Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5

15.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52894

⸱

28 stycznia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Virology and Microbiology, Center for Biomedical Education and Research (ZBAF), Department of Human Medicine, Faculty of Health, University Witten/Herdecke

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół generowania wektorów adenowirusowych o dużej pojemności, pozbawionych wszystkich sekwencji kodujących wirusy. Klonowanie transgenów zawartych w genomie wektora opiera się na endonukleazach naprowadzających. Amplifikacja wirusa w komórkach produkcyjnych hodowanych jako komórki adherentne i w zawiesinie opiera się na wirusie pomocniczym dostarczającym geny wirusowe w trans.

Streszczenie

Wektory adenowirusowe o dużej pojemności (HCAdV) pozbawione wszystkich sekwencji kodujących wirusy stanowią jeden z najbardziej zaawansowanych wektorów dostarczania genów ze względu na ich wysoką zdolność pakowania (do 35 kb), niską immunogenność i niską toksyczność. Jednak w wielu laboratoriach stosowanie HCAdV jest utrudnione ze względu na skomplikowaną procedurę budowy genomu wektorowego i produkcji wirusa. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół efektywnego klonowania i produkcji HCAdV w oparciu o plazmid pAdFTC zawierający genom HCAdV. Budowa genomów HCAdV opiera się na systemie wektorów klonujących wykorzystującym endonukleazy naprowadzające (I-CeuI i PI-SceI). Każdy gen o wielkości do 14 kb może zostać subklonowany do wektora wahadłowego pHM5, który zawiera miejsce wielokrotnego klonowania otoczone przez I-CeuI i PI-SceI. Po uwolnieniu transgenu za pośrednictwem I-CeuI i PI-Sce I-Sz wektora wahadłowego, transgen może zostać wprowadzony do wektora klonowania HCAdV pAdFTC. Ze względu na duży rozmiar plazmidu pAdFTC i długie miejsca rozpoznawania użytych enzymów związanych z silnym wiązaniem DNA, konieczne jest ostrożne obchodzenie się z fragmentami klonowania. W celu produkcji wirusa genom HCAdV jest uwalniany przez trawienie NotI i transfekowany do linii komórkowej producenta opartej na HEK293 stabilnie eksprymującej rekombinazę Cre. Aby dostarczyć wszystkie geny adenowirusa do amplifikacji adenowirusa, wymagana jest koinfekcja wirusem pomocniczym zawierającym sygnał pakowania otoczony miejscami loxP. Wstępną amplifikację wektora przeprowadza się w komórkach produkcyjnych hodowanych na powierzchni, a amplifikację wektora na dużą skalę przeprowadza się w kolbach obrotowych z komórkami produkcyjnymi hodowanymi w zawiesinie. W celu oczyszczenia wirusa przeprowadza się dwa etapy ultrawirowania oparte na gradientach chlorku cezu, a następnie dializę. Tutaj przedstawiono porady, triki i skróty opracowane w ciągu ostatnich lat pracy z tym systemem wektorowym HCAdV.

Wprowadzenie

Dla zastosowań terapeutycznych genów bardzo ważne jest unikanie cytotoksycznych i immunogennych skutków ubocznych spowodowanych ekspresją białek wirusowych, samego transgenu lub przez napływające białka wirusowe. Wektory adenowirusowe (AdV) są szeroko stosowane do wprowadzania obcego DNA do wielu różnych komórek w celu zbadania wpływu ekspresji transgenu 1,2. Najbardziej zaawansowana wersja AdV jest reprezentowana przez wektory adenowirusowe o dużej pojemności (HCAdV), pozbawione wszystkich sekwencji kodujących wirusa 3,4, a tym samym oferujące pojemność do 35 kb w połączeniu z niską immunogennością i niską toksycznością 5-8. Ze względu na dużą pojemność pakowania umożliwiają dostarczanie dużych lub wielu transgenów przy użyciu pojedynczej dawki wektora. W związku z tym stanowią one cenne narzędzie dla społeczności naukowej.

W przeciwieństwie do AdV pierwszej lub drugiej generacji, które nie mają wczesnych genów E1 i/lub E3, które można łatwo wytworzyć przy użyciu komercyjnych zestawów, budowa genomu wektora i produkcja wirusa HCAdV jest bardziej złożona. System budowy genomów HCAdV oparty jest na plazmidzie pAdFTC przenoszącym genom HCAdV pozbawiony wszelkich sekwencji kodujących wirusa oraz plazmidzie wahadłowym pHM5 9-12. Każdy gen zainteresowania o wielkości do 14 kilozasad (kb) może zostać sklonowany do wektora wahadłowego pHM5, w którym miejsce wielokrotnego klonowania jest otoczone miejscami rozpoznawania/rozszczepiania endonukleaz naprowadzających PI-SceI i I-CeuI. W związku z tym sklonowany gen będący przedmiotem zainteresowania może zostać uwolniony przez kolejne trawienia PI-SceI i I-CeuI w celu późniejszej ukierunkowanej insercji do tych samych miejsc restrykcyjnych obecnych w genomie HCAdV zawartym w plazmidzie pAdFTC. W pAdFTC miejsce insercji transgenu znajdujące się między miejscami podziału PI-SceI i I-CeuI jest otoczone przez DNA nadziewarki i niekodujące sekwencje adenowirusowe wymagane do pakowania genomu, takie jak odwrócone powtórzenia końcowe 5' i 3' (ITR) na obu końcach oraz sygnał pakowania za 5'ITR. Dodatkowy nadziewarz DNA zapewnia optymalny rozmiar końcowego genomu HCAdV w zakresie od 27 do 36 kb, aby zapewnić wydajne pakowanie podczas produkcji wirusa. Ponieważ pAdFTC jest dużym plazmidem o wielkości do 45 kb (w zależności od wielkości wstawionego transgenu), a użycie endonukleaz naprowadzających się z porównywalnie długimi miejscami rozpoznawania DNA wykazuje silne wiązanie DNA, podczas transferu transgenu z pHM5 do pAdFTC konieczne jest kilka etapów oczyszczania. Zaleca się ostrożne obchodzenie się z siłami ścinającymi.

