Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

Podsumowanie

Wykazano wydajną, trzyetapową syntezę fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie RAFT, składającą się z przygotowania glikomonomeru, kopolimeryzacji i późniejszej modyfikacji. Protokół ten może być wykorzystany do przygotowania statystycznych glikopolimerów na bazie tratwy o pożądanych strukturach.

Streszczenie

Syntetyczne glikopolimery są instrumentalnymi i wszechstronnymi narzędziami używanymi w różnych dziedzinach badań biochemicznych i biomedycznych. Przedstawiono przykład łatwej i wydajnej syntezy dobrze kontrolowanych fluorescencyjnych statystycznych glikopolimerów przy użyciu odwracalnej polimeryzacji opartej na przenoszeniu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Syntezę rozpoczyna się od otrzymania glikomonomeru 2-laktobionamidoetylometakryloamidu zawierającego β-galaktozę, otrzymanego w reakcji laktobionolaktonu i N-(2-aminoetylo)metakryloamidu (AEMA). 2-glukonamidoetylometakryloamid (GAEMA) jest stosowany jako analog strukturalny pozbawiony końcowego β-galaktozydu. Poniższa reakcja kopolimeryzacji, w której pośredniczy RAFT, obejmuje trzy różne monomery: N-(2-hydroksyetylo)akryloamid jako przekładkę, AEMA jako cel do dalszego znakowania fluorescencyjnego oraz glikomonomery. Tolerancyjny na układy wodne, środkiem RAFT stosowanym w reakcji jest (kwas 4-cyjanopentanowy)-4-ditiobenzoesan. Wśród produktów zaobserwowano niskie dyspersje (≤1,32), przewidywalne składy kopolimerów oraz wysoką powtarzalność polimeryzacji. Polimery fluorescencyjne otrzymuje się przez modyfikację glikopolimerów estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny ukierunkowanym na pierwszorzędowe aminowe grupy funkcyjne na AEMA. Specyficzność wiązania lektyn otrzymanych glikopolimerów jest weryfikowana poprzez testowanie z odpowiednimi kulkami agarozowymi pokrytymi specyficznymi lektynami rozpoznającymi glikoepitopy. Ze względu na łatwość syntezy, ścisłą kontrolę składu produktu i dobrą powtarzalność reakcji, protokół ten można przełożyć na przygotowanie innych glikopolimerów na bazie RAFT o określonych strukturach i składach, zgodnie z potrzebami.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad, badania nad syntetycznymi glikopolimerami były powolne, ale ciągłe rozwijane, wykazując znaczny potencjał w badaniu mechanizmów zakaźnych, w tym badania koncentrujące się na procesach rozpoznawania lektyn^1-3. Ponieważ syntetyczne glikopolimery zawierające wielowartościowe ugrupowania cukrowe wykazują znacznie wyższą skuteczność wiązania lektyn w porównaniu z węglowodanami jednowartościowymi, są one bardzo poszukiwane w dziedzinie glikobiologii3. Szczególnie interesujące w badaniach klinicznych jest zastosowanie glikopolimerów fluorescencyjnych do scharakteryzowania wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny z węglowodanami dostępnymi na powierzchni ludzkich komórek oddechowych i glikoproteinami śluzówki. We wczesnych badaniach in vitro wykorzystano dostępne na rynku glikopolimery na bazie poliakrylamidu w testach wiązania bakteryjnego. Kilka z tych sond wykazało obiecujące wyniki, ale wzbudziło obawy dotyczące możliwości uzyskania i różnic między partiami zarówno w masie cząsteczkowej polimeru, jak i zawartości glikoepitopu. Opracowano ekonomiczny protokół laboratoryjny, który zapewniłby zadowalającą kontrolę struktury, wielkości i czystości syntetycznych glikopolimerów przeznaczonych do lektyn bakteryjnych.

