Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52910

⸱

3 grudnia 2015

 ,  , 
1Primate Research Center, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Streszczenie

Podczas rozwoju, komórki krwiotwórcze powstają z wyspecjalizowanego podzbioru komórek śródbłonka, śródbłonka hemogennego (HE). Modelowanie rozwoju HE in vitro ma zasadnicze znaczenie dla mechanistycznych badań przemiany śródbłonkowo-krwiotwórczej i specyfikacji hematopoetycznej. W tym miejscu opisano metodę efektywnej indukcji HE z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) poprzez nadekspresję różnych zestawów czynników transkrypcyjnych. Kombinacja ETV2 i GATA1 lub GATA2 TF służy do indukcji HE z potencjałem panszpikowym, podczas gdy kombinacja czynników transkrypcyjnych GATA2 i TAL1 pozwala na wytwarzanie HE o potencjale erytroidalnym i megakariocytarnym. Dodanie LMO2 do kombinacji GATA2 i TAL1 znacznie przyspiesza różnicowanie i zwiększa produkcję komórek erytroidalnych i megakariocytarnych. Metoda ta zapewnia skuteczny i szybki sposób indukcji HE z hPSC i pozwala na obserwację przejścia śródbłonkowo-krwiotwórczego w naczyniu hodowlanym. Protokół obejmuje procedury transdukcji hPSC oraz analizę po transdukcji HE i komórek progenitorowych krwi.

Wprowadzenie

Unikalna zdolność ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) do samoodnawiania się i różnicowania w komórki trzech listków rozrodczych, w tym krwi, czyni je cennym narzędziem do mechanistycznych badań nad rozwojem układu krwiotwórczego, modelowania chorób krwi, badań przesiewowych leków, badań toksyczności i rozwoju terapii komórkowych. Ponieważ tworzenie krwi w zarodku przebiega od śródbłonka hemopochodnego (HE) przez śródbłonkowe przejście krwiotwórcze1,2, wytwarzanie HE w hodowlach byłoby niezbędne do zbadania mechanizmów molekularnych regulujących przejście śródbłonka do układu krwiotwórczego i specyfikację układu krwiotwórczego. Obecne metody badań HE opierają się na indukcji różnicowania krwiośródbłonka w agregatach (EBs) z dodatkiem cytokinkrwiotwórczych 3-5 oraz kokulturze hPSC z komórkami zrębu wspierającymi hematopoezę6,7 lub w kulturach dwuwymiarowych z matrycami zewnątrzkomórkowymi i cytokinami8,9. Te klasyczne metody różnicowania opierają się na wprowadzeniu sygnałów zewnętrznych działających na powierzchni komórki i inicjowaniu kaskad szlaków molekularnych, które ostatecznie prowadzą do aktywacji programu transkrypcyjnego kierującego rozwojem krwiośródbłonka. Zatem skuteczność różnicowania hPSC w tych układach zależy od skutecznej indukcji tych sygnałów, transdukcji sygnału do jądra i wynikającej z tego aktywacji określonych regulatorów transkrypcji. Ponadto badanie HE w konwencjonalnych kulturach różnicujących wymaga dodatkowego etapu izolacji komórek HE za pomocą sortowania komórek. W tym miejscu opisujemy prosty protokół bezpośredniej indukcji HE i krwi przez nadekspresję hematopoetycznych czynników transkrypcyjnych. Metoda ta pozwala na efektywną indukcję HE w naczyniu i bezpośrednią obserwację przejścia śródbłonka do układu krwiotwórczego bez konieczności izolacji HE za pomocą uciążliwej procedury sortowania komórek.