ITR genomu HCAdV są otoczone przez miejsca rozpoznawania enzymów restrykcyjnych NotI, zlokalizowane bezpośrednio przed 5'ITR i poniżej 3'ITR 12. W związku z tym HCAdV może być uwalniany przez trawienie NotI w celu późniejszej transfekcji genomu wirusa do linii komórkowej producenta HCAdV. Należy zauważyć, że użycie enzymu restrykcyjnego NotI do uwalniania genomu wirusa z plazmidu pAdFTC oznacza, że wstawiony transgen jest pozbawiony miejsc rozpoznawania DNA NotI. Komórki produkcyjne oparte na komórkach HEK293 (116 komórek) stabilnie eksprymują rekombinazę Cre. W celu amplifikacji wirusa 116 komórek jest jednocześnie zakażonych wirusem pomocniczym (HV), dostarczając wszystkie geny AdV potrzebne do replikacji i pakowania w trans 3,4. HV to AdV pierwszej generacji z floksowanym sygnałem upakowania, który jest usuwany podczas amplifikacji wirusa przez rekombinazę Cre wyrażaną w 116 komórkach 4. Gwarantuje to, że genomy HCAdV zawierające nienaruszony sygnał opakowania są zamknięte.

Wstępne wzmacnianie HCAdV odbywa się poprzez przeprowadzanie szeregowych etapów pasażowania w 116 komórkach hodowanych na powierzchniach w naczyniach do hodowli tkankowych. Po każdym przejściu cząsteczki wirusa są uwalniane z zainfekowanych komórek, przeprowadzając trzy kolejne etapy zamrażania i rozmrażania. Z każdym pasażem coraz więcej komórek jest zakażanych 1/3 lizatu komórkowego z poprzedniego pasażu. Na koniec lizat z ostatniego etapu wstępnej amplifikacji jest używany do infekowania komórek produkcyjnych hodowanych w zawiesinie w kolbie przędzarkowej w celu amplifikacji na dużą skalę. Wiriony są oczyszczane z komórek zawiesiny przez ultrawirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu 4,12. Dzięki tej procedurze puste cząstki i w pełni zmontowane cząstki są rozdzielane na dwa odrębne pasma. W celu dalszego zagęszczenia cząstek HCAdV przeprowadza się drugi niestopniowy etap ultrawirowania. Następnie powstałe prążek zawierający HCAdV jest pobierany i dializowany w buforze fizjologicznym. Końcowe preparaty wektorowe są charakteryzowane pod względem liczby bezwzględnych cząstek wirusa, cząstek zakaźnych oraz poziomów zanieczyszczenia HV. Bezwzględne cząstki wirusa można określić przez lizę cząstek wirusa i pomiar absorbancji przy 260 nm lub przez wykonanie ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) 12. Zakaźność oczyszczonych cząstek wirusa można określić za pomocą qPCR mierzącego genomy HCAdV obecne w zakażonych komórkach 3 godziny po zakażeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Budowa rekombinowanych genomów HCAdV na podstawie plazmidu pAdFTC

Uwaga: Wszystkie plazmidy zostały opisane wcześniej 11,12 i są dostępne na życzenie. Procedurę klonowania przedstawiono schematycznie na rysunku 1.

  1. Sklonuj gen będący przedmiotem zainteresowania (GOI), w tym promotor i sygnał poliadenylacji (pA) do plazmidu wahadłowca pHM5, używając wybranej strategii klonowania, aby wygenerować pHM5-GOI.
    UWAGA: Ponieważ pAdFTC jest stosunkowo dużym plazmidem, zaleca się stosowanie klasycznych protokołów przygotowania plazmidu, aby uniknąć rozdrabniania DNA plazmidu przy użyciu komercyjnych zestawów do oczyszczania plazmidu, które są oparte na membranach krzemionkowych. I-CeuI i PI-SceI silnie wiążą się z DNA i zmieniają ruchliwość elektroforetyczną strawionego DNA. Dlatego przed elektroforezą w żelu agarozowym wymagana jest ekstrakcja fenolowo-chloroformowa i wytrącanie EtOH (etap 1.3).
  2. Trawić 20 μg pHM5-GOI i 10 μg pAdFTC za pomocą I-CeuI (10 U) przez 3 godziny w temperaturze 37 °C w całkowitej objętości 100 μl w celu linearyzacji plazmidów (~2,8 kb + sekwencja GOI ORF i ~31 kb, odpowiednio).
  3. Oczyść zlinearyzowane plazmidy za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, a następnie wytrącania etanolu (EtOH) 13.
    1. Dodać 100 μl alkoholu fenolowo-chloroformowego: izoamylowego i delikatnie wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Wirować przez 2 minuty przy 15 000 x g.
    2. Przenieść supernatant do nowej probówki, dodać 20 μl octanu sodu (pH 5,3 M) i 400 μl lodowatego EtOH (99,8%) i energicznie wymieszać zawiesinę. Wirować przez 10 minut przy 15 000 x g.
    3. Usunąć supernatant, dodać 300 μl 70% EtOH i wirować przez 2 minuty przy 15 000 x g. Następnie usuń supernatant i suche na powietrzu osady DNA. Rozpuścić osad w 10-20 μl dH2O. Nie susz osadu DNA zbyt długo, ponieważ trudniej będzie uzyskać DNA w roztworze.
  4. Trawić I-Ceu I-trawione plazmidy pHM5-GOI i pAdFTC z kroku 1.3) przez co najmniej 3 godziny lub O/N za pomocą enzymu restrykcyjnego PI-SceI (10 U) w temperaturze 37 °C w całkowitej objętości 50 μl, a następnie oczyścić plazmidy strawione przez I-CeuI i PI-Sce I za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, a następnie wytrącania EtOH (patrz krok 1.3). Rozpuścić DNA w 20 μl dH2O.
  5. Oddziel szkielet plazmidowy pHM5 (2,8 kb) i GOI (od kroku 1.4) na preparatywnym żelu agarozowym i oczyść goi żelem za pomocą dostępnego zestawu do czyszczenia żelem i PCR. Reprezentatywny żel agarozowy z trawienia jest pokazany na rysunku 2A.
  6. Defosforylować I-CeuI i PI-Scetrawiony przez I pAdFTC (od kroku 1.4) za pomocą fosfatazy alkalicznej jelitowej cielęcej (10 U) przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w całkowitej objętości 25 μl i oczyszczać zdefosforylowany plazmid pAdFTC przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie wytrącanie EtOH (etap 1.3). Eluować DNA w 20 μl dH2O.
  7. Przeprowadzić analityczną elektroforezę żelową z podwielokrotności defosforylowanego plazmidu pAdFTC (z kroku 1.6) i oczyszczonego fragmentu GOI (z kroku 1.5), aby przeanalizować, czy trawienie jest kompletne, a rozmiary oczekiwanych fragmentów są prawidłowe (~31 kb dla zlinearyzowanego pAdFTC).
    Uwaga: Wielkość GOI jest zmienna w zależności od wielkości kasety ekspresji transgenu. Oszacuj względne stężenia odpowiednich fragmentów do późniejszego podwiązania. Reprezentatywny żel agarozowy złożony z oczyszczonych fragmentów pokazano na rysunku 2B.
  8. Ustawić reakcję ligacji w całkowitej objętości 20 μl, używając 400 U ligazy DNA T4 i stosunku molowego wektora do wstawki 1:3,
    UWAGA: Zgodnie z żelem agarozowym pokazanym na rysunku 2B zwykle podwiązujemy w całkowitej objętości 20 μl z wektorem 2-6 μl, wkładką 8-12 μl i 400 U ligazy DNA T4. Ponieważ stężenie DNA jest zwykle niskie po kilku etapach fenolizacji, należy użyć jak największej ilości DNA, aby nie trzeba było dodawać dodatkowegoH2O, aby osiągnąć końcową objętość 20 μl. Odwiązywać w temperaturze 16 °C O/N, a następnie przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie wytrącać EtOH (etap 1.3).
    1. Eluować DNA w 15 μl wolnego od nukleazdH2O i trawić oczyszczoną reakcję ligacji enzymem restrykcyjnym SwaI (10 U) przez 2 godziny w temperaturze 25 °C w całkowitej objętości 20 μl. Następnie zagęścić i oczyścić DNA, wykonując ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie wytrącając EtOH (krok 1.3). Eluować DNA w 10 μl dH2O.
  9. Przekształć 2 μl oczyszczonego produktu ligacji strawionego SwaI przez elektroporację w elektrokompetentne E. coli DH10B lub DH5α i wybrać klony przez 16 -24 godziny w temperaturze 37 °C na płytkach LB zawierających ampicylinę (50 mg/ml ampicyliny). Wybierz 5-10 klonów i przygotuj minipreparaty plazmidowego DNA za pomocą lizy alkalicznej, a następnie ekstrakcji fenolowo-chloroformowej, a następnie wytrącania EtOH (krok 1.3) 13.
  10. Przeprowadzić analityczny przegląd minipreparatów plazmidowych, a następnie elektroforezę w żelu agarozowym w celu sprawdzenia wielkości fragmentów DNA. Sugerowane enzymy restrykcyjne to na przykład I-CeuI i PI-SceI uwalniające wkładkę, SpeI lub HincII (ryc. 2C).
  11. Amplifikować prawidłowy klon w pożywce LB zawierającej ampicylinę (50 mg/ml ampicyliny) i wykonać preparat plazmidu midi- lub maxi, używając dowolnego dostępnego na rynku zestawu do oczyszczania plazmidu.