W poszukiwaniu odpowiedniego podejścia do syntezy glikopolimerów, przetestowano stosunkowo nową technikę polimeryzacji przy użyciu typu kontrolowanej polimeryzacji rodnikowej, która wykorzystywała odwracalne środki do przenoszenia łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT)⁴. Takie odczynniki RAFT są ostatnio stosowane w kilku preparatach glikopolimerowych^5-7. W porównaniu z innymi protokołami przygotowania glikopolimerów, polimeryzacja za pośrednictwem raft wykazuje kilka zalet, w tym tolerancję na różne struktury monomerów i warunki reakcji, potencjalną kompatybilność z roztworami wodnymi oraz niską dyspersję pożądanych produktów polimerowych^8,9. Na uwagę zasługują protokoły otrzymywania trójskładnikowych glikopolimerów na bazie tratwy, pozwalające na kontrolę składu różnych monomerów, z których każdy może pełnić odrębne funkcje^10-13. Jednak większość wcześniejszych przedsięwzięć badawczych albo nie zawierała anomerycznych węglowodanów wiszących¹⁰, albo wykorzystywała polimeryzacje stopniowane, w wyniku których powstały kopolimery trójblokowe, które składają się z kowalencyjnie połączonych homopolimerów, które często służą innym celom niż polimery statystyczne, które są kopolimerami, w których sekwencja reszt monomerów jest zgodna z regułą statystyczną^9-13.

Niedawno, stosując tiokarbonylotiotio-raft (kwas 4-cyjanopentanowy)-4-ditiobenzoesan w środowisku wodnym, zgłoszono przygotowanie grupy liniowych trójskładnikowych statystycznych glikopolimerów na bazie RAFT zawierających określone cukry wiszące i ich zastosowanie w testach wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny¹⁴. Ogólnym celem tej metody, przedstawionym w sposób wizualny, jest otrzymanie trójskładnikowych statystycznych glikopolimerów fluorescencyjnych poprzez kopolimeryzację sterowaną RAFT. Ze względu na łatwość jednoetapowego protokołu polimeryzacji, precyzyjną kontrolę nad długością i składem polimeru oraz wysoką odtwarzalność reakcji, protokół ten można łatwo zastosować do innych syntez glikopolimerów opartych na tratwie o pożądanych strukturach.

Protokół

1. Synteza 2-laktobionamidoetylometakryloamidu glikomonomeru

1. Rozpuścić 2 g kwasu laktobionowego w 3,0 ml bezwodnego metanolu i powoli dodawać absolutny etanol w kroplach, aż roztwór stanie się mętny, a następnie usunąć rozpuszczalniki przez odparowanie rotacyjne.
2. Rozpuścić pozostałość z kroku 1.1 w 3,0 ml bezwodnego metanolu i ponownie powoli dodawać absolutny etanol aż do zmętnienia, a następnie odparować rozpuszczalniki przez odparowanie rotacyjne. Powtórz ten krok 3 razy, aby uzyskać laktobiono-1,5-lakton (1,94 g, 98% wydajności). Produkt ten ma wystarczającą czystość, aby można go było stosować w następujących reakcjach.
3. Dodać 1,0 g laktobionolaktonu w 3,0 ml metanolu do N-(2-aminoetylo)metakryloamidu (AEMA, 0,58 g) i hydrochinonu eteru monometylowego (MEHQ, 1,0 mg), inhibitora samopolimeryzacji, w 2,0 ml metanolu, a następnie 1,0 ml trietyloaminy. Mieszaj w RT przez 48 godzin.
4. Dodać 20 ml dejonizowanego_H2O(_dH2O) do kolby reakcyjnej, następnie usunąć metanol i wolną trietyloaminę przez odparowanie do sucha przez odparowanie rotacyjne.
5. W celu usunięcia pozostałości kwasu laktobionowego dodać 20 ml _dH2O, a następnie przepuścić roztwór wodny przez kolumnę anionowymienną (forma OH, 10 mm x 20 mm) do zlewki odbiorczej zawierającej 1,0 mg MEHQ.
6. Usunąć trietyloaminę, wytworzoną w kroku 1.5, poprzez odparowanie do sucha w procesie odparowania rotacyjnego.
7. Dodać 20 ml_dH2O i usunąć nieprzereagowaną AEMA, powoli dodając 1 mg porcji żywicy kationowymiennej (forma H⁺), aż do momentu, gdy nie będą wykrywalne żadne materiały reagujące z ninhydryną. Monitorować usuwanie, pobierając 1 μl podwielokrotności roztworu po dodaniu każdej żywicy, nakładając go na cienkowarstwową płytkę chromatograficzną, a następnie spryskując płytkę 2% ninhydryną w roztworze etanolu. Jeżeli nie zaobserwuje się rozwoju ciemnoniebieskiego koloru po podgrzaniu płytki do 90 °C przez 1 minutę, oznacza to, że osiągnięto punkt końcowy.
8. Przefiltrować roztwór przez lejek ze spiekanego szkła, przenieść filtrat do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać liofilizowaniu.
9. Usunąć MEHQ z próbki, rozpuszczając liofilizowany materiał w minimalnej ilości metanolu (~0,5 ml), a następnie dodać zimny bezwodny aceton (-20 °C, 15 ml) w celu wytrącenia produktu. Zebrać osad przez filtrację za pomocą lejka ze spiekanego szkła, a następnie wysuszyć osad w eksykatorze pod próżnią, aby otrzymać 2-laktobionamidoetylometakryloamid (LAEMA) w postaci białawego proszku (0,94 g, wydajność 68%). Produkt ten ma wystarczającą czystość, aby można go było stosować w następujących reakcjach.

