Elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) w mięśniach kończyn tylnych myszy

Podsumowanie

Prezentujemy udoskonalone protokoły, które pozwalają na monitorowanie in vivo funkcji jednostki motorycznej u myszy. Opisano techniki pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) i szacowania liczby jednostek motorycznych (MUNE) w mięśniach kończyn tylnych myszy unerwionych przez nerw kulszowy.

Streszczenie

Złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) i szacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) to techniki elektrofizjologiczne, które mogą być używane do monitorowania stanu funkcjonalnego puli jednostek motorycznych in vivo. Pomiary te mogą zapewnić wgląd w prawidłowy rozwój i zwyrodnienie układu nerwowo-mięśniowego. Środki te mają wyraźny potencjał translacyjny, ponieważ są rutynowo stosowane w badaniach diagnostycznych i klinicznych na ludziach. Przedstawiamy techniki elektrofizjologiczne podobne do tych stosowanych u ludzi, aby umożliwić rejestrację funkcji nerwu kulszowego myszy. Odpowiedź CMAP reprezentuje elektrofizjologiczny wynik z mięśnia lub grupy mięśni po supramaksymalnej stymulacji nerwu obwodowego. MUNE jest techniką elektrofizjologiczną, która opiera się na modyfikacjach odpowiedzi CMAP. MUNE to obliczona wartość, która reprezentuje szacowaną liczbę neuronów ruchowych lub aksonów (dane wejściowe kontroli motorycznej) zaopatrujących badany mięsień lub grupę mięśni. Przedstawiamy metody rejestrowania odpowiedzi CMAP z mięśni proksymalnych nóg za pomocą powierzchniowych elektrod rejestrujących po stymulacji nerwu kulszowego u myszy. Opisano technikę przyrostowego MUNE przy użyciu bodźców submaksymalnych w celu określenia średniej wielkości potencjału pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP). MUNE oblicza się, dzieląc amplitudę CMAP (peak-to-peak) przez amplitudę SMUP (peak-to-peak). Te techniki elektrofizjologiczne pozwalają na powtarzanie pomiarów zarówno u noworodków, jak i dorosłych myszy w taki sposób, że ułatwiają szybką analizę i gromadzenie danych, jednocześnie zmniejszając liczbę zwierząt wymaganych do badań eksperymentalnych. Co więcej, pomiary te są podobne do tych zarejestrowanych w badaniach na ludziach, co pozwala na bardziej bezpośrednie porównania.

Wprowadzenie

Szacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) zostało pierwotnie opisane przez McComas et al. ponad trzy dekady temu¹. Pierwotna technika polegała na modyfikacji techniki rejestracji złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP), która wykorzystywała stopniowe zwiększanie stymulacji w celu uzyskania submaksymalnych przyrostów. Przyrosty te zostały zsumowane i uśrednione w celu określenia szacowanej wielkości potencjału pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP). Wielkość ta została podzielona na odpowiedź CMAP w celu oszacowania liczby jednostek motorycznych unerwiających badany mięsień. Zgodnie z pierwotnym opisem, liczne warianty wykorzystujące zarówno reakcje elektrofizjologiczne, jak i pomiary siły przyrostowej (mechanicznej) zostały wykorzystane zarówno w badaniach na ludziach, jak i w modelach zwierzęcych². Technika MUNE została zmodyfikowana przez Shefnera i współpracowników w celu zbadania mysich modeli stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)^{3, 4}.

W obecnym opisie szczegółowo opisujemy uproszczone modyfikacje technik MUNE, które są szybkie do wykonania. Co ważne, CMAP i MUNE umożliwiają wiarygodne pomiary zarówno u noworodków, jak i dorosłych myszy^{w wieku 5-8} lat. Doświadczone osobniki mogą wykonać te pomiary w ciągu 10-20 minut na zwierzę, a wielokrotne pomiary są wykonalne, co pozwala na uzyskanie danych dotyczących zmian w czasie⁵. W prowadzonych obecnie badaniach wykorzystujemy kliniczny system elektrodiagnostyczny. Z naszego doświadczenia wynika, że kliniczne systemy elektrodiagnostyczne są zoptymalizowane pod kątem szybkiego i wydajnego przechwytywania danych elektrofizjologicznych in vivo, niemniej jednak standardowe stanowiska elektrofizjologiczne można łatwo dostosować do tego zastosowania.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony i przestrzega wytycznych dotyczących opieki nad zwierzętami i etyki Centrum Medycznego Uniwersytetu Stanowego Ohio Wexner.

