Artykuł metodologiczny

Korelacyjna, konfokalna i trójwymiarowa mikroskopia elektronowa określonej komórki czuciowej

DOI:

10.3791/52918

⸱

19 lipca 2015

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Duke University Medical Center, 2Department of Chemistry, University of North Carolina - Chapel Hill, 3Renovo Neural Incorporated

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj wprowadzamy metodę, cocem3D, która pozwala na odkrycie ultrastruktury konkretnej komórki w jej natywnej tkance poprzez połączenie konfokalnej i seryjnej skaningowej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Określenie ultrastruktury komórki jest ważne dla zrozumienia jej funkcji. Może to być zniechęcające przedsięwzięcie w przypadku rzadkich typów komórek rozproszonych w tkankach zbudowanych z różnych typów komórek, takich jak komórki enteroendokrynne nabłonka jelitowego. Te czujniki żołądkowo-jelitowe żywności i bakterii były trudne do zbadania, ponieważ są rozproszone wśród innych komórek nabłonka w stosunku 1:1000. Ostatnio stworzono transgeniczne myszy reporterowe do identyfikacji komórek enteroendokrynnych za pomocą fluorescencji. Jednym z nich jest peptyd mysz YY-GFP. Korzystając z tej myszy, opracowaliśmy metodę korelacji konfokalnej i szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej z blokową powierzchnią. Nazwaliśmy metodę cocem3D i zastosowaliśmy ją do identyfikacji określonej komórki enteroendokrynnej w tkance i odsłonięcia ultrastruktury komórki w 3D. Rozdzielczość cocem3D jest wystarczająca do identyfikacji organelli tak małych jak pęcherzyki wydzielnicze i do rozróżnienia błon komórkowych w celu utylizacji objętościowej. Cocem3D można łatwo dostosować do badania ultrastruktury 3D innych określonych typów komórek w ich natywnej tkance.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Życie wewnątrz komórki odbywa się w czasie i przestrzeni. Zmiany w czasie są często badane za pomocą mikroskopii poklatkowej w połączeniu z technikami obrazowania fluorescencyjnego, takimi jak mikroskopia superrozdzielcza. Przestrzeń, a w szczególności układ organelli wewnątrz komórki lub interakcje międzykomórkowe, można wyprowadzić jedynie poprzez pełny opis delikatnej struktury komórki. Kompleksowe opisanie delikatnej struktury komórki może również zapewnić jasność funkcji genomu w przypadkach, gdy genom jest dostępny, jak w przypadku nicienia C. elegans 1 lub płaskiego placozoa tricoplax adherens2. Mikroskopia elektronowa z seryjnym przekrojem jest obecnie powtarzalnym, efektywnym czasowo i tańszym zadaniem dzięki rozwojowi zautomatyzowanych technologii mikroskopii elektronowej 3D, takich jak seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa3 (SBEM).

Potrzeba informacji strukturalnych do wyjaśnienia funkcji jest bardzo widoczna w niektórych typach komórek, gdzie funkcja zależy od fizycznych interakcji między komórkami, takich jak neurony, komórki glejowe lub nabłonki czuciowe. Jesteśmy szczególnie zainteresowani wyjaśnieniem, w jaki sposób sygnały czuciowe ze składników odżywczych w świetle jelit są przekształcane w sygnał elektryczny, który ostatecznie moduluje zachowania pożądawcze. Obwód jest złożony, ale zaczyna się na ścianie jelita, gdzie składniki odżywcze wchodzą w kontakt z komórkami nabłonka czuciowego, zwanymi komórkami enteroendokrynnymi. W przeciwieństwie do innych komórek nabłonka czuciowego, takich jak komórki smaku, komórki enteroendokrynne są rozproszone w całym nabłonku jelitowym w stosunku od jednego do tysiąca4-7. W związku z tym były trudne do zidentyfikowania i zbadania, a przez długi czas były postrzegane jedynie jako źródło hormonów jelitowych. Ale wraz z rozwojem specyficznych dla komórek myszy reporterowych fluorescencyjnych pojawia się złożona funkcja sensoryczna tych komórek. Używając jednej z tych myszy reporterowych, myszy peptydowej YY-GFP (PyyGFP), odkryliśmy, że komórki enteroendokrynne mają wyraźny ogon cytoplazmatyczny, który nazwaliśmy neuropodem. Pojawienie się neuropodów sugerowało zachowaną funkcję w komunikacji międzykomórkowej. W związku z tym doszliśmy do wniosku, że dokumentując ultrastrukturę komórki enteroendokrynnej, można określić funkcję neuropodów.