2. Synteza monomeru 2-glukonamidoetylometakryloamidu

Uwaga: Przygotowanie 2-glukonamidoetylometakryloamidu (GAEMA), który nie posiada cukru wiszącego, zostało zaadaptowane z opublikowanej metody¹⁵.

1. Dodać 2,0 g AEMA rozpuszczonego w 10 ml metanolu do roztworu D-glukonolaktonu (1,6 g) w 30 ml metanolu i mieszając, powoli dodawać 1,6 ml trietyloaminy.
2. Mieszać reakcję w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
3. Przefiltrować wytrącony produkt za pomocą lejka ze spiekanego szkła i przepłukać osad trzykrotnie po 10 ml izopropanolu, a następnie przemyć 10 ml suchego acetonu. Wysuszyć wytrącony produkt w eksykatorze w próżni.

3. Synteza glikopolimeru RAFT

1. Aby usunąć inhibitor MEHQ obecny w dostępnym na rynku N-(2-hydroksyetylo)akrylamidzie (HEAA), należy dodać 1 ml HEAA do probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml, a następnie dodać 0,5 g nanocząstek tlenku glinu. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 30 sekund i użyć górnej warstwy HEAA w następnej reakcji.
2. Ostrożnie dodać 32,8 mg LAEMA (70,0 μmol), 1,7 mg AEMA (10,5 μmol) i 27,5 μl HEAA (270 μmol), wszystkie rozpuszczone w 0,4 ml_dH2O, do dobrze oczyszczonej probówki Schlenka o pojemności 1 ml, o stosunku molowym monomeru 20:3:77.
3. W reakcji równoległej, w celu wytworzenia polimerów kontrolnych, które nie zawierają cukru wiszącego, zamiast stosować LAEMA w kroku 3.2, należy zastąpić 21,4 mg GAEMA (70,0 μmol) w reakcji.
4. Do odpowiedniej probówki Schlenka (tj. 3.2 lub 3.3) dodać kolejno 50 μl DMF zawierającego 0,53 mg (kwasu 4-cyjanopentanowego)-4-ditiobenzoesanu (1,9 μmol, czynnik RAFT) i 50 μl DMF zawierającego 250 μg 4,4′-azobis-(kwasu 4-cyjanowalerynowego) (0,9 μmol, inicjator). Delikatnie wymieszaj, stukając palcem.
5. Zamrozić zawartość zawartą w probówce Schlenka za pomocą kąpieli suchy lód-etanol (75 g suchego lodu w 100 ml etanolu), zastosować podciśnienie z dokładnością do 10-50 mTorr, następnie zamknąć zawór Schlenka i pozwolić, aby roztwór powoli rozmroził się do RT. Powtórz ten cykl zamrażania-ewakuacji-rozmrażania jeszcze dwa razy. Upewnij się, że wszystkie odczynniki zostały rozpuszczone po ostatnim rozmrożeniu.
6. Umieść rurkę Schlenk w zamykanej plastikowej torbie, spuść powietrze z worka, a następnie zamknij ją. Przenieść worek zawierający probówkę Schlenka do łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 70 °C i inkubować przez 24 godziny.
7. Ostrożnie przenieść roztwór z probówki Schlenka do przygotowanego worka do dializy (MWCO = 3 500) i dializować w stosunku do_{dH 2}O (10 x 2 L) przez 24 godziny, zmieniając_dH2O co godzinę przez pierwsze 8 godzin. Po dializie przenieść próbkę z rurki dializacyjnej do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać ją liofilizacji.