1. Przygotowanie i znieczulenie zwierząt

1. Podczas obchodzenia się z myszami noś rękawice.
2. Znieczulić myszy wziewnym izofluranem i ułożyć w pozycji leżącej. Wywołaj znieczulenie za pomocą 3-5% izofluranu i natężenia przepływu 1 l na minutę_O2. Po indukcji znieczulenia utrzymuj znieczulenie na poziomie 2-3% i 1 l na minutę Natężenie przepływu_O2.
   1. Dostosuj przepływ_O2 i procentową zawartość izofluranu, aby uzyskać odpowiednie znieczulenie w zależności od stanu chorobowego zwierzęcia, wieku i częstości oddechów. Mniejsze lub słabsze zwierzęta mogą wymagać mniejszej ilości izofluranu do odpowiedniego znieczulenia (tj. 1,5-2,5% izofluranu).
   2. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, wywierając lekki nacisk na opuszkę stopy tylnej kończyny przedmiotem, takim jak kleszcze, aby zademonstrować brak reakcji na wycofanie.
3. Utrzymuj temperaturę powierzchni na poziomie 37 °C za pomocą termostatycznej płyty grzewczej, ponieważ zmiany temperatury mogą wpływać na rozmiar i czas trwania CMAP.
4. Nałóż maść na bazie ropy naftowej weterynarza na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Monitoruj poziom znieczulenia, obserwując częstość oddechów i oceniając reakcje odstawienia po nacisku na podkładkę stopy za pomocą kleszczy.
5. Usuń włosy z kończyny tylnej, która ma być badana za pomocą maszynki do strzyżenia. Po usunięciu owłosienia z kończyn tylnych, które mają być badane, lekko wyprostuj kończyny tylne w kolanie, odwodz w biodrach i przymocuj do powierzchni roboczej za pomocą taśmy klejącej (jak pokazano na rysunku 1).
6. Po zapisach CMAP i MUNE oraz odstawieniu znieczulenia nie należy pozostawiać zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Nie zwracaj zwierzęcia do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje w pełni.

2. Konfiguracja i sprzęt do nagrywania

1. Umieść elektrody do zapisów CMAP i MUNE, jak pokazano na rysunku 1.
2. Użyj dwóch cienkich elektrod pierścieniowych do elektrod nagrywających.
   1. Umieść aktywną (E1) elektrodę pierścieniową na skórze leżącą na bliższej części mięśnia brzuchatego łydki kończyny tylnej, w stawie kolanowym, a referencyjną elektrodę pierścieniową (E2) na skórze nad środkową częścią śródstopia stopy.
   2. Aby zmniejszyć impedancję, pokryj skórę pod elektrodami pierścieniowymi żelem, aby wystarczająco nasycić resztki włosów i zmaksymalizować kontakt elektrody ze skórą. Unikaj nadmiernego nakładania żelu elektrodowego, ponieważ może to spowodować powstanie mostka elektrycznego między elektrodami i uniemożliwić dokładne nagrywanie.
3. Do stymulacji nerwu kulszowego w bliższej kończynie tylnej należy użyć dwóch izolowanych igieł monopolarnych 28 G jako katody i anody. Włóż katodę w okolicy bliższej kończyny tylnej i wprowadź anodę bardziej proksymalnie w tkance podskórnej pokrywającej kość krzyżową.
   1. Unikaj umieszczania elektrod stymulujących zbyt blisko nerwu kulszowego lub zbyt głęboko, aby bezpośrednio uszkodzić nerw kulszowy lub inną strukturę. Rysunek 1 ilustruje rozmieszczenie elektrod.
4. W przypadku elektrody uziemiającej umieść jednorazową elektrodę powierzchniową na przeciwległej kończynie tylnej lub ogonie.