Tworzenie HE i krwi z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych może być skutecznie indukowane przez nadekspresję zaledwie kilku czynników transkrypcyjnych (TF). Optymalna kombinacja TF zdolnych do indukowania silnej hematopoezy szpikowej z hPSC obejmuje ETV2 i GATA1 lub GATA2. Natomiast połączenie GATA2 i TAL1 indukuje erytromegakariocytopoezę10. Programowanie hPSC poprzez nadekspresję tych czynników różnicuje hPSC bezpośrednio do komórek HE VE-cad+CD43-CD73-, które stopniowo nabywają fenotyp hematopoetyczny zdefiniowany przez ekspresję wczesnego markera krwiotwórczego CD437. Ta oparta na lentiwirusach metoda bezpośredniego programowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych ma zastosowanie do generowania HE i komórek krwi do badań mechanistycznych, badań przejścia śródbłonka do układu krwiotwórczego oraz transkrypcyjnej regulacji rozwoju i specyfikacji układu krwiotwórczego. Chociaż obecny protokół opisuje produkcję krwi przy użyciu konstytutywnej ekspresji transgenów, podobne wyniki można uzyskać przy użyciu zmodyfikowanego mRNA10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Preparaty wirusowe i kombinacje czynników transkrypcyjnych

  1. Przygotować roztwory z plazmidem o ekspresji lentiwirusa pSIN-EF1α zawierającym DNA kodujące białko dla ETV2, GATA1, GATA2, TAL1 i LMO2 (Tabela 1).
  2. Zmierzyć stężenie i czystość preparatów plazmidowych stosowanych do produkcji lentiwirusów, rejestrując absorpcję UV za pomocą spektrofotometru przy 230 nm, 260 nm i 280 nm. Uwaga: Preparaty DNA wykazujące wartości A260/280 i A260/230 większe niż 1,8 są ogólnie uważane za dobrej jakości. Niższe wartości A260/280 mogą wskazywać na zanieczyszczenie białkami, podczas gdy niższe wartości A260/230 wskazują na zanieczyszczenia solami lub niektórymi rozpuszczalnikami, takimi jak fenol. Zalecane stężenie plazmidu to 1-3 μg/μl.
  3. Wytwarzanie lentiwirusów do transdukcji zgodnie z opisem we wcześniej opublikowanych protokołach11. Indukcja HE z potencjałem pan-mieloidalnym wymaga koekspresji ETV2 i GATA1 lub ETV2 i GATA2. Indukcja HE o potencjale erytro- i megakariocytarnym wymaga GATA2 i TAL1. Dodatek LMO2 znacząco poprawia wydajność komórek erytro-megakariocytarnych z hPSC w obecności GATA2 i TAL110.

2. Protokół hodowli hPSCs

  1. Hoduj pluripotencjalne komórki macierzyste w ciasnych koloniach z ostrymi krawędziami do 70-80% zbiegu przed subkulturą. Oznacz i usuń spontanicznie zróżnicowane kolonie przed pasażowaniem komórek.
  2. Rozcieńczyć dostępny w handlu żel do macierzy zewnątrzkomórkowej (patrz Tabela 2) zgodnie z instrukcjami producenta i przed użyciem pokryć płytki 6-dołkowe przez noc w temperaturze 4 °C lub przez co najmniej godzinę w temperaturze 37 °C. Przed pasażowaniem komórek należy odessać matrycę, dodać 2 ml świeżej, dostępnej w handlu kompletnej pożywki hodowlanej (patrz tabela 2) i utrzymywać płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, gdy komórki będą gotowe do wysiewu.
  3. Punkty hPSC pasażowe
    1. Odessać pożywkę z jednego zlewalnego dołka z 6-dołkowej płytki z hPSC i dodać 1,5 ml wstępnie podgrzanego roztworu Dispase II (2 mg/ml w DMEM/F12, wysterylizowane przez filtrację przez filtry 0,22 μm). Inkubować przez 5-7 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 do momentu, gdy krawędzie kolonii zaczną odrywać się od powierzchni.
    2. Odessać roztwór Dispase II i ostrożnie umyć kolonie dwukrotnie, dodając, a następnie odsysając 2 ml świeżej pożywki DMEM/F12. Następnie, używając szklanej pipety serologicznej o pojemności 5 ml, oddzielić hPSC od 3 ml świeżej, dostępnej w handlu pożywki do hodowli kompletnych (patrz Tabela 2), kilkakrotnie pipetując zawiesinę komórek w górę i w dół.
    3. Dodać 0,5 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 6-dołkowej płytce zawierającej 1,5 ml komercyjnej kompletnej pożywki hodowlanej (patrz Tabela 2). Kilkakrotnie mieszaj płytkę w przód iw tył oraz od prawej do lewej, aby zapewnić równomierny rozkład komórek podczas umieszczania płytki w inkubatorze. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 18-24 godziny.
    4. Następnego dnia należy zmienić pożywkę na świeżą, komercyjną, kompletną pożywkę hodowlaną (patrz Tabela 2) i zbadać morfologię hPSC. Udane pasażowanie skutkuje małymi, dobrze przylegającymi koloniami zachowującymi morfologię hPSC. hPSC muszą być karmione 2,5-3 ml freshmedium na studzienkę dziennie i pasażowane co 4-5 dni przy nie więcej niż 70-80% konfluencji.
      UWAGA: Jeśli hiPSC były utrzymywane na mysich fibroblastach embrionalnych (MEF), muszą zostać przeniesione do warunków wolnych od karmienia i pasażowane 2-3 razy przed transdukcją, aby zapewnić skuteczne różnicowanie.