2. Uwolnienie genomów HCAdV z plazmidu pAdFTC i preamplifikacja wektorów HCAdV w linii komórkowej producenta 116

  1. Trawić 20 μg plazmidu do produkcji adenowirusa na bazie pAdFTC, zawierającego sklonowany rząd Indonezji z kroku 1.11, w całkowitej objętości 100 μl, używając NotI (20 U) w temperaturze 37 °C przez >2 godz. i dwukrotnie przeprowadzić ekstrakcję fenolowo-chloroformową, a następnie wytrącić EtOH. Rozpuścić w 20-30 μl sterylnego dH2O.
  2. Sprawdzić podwielokrotność rozcieńczonego, strawionego pAdFTC-GOI-DNA w stosunku 1:10 za pomocą elektroforezy żelowej. Wykrywalny jest fragment 9 kb dla szkieletu plazmidu i, w zależności od wielkości GOI, drugi fragment DNA dla genomu HCAdV (rozmiar: 28-36 kb).
    UWAGA: Reprezentatywny przykład skrótu NotI przedstawiono na rysunku 2D. Zlinearyzowane DNA może być przechowywane przez kilka dni w temperaturze 4 °C lub w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
  3. Przed przystąpieniem do korzystania z protokołu należy upewnić się, że wirus pomocniczy AdNG163R-2 został amplifikowany do wersji 4.
    Uwaga: Komórki transfekowane wektorami HCAdV pochodzącymi z pAdFTC są organizmami modyfikowanymi genetycznie sklasyfikowanymi jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), należy stosować odpowiednie środki ograniczające rozprzestrzenianie się i postępowanie z odpadami, w tym środki ochrony osobistej, oraz pracować pod okapami z przepływem laminarnym BSL-2.
  4. Hodowla 116 komórek w pożywce MEM eagle uzupełnionej 10% FBS i higromycyną B (100 μg/ml). Wysiewaj nasiona o niskim pasażu (poniżej pasażu 10): 116 komórek (~0,4 x 10,6 komórek) w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej na jeden dzień przed transfekcją, tak aby następnego dnia osiągnęły 50-80% zbieżności.
  5. Transfekcja linearyzowanego genomu HCAdV od kroku 2.1 do 116 komórek przy użyciu metod, takich jak transfekcja fosforanu wapnia lub inne dostępne na rynku odczynniki do transfekcji (Figura 3A). 16-18 godzin po transfekcji, ostrożnie usuń pożywkę, dodaj 3 ml świeżej pożywki (MEM, 5% FBS) i zainfekuj komórki HV AdNG163R-2 4 stosując 5 jednostek transdukcyjnych (TU) na komórkę (ponieważ zlewające się 60-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej zawiera ~3,2 x 106 komórek, dodać ~1,6 x 107 TU WN).
    1. Delikatnie przesuwaj naczynie co 20 minut przez pierwszą godzinę po zakażeniu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie HV. Hodować zakażone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . W przypadku skutecznej amplifikacji wirusa, efekt cytopatyczny (CPE) spowodowany replikacją wirusa (komórki są zaokrąglone i luźno przyczepione lub oderwane od naczynia do hodowli tkankowej) jest obserwowany 48 godzin po zakażeniu. Jeśli CPE zostanie zaobserwowany wcześniej, ilość HV musi zostać zmniejszona. Jeśli CPE uruchomi się później, trzeba użyć więcej wirusa pomocniczego.
  6. Zebrać komórki, w tym supernatant, 48 godzin po zakażeniu, wypłukując komórki z szalki hodowlanej za pomocą pożywki hodowlanej. Komórki, które są zawieszone w pożywce hodowlanej, nazywane są pasażem 0 (P0). Podziel P0 na dwie frakcje.
    1. Z 0,5 ml oderwanych komórek wirować komórki przez 3 minuty w temperaturze 2,000 x g i usuwać pożywkę z osadu komórkowego, która jest później wykorzystywana do izolowania genomowego DNA (gDNA) do analizy procesu amplifikacji opartej na qPCR. Przechowywać granulki komórkowe w temperaturze -20 °C do czasu dalszej obróbki.
    2. Z 2,5 ml oderwanych komórek uwalnia się cząsteczki wirusa poprzez zamrożenie (w temperaturze -80 °C lub w ciekłym azocie) i rozmrożenie (w temperaturze pokojowej lub w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C) komórek, które są ponownie poddawane ich pożywce trzy do czterech razy. Ta frakcja jest wtedy nazywana lizatem P0.
  7. Upewnij się, że szalki do hodowli tkankowej ze 116 komórkami, które są hodowane do 90-95% zbiegu przy użyciu pożywki MEM uzupełnionej FBS (10%) i higromycyną B (100 μg/ml) i HV są dostępne dla następujących etapów pasażowania.
  8. Zmieszać 1 ml świeżej pożywki (MEM, 5% FBS) z 2,5 ml lizatu z poprzedniego pasażu (etap 2.6.2) do końcowej objętości 3,5 ml, dodać HV stosując 2 TU na komórkę (ponieważ 60-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej przy zbiegu 90-95% zawiera ~3,2 x 106 komórek, dodać ~6,4 x 106 TU HV). (Rysunek 3B). Ostrożnie wyjmij pożywkę z 60-milimetrowej płytki ze 116 komórkami i dodaj mieszaninę wirusową do komórek. Powtórzyć krok 2.6-2.8 dwukrotnie, aby uzyskać lizaty pasaży P1 i P2.
  9. Wymieszaj 17,5 ml świeżej pożywki (MEM, 5% FBS) z 2,5 ml lizatu z P2 i dodaj HV, stosując 2 TU na komórkę (ponieważ 150-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowej przy zbiegu 80-100% zawiera ~2 x 107 komórek, dodaj ~4 x 107 TU HV). Usuń pożywkę z 150-milimetrowej płytki zawierającej 116 komórek i zainfekuj komórki mieszaniną wirusów. Hodować zakażone komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  10. 48 godzin po infekcji pobierz komórki, jak opisano w kroku 2.6, aby uzyskać pasaż P3 (Figura 3B).
    1. Powtórz krok 2.6.1.
    2. Z pozostałych 19,5 ml P3 uwalniaj cząsteczki wirusa z regenerowanych komórek poprzez zamrażanie i rozmrażanie 3-4x. Ta frakcja jest wtedy nazywana lizatem P3,
      nuta: Niektóre wektory mogą w końcu wymagać dodatkowych przejść w czaszkach o średnicy 150 mm, dopóki nie zostaną wystarczająco wzmocnione. W związku z tym efektywność procesu wstępnego wzmacniania musi być monitorowana podczas przejścia szeregowego. Analizę procesu amplifikacji opartą na qPCR można przeprowadzić zgodnie z opisem w sekcji 3 (patrz również rysunek 4A). Wstępne amplifikowanie HCAdV przenoszące kasetę ekspresyjną dla białka zielonej fluorescencji (GFP) można łatwo ocenić, obserwując sygnał fluorescencyjny GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (Figura 4B).