Uwaga: Otrzymano wynikowe statystyczne kopolimery polimetakrylamidu/akrylamidu (PMA) zawierające wisiorek 4-O-β-D-galaktopiranozylo-D-glukonamid (laktobionamid) (z Kroku 3.2) lub D-glukonamid (z Kroku 3.3). Dla wygody dyskusji, te dwa glikopolimery są skracane odpowiednio jako PMA-LAEMA i PMA-GAEMA.

4. Modyfikacja glikopolimerów za pomocą fluoroforów

1. Rozpuścić 5,0 mg glikopolimeru PMA-LAEMA lub PMA-GAEMA zawierającego ~0,9 μmola pierwszorzędowych aminowych grup funkcyjnych w 0,9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 0,1 M fosforan sodu, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
2. Powoli dodawać 0,6 mg estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny w 100 μl DMF do roztworów, szybko mieszając. Delikatnie mieszaj reakcje przez 16 godzin w ciemności w temperaturze pokojowej.
3. Chroniąc ją przed światłem, załadować próbkę do przygotowanego rurki do dializy (MWCO = 3 500) i dializować w stosunku do_{dH 2}O (2 L) przez 16 godzin, zmieniając roztwór dializacyjny co godzinę przez pierwsze 8 godzin. Po dializie przenieść próbkę z rurki dializacyjnej do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać ją liofilizacji.

Uwaga: Po liofilizacji otrzymuje się fluorescencyjne glikopolimery PMA-LAEMA-Fluoresceina i PMA-GAEMA-Fluoresceina, odpowiednio.

5. Charakterystyka glikopolimerów

1. Oznaczyć średnią liczbową masę cząsteczkową (Mn), średnią wagowo masę cząsteczkową (Mw) i dyspersję (Mw/Mn) glikopolimerów w komercyjnym systemie HPLC wyposażonym w oprogramowanie do chromatografii żelowej (GPC), kolumnę GPC odpowiednią do masy cząsteczkowej będącej przedmiotem zainteresowania oraz detektor indeksu refrakcji, używając 0,1 M Tris/0,1 M buforu chlorku sodu (pH 7) jako eluentu o natężeniu przepływu 0,6 ml/min¹⁴. Jako wzorce masy cząsteczkowej należy stosować wzorce glikolu polietylenowego (MW: 200-1 200 000 g/mol).
2. Określić ilościowo rzeczywiste stężenia pierwszorzędowych aminowych grup funkcyjnych w glikopolimerach¹⁶. Przeanalizować całkowitą zawartość węglowodanów w zsyntetyzowanych glikopolimerach zgodnie z opublikowaną metodą¹⁷.
3. Wykonać badania składu strukturalnego i czystości glikomonomerów LAEMA, GAEMA i glikopolimerów PMA-LAEMA, PMA-GAEMA w_D2Ometodą spektroskopii NMR¹⁴.