3. Indukcja pprekursorów hematośródbłonka z hPSC (dzień 0, Transdukcja hPSC)

  1. Aby przygotować pożywkę reakcyjną, należy połączyć 1,3 ml komercyjnej pożywki całkowicie wolnej od surowicy (patrz Tabela 2), wirusa, polibrenu i inhibitora Y27632 ROCK (Tabela 1): dodać 1,3 μl 10 mM inhibitora ROCK do 1,3 ml pożywki do końcowego stężenia 10 μM i polibrenu do końcowego stężenia 6 μg/ml.
    1. Dodać odpowiednią ilość koncentratu (koncentratów) wirusa o końcowym stężeniu 0,5-1,0 MOI (wielokrotność infekcji) każdego wirusa na komórkę. Utrzymywać pożywkę reakcyjną na lodzie lub w temperaturze 4 °C, aż zawiesina jednokomórkowa będzie gotowa.
      UWAGA: Ta sama ilość MOI dla każdego wirusa w mieszaninach reakcyjnych GATA1/ETV2, GATA2/TAL1 i GATA2/TAL1/LMO2 jest optymalna dla indukcji różnicowania. Jednak w kulturach transdukowanych ETV2/GATA2 podwojenie MOI dla GATA2 w stosunku do ETV2 zwiększa różnicowanie. Dlatego dla tych hodowli zaleca się stosunek 1:2 dla MOI ETV2 i 1 MOI GATA2 (np. jeśli koncentrat wirusa szacuje się na około 6,8 x 107 cząstek/ml, dodaj 10 μl ETV2 i 20 μl koncentratów wirusa GATA2 do 0,68 x 106 komórek na jedną reakcję ETV2/GATA2 w 35 mm dołku 6-dołkowej płytki).
  2. Przygotować hPSC w zawiesinie pojedynczej komórki.
    1. Hoduj hPSC w warunkach wolnych od karmienia, jak opisano w sekcji 2. W 4 dniu po ostatnim pasażu obserwuj gęstość i morfologię komórek pod odwróconym mikroskopem. hPSC powinny rosnąć w ciasnych koloniach z ostrymi krawędziami, bez spontanicznego różnicowania i osiągać ~60-70% konfluencji w dniu transdukcji.
    2. Odessać pożywkę, dodać 1,5-2 ml komercyjnego odczynnika do dysocjacji komórek (Tabela 1) do dołka i inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 5-7 minut.
    3. Zebrać komórki do równych objętości komercyjnej kompletnej pożywki (patrz Tabela 2) z 10 μM inhibitora ROCK, policzyć komórki i określić ich żywotność. Komórki osadzać przez wirowanie przy 200 x g przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić komórki w komercyjnym kompletnym podłożu z 10 μM inhibitora ROCK do stężenia 3,4-5 x 106 komórek na ml.
      UWAGA: Żywotność komórek ma kluczowe znaczenie dla pomyślnej transdukcji wirusa i późniejszego różnicowania. Zazwyczaj żywotność komórek przed transdukcją powinna przekraczać 90%.
  3. Dodać 200 μl zawiesiny komórek, zawierającej 0,68-1 x106 komórek, do 1,3 ml pożywki reakcyjnej przygotowanej w 3.1.
  4. Odessać roztwór matrycy z powlekanej przez noc płytki 6-dołkowej przygotowanej w 2.2., przenieść mieszaninę reakcyjną do jednego dołka płytki 6-dołkowej i równomiernie rozprowadzić komórki. Inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny. Po 24 godzinach co najmniej 80% komórek powinno być przyłączonych do matrycy.

