells to pluripotency using mature microRNAs. Cell. Stem Cell. 8 (6), 633-638 (2011).
  19. Wang, Y., et al. Induced pluripotent stem cells from human hair follicle mesenchymal stem cells. Stem Cell. Rev. 9 (4), 451-460 (2013).
  20. Beltrao-Braga, P. C., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from human immature dental pulp stem cells. Cell Transplant. 20 (11-12), 1707-1719 (2011).
  21. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell. Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  22. Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat. Protoc. 7 (11), 2013-2021 (2012).
  23. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell. Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  24. Geti, I., et al. A practical and efficient cellular substrate for the generation of induced pluripotent stem cells from adults: blood-derived endothelial progenitor cells. Stem Cells Transl. Med. 1 (12), 855-865 (2012).
  25. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. , Appendix 3-Appendix 3B (2001).
  26. Hasegawa, K., et al. Comparison of reprogramming efficiency between transduction of reprogramming factors, cell-cell fusion, and cytoplast fusion. Stem Cells. 28 (8), 1338-1348 (2010).
  27. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), 2565(2010).
  28. Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Mol Aspects Med. 27 (2-3), 126-129 (2006).
  29. Meraviglia, V., et al. Human chorionic villus mesenchymal stromal cells reveal strong endothelial conversion properties. Differentiation. 83 (5), 260-270 (2012).
  30. Caspersson, T., Zech, L., Johansson, C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. Exp Cell Res. 253 (2), 302-304 (1999).
  31. Alikani, M., Munne, S. Nonviable human pre-implantation embryos as a source of stem cells for research and potential therapy. Stem Cell. Rev. 1 (4), 337-343 (2005).
  32. Tropel, P., et al. High-efficiency derivation of human embryonic stem cell lines following pre-implantation genetic diagnosis. In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 46 (3-4), 376-385 (2010).
  33. Hanna, J., et al. Direct cell reprogramming is a stochastic process amenable to acceleration. Nature. 462 (72-73), 595-601 (2009).
  34. Li, H., et al. The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming. Nature. 460 (7259), 1136-1139 (2009).
  35. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  36. Lindner, S. E., Sugden, B. The plasmid replicon of Epstein-Barr virus: mechanistic insights into efficient, licensed, extrachromosomal replication in human cells. Plasmid. 58 (1), 1-12 (2007).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mononuklearne kom rki krwi obwodowejizolacja warstwy leukocytarnejreprogramowanie nieintegruj cetransfekcja poprzez elektroporacjkom rki karmid a z fibroblast w embrionalnych myszyanaliza immunofluorescencyjnapomiar ekspresji gen wkosztowo efektywny protok
Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.