Ten protokół opisuje wykrywanie integronów klasy 1 i związanych z nimi kaset genowych w produktach spożywczych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badania przesiewowe środków spożywczych na obecność integronów klasy 1 i kaset genowych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oporność na antybiotyki jest jednym z największych zagrożeń dla zdrowia w XXIwieku. Nabywanie genów oporności poprzez boczny transfer genów jest głównym czynnikiem rozprzestrzeniania się różnych mechanizmów oporności. Wśród elementów DNA ułatwiających transfer boczny, integrony klasy 1 są w dużej mierze odpowiedzialne za rozprzestrzenianie się determinantów oporności na antybiotyki wśród patogenów Gram-ujemnych. W sumie integrony te nabyły i rozpowszechniły ponad 130 różnych genów oporności na antybiotyki. Przy ciągłym stosowaniu antybiotyków, integrony klasy 1 stały się wszechobecne w komensalach i patogenach ludzi i ich udomowionych zwierząt. W związku z tym można je teraz znaleźć we wszystkich strumieniach ludzkich odchodów, gdzie nadal nabywają nowe geny i mają potencjał, aby powrócić do ludzi poprzez łańcuch pokarmowy. Protokół ten szczegółowo opisuje uproszczone podejście do wykrywania integronów klasy 1 i związanych z nimi kaset genów oporności w środkach spożywczych przy użyciu hodowli i PCR. Korzystając z tego protokołu, naukowcy powinni być w stanie: zbierać i przygotowywać próbki do tworzenia wzbogaconych kultur i badań przesiewowych pod kątem integronów klasy 1; izolować pojedyncze kolonie bakteryjne w celu identyfikacji izolatów integron-dodatnich; identyfikować gatunki bakterii, które zawierają integrony klasy 1; i scharakteryzować te integrony i związane z nimi kasety genowe.
Wprowadzenie
Odkrycie antybiotyków było jednym z największych osiągnięć naukowychXX wieku. Jednak stosowanie i nadużywanie antybiotyków doprowadziło do szybkiej ewolucji bakterii opornych na antybiotyki, które obecnie stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego w XXIwieku. Wzrost liczby szczepów bakteryjnych opornych na większość opcji leczenia zwiększa prawdopodobieństwo, że wkraczamy w erę, w której leki przeciwdrobnoustrojowe nie są już skuteczne1,2.
Genetyczna maszyneria, która nadaje odporność na antybiotyki, to starożytny system, wyprzedzający ludzi i presję selekcji antybiotyków o miliony lat3. ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Pokarmy, które są spożywane na surowo lub lekko ugotowane, są najbardziej niepokojące dla ludzkiego zdrowia. Przykłady obejmują warzywa sałatkowe, owoce, skorupiaki i skorupiaki.
1. Pobieranie próbek
- Próbki należy pobierać w warunkach minimalizujących zanieczyszczenie i przechowywać w oddzielnych, czystych workach podczas transportu. Po pobraniu próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C i przetworzyć w ciągu 24 godzin.
2. Wzbogacone przygotowanie kultury
- Owoce i warzywa:
- Umieść około 10 g materiału w wytrzymałej plastikowej torbie. Jeśli przetwarzasz większy materia....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przesiewowe badanie kultur mieszanych i izolatów bakteryjnych pod kątem obecności intI1
Zestaw starterów HS463a/HS464 PCR może być wykorzystany do wykrywania obecności genu integrazji integronu klasy 1, intI1 (Rysunek 1). Ten zestaw starterów sprawdza się w wykrywaniu intI1 w kulturach mieszanych i jest również stosowany do przesiewania kolonii bakteryjnych pobranych z płyt z wysianą kulturą (Rysunek 2). Izolaty dodatnie powinny dawać pojedynczy.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Identyfikacja integronów i związanych z nimi kaset genowych jest potencjalnie kluczowym krokiem w przewidywaniu pojawienia się nowych patogenów oportunistycznych, śledzeniu szlaków patogenów w łańcuchu pokarmowym człowieka oraz identyfikacji nowych determinantów oporności i wirulencji8,21,26. Celem pracy było opisanie uproszczonego podejścia do badań przesiewowych próbek pod kątem integronów klasy 1, scharakteryzowanie ich układów kasetowych i identyfikacja gatunków bakterii, w których występują. Kluczowe krok.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic istotnego do ujawnienia.
Podziękowania
Podziękowania dla Michaela Hall, Larissy Bispo i Gustavo Tavaresa za pomoc techniczną.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| GoTaq Bezbarwny Mastermix | Promega | M7132 | Stosowany we wszystkich PCR |
| RNAzy (rybonukleaza A z trzustki bydlęcej) | Sigma | R6513-10MG | Stosowany we wszystkich PCR |
| Enzym restrykcyjny HinFI | Promega | R6201 | Stosowany do trawienia produktów 16S rDNA PCR. Enzym jest dostarczany z optymalnym buforem i |
| drabinką BSA 100 pz | GE Healthcare | 27400701 | Stosowany jako wzorzec rozmiaru na wszystkich żelach agarozowych |
| GelRed DNA barin | Biotium | 41003 | UWAGA: Podczas pracy z tym materiałem należy nosić środki ochrony osobistej |
| Tiocyjanian guanidyny | Technologies | AM9422 | UWAGA: Podczas obchodzenia się z tym materiałem należy nosić środki ochrony osobistej |
| CLS-TC Rozwiązanie | MP Biomedicals | 6540409 | Roztwór do ponownego zawieszania stosowany na początku ekstrakcji genomowego DNA |
| Lysing Matrix E FastPrep probówki | MP Biomedicals | 116914500 | Tube wymagane do mechanicznego rozbijania ścian komórkowych bakterii. Ten kod jest używany dla opakowań po 500 tubek, dostępne są mniejsze ilości. |
| Macierz wiążąca | MP Biomedicals | 116540408 | Rozcieńczony w stosunku 1:5 6 M tiocyjanianem guanidyny i stosowany w metodzie ekstrakcji genomowego DNA. |
| Maszyna Fast Prep | MP Biomedicals | Liczba dostępnych opcji | MP Biomedicals posiada wiele maszyn FastPrep dostępnych do zakupu. Więcej informacji można znaleźć na stronie http://www.mpbio.com |
Bibliografia
- Bush, K., et al. Tackling antibiotic resistance. Nature Rev. Microbiol. 9, 894-896 (2011).
- Davies, J., Davies, D. Origins and evolution of antibiotic resistance. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 74 (3), 417-433 (2010).
- Costa, V. M., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