4. Indukcja prekursorów hematośródbłonka z hPSC (Dzień 1-7)

  1. 24 godziny po transdukcji usunąć pożywkę zawierającą wirusa i przemyć przyłączone komórki komercyjną niekompletną pożywką do hodowli komórkowych (patrz Tabela 1), a następnie dodać 3 ml na studzienkę komercyjnej pożywki do niekompletnych hodowli komórkowych zawierającej cytokiny krwiotwórcze: SCF 100 ng/ml, TPO 50 ng/ml, bFGF 20 ng/ml (zwane dalej pożywką 3F).
  2. Zastąp całkowitą pożywkę świeżą pożywką 3F w dniach 2, 3 i 4, aby usunąć martwe komórki i zanieczyszczenia. Po 4 dniu, gdy pojawiają się pływające komórki krwiotwórcze, należy wymieniać połowę pożywki 3F co drugi dzień, utrzymując całkowitą objętość na poziomie 4 ml.
    UWAGA: plazmidy ekspresji lentiwirusa pSIN-EF1α zawierają gen oporności na puromycynę, umożliwiając w ten sposób pozytywną selekcję transdukowanych komórek. 1 μg/ml puromycyny można dodać do pożywki w ciągu pierwszych 1-2 dni różnicowania w celu wyeliminowania wszelkich pozostałości niezróżnicowanych hPSC.
  3. Obserwuj morfologię komórek w 4 dniu pod odwróconym mikroskopem: zaczynają pojawiać się ciasne skupiska komórek o typowej morfologii śródbłonka (ryc. 2A, 3A). Okrągłe krwinki pojawiają się od 5 do 7 dnia różnicowania, podczas gdy niektóre obszary mogą zachować morfologię hPSC. Przeanalizuj różnicowanie HE i układu krwiotwórczego zgodnie z poniższym opisem.
    UWAGA: Pomyślne różnicowanie śródbłonka krwiotwórczego powoduje wytwarzanie komórek krwi, które wyglądają jak ogniotrwałe okrągłe komórki luźno połączone z leżącymi pod spodem płaskimi komórkami śródbłonka. Komórki te aktywnie namnażają się, tworząc małe agregaty, a ostatecznie odłączają się i unoszą (ryc. 2A i 3A). Żywe komórki krwi można wizualnie odróżnić od martwych i umierających komórek na podstawie ich zdolności do odbijania światła i rozszerzania się w warunkach hodowli.