Potrzeba zrozumienia struktury wyrostka w rozproszonej komórce, która jest trudna do zidentyfikowania, była głównym powodem opracowania metody łączącej mikroskopię konfokalną i SBEM. Komórka będąca przedmiotem zainteresowania została zidentyfikowana przy użyciu myszy reporterowych PyyGFP specyficznych dla komórek enteroendokrynnych. Metoda pozwoliła nam udokumentować całą ultrastrukturę komórki enteroendokrynnej i jej neuropoda. W obrębie neuropodów znaleźliśmy cechy strukturalne aksonów neuronalnych, a poza neuronogami znaleźliśmy fizyczny związek z glejem jelitowym8. Rzeczywiście, neuropody zawierają około 70% wszystkich pęcherzyków wydzielniczych, co sugeruje istotną rolę w funkcji wydzielniczej tych komórek. Opierając się na danych strukturalnych, niedawno odkryliśmy, że dzięki tym neuropodom komórki enteroendokrynne i neurony unerwiające jelita tworzą obwód neuronabłonkowy, podobny do tego, jaki mają komórki smakowe w języku8,9.

Odkrycie takich cech mechanizmów chemosensorycznych przewodu pokarmowego wynikało z danych strukturalnych zebranych za pomocą tej metody mikroskopii korelacyjnej. Uważamy, że ta metoda może być przydatna w innych obszarach biologii komórki, szczególnie tam, gdzie komórki są rozproszone w tkankach w bardzo niskim stosunku. Odnieśliśmy się do tej metody jako korelacyjnej konfokalnej i szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej w 3D (Cocem3D). Metoda składa się z następujących głównych etapów: preparacji tkanek, mikroskopii konfokalnej, obrazowania SBEM, korelacji SBEM i obrazu konfokalnego oraz segmentacji manualnej. W porównaniu z innymi metodami korelacji, koncepcja jest raczej prosta, ponieważ korelacja jest fizyczna, a nie chemiczna.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty i opieka nad zwierzętami zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Duke'a.

Cocem3D powstał z kombinacji wcześniej opublikowanych protokołów10,11 i został tutaj zastosowany do badania specyficznej komórki enteroendokrynnej za pomocą myszy reporterowej PyyGFP12. Metodę tę można łatwo zastosować do innych komórek będących przedmiotem zainteresowania przy użyciu dostępnych na rynku transgenicznych myszy reporterowych. Metoda jest opisana w trzech sekcjach: Korelcyjna mikroskopia konfokalna, seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM) oraz renderowanie danych w 3D.

Mikroskopia konfokalna korelacyjna.

Celem tej sekcji jest pobranie segmentu tkanki z dystalnej części jelita grubego o wymiarach, które umożliwiają korelacyjne obrazowanie konfokalne i SBEM. Protokół jest następujący:

1. Pobieranie tkanki

  1. Przygotować 10 ml roztworu heparyny o stężeniu 50 μg/ml w PBS.
  2. Przygotować bulion znieczulający ksylazyna/ketamina, mieszając 10 ml ketaminy (100 mg/ml) i 1 ml ksylazyny (20 mg/ml).
    1. Rozcieńczyć ksylazynę/ketaminę 1:4 w 0,1 mln PBS.
  3. Przygotować 100 ml roztworu utrwalającego zawierającego 4% paraformaldehydu i 0,1% aldehydu glutarowego w PBS.
  4. Znieczulenie myszy PyyGFP w wieku od 6 do 10 tygodni za pomocą śmiertelnej dawki środka znieczulającego ksylazyna/ketamina. Środek znieczulający należy wstrzykiwać dootrzewnowo w ilości 0,15 ml na 20 g masy myszy.
  5. Potwierdź prawidłowe znieczulenie myszy, szczypiąc ogon lub palce u nóg i nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu.
  6. Użyj pompy perystaltycznej o zmiennym przepływie, aby perfaktor utrwalający dosierdziowo10. Za pomocą nożyczek chirurgicznych (o długości 13 cm) rozetnij jamę brzuszną, aby odsłonić jelita, serce i płuca. Przytrzymaj serce za pomocą zakrzywionych kleszczyków o wąskim wzorze (12 cm długości) i włóż igłę motylkową (19 G) z pompy perystaltycznej do lewej komory. Natychmiast odetnij prawy przedsionek za pomocą sprężynowych nożyczek prostych (długość 4 mm). Perfuzję z szybkością 2 ml/min najpierw z roztworem heparyny przez 1 minutę, a następnie z lodowatym roztworem utrwalającym przez 15 minut, aż ogon myszy stanie się całkowicie sztywny.
    Uwaga: Bardzo ważne jest, aby perfuzja była powolna, aby zapobiec pękaniu małych naczyń w błonie śluzowej jelit. Pękanie naczynek narusza ultrastrukturę tkanki. Jeśli perfuzja jest odpowiednia, wątroba powinna zblednąć w ciągu 3-5 minut.
  7. Za pomocą małych nożyczek otwórz jamę brzuszną i wytnij całą okrężnicę od połączenia z jelitem ślepym do dystalnej odbytnicy. Umieść tkankę w lodowatym PBS. Po zanurzeniu w PBS rozetnij małymi sprężynowymi nożyczkami okrężnicę wzdłuż krezki.