3. Akwizycja danych

1. Rwa kulszowa CMAP
   1. Uzyskaj odpowiedzi na rwę kulszową CMAP poprzez stymulację nerwu kulszowego impulsami fali prostokątnej o czasie trwania 0,1 ms i intensywności w zakresie 1-10 mA.
   2. Uzyskuj odpowiedzi CMAP wraz ze wzrostem intensywności bodźca, aż amplituda odpowiedzi przestanie rosnąć. Następnie, w celu zapewnienia stymulacji supramaksymalnej, należy zwiększyć stymulację do ~120% intensywności bodźca wykorzystanej do uzyskania maksymalnej odpowiedzi i uzyskania dodatkowej odpowiedzi. Jeśli nie ma dalszego wzrostu rozmiaru CMAP, zapisz tę odpowiedź jako maksymalną wartość CMAP.
   3. Zapisz amplitudy CMAP od linii podstawowej do szczytu i od szczytu do piku w mV (rysunek 2).
2. Średnia wielkość potencjału pojedynczej jednostki silnikowej (SMUP) i obliczanie MUNE
   1. Określ średnią wielkość potencjału pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP) za pomocą techniki stymulacji przyrostowej¹. Aby uzyskać odpowiedzi przyrostowe, należy zapewnić submaksymalną stymulację trwającą 0,1 ms z częstotliwością 1 Hz, jednocześnie zwiększając intensywność w krokach co 0,03 mA, aby uzyskać minimalne odpowiedzi typu "wszystko albo nic". Uzyskaj początkową odpowiedź o intensywności bodźca od 0,21 mA do 0,70 mA.
      1. Jeśli początkowa reakcja nie występuje przy intensywności bodźca od 0,21 mA do 0,70 mA, dostosuj stymulującą pozycję katody bliżej lub dalej od pozycji nerwu kulszowego w bliższej części uda, aby odpowiednio zmniejszyć lub zwiększyć wymaganą intensywność bodźca.
      2. Jeżeli początkowa odpowiedź przyrostowa jest uzyskiwana przy natężeniu bodźca między 0,21 mA a 0,70 mA i spełnia kryteria wymienione poniżej (3.2.2), należy przechowywać i zapisywać dodatkowe przyrosty ze wzrostem intensywności bodźca, dostosowując się w krokach co 0,03 mA, aby uzyskać w sumie 9 dodatkowych przyrostów, które spełniają ustalone kryteria.
   2. Podczas pomiarów odpowiedzi przyrostowych należy upewnić się, że każdy przyrost spełnia następujące kryteria.
      1. Upewnij się, że początkowy ujemny pik odpowiedzi przyrostowych jest czasowo wyrównany w ujemnym piku maksymalnej odpowiedzi CMAP pokazanej jako zacieniona część ilustracji CMAP na rysunku 2.
      2. Upewnij się, że każda odpowiedź przyrostowa jest stabilna i bez frakcjonowania, ustalona przez obserwację trzech zduplikowanych odpowiedzi. Rozróżniaj wizualnie przyrostowe odpowiedzi w czasie rzeczywistym (nałożone na wcześniej zarejestrowane przyrosty).
         Uwaga: Każdy przyrost powinien być wizualnie odrębny i większy w porównaniu z poprzednią odpowiedzią (Rysunek 3). Analiza w czasie rzeczywistym pozwala na rozpoznanie odpowiedzi o większej amplitudzie (przyrostowej) w porównaniu z wcześniejszymi odpowiedziami, a niewielkie zmiany związane z szumem tła można pominąć. Nałożony widok 10 przyrostów pokazano na rysunku 4 (B i D), aby dodatkowo zilustrować ten punkt.
      3. Po wizualnym potwierdzeniu każdego przyrostu upewnij się, że zmierzona różnica amplitudy (potwierdzona odpowiedź-amplituda poprzedniej odpowiedzi = różnica amplitudy) wynosi co najmniej 25 μV.
      4. Jeśli przyrost jest mniejszy niż 25 μV, należy odrzucić i ponownie zmierzyć odpowiedź. Po zarejestrowaniu 10 odpowiedzi przyrostowych należy ocenić przyrosty, aby upewnić się, że amplituda każdej pojedynczej odpowiedzi przyrostowej nie jest większa niż 1/3 sumy wszystkich dziesięciu przyrostów (tj. całkowitej amplitudy odpowiedzi końcowej). Jeśli ten warunek nie jest spełniony, ponownie zmierz odpowiedzi przyrostowe.
   3. Uśrednij 10 wartości przyrostowych, aby oszacować średnią amplitudę potencjału pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP) (rysunek 3). Uwaga: Rysunek 3 przedstawia podstawy obliczenia średniej amplitudy SMUP, ale średnią amplitudę SMUP można łatwo obliczyć, dzieląc całą amplitudę końcowej odpowiedzi przyrostowej przez całkowitą liczbę przyrostów (tj. 10).
      Przykładowe indywidualne obliczenia SMUP (zilustrowane na rysunku 3):
      SMUP 1 = amplituda międzyszczytowa przyrostu 1
      SMUP 1=0,050 mV
      SMUP 2= (amplituda międzyszczytowa przyrostu 2) – (amplituda międzyszczytowa przyrostu 1)
      SMUP 2=0,150 mV-0,050 mV=0,100 mV
      1. Oblicz każdy kolejny przyrost (w sumie do 10) i uśrednij dziesięć przyrostów.
   4. Oblicz MUNE, dzieląc maksymalną amplitudę CMAP (od szczytu do szczytu) przez średnią amplitudę SMUP (od szczytu do szczytu). (MUNE=CMAP/średni SMUP). W niektórych układach elektrofizjologicznych przyrosty SMUP są mierzone w μV, podczas gdy CMAP jest zwykle podawany w mV. W razie potrzeby przekonwertuj wyniki CMAP i SMUP na podobne jednostki przed obliczeniem MUNE.