3. Monitorowanie procesu amplifikacji za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) (zobacz również rysunek 4A).

  1. Wyizolować gDNA z osadów komórkowych z każdego przejścia preamplifrakcji (kroki 2.6-2.10) przy użyciu dowolnego dostępnego na rynku zestawu do izolacji DNA do izolacji gDNA z hodowanych komórek lub innej metody z wyboru. Aby uzyskać optymalne wyniki PCR, używaj gDNA tak świeżego, jak to możliwe. W przeciwnym razie gDNA może być przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
  2. Aby określić liczbę genomów HCAdV obecnych w komórkach odpowiedniego pasażu za pomocą analizy qPCR, należy wygenerować krzywą wzorcową przy użyciu 10,1-10,9 kopii plazmidu przenoszącego GOI zawarty w genomie HCAdV.
  3. Przeanalizuj tę samą ilość gDNA z P0-P3 (krok 2.6-2.10), stosując qPCR przy użyciu 400 nM starterów specyficznych dla GOI zawartych w genomie HCAdV. W celu przeprowadzenia qPCR postępuj zgodnie z instrukcjami producenta odpowiednich chemikaliów qPCR. Ustaw program qPCR w następujący sposób: wstępna inkubacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, amplifikacja w 40 cyklach po 95 °C przez 10 sekund, 55-60 °C przez 15 sekund i 72 °C przez 20 sekund. Na podstawie krzywej standardowej można interpolować liczbę genomów HCAdV w reakcji.