2. Wycinanie i naprawianie segmentów tkanek

  1. Za pomocą skalpela wytnij około 6 małych segmentów tkanki (2 mm2) z dystalnej części jelita grubego. Zrób to na arkuszu wosku dentystycznego i zanurz go w kilku kroplach PBS.
  2. Po utrwaleniu segmentów tkanki w roztworze utrwalającym przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.

3. Mikropreparowanie bloków tkanek

  1. Przygotować 5% niskotopliwej agarozy w PBS i przechowywać w łaźni wodnej o temperaturze 45 °C.
  2. Osadź segmenty tkanek w 5% niskotopliwej agarozie za pomocą małego plastikowego pojemnika, takiego jak standardowy rozmiar Tissue-Tek Cryomold.
  3. Zamontuj osadzone sekcje na mikrotomie z wibrującymi ostrzami i napełnij tackę buforową lodowatym PBS.
  4. Wycinanie pasków tkankowych o grubości 300 μm z amplitudą 0,8 i prędkością 0,04 mm/s. Uwaga: W tym momencie paski tkanki zostaną usunięte z agarozy.
  5. Ponownie zanurz paski tkankowe o wielkości 300 μm w agarozie i zamontuj je na mikrotomie prostopadle do ostrza wibratomu.
  6. Za pomocą wibratomu wytnij paski tkanki o grubości 50 μm. Uwaga: Końcowe bloki tkanek powinny mieć około 300 μm szerokości x 50 μm grubości. Wymiary te zostały zoptymalizowane na podstawie pilotażowych eksperymentów konfokalnych, które wykazały, że grubość komórki enteroendokrynnej wynosi od 15 do 20 μm, a długość neuropoda 30-70 nm. W związku z tym cała komórka może być zawarta w bloku tkanki o szerokości 300 μm i grubości 50 μm, jeśli orientacja komórki jest równoległa do powierzchni bloku tkankowego. Zmieniaj te wymiary w zależności od rodzaju tkanki i komórki, która Cię interesuje.
  7. Przechowywać bloki tkanek w PBS w temperaturze 4 °C.

4. Obrazowanie konfokalne

  1. Przygotuj roztwór barwienia jądrowego, rozcieńczając DAPI w PBS w stosunku 1:4,000.
  2. Inkubuj bloki tkanek w barwieniu jądrowym DAPI przez 5 minut. Uwaga: Barwienie DAPI ułatwia rozróżnianie poszczególnych komórek na podstawie ich jąder, co jest pomocne w korelacji obrazów konfokalnych i SBEM.
  3. Zamontuj bloki tkanek na naładowanym szkiełku podstawowym, dodaj kilka kropli PBS i przykryj je szkiełkiem nakrywkowym.
  4. Za pomocą mikroskopu konfokalnego zidentyfikuj bloki z nienaruszonymi kosmkami i komórkami PyyGFP będącymi przedmiotem zainteresowania i zobrazuj je, aby uzyskać przekroje optyczne z-stacks.
    1. Użyj obiektywu Zeiss Plan Apochromat 20x/0,8, aby uzyskać stosy z o przekroju optycznym 1 μm.
    2. W przypadku stosu z użyj kanałów dla 405 nm (DAPI), aby określić związek z innymi komórkami, endogennego GFP 488 nm, aby zlokalizować komórkę będącą przedmiotem zainteresowania, oraz różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), aby określić lokalizację komórki względem światła.
    3. Użyj rozdzielczości obrazu 1 024 pikseli lub wyższej.

5. Osadzanie bloków w agarozie

  1. Przygotować 10 ml utrwalacza zawierającego 4% paraformaldehydu i 2,5% aldehydu glutarowego w PBS.
  2. Usunąć bloki tkanki ze szkiełka podstawowego, ostrożnie dodając PBS na krawędziach szkiełka nakrywkowego, aby zsunąć szkiełko nakrywkowe z szkiełka podstawowego bez uszkadzania szkiełka tkankowego. Następnie za pomocą pędzla artystycznego przenieś blok tkanki ze szkiełka do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 4% paraformaldehydu i 2,5% utrwalacza aldehydu glutarowego.
  3. Tkanka po utrwaleniu blokuje O/N w temperaturze 4 °C.
  4. Przenieś bloki tkanek do PBS. Następnie osadź bloki płasko w 5% niskotopliwej agarozie, umieszczając je między dwoma szklanymi szkiełkami.
    Uwaga: Osadzenie klocków w cienkiej warstwie agarozy ułatwia manipulację tylną częścią ciała podczas barwienia.
  5. Pokrój agarozę w kwadrat i zrób nacięcie po górnej stronie. Uwaga: Ten krok jest konieczny, aby zachować orientację w kolejnych krokach.
  6. Przechowywać bloki w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml z PBS w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania.

Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa (SBEM)

W tej sekcji, blok tkankowy jest przygotowany i zobrazowany za pomocą SBEM w małym powiększeniu. Obraz geodezyjny powierzchni bloku jest następnie korelowany z danymi konfokalnymi w celu zidentyfikowania obszaru zawierającego komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. Po zidentyfikowaniu regionu tkanka jest obrazowana w rozdzielczości 7 nm/piksel i w warstwach 70 nm. To wystarczyło, aby rozróżnić i odróżnić pęcherzyki wydzielnicze rdzenia o dużej gęstości od innych organelli. W komórkach enteroendokrynnych ten typ pęcherzyków ma średnicę od 100 do 150 nm13. Protokół jest następujący:

6. Barwienie skrawków tkanek

  1. Usunąć tkankę z PBS i spłukać trzykrotnie, po 5 minut każdy, w 0,1 M buforze kakodylowym.
  2. Bloki barwienia przez 1 godzinę w 0,1% kwasie garbnikowym rozpuszczonym w 0,1 M buforze kakodylowym w celu zwiększenia kontrastu błon komórkowych14.
  3. Przeprowadź późniejsze barwienie i odwodnienie tkanki zgodnie z opublikowanym protokołem11. Postępując zgodnie z protokołem Deerinck i wsp., przygotuj następujące roztwory: 1) 1% (w/v) tiokarbonhydrazydu (THC); 2) roztwór asparaginianu ołowiu; 3) 1% octan uranylu i 4) tetraoksyd osmu / żelazocyjanek potasu (żelazocyjanek OsO4/K). Wymieszaj 4% OsO4 i 2x K żelazocyjanek [0,3 g K żelazocyjanku i 0,86 g Kakodylanu Na w 10 ml H2O] w stosunku 1:1, aby uzyskać żelazocyjanek OsO4/K. Uwaga: Zanurzenie tkanki w agarozie ułatwia obchodzenie się z nią podczas barwienia. Ostrożnie usuń agarozę w celu późniejszej infiltracji żywicy.
  4. Próbki należy przepłukać trzykrotnie, po 5 minut każda, w 0,1 M buforze kakodylowym, a następnie wybarwić roztworem żelazocyjanku OsO4/K przez 2 godziny w temperaturze 4 °C.
  5. Spłucz w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut i zaplamij TCH przez 30 minut w temperaturze 60 °C.
  6. Spłucz w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut i zaplamij 2% OsO4 (bez żelazocyjanku K) przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Spłucz ponownie w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut każdy.
  7. Plamić 1% octanem uranylu O/N w temperaturze 4 °C. Spłukać w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut każdy.
  8. Barwieć asparaginianem ołowiu przez 30 minut w temperaturze 60 °C. Spłukać w ultra czystej wodzie trzy razy po 5 minut.
  9. Odwodnić tkanki przez płukanie w roztworach o rosnącym stężeniu etanolu. Spłucz 2 razy po 5 minut 50%, 75%, 85%, 95% i absolutnym 100% etanolem. Na koniec spłucz sekcje tlenkiem propylenu dwa razy po 10 minut każda.

7. Infiltracja i zatapianie skrawków tkanek w żywicy

  1. Infiltruj bloki żywicą za pomocą dostępnego na rynku zestawu. Zanurz tkanki w żywicy za pomocą zestawu do zatapiania epon. Przygotuj mieszankę żywic składającą się z 48% żywicy epoksydowej, 20% ml DDSA, 30% ml NMA i 2% DMP30. Mieszaj mieszaninę żywicy energicznie przez 5 minut, a następnie umieść mieszaninę w próżni na 30 minut, aby pęcherzyki mogły wydostać się na powierzchnię.
  2. Wymieszaj żywicę z tlenkiem propylenu w stosunku 1:1 i energicznie wstrząśnij. Usuń ostatnie płukanie odwodnieniowe z tkanek i dodaj żywicę zmieszaną z tlenkiem propylenu. Umieścić fiolkę z próbkami w rotatorze O/N i pozostawić fiolkę bez nakrętki. Następnego dnia dodaj świeżo przygotowaną żywicę epon i mieszaj przez 90 minut w rotatorze.
  3. Osadź bloki w żywicy tak płasko, jak to możliwe, umieszczając je między szklanymi szkiełkami, które zostały utwardzone płynnym środkiem antyadhezyjnym, aby zapobiec ich sklejaniu się ze sobą15.
  4. Po płaskim osadzeniu bloków utwardzić je przez 48 godzin w temperaturze 60 °C.
  5. Rozsuń suwaki, aby zwolnić bloki.