Wyniki

Techniki CMAP i MUNE opisane w tym raporcie pozwalają na rejestrację funkcji nerwowo-mięśniowej unerwionych mięśni kończyn tylnych rwy kulszowej przy użyciu minimalnie inwazyjnego umieszczenia elektrod (Rysunek 1). Supramaksymalny rozmiar CMAP, który reprezentuje całkowitą moc wyjściową z grupy mięśniowej, można opisać za pomocą parametrów amplitudy i pola (ryc. 2), jednak w obecnych metodach używamy amplitudy do ilościowego określenia rozmiarów CMAP i SMUP. Ponieważ odpowiedź CMAP mierzy sumowaną depolaryzację włókien mięśniowych w mięśniu, patologia w dowolnym miejscu, od neuronu ruchowego do włókna mięśniowego, może powodować zmniejszenie rozmiaru CMAP. Dlatego CMAP stanowi doskonałą miarę całkowitego stanu funkcjonalnego. Zgodnie z oczekiwaniami, rozmiar CMAP zwiększy się podczas tworzenia⁵. Ze względu na zmiany kompensacyjne, które mogą wystąpić po odnerwieniu (tj. kiełkowaniu obocznym), rozmiar CMAP może być utrzymany pomimo procesów utraty neuronu ruchowego lub aksonów ruchowych. Dlatego technika MUNE jest wymagana do określenia neuronu ruchowego lub aksonu wejściowego do badanego mięśnia lub grupy mięśni. Rejestracja poszczególnych przyrostów (rysunek 3) pozwala na oszacowanie średniej mocy wyjściowej pojedynczych jednostek silnikowych (rozmiar SMUP) w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji na temat stanu funkcjonalnego jednostek motorycznych.

CMAP i MUNE mogą być używane do pomiaru funkcji nerwowo-mięśniowej w różnych mysich modelach chorób nerwowo-mięśniowych. Na rycinie 4 porównano wyniki uzyskane u dorosłej myszy kontrolnej i dorosłej myszy 11 tygodni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego. Po zmiażdżeniu nerwu kulszowego MUNE jest znacznie zmniejszone przy 50 szacowanych funkcjonalnych jednostkach motorycznych w porównaniu z normalnymi wynikami 278 funkcjonalnych jednostek motorycznych u myszy kontrolnej. W przeciwieństwie do tego, amplituda CMAP u zmiażdżonego zwierzęcia (39,6 mV od początku do szczytu, 74,9 mV od szczytu do szczytu) wykazuje tylko łagodne zmniejszenie w porównaniu z kontrolą (49,0 mV od początku do szczytu, 84,2 mV między szczytami) z powodu kiełkowania ubocznego.

