Technika mankietowa skraca i ułatwia model heterotopowego przeszczepu szyjki macicy u myszy, unikając technicznie trudnych zespoleń szwów w małych naczyniach. Szczegóły techniczne przedstawione w tym artykule wideo powinny pozwolić naukowcom na ustalenie tego modelu w swoich laboratoriach.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Heterotopowy przeszczep szyjki macicy u myszy jest cennym narzędziem w badaniach nad transplantacją i układem sercowo-naczyniowym. Technika mankietu znacznie upraszcza ten model, unikając trudnych zespoleń szwów małych naczyń, skracając w ten sposób czas ciepłego niedokrwienia. W porównaniu z implantacją przeszczepu jamy brzusznej, model szyjki macicy jest mniej inwazyjny, a wszczepiony przeszczep jest łatwo dostępny do dalszych badań kontrolnych. Zespolenia wykonuje się poprzez przeciągnięcie aorty wstępującej przeszczepu nad mankietem z tętnicą szyjną wspólną biorcy oraz poprzez przeciągnięcie głównej tętnicy płucnej nad mankietem z żyłą szyjną zewnętrzną. Dobór odpowiedniego rozmiaru mankietu i pełna mobilizacja naczyń są ważne dla udanej rewaskularyzacji. Uraz niedokrwienno-reperfuzyjny (I/R) można zminimalizować poprzez perfuzję przeszczepu roztworem kardioplegicznym i hipotermię. W tym artykule przedstawiamy szczegóły techniczne dotyczące uproszczonej i ulepszonej techniki mankietu, która powinna umożliwić chirurgom z podstawowymi umiejętnościami mikrochirurgicznymi wykonanie zabiegu z wysokim wskaźnikiem sukcesu.
Wprowadzenie
Model transplantacji serca jest często używany do badania uszkodzeń I/R, odrzucenia przeszczepu allogenicznego, waskulopatii po przeszczepie i skuteczności środków immunomodulujących. Modele mysie łączą w sobie wiele zalet, takich jak znane podłoże immunologiczne i genetyczne, dostępność wielu szczepów wsobnych i transgenicznych oraz stosunkowo niskie koszty eksperymentalne.
W 1973 roku technika przeszczepu serca w jamie brzusznej u myszy została po raz pierwszy opisana przez Corry'ego iwsp.1. W tym modelu przeszczepy są rewaskularyzowane przez zespolenia końca do boku aorty wstępującej do aorty brzusznej biorcy oraz głównej tętnicy płucnej do żyły głównej dolnej. W 1991 roku technika szwów do przeszczepu szyjki macicy u myszy została opisana przez Chen i wsp. 2. W tym modelu wsteczna perfuzja tętnicy wieńcowej jest ustalana przez zespolenie tętnicy szyjnej biorcy z aortą wstępującą przeszczepu. Krew żylna spływa przez zatokę wieńcową do prawego przedsionka, prawej komory i jest wyrzucana przez tętnicę płucną do żyły szyjnej zewnętrznej biorcy (ryc. 1). W porównaniu z implantacją przeszczepu jamy brzusznej, model szyjki macicy jest mniej inwazyjny, a powierzchowne umiejscowienie przeszczepu umożliwia bardzo łatwy dostęp do dodatkowych badań kontrolnych (np. badania palpacyjnego, echokardiografii, przyżyciowej mikroskopii fluorescencyjnej)3,4.
Pomimo ulepszeń technicznych5,6, bardziej powszechne zastosowanie tego modelu zostało ograniczone z powodu trudności technicznych w wykonywaniu zszywanych zespoleń małych naczyń z częstym występowaniem nieszczelności zespolenia i zakrzepicy. W 1991 roku Matsuura i wsp. Wprowadzono technikę mankietową, w której ściana naczynia jest naciągana na syntetyczny cylinder, co znacznie ułatwia model przeszczepu szyjki macicy7. Technika ta została następnie zastosowana w różnych eksperymentalnych modelach przeszczepów, w tym nerkinr 8, trzustkinr 9, kończyny10, wątrobynr 11,12, płuc13,14 i przeszczepu naczyniowego15. W porównaniu z techniką szwów wymagany czas na zespolenie, a co za tym idzie, czas ciepłego niedokrwienia jest krótszy, a powikłań naczyniowych w przypadku techniki mankietowej jest znacznie mniej16. Co więcej, umożliwia chirurgom z niewielkim przeszkoleniem w zakresie mikrochirurgii wykonanie operacji z wysokim wskaźnikiem sukcesu. Wadą techniki mankietowej jest wstępne podwiązanie tętnicy szyjnej wspólnej, co może zmienić perfuzję mózgu.