5. Analiza etapu różnicowania śródbłonka hemogennego (HE).

  1. Wykryj powstawanie HE między 3 a 4 dniem różnicowania poprzez obserwację mikroskopową komórek o morfologii śródbłonka. Na tym etapie różnicowania w hodowli nie ma pływających krwinek. Obecność HE można potwierdzić za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego i analizy cytometrii przepływowej przy użyciu przeciwciał VE-kadheryny, CD73, CD226 i CD43.
    1. Aby ocenić powstawanie HE za pomocą analizy cytometrii przepływowej, należy użyć komórek w dniu 3 i dniu 4 z jednego eksperymentu. Zebrać komórki przez inkubację kultur z dostępnym w handlu odczynnikiem do dysocjacji komórek (patrz Tabela 1) przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , a następnie użyć do 1 x 105 komórek na reakcję barwienia (procedura barwienia cytometrii przepływowej opisana w 12).
      UWAGA: Komórki HE VE-kadheryny + uzyskują ekspresję wczesnego markera krwiotwórczego CD226, ale brakuje im ekspresji CD73 i CD436. W przeciwieństwie do tego, komórki inne niż HE wyrażają CD73 (ryc. 2B, 3B).
  2. Barwienie immunofluorescencyjne w kierunku HE pochodzącego z hPSC.
    1. Przemyj dołączoną monowarstwę komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), a następnie utrwal komórki w 4% paraformaldehydzie od 30 do 60 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Ponownie przemyć komórki PBS, a następnie przepuścić powietrze za pomocą 0,1% Triton X-100 w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj komórki w PBS dwa do trzech razy, a następnie inkubuj w buforze blokującym składającym się z PBS z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), przez 30 do 120 minut.
    4. Przygotować roztwór barwiący, zawierający zarówno pierwszorzędowe przeciwciała (rozcieńczenie 1:1000) mysi anty-ludzki CD43, jak i króliczą anty-ludzką kadherynę VE-w PBS z 5% FBS (Tabela 1).
    5. Odessać bufor blokujący z komórek i dodać 1 ml do studzienki buforu barwiącego z dodanymi przeciwciałami pierwszorzędowymi; inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    6. Umyj komórki trzykrotnie, dodając 2 ml PBS z 5% FBS.
    7. Przygotować drugi bufor barwiący, zawierający przeciwciała drugorzędowe w rozcieńczeniu 1:500 w PBS z 5% FBS: anty-królik osła sprzężony z zielonym barwnikiem fluorescencyjnym i anty-mysz skoniugowany z czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym (Tabela 1). Dodać 1 ml do studzienki wtórnego buforu barwiącego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    8. Umyj trzy razy PBS bez serum. Komórki barwiące roztworem roboczym DAPI 300 nM wdH2Oprzez 10-15 min.
    9. Umyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj 2-3 ml PBS do studzienki z wybarwionymi komórkami. Obserwuj fluorescencję za pomocą zielonych, czerwonych i niebieskich filtrów mikroskopowych.

6. Analiza indukowanych prekursorów hematopoetycznych

  1. Utrzymywać kultury różnicujące aż do znacznego rozszerzenia pływających komórek, do 10-14 dni, zmieniając połowę pożywki 3F, jak opisano w ppkt 3.1, co dwa dni.
  2. Dysocjację i zbieranie różnicujących się monowarstw komórek poprzez traktowanie komórek komercyjnym odczynnikiem do dysocjacji komórek (patrz Tabela 1) przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  3. Wykonać cytometrię przepływową przy użyciu przeciwciał anty-VE-kadheryny, CD43 i CD45 w celu oceny hematopoezy w kulturach12. Należy zauważyć, że duża część komórek, do 40% komórek transdukowanych ETV2 i GATA2, ulega koekspresji VE-cad i CD43. Następujące przeciwciała mogą być stosowane do wykrywania określonych linii komórkowych po ekspansji lub różnicowaniu indukowanych progenitorów krwi: CD235a (komórki erytroidalne), CD41a (megakariocytarne), CD32 (wszystkie typy komórek szpikowych), CD66b (neutrofile) i CD163 (makrofagi).
  4. Przeprowadzić test CFC przy użyciu komercyjnego podłoża klonogennego (Tabela 1) zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Przenieść 1-2 x 104 komórki do 3 ml komercyjnej pożywki klonogennej (patrz Tabela 3), aby ocenić liczbę komórek tworzących kolonie i typy kolonii krwiotwórczych. Optymalna gęstość wysiewu pozwala na identyfikację i izolację pojedynczych kolonii, które rosną oddzielnie od siebie i nie zachodzą na siebie. Gęstość wysiewu może się różnić w zależności od doświadczenia w zależności od skuteczności różnicowania, ale nie powinna przekraczać 1 x 104 komórek na 1 ml komercyjnej pożywki klonogenicznej.
    2. Wymieszaj komórki w komercyjnym pożywce klonogennej przez delikatne wirowanie i przenieś 3 ml zawiesiny do dwóch 35-milimetrowych szalek o bardzo niskim nasadce do testu CFC, 1,5 ml zawiesiny do każdej szalki. Rozprowadzić równomiernie podłoże i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 14 dni. Unikaj przeszkadzania potrawom; Obserwuj tworzenie się kolonii w 7 i 10 dniu testu.
    3. Zidentyfikuj i policz kolonie krwiotwórcze zgodnie z ich morfologią w 14 dniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny rysunek indukcji HE (komórek hematoendotelialnych) i krwi z hPSC poprzez nadekspresję czynników transkrypcyjnych przedstawiono na Rysunku 1. Kombinacja ETV2 z GATA1 lub GATA2 indukuje pan-mieloidalną hematopoezę, podczas gdy kombinacja GATA2, TAL1 +/- LMO2 indukuje głównie erytro-megakariocytarną hematopoezę. Obie kombinacje TF bezpośrednio indukowały komórki HE, które następnie przekształciły się w progenitory krwi o odmiennym spektrum różnicowania hematopoetycznego. Różnicowanie hPSC ze st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisana powyżej metoda hematopoetycznego różnicowania hPSC przez nadekspresję TF stanowi szybkie i skuteczne podejście do wytwarzania HE oraz komórek progenitorowych szpiku i eryto-magakaryocytarów z hESC i iPSC, umożliwiając w ten sposób wytworzenie do 30 milionów komórek krwi z jednego miliona pluripotencjalnych komórek macierzystych10. Metoda ta wykazała konsekwentne różnicowanie w wielu liniach hESC i iPSC10. Podczas różnicowania przez ETV2 i GATA2, czynniki GATA1 oraz czynniki GATA2 i TAL1 komó...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