8. Montaż i przycinanie bloku tkankowego do obrazowania

  1. W zakresie preparacyjnym dopasuj orientację bloków tkanek zanurzonych w żywicy do orientacji mikrofotografii konfokalnych, aby ułatwić identyfikację regionów zawierających interesujące komórki przed przycięciem bloku.
  2. Ręcznie przytnij blok osadzony w żywicy do powierzchni bloku ~500 x 500 μm.
  3. Zamontuj blok płasko na kołku zawierającym przewodzącą żywicę epoksydową i schnij przez 30 minut. Następnie położyć blok płasko na powierzchni i wysuszyć O/N w temperaturze 60 °C.
  4. Pokryj blok płynem ze srebra koloidalnego. Utrzymuj skrawki tkanki płasko, aby zapewnić cięcie bloku pod kątem prostym, aby ułatwić korelację seryjnych mikrofotografii blokowych i konfokalnych.

9. SBEM

  1. Zobrazuj blok za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w system SBEM (np. 3View).
  2. Ustaw początkowy przekrój grubości w krokach co ~2 μm i tnij, aż powierzchnia tkanki wyłoni się z bloku.
  3. Uzyskaj obraz surver całej powierzchni bloku.
  4. Korzystając z oprogramowania Fidżi, wykonaj pomiary zarówno seryjnych mikrofotografii blokowych, jak i konfokalnych, aby wygenerować wspólny mianownik i uwzględnić wypaczenie próbki podczas utrwalania i barwienia16.
  5. Zlokalizuj obszar zainteresowania na powierzchni bloku, mnożąc mianownik przez współrzędne na obrazach konfokalnych. Użyj również innych cech strukturalnych, takich jak położenie mikrokosmków, komórek kubkowych lub blaszki właściwej, jako odniesienia.
  6. Obraz obszaru zainteresowania przy napięciu 2,25 kV i długości fali 7 nm/piksel (lub powiększeniu 15 147x) w trybie wysokiej próżni. Przyrosty warstwy powinny być ustawione na 70 nm lub mniej.
  7. Zbieraj dane SBEM w surowym 16-bitowym formacie .dm3.

10. Optymalizacja obrazów SBEM pod kątem segmentacji powierzchni

  1. Konwertuj obrazy SBEM z surowego formatu .dm3 na 8-bitowy .tiff.
  2. Filtruj obrazy .tiff za pomocą filtra rozmycia 0,8 Gaussa na Fidżi.
  3. Zmniejsz zestaw danych do 25% oryginalnego rozmiaru i zapisz go jako stos .tiff, aby zminimalizować ilość pamięci RAM niezbędnej do obsługi zestawu.
  4. Wyrównaj stos obrazów SBEM za pomocą wtyczki Fiji "liniowe wyrównanie stosu z SIFT" w trybie tłumaczenia i przycięte za pomocą wtyczki "crop 3D". Uwaga: Kadrowanie pomaga jeszcze bardziej zmniejszyć ilość pamięci RAM niezbędnej do segmentacji i renderowania woluminów.

Renderowanie danych w 3D

11. Mikroskopia konfokalna

  1. Rekonstruuj stosy z za pomocą automatycznego trybu przewyższania narzędzia "powierzchnie". Rysunek 1D przedstawia rekonstrukcję każdego kanału przy użyciu opcji gładkiej, szczegółowości obszaru powierzchni na poziomie 0,126 μm i progowania jako intensywności bezwzględnej.

12. Szeregowy blok SEM

Uwaga: Ręczna segmentacja danych jest bardzo czasochłonną procedurą i w zależności od funkcji, które mają być renderowane, procedura może potrwać kilka tygodni. Segmentacja filmów i rysunków przedstawionych w Bohórquez et al. 2014 8 została wykonana ręcznie i zajęła około 500 godzin pracy. Zaleca się nadanie priorytetu podstawowym funkcjom wymagającym renderowania przed rozpoczęciem procesu segmentacji. Procedura jest następująca:

  1. Użyj narzędzia "powierzchnie" w trybie rysowania i opcji "kontur" w trybie rysowania 50 ms, aby ręcznie segmentować i objętościowo renderowaną komórkę zainteresowania.
  2. Kontury śledzenia są wykonywane na każdym wycinku komórki, aby zapewnić płynniejsze renderowanie, lub co 5 plasterków, aby zapewnić szybsze renderowanie.
  3. Eksportuj końcowe obrazy za pomocą narzędzia "migawka" w rozdzielczości 300 dpi lub większej.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj metoda została wykorzystana do zbadania ultrastruktury określonej komórki w warstwie nabłonka. Komórką będącą przedmiotem zainteresowania w tym przypadku jest nieuchwytna komórka enteroendokrynna. Ich identyfikacja in situ była możliwa dopiero w ciągu ostatnich kilku lat dzięki rozwojowi specyficznych dla komórek myszy reporterowych fluorescencyjnych. W 2011 roku opracowaliśmy mysz, u której promotor hormonu PYY napędza ekspresję białka zielonej fluorescencji17. W tej myszy PyyGFP komórki enteroendokrynne dystalnej części jelita cienkiego i okrężnicy są łatwo rozróżniane w świetle UV. Ten mysi model był podstawą do zidentyfikowania bloku tkanki zawierającego komórkę enteroendokrynną i przetworzenia go pod kątem SBEM. Metoda korelacji jest tutaj określana jako cocem3D i została zbudowana na wcześniej opublikowanych protokołach10,11.

Optymalizacja wymiarów bloku tkankowego jest kluczowa dla korelacji. We wstępnych eksperymentach ustalono, że w bloku tkankowym o długości 300 μm x grubości 50 μm liczba obrazów SBEM jest zredukowana do minimum, przy jednoczesnym pokryciu całego ciała komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Rysunek 1A przedstawia widok na rozwarstwienie za pomocą mikrotromu z wibrującymi ostrzami w celu uzyskania bloku tkanki o odpowiednich wymiarach. Uzyskuje się co najmniej 100 bloków przed ich posortowaniem, aby wybrać te z nienaruszonymi komórkami, które Cię interesują. Wybrane bloki są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej, a stosy obrazów z są optycznie rozmieszczone co 1 μm (ryc. 1B i C). Rysunek 1D przedstawia renderowany objętościowo widok komórki enteroendokrynnej w jelicie krętym myszy. Jego wydatny neuropod rozciąga się pod komórkami nabłonka na ~60 μm.

Interesująca komórka jest znajdowana poprzez skorelowanie konfokalnych stosów z obrazem SBEM całej powierzchni bloku. Przedstawiono tutaj przykład bloku z dystalnej części jelita grubego myszy PyyGFP. Po uzyskaniu konfokalnych stosów z (ryc. 2A), blok jest zatopiony w cienkiej warstwie niskotopliwej agarozy (ryc. 2B). Jest to konieczne do późniejszej manipulacji blokiem. Ważne jest, aby orientacja bloku była jak najbardziej płaska, aby dopasować warstwy optyczne do warstw SBEM. Na rysunku 2C pokazano reprezentatywny obraz całej powierzchni bloku tkankowego. Fragmenty tej liczby zostały wcześniej opublikowane w Bohorquez et al., 20148. Zostało to następnie skorelowane z obrazem konfokalnym, biorąc pod uwagę punkty orientacyjne i wymiary tkanek. Rysunek 2D przedstawia nakładkę obrazu konfokalnego i SBEM bloku, ujawniając dokładną lokalizację naszej interesującej nas komórki.

Po zidentyfikowaniu komórki, obrazowanie SBEM jest wykonywane w rozdzielczości wystarczająco wysokiej, aby zidentyfikować pęcherzyki wydzielnicze i inne organelle komórkowe. Prezentowany tutaj zestaw danych został zobrazowany z prędkością 7 nm na piksel, ponieważ obrazy bloku były wykonywane co 70 nm. Zestaw danych zawierał 643 obrazy, które obejmowały 45 μm głębokości tkanki. Kilka mikronów jest golonych podczas wstępnego obrazowania całej powierzchni bloku przy małym powiększeniu. Surowy zestaw danych SBEM został pozyskany w formacie .dm3 i przekształcony w .tiff w celu późniejszej obsługi. Stos SBEM został przycięty przy użyciu bloku "crop (3D)" wtyczki oprogramowania Fidżi, aby zawierał tylko obszar zainteresowania. Zmniejsza to ilość pamięci RAM potrzebnej do renderowania woluminów. Komórka została zidentyfikowana na podstawie jej położenia i pęcherzyków wydzielniczych, a następnie podzielona na segmenty za pomocą oprogramowania Imaris. Rysunek 3 zawiera renderowanie w 3D komórki enteroendokrynnej.