6. Testy wiązania syntetycznych glikopolimerów z kulkami agarozowymi pokrytymi lektyną

1. Dodać 1,5 ml PBS do 50 μl zawiesiny kulek agarozowych pokrytych lektyną Erythrina crista-galli (ECL), odwirować przy 300 x g przez 1 minutę, a następnie ostrożnie usunąć i usunąć sklarowany osad. Powtórz ten krok dwukrotnie, a następnie ponownie zawieś kulki w 0,5 ml PBS.
2. Dodać 3 μg PMA-LAEMA-Fluoresceiny lub PMA-GAEMA-Fluoresceiny (kontrola ujemna) w 6 μl PBS do zawiesiny kulek i inkubować mieszaniny, w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
3. Umyj mieszaniny trzykrotnie 1,5 ml PBS i ponownie zawieś kulki w 0,2 ml PBS. Załadować podwielokrotność (4 μl) do studzienki na szkiełku mikroskopu immunofluorescencyjnego (pokrytym teflonem), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu filtra FITC (długość fali wzbudzenia: 467-498 nm, długość fali emisji: 513-566 nm) i obiektywu 10X, aby zbadać wiązanie fluorescencyjnych glikopolimerów z kulkami¹⁴.

Wyniki

Synteza glikomonomeru

Kwas laktobionowy został użyty tutaj jako przykład do przygotowania glikomonomerów. Stosując metody zawarte we wstępnym raporcie z syntezy LAEMA¹¹, zaobserwowano zróżnicowane plony preparatu o niezadowalającej czystości. Zmodyfikowana metoda oczyszczania z wykorzystaniem żywic kationowymiennych i anionitowych w celu usunięcia nieprzereagowanego materiału wyjściowego zapewniła stabilną wydajność produktu i wysoką czystość, co potwierdza spektroskopia ¹H i ¹³C NMR (rysunek 1).

Synteza glikopolimerów RAFT i post-modyfikacja glikopolimerów za pomocą fluoroforów

W przeciwieństwie do blokowych glikopolimerów przygotowanych za pomocą stopniowej polimeryzacji RAFT, ten jednoetapowy protokół kopolimeryzacji zapewnia równomierny rozkład glikomonomeru w całym szkielecie polimeru. Przedstawione tutaj glikopolimery zawierają 20 mol% glikomonomeru, 77 mol% HEAA jako przekładkę i 3 mol% AEMA jako cel do modyfikacji końcowych (patrz rysunek 2). ¹Spektroskopia H- i ¹³C-NMR potwierdziła struktury PMA-LAEMA i PMA-GAEMA (ryc. 3 i 4). Jak pokazano na rysunku 5, po wykreśleniu względem profili elucji GPC glikopolimeru zsyntetyzowanego bez RAFT, zarówno PMA-LAEMA, jak i PMA-GAEMA mają niskie dyspersje, co dowodzi skuteczności podejścia RAFT. Zgodnie z oczekiwaniami, PMA-GAEMA ma Mn mniejszy niż PMA-LAEMA ze względu na brak cukru wiszącego w PMA-GAEMA. Analiza zawartości węglowodanów i pierwszorzędowych aminowych grup funkcyjnych w glikopolimerach RAFT wykazała, że stosunek monomerów w glikopolimerach produktu jest zgodny ze stosunkiem stechiometrycznym monomerów wyjściowych zastosowanych w reakcji polimeryzacji za pośrednictwem RAFT (tab. 1). Oznacza to ścisłą kontrolę składu monomerów w zsyntetyzowanych glikopolimerach, zgodnie z projektem.

Reakcja pierwszorzędowych grup funkcyjnych aminy z aktywowanymi fluoroforami jest powszechnie stosowaną techniką znakowania białek. Technika ta została tutaj zastosowana do znakowania oczyszczonych glikopolimerów karboksyfluoresceiną. Po modyfikacji otrzymano polimery fluorescencyjne (ryc. 6). W analizie GPC nie wykryto degradacji polimerów znakowanych fluoresceiną w reakcji (dane nie pokazane).

Testy wiązania syntetycznych glikopolimerów z kulkami agarozowymi pokrytymi lektyną

Aby ocenić specyficzność wiążących lektyny zsyntetyzowanych glikopolimerów, użyto pokrytych lektyną kulek agarozowych o znanej specyficzności wiązania węglowodanów. Lektyna Erythrina crista-galli (ECL), zastosowana w eksperymentach, ma swoistość wiążącą w stosunku do β-D-galaktozydu. Rycina 7A wyraźnie pokazuje, że PMA-LAEMA-fluoresceina, która zawiera β-D-galaktozyd jako węglowodan wiszący, wykazywała silne wiązanie z lektyną ECL. Natomiast ujemne wiązanie glikopolimeru PMA-GAEMA-Fluoresceiny z ECL pokazano na rysunku 7B. Wynik ten stanowi przykład skuteczności wiązania i powinowactwa zsyntetyzowanego glikopolimeru fluorescencyjnego.