I.S. jest udziałowcem-założycielem i konsultantem firmy Cynata.

Podziękowania

Dziękujemy Mattowi Raymondowi za pomoc redakcyjną. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institute of Health (U01HL099773, R01HL116221 i P51 RR000167) oraz The Charlotte Geyer Foundation.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze

Tabela 1. Indukcja różnicowania hPSCs za pomocą czynników trancription oraz analiza śródbłonka hemogennego i komórek krwi.

pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro Addgene Plasmid #61061Wektor lentiwirusowy
pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro Addgene Plasmid #61063Wektor lentiwirusowy
pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro Addgene Plasmid #61062Wektor lentiwirusowy
pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro AddgenePlasmid #61062Wektor lentiwirusowy
pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro AddgenePlasmid #61064Wektor lentiwirusowy
Bromek heksadimetryny (Polybrene) Sigma-Aldrich107689-10GPolimer kationowy stosowany w celu zwiększenia skuteczności infekcji
Y-27632 (Dichlorowodorek) Inhibitor ROCKSTEMCELL Technologies72302Inhibitor szlaku RHO/ROCK Hamuje ROCK
Odczynnik do dysocjacji komórek StemPro AccutaseLife TechnologiesA11105-01Odczynnik
Niekompletna pożywka hodowlana (bez czynnika wzrostu)                                                                                          mTeSR1 Preparat niestandardowy Instytut Badawczy WiCell (Madison, WI)MCFPodłoże mTeSR1 bez surowicy bez bFGF i TGFb 
human SCFPeprotech300-07Najwyższej jakości
ludzki TPOPeprotech300-18Klasa badawcza
ludzka FGF-basicPeprotech100-18BKlasa premium
CD144 (VE-cad) FITCBD Biosciences560411Marker śródbłonka (FACS)
CD226 PEBD Biosciences338305Hematopoetyczny ( FACS)
CD43 PEBD Nauki biologiczne560199Hematopoetyczne (FACS)
CD73 APCR& D SystemsFAB5795AMarker śródbłonka (FACS)
CD45 APCBD Biosciences555485Hematopoetyczny (FACS)
7AADLife TechnologiesA1310Test żywy/martwy (FACS)
Paraformaldehyd Sigma-AldrichP6148-500GStabilizacja komórek 
Triton X-100 Sigma-AldrichT9284-500ML Przepuszczalność 
FBSFisher ScientificSH3007003Płodowa surowica bydlęca
Mysz anty-ludzka CD43BD Biosciences551457Czyste, pierwotne przeciwciało do barwienia immunofluorescencyjnego (IF)
Królik anty-ludzki VE-kadherynaBenderMedSystemBMS158Pierwotny (IF)
Anty-królik Alexa Fluor 488-sprzężonyJacksonResearch715-486-152Wtórny (IF)
Anty-mysz Alexa Fluor 594-sprzężonaJacksonResearch715-516-150 Drugorzędne (IF)
Barwienie kwasem nukleinowym DAPILife TechnologiesD1306 Test żywy/martwy (IF)
Pożywka klonogeniczna MethoCult H4435 Wzbogaconetechnologie STEMCELL4435Test CFC
Roztwór barwnika WrightaSigma -Aldrich32857Barwienie cytospinów

Tabela 2. hPSCs culture.