4. Wielkoskalowe wzmocnienie wektorów HCAdV w 116 komórkach rosnących w zawiesinie

  1. Dodać 900 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) świeżego MEM uzupełnionego 10% FBS i higromycyną B (100 μg/ml) do 3-litrowej kolby hodowlanej typu spinner (ryc. 3B).
  2. Usunąć pożywkę z co najmniej 10 pojedynczych naczyń do hodowli tkankowych o średnicy 150 mm ze 116 komórkami wyhodowanymi w zbiegu 90-100% i wypłukać komórki 10 ml świeżej, wstępnie ogrzanej (37 °C) MEM uzupełnionej FBS (10%) i higromycyną B (100 μg/ml) za pomocą pipety serologicznej. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Przenieść komórki bezpośrednio do kolby obrotowej zawierającej już 900 ml z kroku 4.1.
    nuta: Nie należy stosować trypsyny/EDTA, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na wzrost komórek zawiesinowych. Po usunięciu pożywki natychmiast przenieść komórki do kolby przędzarkowej. Nie dotykaj jednocześnie więcej niż dwóch szalek do hodowli tkankowych. Im dłuższy czas oczekiwania po dodaniu świeżej pożywki, tym trudniej będzie oderwać komórki od naczynia do hodowli tkankowej.
  3. Aby zapewnić optymalny wzrost komórek, inkubować kolbę wirową na mieszadle magnetycznym w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Ustaw mieszadło magnetyczne na 70 obr./min, aby uniknąć przyklejania się komórek do szklanych powierzchni.
  4. Monitorować wzrost komórek w kolbie do hodowli spinnerów, aby zbadać, czy komórki hodowane w kolbie do hodowli spinnerów są żywotne i czy rosną do wystarczających ilości. Za każdym razem, przed dodaniem świeżej pożywki, przenieść 2 ml z bioreaktora do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 60 mm. Obserwuj morfologię komórek pod mikroskopem.
    nuta: Komórki tworzące grudki unoszące się w pożywce hodowlanej wskazują na optymalny wzrost i żywotność (patrz również ryc. 4C). Po 24 godzinach tworzą kolonie na powierzchni szalki do hodowli tkankowej. Zbieg 30-50% wskazuje na optymalną gęstość.
  5. Po 24 godzinach od ustawienia kolby hodowlanej należy dodać 500 ml świeżej pożywki (MEM, 10% FBS) uzupełnionej higromycyną B (100 μg/ml). 24 godziny później powtórzyć ten krok.
  6. 72 godziny po ustawieniu kultury przędzalniczej dodać 1 000 ml świeżej pożywki MEM (10% FBS) z higromycyną B (100 μg/ml), co daje całkowitą objętość 3 l zawiesiny komórek.
  7. Po 24 godzinach od osiągnięcia objętości trzech litrów, zebrać 116 komórek zawiesiny przez odwirowywanie przez 10 minut przy 500 x g w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant. Opróżnioną kolbę do hodowli metodą spinnera należy przechowywać pod kapturem do hodowli tkankowych.
  8. Zawiesić granulki komórkowe w świeżym MEM uzupełnionym 5% FBS, pipetując w górę iw dół około 8-10 razy, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Objętość pożywki zależy od tego, czy lizat z kroku 2.10.2. (19,5 ml, patrz krok 4.8.1. opcja a) lub oczyszczony zapas wirusowy HCAdV z kroku 5.9.2. (kilka μl w zależności od miana wirusa, patrz krok 4.8.2, opcja b) stosuje się do zakażenia komórek. Użyj całkowitej objętości 150 ml.
    1. Opcja a: W przypadku zakażenia 116 komórek zawiesinowych lizatem z P3 (amplifikacja pierwotna) przenieś komórki z kroku 4.8) do butelki o pojemności 250 ml wyposażonej w sterylne mieszadło magnetyczne lub 250-mililitrową małą kolbę obrotową i współinfekuj komórki wirusem w lizacie z P3 (etap 2.10.2) i 2 TU HV na komórkę. Zakładając gęstość 3 x 105 komórek na ml, całkowita liczba komórek wynosi 9 x 108 komórek. W ten sposób dodaj 1,8 x 109 TU WN.
    2. Opcja b: W przypadku zakażenia 116 komórek zawiesinowych oczyszczonym materiałem wirusowym, przenieść komórki z kroku 4.8 do butelki do przechowywania o pojemności 250 ml wyposażonej w sterylne mieszadło magnetyczne lub 250-mililitrową małą kolbę przędzalniczą i jednocześnie zainfekować komórki 100 cząstkami wirusa na komórkę uprzednio oczyszczonego HCAdV (od kroku 5.9.2). W ten sposób dodać 9 x 1010 VP zgodnie z mianem fizycznym (mierzonym przez absorbancję przy 260 nm; krok 6) oczyszczonego HCAdV i 1,8 x 109 TU HV.
  9. Mieszaninę komórka-wirus z 4.8.1 lub 4.8.2 wymieszać na mieszadle magnetycznym w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5%CO2 przez 2 godziny przy 60 obr./min. Upewnij się, że butelka do przechowywania nie jest całkowicie zamknięta, aby umożliwić cyrkulację powietrza.
  10. 2 godziny po zakażeniu przenieść całkowitą objętość mieszaniny komórka-wirus z powrotem do 3-litrowej kolby hodowlanej typu spinner, a następnie dodać 1 850 ml świeżej, wstępnie ogrzanej (37 °C) pożywki MEM uzupełnionej 5% FBS do całkowitej objętości 2 l i inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 48 godzin przy 70 obr./min.
  11. Zbierać komórki przez wirowanie przez 10 minut przy 890 x g w temperaturze pokojowej w probówkach wirówkowych o pojemności 500 ml. Usunąć pożywkę i ponownie zawiesić granulowane komórki w łącznej objętości 28 ml DPBS. Pipetować w górę i w dół, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek. Zamrozić zawiesinę wirusa komórkowego w ciekłym azocie lub w temperaturze -80 °C, upewniając się, że zawiesina jest całkowicie zamrożona. Zawiesinę wirusa komórkowego przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu rozpoczęcia oczyszczania wirusa.