Rysunek 1. Przypisano ¹ widma H- (a) i ¹³C-NMR (b) (_D2O) dla LAEMA. (Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Wang et al.¹⁴) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schematyczna ilustracja syntezy fluorescencyjnego glikopolimeru PMA-LAEMA zawierającego β-galaktozyd jako cukier wiszący. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Przypisano ¹ widma H- (A) i ¹³C-NMR(B) (_D2O) dla glikopolimeru PMA-LAEMA. (Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Wang et al.¹⁴) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Przypisano ¹ widma H- (A) i ¹³C-NMR(B) (_D2O) dla PMA-GAEMA. (Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Wang et al.¹⁴) Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Ślady chromatografii żelowej PMA-GAEMA i PMA-LAEMA na bazie RAFT, przygotowane z użyciem środka RAFT i bez niego. W przeciwieństwie do PMA-LAEMA przygotowanego bez środka RAFT (kolor niebieski), PMA-LAEMA na bazie RAFT-LAEMA (kolor zielony) charakteryzuje się znacznie niższą dyspersją (Mw/Mn). PMA-GAEMA (czerwony) i PMA-LAEMA na bazie tratwy mają podobne profile GPC, ale ten pierwszy ma mniejszy Mn ze względu na brak jakichkolwiek cukrów wiszących. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. PMA-LAEMA przed i po modyfikacji fluoroforem. (A) W porównaniu z białym, nieznakowanym glikopolimerem (lewa probówka), PMA-LAEMA znakowany fluoresceiną wykazuje silny żółty kolor (prawa probówka). (B) W promieniowaniu UV nieznakowany PMA-LAEMA (lewa probówka, 1 mg/ml w PBS) jest ciemny i nie wykazuje fluorescencji, podczas gdy PMA-LAEMA znakowany fluoresceiną (prawa probówka, 1 mg/ml w PBS) wykazuje silną zieloną fluorescencję. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7. Kulki agarozy powlekane lektyną Erythrina crista-galli (ECL) wiążą β-D-galaktozyd zawierający glikopolimery, a nie te, które nie zawierają cukru wiszącego. (A) PMA-LAEMA-Fluoresceina (3 μg) wykazywała silne wiązanie z ECL, podczas gdy w (B) PMA-GAEMA-Fluoresceina, która nie posiada reszty β-D-galaktozydu, nie wykazywała wiązania z kulkami pokrytymi lektyną. Podziałka = 100 μm.

Tabela 1. Docelowe wartości^a parametrów syntetycznych i rzeczywistego składu glikopolimerów. a) Wartości docelowe, wartości, które są pożądane od produktów; b) DP, stopień polimeryzacji; c) NA, niedostępne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. Rozdział

	DPb	Dyspersja	Rzeczywista zawartość glikomonomerów mol %	Rzeczywista zawartość pierwszorzędowej aminy mol %
Wartości kierowania	100	< 1,3	20	3
PMA-LAEMA	99	Pytanie 1,26	Rozdział 19	3.2
PMA-GAEMA (PMA-GAEMA)	Rozdział 89	1,32	NAc	2.7

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiono łatwy i skuteczny protokół dla trójskładnikowych fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie tratwy, z węglowodanami w wisiorku i bez niego, oraz ich zastosowanie w teście wiązania lektyny. Protokół rozpoczyna się od przygotowania glikomonomerów LAEMA i GAEMA. Poprzez jednoetapową kopolimeryzację sterowaną tratwą uzyskuje się glikopolimery o powtarzalnej wydajności, przewidywalnym składzie monomerów i niskiej dyspersji. Po późniejszej modyfikacji glikopolimerów estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny, wiązanie otrzymanego odpowiedniego glikopolimeru znakowanego fluorescencyjnie można łatwo przetestować pod kątem jego specyficzności wiązania lektyny.