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) Instytut Badawczy WiCell (Madison, WI)hESC (WA01, WA09) ludzkie embrionalne komórki macierzyste; iPSC (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) indukowane bez transgenów pluripotencjalne komórki macierzystehPSC są zdolne do samoodnawiania się i różnicowania w komórki trzech listków rozrodczych
Kompletna pożywka bez surowicy do hodowli hPSCs                                                                                                      Nośniki mTeSR1   Instytut Badawczy WiCell (Madison, WI)M500 Bez surowicy  pożywki z czynnikami wzrostu do hodowli ESC/iPSC bez karmienia
MatrigelBD Biosciences/ Corning 356234Matryca do utrzymania ludzkich ESC/IPSC
DEM/F-12, proszek Life Technologies12500-062Podłoże podstawowe 
HyClone Dulbecco's PBS powderFisher ScientificdSH30013.04PBS
Dispase II, proszekLife Technologies17105-041Neutralna proteaza, dysocjacja komórek

Tabela 3. Startery do wykrywania integracji genomu wirusa.

Nazwa starteraNaprzód (fwd)  5' -->3' Reverse (Rev) 5'-->3' Opis 
pSIN EF1a FwdTTC CAT TTC AGG TGT CGT GA--EF1a sekwencja promotora
GATA1 Rev--TCC CTG ZNACZNIK GCC AGT GC  Region kodowania 
GATA2 Rev--GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG  Region kodowania 
TAL1 Rev--AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT  Region kodowania 
LMO2 Rev--GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC  Region kodowania 
ETV2 Rev--GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC   Region kodowania 
do dysocjacji komórek

Bibliografia

  1. Zape, J. P., Zovein, A. C. Hemogenic endothelium: origins, regulation, and implications for vascular biology. Semin Cell Dev Biol. 22, 1036-1047 (2011).
  2. Swiers, G., Rode, C., Azzoni, E., de Bruijn, M. F. A short history of hemogenic endothelium. Blood Cells, Mol & Dis. 51, 206-212 (2013).
  3. Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 1722-1735 (2012).
  4. Wang, L., et al. Endothelial and hematopoietic cell fate of human embryonic stem cells originates from primitive endothelium with hemangioblastic properties. Immunity. 21, 31-41 (2004).
  5. Rafii, S., et al. Human ESC-derived hemogenic endothelial cells undergo distinct waves of endothelial to hematopoietic transition. Blood. 121 (5), 770-780 (2012).
  6. Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2, 553-567 (2012).
  7. Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108, 2095-2105 (2006).
  8. Wang, C., et al. TGFbeta inhibition enhances the generation of hematopoietic progenitors from human ES cell-derived hemogenic endothelial cells using a stepwise strategy. Cell Res. 22, 194-207 (2012).
  9. Uenishi, G., et al. Tenascin C promotes hematoendothelial development and T lymphoid commitment from human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Stem Cell Rep. 3, 1073-1084 (2014).
  10. Elcheva, I., et al. Direct induction of haematoendothelial programs in human pluripotent stem cells by transcriptional regulators. Nat Commun. 5, 4372(2014).
  11. Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
  12. Vodyanik, M. A., Slukvin, I. I. Hematoendothelial differentiation of human embryonic stem cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 23, Unit 23.6(2007).
  13. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Mol Imgn and Biol. 12, 15-24 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Nadekspresja czynnik w transkrypcyjnychendotelialno hematopoetyczna transformacjaanaliza cytometrycznatransdukcja lentiwirusowadodanie ETV2 GATA1GATA2 TAL1LMO2r nicowanie kom rek krwi
Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.