5. Oczyszczanie i dializa HCAdV

  1. Aby przygotować lizat wirusowy dla gradientów chlorku cezu (CsCl), należy zamrozić zawiesinę wirusa komórkowego z kroku 4.11 w ciekłym azocie i rozmrozić w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C 4x.
  2. Odwirować lizat wirusa przy 500 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant zawierający HCAdV.
  3. Do ultrawirowania przygotuj roztwory CsCl w następujący sposób. Odważyć odpowiednio 37,5 g (dla 1,5 g/cm3), 33,5 g (dla 1,35 g/cm3) i 31,25 g (dla 1,25 g/cm3) proszku CsCl i napełnić dH2O do 25 ml.
    1. Mieszaj, aż roztwór stanie się klarowny i sterylny, przefiltruj roztwory. Na koniec pobrać 1 ml każdego roztworu i zważyć go na drobnej skali, aby sprawdzić, czy gęstość jest prawidłowa. 1 ml powinien ważyć odpowiednio 1,5 g, 1,35 i 1,25 g.
    2. Jeśli gęstość jest zbyt wysoka, dostosuj ją poprzez stopniowe dodawanie małych objętości (μl) sterylnego dH2O. Po dH2O ponownie zmierzyć gęstość. W razie potrzeby dodać więcej dH2O.
    3. Powtarzaj procedurę, aż gęstość będzie prawidłowa. Jeśli gęstość jest zbyt niska, dostosuj ją, dodając niewielką ilość proszku CsCl. Sterylnie przefiltruj go ponownie i sprawdź gęstość. Jeśli gęstość jest zbyt wysoka, dostosuj ją, dodającdH 2O, jak opisano wcześniej. Jeśli gęstość jest nadal zbyt niska, dodaj mor CsCl, sterylnie przefiltruj go ponownie i sprawdź gęstość. Powtarzaj procedurę, aż gęstość będzie prawidłowa.
  4. Przygotuj gradienty krokowe CsCl w 6 przezroczystych probówkach ultrawirówek. Ostrożnie i powoli pipetować roztwory CsCl do probówek, w następującej kolejności: 0,5 ml roztworu3 CsCl o stężeniu 1,5 g/cm, 3 ml roztworu3 CsCl o stężeniu 1,35 g/cm i 3,5 ml roztworu o stężeniu 1,25 g/cm3 CsCl (Rysunek 2C).
  5. Nałóż ~4,5 ml oczyszczonego supernatantu wektorowego z kroku 5.2 na warstwę 1,25 g/cm3 CsCl. Odwirować gradienty w ultrawirówce za pomocą odchylanego rotora (SW-41) w temperaturze 12 °C przez co najmniej 2 godziny przy 226 000 x g (35 000 obr./min) z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem w celu oddzielenia genomu HCAdV zawierającego cząstki wirusa od pustych cząstek i resztek komórkowych.
    UWAGA: W optymalnych warunkach na wierzchu probówek tworzy się rozproszony pas resztek komórek. Poniżej można zaobserwować dwa białe paski. Górne pasmo zawiera puste cząstki, podczas gdy dolne pasmo jest równe HCAdV (rysunki 2C i 5A).
  6. Ostrożnie usunąć warstwy resztek komórkowych i pustych cząstek, zebrać 1 ml dolnych pasm z każdej probówki i przenieść wirusa za pomocą czystej końcówki pipety do sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Dodać do zebranych cząsteczek wirusa do 24 ml roztworu o stężeniu 1,35 g/cm, 3 CsCl i dokładnie wymieszać.
  7. Napełnij probówki wirówkowe roztworem wirusa CsCl o stężeniu 1,35 g/cm3 CsCl do góry i odwiruj O/N (18-20 h) przy 226 000 x g (35 000 obr./min) w temperaturze 12 °C w ultrawirówce za pomocą odchylanego wirnika (SW-41) z powolnym przyspieszaniem i zwalnianiem.
  8. Zbierz HCAdV obecny w widocznym dolnym paśmie. Ponieważ potencjalny górny pasek zawiera puste cząstki, usuń górne warstwy z góry za pomocą pipety (patrz rysunki 2C i 5B), a następnie usuń dolny pasek za pomocą pipety.
  9. Dializuj zebrane cząsteczki wirusa w celu wymiany buforu.
    1. Odetnij pasek rurki do dializy (MWCO: 50 000) o długości około 8 cm, umyj go sterylnym dH2O przez 3 razy. Następnie zamknij jedną stronę rurki dializacyjnej plastikowym zaciskiem i przenieś pobranego wirusa z kroku 5.8 do rurki za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Unikaj pęcherzyków powietrza w przewodach i zamknij je z drugiej strony plastikowym zaciskiem do dializy.
    2. Dializować w 1 l buforu dializacyjnego (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10% glicerolu i 1 mM MgCl2 w dejonizowanymH2O) przez 2 godziny w temperaturze 4 °C, powoli mieszając. Wymienić bufor dializacyjny na 2 litry buforu dializacyjnego i dializować O/N w temperaturze 4 °C, powoli mieszając. Alternatywnie można użyć buforu sacharozowego (140 mM NaCl, 5 mM Na2HPO4x2H2O, 1,5 mM KH2PO4 i 730 mM sacharozy, pH 7,8).
    3. Zebrać dializowane cząsteczki wirusa z kroku 5.9.2. za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Przygotować wiele porcji o żądanych małych objętościach (25-100 μl) i przechowywać oczyszczony wirus w temperaturze -80 °C.

6. Pomiar fizycznego miana końcowych preparatów HCAdV za pomocą gęstości optycznej (OD)

  1. Rozcieńczyć 25 μl końcowego przygotowania wektora z kroku 5.9.2 475 μl buforu do lizy (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS)), delikatnie wstrząsać przez 20 minut w temperaturze pokojowej i na koniec odwirowywać przez 2 minuty w temperaturze pokojowej przy 15 000 x g.
  2. Ponieważ wartości absorbancji przy 260 nm (A260) są zwykle niskie, należy zmierzyć absorbancję 4x przy użyciu 100 μl supernatantu i obliczyć średnią wartość z czterech pomiarów. Obliczyć liczbę cząstek wirusa na ml (vp/ml) za pomocą następującego wzoru: vp/ml = (średnia A260) x (20) x (1,1 x10 12) x (36 kb / wielkość HCAdV w kb).
    UWAGA: Wyniki typowego plonu bezwzględnych cząstek wirusa (miano OD) przedstawiono na rysunku 7A. Doświadczenie pokazuje, że miano OD zawyża liczbę cząsteczek wirusa. Bezwzględne cząstki wirusa mierzone za pomocą OD mogą być 20-100 razy wyższe niż zakaźne cząstki wirusa mierzone za pomocą q-PCR. Bardziej precyzyjny pomiar absoltowych i zakaźnych cząstek HCAdV, a także zanieczyszczenia HV metodą q-PCR znajduje się w sekcji 7.

7. Pomiar całkowitych cząstek, jednostek zakaźnych poziomów skażenia HCAdV i HV w końcowym przygotowaniu wektora metodą qPCR. Schemat procedury miareczkowania przedstawiono na rysunku 6