W początkowych etapach preparatywnych glikomonomerów, które mają być wykorzystane w kolejnych syntezach glikopolimerów, wykorzystano łatwo dostępny kwas laktobionowy i glukonolakton. Teoretycznie wszelkie interesujące nas węglowodany, od cukrów prostych po złożone oligosacharydy, mogą zostać przekształcone w glikomonomery poprzez sprzężenie docelowego cukru z pierwszorzędową grupą hydroksylową na C6 glukozy. Po utlenieniu reszty glukozy redukującej, a następnie jej odwodnieniu do laktonu, produkt może być następnie łatwo poddany reakcji z aminą pierwszorzędową na AEMA, tworząc odpowiedni glikomonomer. Dalsze przykłady tej trasy można znaleźć w niedawnym raporcie¹⁴. Należy zauważyć, że przed rozpoczęciem jakiegokolwiek etapu polimeryzacji, MEHQ, silny inhibitor polimeryzacji, musi zostać usunięty ze wszystkich preparatów monomerów i glikomonomerów tuż przed użyciem. Można to łatwo osiągnąć poprzez użycie minimalnej ilości metanolu do rozpuszczenia glikomonomeru, który posiada MEHQ, a następnie natychmiastowe potraktowanie go acetonem w temperaturze -20 °C w celu wytrącenia produktu wolnego od inhibitorów z wysoką wydajnością.

Niezbędne w każdym schemacie polimeryzacji rodnikowej jest podkreślenie dbałości o szczegóły i czystość monomerów. Jak to jest typowe dla systemu polimeryzacji RAFT, składa się on ze źródła rodnika, odczynnika RAFT, monomeru i rozpuszczalnika. W tej wizualizacji opisano jednoetapowy system polimeryzacji RAFT, który koncentruje się na wytwarzaniu statystycznych kopolimerów generowanych z mieszaniny reakcyjnej zawierającej trzy różne monomery w roztworze wodnym. Przedstawiono dwie oddzielne reakcje, w których pośredniczy RAFT, w jednej wykorzystuje się glikomonomer, który posiada wiszący, nieredukujący koniec węglowodanowy (tj. β-D-galaktozę), a drugi zawiera poliol bez związanej reszty węglowodanowej. Wspólne dla obu reakcji za pośrednictwem RAFT były monomery posiadające pojedynczą grupę hydroksylową, która służy jako cząsteczka dystansowa, oraz inne posiadające wolną aminę do późniejszej modyfikacji za pomocą amino-reaktywnego fluoroforu.

Ponieważ obecność tlenu w mieszaninie reakcyjnej i środowisku jest szkodliwa dla polimeryzacji za pośrednictwem RAFT, jego usunięcie do śladowych ilości można łatwo osiągnąć poprzez kilka cykli zamrażania-ewakuacji-rozmrażania, utrzymując naczynie reakcyjne rurki Schlenka w wysokiej próżni.

Należy zauważyć, że stosunek molowy różnych monomerów w reakcji można dostosować w razie potrzeby. Ponadto, zmieniając ilość użytego środka RAFT, można kontrolować długość powstałych polimerów¹⁸. Jednak stosunek molowy środka RAFT do inicjatora powinien być zawsze większy niż dwa, aby zapewnić niską dyspersję produktu. W tych warunkach ewolucja kopolimeryzacji jest stabilna, a powtarzalność reakcji jest bardzo wysoka. Biorąc to pod uwagę, jest mało prawdopodobne, aby uzyskać całkowicie równomierny rozkład wszystkich uczestniczących monomerów w statystycznym kopolimerze, ze względu na ich różne prędkości polimeryzacji. Scharakteryzowanie rozkładu różnych monomerów w polimerze jest nadal bardzo trudne.