W tym artykule wideo prezentujemy ulepszoną i uproszczoną technikę zakładania mankietów do przeszczepu szyjki macicy u myszy
.Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Niemieckie Centrum Kardiologiczne w Monachium i Rząd Bawarii, Niemcy (Gz. 55.2-1-54-2532.3-17-13). Zwierzęta były trzymane w określonym obiekcie wolnym od patogenów i otrzymywały opiekę człowieka zgodnie z "Zasadami opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi" opracowanymi przez National Society for Medical Research oraz "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" dostarczonym przez National Academy of Sciences i opublikowanym przez National Institutes of Health (publikacja NIH nr 86-23, Poprawiona w 1985).
UWAGA: Do zabiegu niezbędny jest kompletny zestaw sterylnych narzędzi mikrochirurgicznych, w tym dwa zakrzywione kleszcze i rozszerzacze naczyń (ryc. 2a). Okołooperacyjna profilaktyka antybiotykowa nie jest rutynowo konieczna, ale może być wskazana u zwierząt z obniżoną odpornością. Zwierzęta uśmiercano za pomocą terminalnej inhalacji izofluranu.
Przygotowanie dawcy i pobieranie przeszczepów
- Znieczulić zwierzę przez dootrzewnowe wstrzyknięcie midazolamu (5,0 mg/kg), medetomidyny (0,5 mg/kg) i fentanylu (0,05 mg/kg masy ciała). Umieść mysz w pozycji leżącej na polu operacyjnym i potwierdź tolerancję chirurgiczną za pomocą odruchu wycofania pedału.
- Zdezynfekuj skórę trzykrotnie chlorheksydyną i wykonaj nacięcie brzucha w linii środkowej. Cofnij jelita mokrą gazą w lewo, aby odsłonić żyłę główną dolną.
- Wstrzyknąć 50 j.m. heparyny rozcieńczonej w 0,4 ml soli fizjologicznej przez żyłę główną dolną w celu przeciwdziałania zakrzepom. Naciąć naczynie 1 minutę po heparynizacji.
- Otwórz przeponę i wykonaj obustronną torakotomię, aby odsłonić serce. Przednia ściana klatki piersiowej jest odbita wyżej i utrzymywana na miejscu za pomocą zacisku.
- Usuń grasicę i tępo wypreparuj tkankę łączną między aortą a pniem płucnym. Naciąć prawą żyłę główną górną.
- Nakłuć zmobilizowaną aortę wstępującą na poziomie tułowia ramienno-głowowego za pomocą igły 30 G zamontowanej na strzykawce o pojemności 5 ml i powoli perfundować serce wstecznie, bez nadmiernego ucisku, za pomocą 3 ml zimnego roztworu kardioplegicznego o temperaturze 4 °C. Unikaj przedostawania się powietrza do krążenia wieńcowego. Wlej lodowaty roztwór soli fizjologicznej na przeszczep, aby jeszcze bardziej zwiększyć zatrzymanie akcji serca.
- Przeciąć aortę proksymalnie do początku pnia ramienno-głowowego.
- Podwiązaj dolne i obie żyły główne górne blisko serca z 8-0 jedwabiu i przeciąć je dystalnie do ligatur.
- Wypreparuj pień płucny tak dystalnie, jak to możliwe. Podwiązuj tętnice płucne w pobliżu rozwidlenia za pomocą 8-0 jedwabiu i przeciąć je dystalnie.
- Podwiązuj żyły płucne razem za pomocą jednego 8-0 jedwabna ligatura i transekt je.
- Usuń serce od dawcy i przechowuj je w lodowatym roztworze kardioplegicznym do czasu implantacji.
2. Przygotowanie odbiorcy
- Przygotuj mankiety do zespoleń, przecinając rurkę poliimidową skalpelem nr 11 lub nożyczkami pod mikroskopem. Mankiet składa się z cylindrycznego korpusu i przedłużenia (1/3 obwodu) do umieszczenia zacisku naczyniowego, każdy o długości 1 mm (ryc. 2b).
- Znieczulić zwierzę i potwierdzić tolerancję chirurgiczną, jak opisano powyżej. Wstrzyknąć podskórnie (s.c.) 0,25 ml ciepłego roztworu soli fizjologicznej w celu uzupełnienia płynu.
- Usuń włosy z prawej części szyjki macicy za pomocą golarki elektrycznej i ułóż zwierzę w pozycji leżącej na ciepłej podkładce. Zabezpiecz nogi pasmami taśmy, unikając nadmiernego rozciągania przednich kończyn, ponieważ może to zagrozić oddychaniu. Zakryj oczy maścią okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu. Zdezynfekuj miejsce operowane trzykrotnie chlorheksydyną.