Rysunek 1. Rozmieszczenie elektrod. Czarną (E1) "aktywną" elektrodę (A) i czerwoną (E2) "referencyjną" elektrodę rejestrującą (B) umieszcza się nad mięśniem brzuchatym łydki w bliższej części mięśnia brzuchatego łydki w kolanie. Katoda stymulująca () (C) i anoda (czerwona) (D) są wprowadzane podskórnie proksymalnie do elektrod rejestrujących w celu wytworzenia odpowiedzi dystalnych. Jednorazową elektrodę dyskową (D) umieszcza się na tylnej kończynie, ogonie lub kości krzyżowej jako podłoże w celu zminimalizowania artefaktu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Złożony potencjał czynnościowy mięśni. Na zdjęciu przedstawiono ilustrację reprezentatywnej odpowiedzi CMAP. (A) Amplitudę od linii podstawowej do wartości szczytowej mierzy się od izoelektrycznej linii podstawowej do początkowego ujemnego piku (napięcie ujemne jest przedstawione powyżej linii podstawowej). (B) Amplituda międzyszczytowa jest mierzona od ujemnego napięcia szczytowego do dodatniego napięcia szczytowego. Szary zacieniony obszar oznacza ujemny obszar piku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Odpowiedzi przyrostowe.Dwie reprezentatywne odpowiedzi przyrostowe są pokazane nałożone na siebie i odizolowane. W obliczeniach MUNE amplitudy każdego przyrostu są mierzone od piku do szczytu. Przyrost #1 jest początkową zarejestrowaną odpowiedzią typu "wszystko albo nic" i reprezentuje potencjał pojedynczej jednostki motorycznej (SMUP). Każdy kolejny przyrost (#2-10) reprezentuje ilościowy wzrost nałożony na poprzednią odpowiedź. Dlatego, aby uzyskać amplitudy SMUP dla przyrostów 2-10, amplituda poprzedniej odpowiedzi jest odejmowana od amplitudy uzyskanego przyrostu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Przykład rwy kulszowej CMAP i MUNE.(A) Potencjał czynnościowy mięśni kulszowych (CMAP) u dorosłej myszy kontrolnej (w wieku 6 miesięcy) z amplitudą wyjściową do szczytowej 49,0 mV i amplitudą szczytową 84,2 mV. Czułość ekranu = 10 mV na podział i czas trwania ekranu 10 ms. (B) Dziesięć odpowiadających odpowiedzi przyrostowych (w myszy sterującej) o całkowitej amplitudzie 3,028 mV dzieli się przez 10 w celu określenia średniego rozmiaru SMUP (0,3028 mV). Czułość ekranu = 0,5 mV i prędkość przemiatania 1 ms na działkę. Obliczone MUNE=278 (MUNE=CMAP/średni SMUP(84,2 mV/ 0,3028 mV)) (C) Rwa kulszowa CMAP 11 tygodni po zmiażdżeniu nerwu kulszowego u dorosłej myszy (w wieku 6 miesięcy) wykazującej nieznacznie zmniejszoną amplitudę wyjściową do szczytowej (39,6 mV) i amplitudę między szczytami (74,9 mV). Czułość ekranu = 10 mV na działkę i prędkość przemiatania 1 ms na działkę. (D) Dziesięć odpowiadających odpowiedzi przyrostowych (u myszy ze zmiażdżeniem nerwów) z całkowitą amplitudą od szczytu do szczytu 14,923 mV podzieloną przez 10, aby uzyskać średnią wielkość SMUP 1,4923 mV. Czułość ekranu = 2 mV na działkę i prędkość przemiatania 1 ms na podział. Obliczono MUNE=50 (MUNE=CMAP/średni SMUP (74,9 mV/1,4923 mV)). (**Zwróć uwagę na różną czułość dla przyrostowych reakcji myszy z rwą kulszową). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

MUNE i CMAP są klinicznie istotnymi pomiarami, często stosowanymi w badaniach naukowych i monitorowaniu pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, takimi jak ALS i rdzeniowy zanik mięśni (SMA)^{9, 10}. Na przykład w SMA CMAP i MUNE dobrze korelują z wiekiem, nasileniem i klinicznymi wskaźnikami funkcji^10-14. Oba pomiary są minimalnie inwazyjne i umożliwiają ocenę funkcji podłużnie u tej samej osoby. Co ważne, pomiary te nie mogą mierzyć aktywacji lub rekrutacji jednostki motorycznej przez korowe neurony ruchowe, ale zapewniają klinicznie istotną ocenę integralności neuronu ruchowego i jego funkcjonalnego odpowiednika, jednostki motorycznej.