Przedstawiona tutaj metoda po modyfikacji jest zarówno prostsza, jak i bardziej podatna na zastosowanie szerszego wyboru znaczników fluorescencyjnych w porównaniu z innymi protokołami stosowanymi do znakowania glikopolimerów^2,11. Obejmuje to wiele rozpuszczalnych w wodzie fluoroforów reagujących z aminami, kropek kwantowych, biotyn i innych. Specyfika wiązania zsyntetyzowanych, znakowanych glikopolimerów jest łatwa do zweryfikowania przy użyciu lektyn o znanym powinowactwie wiązania. PMA-GAEMA nie zawierający cukru w układzie macierzystym stanowi odpowiednią kontrolę negatywną. Glikopolimery o różnych znacznikach fluorescencyjnych otrzymane tą drogą zostały z powodzeniem wykorzystane w badaniach wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny¹⁴. Jak pokazano, to łatwe i wydajne przygotowanie statystycznych glikopolimerów fluorescencyjnych powinno zapewnić ogromny potencjał dla szerokiej gamy badań glikobiologicznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynnik
Kwas laktobionowy	Sigma-Aldrich	153516
D-Glukonolakton	Sigma-Aldrich	G2164
N-(2-hydroksyetylo)akryloamid (HEAA)Sól	Sigma-Aldrich	697931
Orange II Eter monometylowy	hydrochinonu Sigma-Aldrich	O8126
MEHQ)	Inhibitor polimeryzacji	Sigma-Aldrich	54050
N-(2-aminoetylo)metakryloamidu chlorowodorek (AEMA)	Polysciences, Inc	24833-5
Triethylamine	Fisher Scientific	BP-616
Żywica anionowymienna IRN-78 w postaci wodorotlenku, 80 mesh	Sigma-Aldrich	10343-U
Żywica kationowymienna 50Wx8, 200 mesh	Sigma-Aldrich	217514
Tlenek glinu, ~150 oczek	Sigma-Aldrich	A1522	Typ WN-6, Neutralny, Klasa aktywności Super I
Ninhydrin	Sigma-Aldrich	N4876	W teście użyto roztworu etanolu 0,2% ninhydryny Kwas
4-cyjano-4-(fenylokarbomatioltio)pentanowy	Sigma-Aldrich	722995	Środek RAFT
4,4′-Azobis(kwas 4-cyjanolerynowy)	Sigma-Aldrich	11588	Inicjator polimeryzacji
Ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny	Life Technologies	C1157
Koralik agarozowy pokryty lektyną Erythrina Cristagalli	Vector Laboratories	AL-1143
Solvent
dH2O			Produkowane przez system oczyszczania wody Barnstead, 18 megOhm-cm
Izopropanol	Fisher Scientific	A461-4	klasa ACS lub lepsza
Metanol	Fisher Scientific	A454-4	ACS lub lepszy
etanol	Fisher Scientific	BP2818-100	ACS klasa lub lepsza
Dimetyloformamid	Sigma-Aldrich	22705	Klasa ACS lub lepsza
Aceton	Fisher Scientific	A929-4	ACS klasa lub lepsza
Equipment
membrana do dializy (MWCO: 3,500)	Spectrum Labs	132720
Standardowy standard analityczny glikolu polietylenowego	Sigma-Aldrich	Ø2393
Probówka Schlenka, 1 ml			twarogowe
Dostosowane TSK-GEL G4000 PWxl	Tosoh Bioscience	8022	Używany do analizy GPC glikopolimerów
Empower 3 z pakietem GPC/SEC	Waters Corporation
Waters Alliance	Waters Corporation		Wyposażony w detektor indeksu refrakcji (Waters 2414) i detektor fluorescencji (Waters 2475)
Spektrometr NMR Avance III 800 MHz	Bruker Corporation
BX43	Olympus Corporation		Używany z filtrem FITC w teście wiązania glikopolimeru
Rotavap / Parownik Rotoevapor	Heidolph
Fritted lejek dyskowy	Fisher Scientific	10-310-109
Liofilizator	Labconco
Szkiełko mikroskopu immunofluorescencyjnego	Polysciences	18357-1
Revco Ultima Plus -80  ° C Zamrażarka	Thermo Scientific
Plastikowy worek próżniowy i pompka ręczna	Pompa próżniowa Ziploc
, napęd bezpośredni, wakuometr Maxima C Plus	Fisher Scientific
	Sargent-Welch