- Wykonaj poprzeczne nacięcie skóry od prawego kąta żuchwy do wcięcia szyjnego.
- Tępo zmobilizuj żyłę szyjną zewnętrzną. Kauteryzuj boczne gałęzie za pomocą kleszczy bipolarnych i przetransektuj je.
- Podziel żyłę szyjną zewnętrzną między ligatury na poziomie zbiegu z żyłą z gruczołem podżuchwowym.
- Przeciągnij zewnętrzną żyłę szyjną przez mankiet i zamknij naczynie proksymalnie, umieszczając zacisk naczyniowy na przedłużeniu mankietu. Usuń ligaturę i przepłucz światło naczynia solą fizjologiczną w stosunku 1:10.
- Umieść ścianę naczynia na mankiecie i przymocuj ją za pomocą ustawionego obwodu 8-0 jedwabna ligatura.
- Usuń powierzchowną część mięśnia mostkowo-obojczykowo-sutkowego.
- Zmobilizuj prawą tętnicę szyjną wspólną i przeciąć naczynie między ligaturami poniżej rozwidlenia tętnicy szyjnej.
- Przeciągnąć tętnicę szyjną przez mankiet i zamknąć naczynie proksymalnie, umieszczając zacisk Yasargil na przedłużeniu mankietu. Usuń ligaturę i przepłucz światło naczynia solą fizjologiczną w stosunku 1:10.
- Delikatnie rozszerz światło tętnicy za pomocą rozszerzacza naczyń, nałóż ścianę naczynia na mankiet i przymocuj ją za pomocą ustawionego obwodu 8-0 jedwabna ligatura.
- Aby uzyskać wystarczającą ilość miejsca do implantacji przeszczepu, należy usunąć prawy płat gruczołu podżuchwowego.
- Utrzymuj wilgotne pole operacyjne aż do implantacji.
3. Implantacja przeszczepu
- Umieść przeszczep w odcinku szyjnym biorcy do góry nogami, z aortą zorientowaną przyśrodkowo i tętnicą płucną bocznie.
- Przeciągnij aortę przeszczepu przez mankiet z tętnicą szyjną i zabezpiecz zespolenie za pomocą obwodu 8-0 jedwabna ligatura.
- Naciąć pień płucny po jego przedniej stronie i przeciągnąć go przez mankiet z żyłą szyjną zewnętrzną. Ponownie zabezpieczyć zespolenie za pomocą obwodu 8-0 jedwabna ligatura.
- Usuń zacisk na zewnętrznej żyle szyjnej, a następnie odblokuj tętnicę szyjną. Serca natychmiast wypełniają się krwią. Aby zwiększyć reperfuzję, upuść ciepły roztwór soli o temperaturze 37 °C na przeszczep. Zwykle serce rozwija rytm zatokowy w ciągu jednej minuty. Zdejmij przedłużenie mankietu w miejscu żylnym.
- Należy zapewnić prawidłowe ułożenie przeszczepu, zespolenia muszą być wolne od naprężeń, a naczynia bez skręcania. Nie należy kauteryzować naczyń krwionośnych skóry, ponieważ może to utrudnić gojenie się ran. Krwawienie zwykle ustaje samoistnie. Zamknij skórę pojedynczym 8-0 szew ciągły.
4. Opieka pooperacyjna
- Wstrzyknąć 0,25 ml ciepłego roztworu soli fizjologicznej s.c. w celu wymiany płynu.
- Aby zantagonizować narkotyki, wstrzyknąć nalokson (1,2 mg/kg), flumazenil (0,5 mg/kg) i atipamezol (2,5 mg/kg masy ciała) s.c. Pozostawić zwierzę na ciepłej podkładce, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Obserwuj zwierzę przez co najmniej jedną dodatkową godzinę, aby zarejestrować wszelkie nietypowe zachowanie. Nie należy zwracać zwierzęcia, które przeszło operację, do towarzystwa innych zwierząt, dopóki nie wyzdrowieje.
- Należy zastosować prewencyjną analgezję buprenorfiną (0,05 mg/kg s.c. trzy razy dziennie) lub alternatywną analgezją zgodnie z lokalnym protokołem instytucjonalnym przez co najmniej 72 godziny po zabiegu.