Zwierzęce modele chorób nerwowo-mięśniowych mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów patogennych chorób u ludzi oraz dla przedklinicznego rozwoju potencjalnie skutecznych środków terapeutycznych. Zdolność do translacji miar wyników i biomarkerów, które można wykorzystać u różnych gatunków, może ułatwić i przyspieszyć przełożenie obiecujących wyników przedklinicznych na badania kliniczne na ludziach. Kilka grup wykorzystało wcześniej zarówno pomiary elektrofizjologiczne, jak i siłowe (mechaniczne) do oszacowania funkcji jednostek motorycznych w modelach^{myszy 2-4, 15-22}. Ze względu na względną złożoność pomiarów, udoskonaliliśmy te techniki w formacie wizualnym, aby umożliwić szersze stosowanie i implementację u myszy. Format demonstracji wideo i instrukcji pozwala na podkreślenie kluczowych etapów procedury i wyeliminowanie potencjalnych pułapek. Zastosowanie tych technik do badań przedklinicznych potencjalnych terapii w chorobach neuronu ruchowego może poprawić przełożenie przypuszczalnych terapii z myszy na chorobę ludzką.

W procesie uzyskiwania odpowiedzi CMAP i MUNE składa się z kilku krytycznych etapów. Prawidłowe i spójne rozmieszczenie elektrod rejestrujących oraz wystarczający kontakt elektrody z kończyną tylną mają kluczowe znaczenie dla powtarzalnego pomiaru amplitudy i zmniejszenia szumu tła. Dlatego należy konsekwentnie potwierdzać bliski kontakt skóry kończyn tylnych z elektrodami. Odkryliśmy, że elektrody powierzchniowe oferują bardziej spójne zapisy CMAP i MUNE niż elektrody igłowe. Ze względu na bardzo cienkie tkanki podskórne, niewielkie ruchy powierzchni zapisu igły mogą prowadzić do dużych różnic w amplitudach CMAP. Ponadto bardziej inwazyjny charakter elektrod igłowych nie jest optymalny dla nowonarodzonych myszy lub badań podłużnych ze względu na potencjalne zakłócenia i urazy mięśni. Jedna potencjalna wada nieselektywnych zapisów elektrod powierzchniowych wiąże się z możliwością zmniejszonej rozdzielczości fenotypu, jeśli jeden mięsień jest mniej lub bardziej zaangażowany w porównaniu z innym, i zostało to zgłoszone w mysim modelu^{ALS 21}.

Uzyskanie średniego rozmiaru SMUP jest technicznie trudniejsze w porównaniu z CMAP. Ze względu na mniejszy rozmiar odpowiedzi (w zakresie μV, a nie mV) szum tła może być bardziej problematyczny. Szum tła można zredukować, regulując elektrodę masową, katodę, anodę i sprawdzając inne urządzenia elektryczne w pobliżu konfiguracji eksperymentalnej. Klatka Faradaya, zwykle używana do zastosowań w elektrofizjologii wewnątrzkomórkowej, nie jest wymagana. Wizualne określanie poszczególnych odpowiedzi SMUP jest najtrudniejszą umiejętnością do zdobycia i wymaga praktyki w celu uzyskania spójnych wyników z odpowiednią powtarzalnością. Ważne jest, aby upewnić się, że SMUP, które są rejestrowane, inicjują się w czasie trwania maksymalnej odpowiedzi CDAP. Określiliśmy kryteria akceptacji poszczególnych odpowiedzi przyrostowych, aby ułatwić przeprowadzenie tego procesu i zwiększyć wiarygodność wewnątrz i między oceniającymi.

Jedną z potencjalnych wad techniki przyrostowej MUNE jest możliwość przeszacowania liczby funkcjonalnych jednostek motorycznych z powodu naprzemienności jednostek motorycznych. Użyliśmy techniki podobnej do Shefnera i wsp. W tym sensie, że każda odpowiedź powinna być powtarzalnie widziana w sumie 3 razy, aby zmniejszyć wpływ tego zjawiska³.