figure-results-1

Rysunek 1: Korelacyjne mikroskopie konfokalne. (A) Przebieg pracy polegający na wypreparowaniu fragmentu tkanki jelitowej na blok tkanki o grubości 300 x 50 μm. (B) Reprezentatywny blok tkanki o odpowiednich wymiarach. Zauważ, że blok tkankowy o tych wymiarach z jelita cienkiego myszy rozciąga się na około 3 kosmki lub, w przypadku okrężnicy, na około 8 krypt. (C) Biopsja w jelicie cienkim zawierająca komórkę będącą przedmiotem zainteresowania. (D) Konfokalny stos z renderowany w 3D przy użyciu oprogramowania Imaris pokazuje komórkę enteroendokrynną z wyraźnym neuropodem biegnącym pod nabłonkiem jelitowym. Niebieski = plama jądrowa DAPI. Słupki = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Seryjna skaningowa mikroskopia elektronowa typu block-face. (A) Obraz konfokalny wybranego bloku tkankowego z jelita grubego zawierającego interesujące nas komórki enteroendokrynne PyyGFP (zielony). (B) Po zobrazowaniu bloku za pomocą mikroskopii konfokalnej, jest on następnie umieszczany płasko w niskotopliwej agarozie za pomocą szklanych szkiełek. Osadzenie bloku tkankowego w agarozie ułatwia późniejszą manipulację, a wycięcie w lewym rogu pomaga zamontować blok w SBEM we właściwej orientacji. (C) Obraz SBEM czoła bloku. (D) Korelacja danych konfokalnych z SBEM w celu identyfikacji komórki będącej przedmiotem zainteresowania (biała strzałka). Obrazy w c i d tego rysunku są zmodyfikowane na podstawie Bohorquez et al., 20148. Niebieski = plama jądrowa DAPI. Słupki = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Renderowanie danych w 3D. (A) Renderowanie objętościowe komórek enteroendokrynnych za pomocą oprogramowania Imaris. Komórka zawiera neuropod wypełniony pęcherzykami wydzielniczymi. Pełny opis ultrastruktury komórki enteroendokrynnej można znaleźć w Bohórquez et al., 20148. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chemosensacja przewodu pokarmowego staje się nową, ekscytującą dziedziną badań biomedycznych. Wynika to w dużej mierze z odkrycia funkcjonalnych receptorów smaku w komórkach enteroendokrynnych18. Późniejsze badania wykazały, że komórki enteroendokrynne wyrażają specyficzne receptory dla składników odżywczych, w tym węglowodanów, lipidów i aminokwasów5,6,19,20. Czynnikiem katalitycznym dla tych odkryć było opracowanie myszy reporterowych, u których komórki enteroendokrynne są znakowane fluorescencyjnie20. Opracowaliśmy jedną z tych myszy, mysz PyyGFP, do badania komórek enteroendokrynnych dystalnego jelita cienkiego i okrężnicy17,21. Komórki te są interesujące, ponieważ wydzielają PYY i glukagonopodobny peptyd 1, z których oba są induktorami sytości22,23. W tamtym czasie brakowało kompletnego ultrastrukturalnego opisu tych komórek, który naszym zdaniem był niezbędny do zrozumienia ich mechanizmów sygnalizacyjnych.

W tym miejscu opisaliśmy wizualnie metodę łączenia mikroskopii konfokalnej z SBEM. Metoda określana jest jako Cocem3D, co pozwoliło nam udokumentować pełną ultrastrukturę komórek enteroendokrynnych. Donieśliśmy, że komórki te mają neuropod, który zawiera trzy czwarte wszystkich pęcherzyków wydzielniczych8. Wewnątrz neuropoda znajdują się neurofilamenty i podobnie jak aksony neuronów, neuropody są pielęgnowane przez jelitowe komórki glejowe8. Co ważniejsze, to właśnie te neuropody fizycznie łączą się z neuronami unerwiającymi jelito i okrężnicę9.