- Chirurg i weterynarz powinni regularnie widywać zwierzęta. W przypadku utraty masy ciała >15%, apatii, obrzęku lub chirurgicznej infekcji bocznej zwierzęta są poddawane eutanazji za pomocą końcowej inhalacji izofluranu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Nasz zespół zdołał z sukcesem opanować opisaną technikę po około 20 operacjach treningowych. Najtrudniejszym etapem jest wywinięcie ściany tętnicy szyjnej nad mankietem, ponieważ łatwo ona wraca do poprzedniej pozycji, a wielokrotne próby mogą doprowadzić do przerwania ściany. Po okresie treningowym średni całkowity czas operacji wynosił 60 ± 8 min. Około 20 min jest wymaganych na pobranie tkanek od dawcy, 25 min na przygotowanie naczyń szyjnych oraz 15 minut na wykonanie anastomoz i zamknięcie skóry.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Przeprowadziliśmy ponad 200 przeszczepów serca z powodzeniem przekraczającym 90% w różnych warunkach eksperymentalnych. Dzięki opisanej tutaj technice cały zabieg może zostać wykonany w ciągu 60 minut przez doświadczonego chirurga. Przygotowując naczynia szyjki macicy przed pobraniem narządów, całkowity czas niedokrwienia przeszczepu można ograniczyć do 20 minut. Czas do implantacji (czas ciepłego niedokrwienia) jest znacznie krótszy przy użyciu techniki mankietowej w porównaniu z techniką szwów16.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
M.-A. Deutsch jest wspierany przez Dr. Rusche Forschungsprojekt (2014), Deutsche Stiftung für Herzforschung i Deutsche Gesellschaft für Thorax- Herz- und Gefäßchirurgie. M. Krane jest wspierany przez Deutsche Stiftung für Herzforschung (F/37/11), Deutsches Zentrum für Herz Kreislauf Forschung (DZHK B 13-050A; DZHK B 14-013SE) oraz Deutsche Forschungsgemeinschaft (KR3770/7-1; KR3770/9-1)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kleszcze JFC-7.2 | S& T | P-00036 | Końcówka zakrzywiona 0,20 mm |
| Dylatator naczyń D-5a | S& T | S-00124 | |
| Nożyczki Adventita | S& T | S-00102 | |
| Zacisk naczyniowy B-1V | S& T | S-00396 | |
| Yasargil Clip | Peter Lazic | 65,097 | długości 3,5 mm |
| Micromed | 148-100-011 | końcówka 0,25 mm | |
| Rurki poliamidowe | River Tech Medical | 19-24 gauge | |
| 8,0 ligatury jedwabne | Catgut | ||
| Custodiol HTK roztwór | Essential Pharmaceuticals |
Bibliografia
- Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. Heart transplantation in congenic strains of mice. Transplant Proc. 5, 733-735 (1973).
- Chen, Z. H. A technique of cervical heterotopic heart transplantation in mice. Transplantation. 52, 1099-1101 (1991).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28, 565-570 (2008).
- Schramm, R., et al. The subepicardial microcirculation in heterotopically transplanted mouse hearts: an intravital multifluorescence microscopy study. J Thorac Cardiovasc Surg. 134, 210-217 (2007).
- Liu, F., Kang, S. M. Heterotopic heart transplantation in mice. J Vis Exp : JoVE. 238, (2007).
- Gong, W., et al. Introduction of modified cervical cardiac transplant model in mice. Exp Clin Transplant. 10, 158-162 (2012).
- Matsuura, A., Abe, T., Yasuura, K. Simplified mouse cervical heart transplantation using a cuff technique. Transplantation. 51, 896-898 (1991).
- Chen, H., Zhang, Y., Zheng, D., Praseedom, R. K., Dong, J. Orthotopic kidney transplantation in mice: technique using cuff for renal vein anastomosis. PloS one. 8, e77278(2013).
- Maglione, M., et al. A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assess ischemia reperfusion injury and graft pancreatitis. Surgery. 141, 682-689 (2007).
- Sucher, R., et al. Orthotopic hind-limb transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2010).
- Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat. Technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. 28, 47-50 (1979).
- Oldani, G., Lacotte, S., Morel, P., Mentha, G., Toso, C. Orthotopic liver transplantation in rats. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 7, 1672-1679 (2007).
- Suzuki, H., Fan, L., Wilkes, D. S. Development of obliterative bronchiolitis in a murine model of orthotopic lung transplantation. J Vis Exp : JoVE. , (2012).
- Zou, Y., et al. Mouse model of venous bypass graft arteriosclerosis. Am J Pathol. 153, 1301-1310 (1998).
- Zhou, Y., Gu, X., Xiang, J., Qian, S., Chen, Z. A comparative study on suture versus cuff anastomosis in mouse cervical cardiac transplant. Exp Clin Transplant. 8, 245-249 (2010).
- Niimi, M. The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice: experience of 3000 operations by one surgeon. J Heart Lung Transplant. 20, 1123-1128 (2001).
- Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth. Comp Med. 51, 443-456 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