  1. Umieść komórki HEK293 w 6- lub 12-dołkowych płytkach do hodowli tkankowej, tak aby komórki osiągnęły 90% zbieżności następnego dnia. Aby określić liczbę zakaźnych cząstek wirusa (miano zakaźne), należy zainfekować komórki jednej studzienki na płytce wielodołkowej z 1 μl i drugiej studzienki z 10 μl oczyszczonego wirusa z kroku 5.9.3.
  2. Zbierz komórki 3 godziny po infekcji. Usunąć pożywkę i dodać trypsynę, aby przykryć całą studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut. Spłucz komórki trypsyną za pomocą pipety i wiruj komórki przy 890 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  3. Ponownie zawiesić granulowane komórki w 200 μl DPBS i dokładnie je umyć, aby usunąć wolne (niezakaźne) cząstki wektora. Wirować przez 3 minuty przy 890 x g przy wilgotności względnej. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulki komórek w 200 μl świeżego DPBS.
    Uwaga: W celu dokładnego określenia miana zakaźnego ważne jest, aby usunąć wszystkie niezakaźne cząsteczki wirusa z powierzchni komórek poprzez leczenie trypsyną i dokładne mycie.
  4. Aby określić całkowitą liczbę cząstek wirusa (cząstki infekcyjne i cząstki niezakaźne = miano fizyczne), należy pobrać niezakażone komórki HEK293 z 2 dołków bez trypsyny, wypłukując komórki pożywką hodowlaną za pomocą pipety.
  5. Wirować komórki przez 3 minuty w temperaturze 890 x g w temperaturze pokojowej. Wyrzucić pożywkę i ponownie zawiesić granulowane komórki w 200 μl DPBS. Następnie dodać odpowiednio 1 μl i 10 μl oczyszczonego preparatu HCAdV bezpośrednio do komórek. Użyj niezakażonych komórek jako tła, aby zapewnić te same warunki do izolacji gDNA i późniejszego q-PCR.
  6. Wyizoluj gDNA z komórek HEK293 pochodzących z kroków 7.3 i 7.5
    1. Komórki wirowe zawiesić w 200 μl DPBS (kroki 7.3 i 7.4) przez 3 sekundy, dodać 200 μl roztworu SDS. (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM EDTA (pH 8,0), 0,5% SDS) i 20 μl proteinazy K (20 mg/ml) i zawiesina wirowa przez 3 sek. Inkubować 12-16 godzin w temperaturze 55 °C i powoli wstrząsać. Następnie dodać 2 μl RNAzy A (20 mg/ml) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
    2. Dodać 350 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego i wirować przez 2 minuty przy 15 000 x g. Przenieść supernatant do nowej probówki i powtórzyć ten krok raz.
    3. Przenieść supernatant do nowej probówki, dodać 50 μl octanu sodu (pH 5,3 M) i 1 ml lodowatego EtOH (99,8%) i wymieszać zawiesinę. Odwiruj próbki przez 10 minut przy 15 000 x g w celu osadzenia genomowego DNA.
    4. Następnie usunąć supernatant, dodać 500 μl 70% EtOH i odwirować przez 2 minuty przy 15 000 x g. Usunąć supernatant, dodać 500 μl 70% EtOH i wstrząsać przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie wirować przez 2 minuty przy 15 000 x g.
    5. Usunąć supernatant i wysuszyć na powietrzu osad DNA. Nie susz granulek DNA przez długi czas, ponieważ trudniej będzie uzyskać gDNA w roztworze. Zawiesić osad DNA w 120 μl dH2O i inkubować przez ~ 1 godzinę w temperaturze 37 °C, wytrząsając. Jeśli roztwór DNA wydaje się lepki, potrząsaj nim przez kilka godzin w temperaturze 37 °C lub inkubuj w temperaturze 55 °C przez ~1 godzinę.
  7. Aby określić zakaźne cząstki HCAdV i bezwzględne cząstki HCAdV, wygeneruj krzywą standardową 101-10 8 kopii plazmidu przenoszącego GOI zawarty w genomie HCAdV.
  8. Określ całkowite cząstki i cząstki zakaźne, analizując te same ilości gDNA zakażonych komórek HEK293 z kroku 7.3 i 7.4, zastosuj qPCR przy użyciu 400 nM starterów specyficznych dla GOI zawartych w genomie HCAdV.
  9. Ustaw program PCR w następujący sposób: wstępna inkubacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, amplifikacja w 40 cyklach w temperaturze 95 °C przez 10 sekund, 55 °C przez 10 sekund i 72 °C przez 20 sekund. Na podstawie krzywej standardowej (krok 7.7) należy przeprowadzić interpolację całkowitej liczby genomów adenowirusowych w reakcji.
  10. Obliczyć liczbę genomów adenowirusowych w końcowym preparacie wektorowym, korzystając z następującego wzoru: (liczba HCAdV / waga w ng gDNA w reakcji) x (waga w ng DNA wszystkich komórek w zakażonym naczyniu / objętość wirusa w μl).
    UWAGA: Typowy zakres wydajności bezwzględnych i zakaźnych cząstek wirusa wynosi około 1 x 107-1 x 108 cząstek wirusa/μl. Miana, które są dziesięciokrotnie wyższe lub niższe niż pokazane tutaj, można uznać za normalne. Wyższe miana byłyby poprawą. Jeśli chodzi o stosunek bezwzględnych cząstek HCAdV do zakaźnych cząstek HCAdV, doświadczenie pokazuje, że około 5-10% bezwzględnych cząstek HCAdV jest zakaźnych (ryc. 7A).
  11. Aby określić poziomy zanieczyszczenia HV, należy przeprowadzić qPCR poprzez amplifikację części adenowirusowego późnego genu 3 (L3) obecnego w genomie HV. Użyj plazmidu przenoszącego późny gen adenowirusa 3 (L3), aby wygenerować krzywą standardową (krok 7.7).
  12. W tej reakcji zastosować 400 nM starterów L3 forward 5'-AGA, AGC, TTA, GCA, TCC, GTT, ACT, GTG, GTT, GG-3' i L3, reverse 5'-ATA, AGC TTG, CAT GTT GGT ATG, CAG, GAT, GG-3' wraz z 300 nM sondy specyficznej dla L3, 5'-Fam-CCA, CCC, GTG, TGT, ACC, TGG, TGG, ACA-Tamra-Tamra-3'.
  13. Ustaw program PCR w następujący sposób: wstępna inkubacja/aktywacja w temperaturze 95 °C przez 10 minut, amplifikacja podczas 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 sekund i 60 °C przez 1 minutę. Do reakcji qPCR należy użyć dowolnej uniwersalnej sondy PCR mastermix. Na podstawie krzywej wzorcowej (krok 7.7) obliczyć liczbę zakaźnych cząstek HV w końcowym przygotowaniu wektora. Patrz (Rysunek 7A) dla typowych plonów dla cząstek HV.
  14. Na koniec należy obliczyć stosunek bezwzględnych cząstek zakaźnych HCAdV do poziomów zanieczyszczenia HV, aby ocenić jakość preparatu wektorowego.
    UWAGA: Do tej pory nie można było wykluczyć niewielkiej części pozostałej wysokości narządu. Zwykle procent zanieczyszczenia HV wynosi ~5% cząstek zakaźnych lub mniej, co jest dopuszczalne (ryc. 7B). Oczywiście pożądane jest jak najmniejsze HV, zwłaszcza jeśli preparat wektorowy ma być używany do eksperymentów na zwierzętach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiono reprezentatywne przykłady klonowania, amplifikacji i oczyszczania preparatów HCAdV. Przedstawiono przegląd strategii klonowania (Rysunek 1) oraz reprezentatywne przykłady klonowania i uwalniania genomu HCAdV poprzez trawienie enzymami restrykcyjnymi (Rysunek 2). Pokazano typowy obraz restrykcyjny po uwolnieniu kasety ekspresyjnej GOI z pHM5 za pomocą trawienia PI-SceI i I-CeuI oraz następującej po nim ekstrakcji fenolowo-ch...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony tu protokół pozwala na oczyszczanie wektorów HCAdV na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5 w oparciu o wcześniej opisane procedury 4,12. Genom HCAdV w plazmidzie pAdFTC jest pozbawiony wszystkich genów adenowirusa i przenosi tylko 5'- i 3'- ITR oraz sygnał pakowania. W tej strategii HV AdNG163R-2 4 dostarcza wszystkich genów niezbędnych do wydajnej produkcji wirusa w trans. Oferuje to pojemność pakowania do 35 kb, co wyraźnie przewyższa AdV pierwszej i drugiej generacji lub szer...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant DFG EH 192/5-1 (A.E.), unijny (E-rare-2) projekt Transposmart (A.E.), UWH Forschungsförderung (E.S. i W.Z) oraz program doktorancki Uniwersytetu Witten/Herdecke (P.B.). J.L. był wspierany przez stypendium Chińskiej Rady Stypendialnej, a T.B. i M.G przez fundację Else Kröner-Fresenius (EKFS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CeuINew England BiolabsograniczeńR0699S
PI-SceINew England BiolabsPrzegląd ograniczeńR0696S
Ligaza T4 NewEngand BiolabsM0202Sligacja
SwaINew England BiolabsPrzegląd ograniczeń R0604S
NotINew England BiolabsPrzegląd ograniczeń R0189S
Fosfataza alkaliczna jelit cieląt ()New England BiolabsM0290Sdefosforylacja strawionych plazmidów
Hygromycyna BPAN BiotechP02-015wybór CRE wyrażających 116 komórek
DMEMPAN BiotechP04-03590     Pożywka do hodowli komórkowych Hek293T
Pożywka do hodowli komórkowych Minimal Essential Medium (MEM) EaglePAN BiotechP04-08500116   
Dulbecco' s bufor fosforanowy sól fizjologiczna (DPBS)PAN BiotechP04-36500mycie komórek, ponowne zawieszenie komórek
Butelka CLS430281 do przechowywania 250 mlZakażenie116 komórek hodowanych w zawiesinie
500 ml PP CentrifugeTubesSigmaCLS431123-36EAsedymentacja komórek z hodowli zawiesinowej
Kolba obrotowaBellco1965-61030wzrost 116 komórek w zawieszenie
Ultra Clear Ultra Probówki do ultrawirówekgradinie gęstości344059 Beckmann Coulter
Ultrawirówkaw gradinie gęstościBeckmann Coulter
SW-41 Wirowaniew gradionym kącie gęstościBeckmann Coulter
Spectrum Laboratories Spectrapor MembranaVWR132129rurki dializacyjne
Gotowe do użycia kasety do dializy Thermo66383dializa
one shot DH10B elektrokompetentna E. coliinvitrogenC4040-52transformacja reakcji ligacji
PureYield Plasmid Midiprep SystemPromegaA2495midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit Peqlab12-3396-02izolacja genomowego DNA
SuperFect Odczynnik do transfekcjiQiagen301305transfekcja 116 komórek
opti MEM (10% FBS)Gibco31985-062transfekcja 116 komórek
iQ SYBR Green SupermixBioRad  170-8882q-PCR
CFX 96 C1000 dotykowy Maszyna do qPCRBiorad
Fenol/Chloroform/Alkohol izoamylowy Carl RothA156.1oczyszczanie DNA
Chlorek cezuCarl Roth8627.1wirowanie w gradimencie gęstości
octan sodu 99%Carl Roth6773.2Wytrącanie DNA
LB średnie Carl RothX968.3bakteryjne podłoże wzrostowe
etanol  99,8% czystyCarl Roth9065,5 Wytrącanie i mycie DNA
SDS 99,5%Carl Roth2326.2liza  bufor
EDTACarl Roth8043.2liza  bufor
Tris-HCl 99%Carl Roth9090.3bufor do dializy  bufor
glicerynowy 99,5%Carl Roth3783.1bufor do dializy
MgCl2 98,5%Carl RothKK36.2Bufor do dializy
NaClCarl Roth3957.1opcjonalny bufor dializacyjny
KH2PO4Carl Roth3904.2opcjonalny bufor do dializy
sacharozaCarl Roth9286.1opcjonalny bufor do dializy
Na2HPO4x2H2OCarl Roth4984.2Opcjonalny bufor do dializy
1,5 ml probówkiSarstedt72,730,005Przechowywanie preparatów wirusowych w temperaturze -80 &; Z
Przegląd Wirowanie w Wirowanie