Z naszego doświadczenia wynika, że kliniczne systemy elektrodiagnostyczne są zoptymalizowane pod kątem opisanych w nich badań ze względu na ulepszoną ergonomię interfejsu między egzaminatorem a systemem elektrodiagnostycznym, co ułatwia kontrolę. System dwukanałowy stosowany w naszym laboratorium wyposażony jest w dwa nieprzełączane kanały wzmacniacza wykorzystujące wzmacniacz z 24-bitowym przetwornikiem analogowo-cyfrowym i częstotliwością próbkowania 48 kHz na kanał. Wzmocnienie sprzętowe można regulować w zakresie od 10 nV do 100 mV/działkę. Filtr niskich tonów ma zakres od 0,2 Hz-5 kHz, a ustawienia filtra wysokich tonów od 30 Hz-10 kHz. Stosowany jest stymulator prądu stałego (natężenie: 0-100 mA; czas trwania: 0,02-1 ms). Większość systemów klinicznych ma podobne odpowiednie funkcje i można je dostosować tak, aby odpowiednio rejestrować odpowiedzi CMAP i MUNE. Dodatkowo, standardowe zestawy elektrofizjologiczne mogą być zmontowane, aby odpowiednio rejestrować CMAP i MUNE, ale interfejs może wymagać dostosowania w celu łatwej regulacji stymulacji i szybkiej identyfikacji odpowiedzi CMAP i SMUP.

Wcześniej wykorzystaliśmy opisane tutaj techniki CMAP i MUNE, aby umożliwić szybką i powtarzalną ocenę unerwionego mięśnia kulszowego kończyny tylnej u myszy we wczesnym okresie poporodowym do dorosłości⁵. Techniki te umożliwiają ocenę w modelach mysich, gdy testy behawioralne funkcji motorycznych są niewykonalne lub są mniej wiarygodne. Zastosowanie tej techniki u nowonarodzonych myszy ułatwia badanie rozwoju jednostek motorycznych i może poszerzyć naszą wiedzę na temat unerwienia i przycinania neuronów ruchowych. Na przykład wykazaliśmy, że liczba funkcjonalnych jednostek motorycznych zarejestrowanych za pomocą MUNE wzrośnie podczas przycinania z unerwienia polineuronalnego do mononeuronalnego w ciągu pierwszych dwóch tygodni życia u nowonarodzonych myszy⁵. Możliwość testowania myszy przez długi czas za pomocą tej techniki nadaje się do badania reakcji jednostek motorycznych na uszkodzenie nerwów obwodowych, dziedziczne zaburzenia nerwowo-mięśniowe i starzenie się.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Profesjonalny trymer Zestaw do pielęgnacji zwierząt	Oster	078577-010-003	maszynki do strzyżenia do depilacji
System EMG Synergy T2	Natus Neurology	Model nie jest już dostępny	przenośny system elektrodiagnostyczny
igły monopolarne 28 G	Teca	017K121	elektrody stymulujące katodę i anodę
Alpine Biomed Digital Ring Electrode ze skręconymi drutami i złączami TP 1,5 mm.	Elektrody nagrywające	Alpine Biomed	9013S0312
Pomocna dłoń klips aligatora z żelazną podstawą	Radio Shack	64-079	Utrzymanie umieszczenia elektrody nagrywającej
Żel elektrodowy Spectra 360	Parker Laboratories	9013G5012	stosowany w celu zmniejszenia impedancji skóry
monojektowa strzykawka do irygacji z zakrzywioną końcówką	Covidien	81412012	wykorzystywany do aplikacji
igłowego EMG	Teca	902-RLC-TP	do podłączenia elektrod monopolarnych do stymulatora elektrodiagnostycznego
Jednorazowa elektroda 2" x 2" lub podobnie przycięta w razie potrzeby	Carefusion	019-415000	elektroda uziemiająca
Mała płyta grzewcza z wbudowanym czujnikiem RTD, 15 x10 cm	World Precision Instruments	61830	używana z regulatorem temperatury zwierząt do przekazywania ciepła zwierzętom
Silikonowa podkładka do użytku z ATC2000	World Precision Instruments	503573	przewodząca wyjmowana podkładka zakrywająca płytę grzewczą ułatwiająca czyszczenie
Regulator temperatury zwierząt	World Precision Instruments	ATC2000	Cichy system ogrzewania zwierząt do utrzymywania temperatury zwierząt
Maść okulistyczna na bazie ropy naftowej	Puralube	26870	stosowany podczas znieczulenia w celu uniknięcia uszkodzenia rogówki