Jedną z mocnych stron cocem3D jest jego prostota. Zredukowanie próbki tkanki do bloku, który można zobrazować za pomocą konfokalnego i SBEM, ułatwia identyfikację określonej komórki w tkance. Pęcherzyki wydzielnicze i inne organelle można łatwo zidentyfikować w rozdzielczości 7 nm/piksel. Ponieważ skrawki w SBEM są odrzucane, dalsze przetwarzanie tkanek w celu identyfikacji określonych białek nie jest w tym momencie opcją. Jednak rozwój metod takich jak ATUM24, w których zachowane są skrawki z bloku tkankowego, prawdopodobnie umożliwi identyfikację określonych białek w komórce. Określenie specyficznej lokalizacji receptorów chemosensorycznych na komórkach enteroendokrynnych jest niezbędną informacją dla opracowania terapii lekowych w leczeniu otyłości, ponieważ komórki enteroendokrynne są interfejsem sensorycznym między pokarmem w jelitach a uczuciem sytości w mózgu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr Satish Medicetty jest pracownikiem i otrzymuje 100% wynagrodzenia od Renovo Neural Inc.; Nie zmienia to jednak przestrzegania przez autora zasad JoVE dotyczących udostępniania danych i materiałów. W przypadku pozostałych autorów nie zgłasza się konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasze szczere podziękowania kierujemy do następujących osób: Drs. Sam Johnson i Benjamin Carlson z Duke Light Microscopy Core Facility za pomoc w tworzeniu oprogramowania do wizualizacji danych, oraz Pani. Valerie Lapham i Dr. John M. Mackenzie, Jr. z Centrum Mikroskopii Elektronowej na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej za ich porady dotyczące mikroskopii elektronowej. Dziękujemy dr Elaine B. Bohórquez za pomoc redakcyjną. Autorzy przyczynili się do tego w następujący sposób: DVB, SM i RAL zaprojektowali eksperymenty i przeanalizowali dane. DVB przeprowadziło eksperymenty, a FH wykonało ręczne renderowanie danych. SM jest dyrektorem firmy Renovo Neural, w której pozyskano dane SBEM. DVB napisało manuskrypt, a wszyscy autorzy zrecenzowali i zredagowali ostateczną wersję rękopisu. Praca ta była wspierana przez granty NIH R01DK091946 i granty Veterans Affairs I01BX002230 dla RAL, a F32DK094704 dla DVB.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanamiTechnologie życia10010023
Sól sodowa heparynySigmaH4784
Paraformaldehyd Sigma1581274%, świeżo wyprodukowana w PBS, końcowe pH 7,4
Aldehyd glutarowySigmaG5882
Wosk dentystycznyMikroskopia elektronowa Nauki72660
Agaroza niskotopliwaTechnologie życia16520-1005%, świeżo wyprodukowane w PBS
Standard Tissue-Tek Mikroskopiaelektronowa62534-25
DAPI  plama jądrowa TechnologieżyciaD1306
Dodatnio naładowane szkiełka podstawowe i nakrywkowe
Pędzel artystyczny #1
Bufor kakodylanowyMikroskopia elektronowa Nauki11650
Kwas garbnikowyMikroskopia elektronowa Nauki21700
Zestaw EMbed 812 Mikroskopia elektronowa Sciences14120
Płynny środek antyadhezyjny Mikroskopia elektronowa Sciences70880
Ciekłe srebro koloidalne     Mikroskopia elektronowa Sciences12630
CircuitWorks przewodząca żywica epoksydowa   ITW ChemtronicsCW2400
Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływieVWR70730-064
VT1200S Mikrotom z wibracyjnymi ostrzamiLeica
Zeiss 780iCarl Zeiss 
Skaningowy mikroskop elektronowy Sigma VP Carl Zeiss 
System 3viewGatan
Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)http://www.renovoneural.comRenovo świadczy usługi 3D EM
Oprogramowanie FidżiOprogramowanie
Stacja komputerowa z 16 GB pamięci RAM lub więcej
Oprogramowanie do wizualizacji danych Imaris 7.5 Płaszczyzna bitowa
Cryomold Mikroskop konfokalny otwartego dostępu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).
  2. Smith, C. L., et al. Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens. Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).
  3. Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS biology. 2, e329(2004).
  4. Engelstoft, M. S., et al. Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells. Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).
  5. Chandra, R., et al. Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion. The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).
  6. Wang, Y., et al. Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).
  7. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).
  8. Bohórquez, D. V., et al. An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy. PloS one. 9, e89881(2014).
  9. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of clinical investigation. , (2015).
  10. Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis. Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).
  11. Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , University of California. San Diego San Diego, CA. (2010).
  12. Bohórquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).
  13. Nilsson, O., et al. Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon. Endocrinology. 129, 139-148 (1991).
  14. Mizuhira, V., Futaesaku, Y. New fixation method for biological membranes using tannic acids. Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).
  15. Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy. Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
  17. Bohórquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells. J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).
  18. Jang, H. J., et al. Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).
  19. Liou, A. P., et al. The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin. Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).
  20. Reimann, F., et al. Glucose sensing in L cells: a primary cell study. Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).
  21. Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets. Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).
  22. Batterham, R. L., et al. Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake. Nature. 418, 650-654 (2002).
  23. Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans. The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).
  24. Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Frontiers in neural circuits. 8, 68(2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalnaseryjne skanowanie powierzchni blok w w mikroskopii elektronowejkom rki enteroendokrynnemysz Peptide YY GFPzatapianie tkanekinfiltracja ywicrenderowanie ultrastruktury 3Didentyfikacja p cherzyk w wydzielniczychwizualizacja neuropod wkorelacyjna mikroskopia wietlna i elektronowa

Powiązane artykuły