Bibliografia

  1. Benihoud, K., Yeh, P., Perricaudet, M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 10 (5), 440-447 (1999).
  2. Crystal, R. G. Adenovirus: the first effective in vivo gene delivery vector. Hum Gene Ther. 25 (1), 3-11 (2014).
  3. Parks, R. J., et al. A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (24), 13565-13570 (1996).
  4. Palmer, D., Ng, P. Improved system for helper-dependent adenoviral vector production. Mol Ther. 8 (5), 846-852 (2003).
  5. Morral, N., et al. High doses of a helper-dependent adenoviral vector yield supraphysiological levels of alpha1-antitrypsin with negligible toxicity. Hum Gene Ther. 9 (18), 2709-2716 (1998).
  6. Muruve, D. A., et al. Helper-dependent adenovirus vectors elicit intact innate but attenuated adaptive host immune responses in vivo. J Virol. 78 (11), 5966-5972 (2004).
  7. Ehrhardt, A., et al. A gene-deleted adenoviral vector results in phenotypic correction of canine hemophilia B without liver toxicity or thrombocytopenia. Blood. 102 (7), 2403-2411 (2003).
  8. Cots, D., Bosch, A., Chillon, M. Helper dependent adenovirus vectors: progress and future prospects. Curr Gene Ther. 13 (5), 370-381 (2013).
  9. Mizuguchi, H., Kay, M. A. Efficient construction of a recombinant adenovirus vector by an improved in vitro ligation method. Hum Gene Ther. 9 (17), 2577-2583 (1998).
  10. Mizuguchi, H., Kay, M. A. A simple method for constructing E1- and E1/E4-deleted recombinant adenoviral vectors. Hum Gene Ther. 10 (12), 2013-2017 (1999).
  11. Ehrhardt, A., Kay, M. A. A new adenoviral helper-dependent vector results in long-term therapeutic levels of human coagulation factor IX at low doses in vivo. Blood. 99 (11), 3923-3930 (2002).
  12. Jager, L., et al. A rapid protocol for construction and production of high-capacity adenoviral vectors. Nat Protoc. 4 (4), 547-564 (2009).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York. (2001).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Plazmid pAdFTCendonukleazy homingowekom rki producenta HEK293koinfekcja wirusem pomocniczymamplifikacja w kolbie spinnerzeoczyszczanie chlorkiem cezuultrawirowaniewymiana buforu dializacyjnego
Klonowanie i produkcja na dużą skalę wektorów adenowirusowych o dużej pojemności na bazie ludzkiego adenowirusa typu 5
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.