Artykuł metodologiczny

Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT

13.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52922

⸱

19 czerwca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Missouri, 2Department of Biological Sciences, University of Missouri, 3Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri, 4Department of Child Health, University of Missouri

W tym artykule

Podsumowanie

Wykazano wydajną, trzyetapową syntezę fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie RAFT, składającą się z przygotowania glikomonomeru, kopolimeryzacji i późniejszej modyfikacji. Protokół ten może być wykorzystany do przygotowania statystycznych glikopolimerów na bazie tratwy o pożądanych strukturach.

Streszczenie

Syntetyczne glikopolimery są instrumentalnymi i wszechstronnymi narzędziami używanymi w różnych dziedzinach badań biochemicznych i biomedycznych. Przedstawiono przykład łatwej i wydajnej syntezy dobrze kontrolowanych fluorescencyjnych statystycznych glikopolimerów przy użyciu odwracalnej polimeryzacji opartej na przenoszeniu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Syntezę rozpoczyna się od otrzymania glikomonomeru 2-laktobionamidoetylometakryloamidu zawierającego β-galaktozę, otrzymanego w reakcji laktobionolaktonu i N-(2-aminoetylo)metakryloamidu (AEMA). 2-glukonamidoetylometakryloamid (GAEMA) jest stosowany jako analog strukturalny pozbawiony końcowego β-galaktozydu. Poniższa reakcja kopolimeryzacji, w której pośredniczy RAFT, obejmuje trzy różne monomery: N-(2-hydroksyetylo)akryloamid jako przekładkę, AEMA jako cel do dalszego znakowania fluorescencyjnego oraz glikomonomery. Tolerancyjny na układy wodne, środkiem RAFT stosowanym w reakcji jest (kwas 4-cyjanopentanowy)-4-ditiobenzoesan. Wśród produktów zaobserwowano niskie dyspersje (≤1,32), przewidywalne składy kopolimerów oraz wysoką powtarzalność polimeryzacji. Polimery fluorescencyjne otrzymuje się przez modyfikację glikopolimerów estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny ukierunkowanym na pierwszorzędowe aminowe grupy funkcyjne na AEMA. Specyficzność wiązania lektyn otrzymanych glikopolimerów jest weryfikowana poprzez testowanie z odpowiednimi kulkami agarozowymi pokrytymi specyficznymi lektynami rozpoznającymi glikoepitopy. Ze względu na łatwość syntezy, ścisłą kontrolę składu produktu i dobrą powtarzalność reakcji, protokół ten można przełożyć na przygotowanie innych glikopolimerów na bazie RAFT o określonych strukturach i składach, zgodnie z potrzebami.

Wprowadzenie

W ciągu ostatnich dwóch dekad, badania nad syntetycznymi glikopolimerami były powolne, ale ciągłe rozwijane, wykazując znaczny potencjał w badaniu mechanizmów zakaźnych, w tym badania koncentrujące się na procesach rozpoznawania lektyn1-3. Ponieważ syntetyczne glikopolimery zawierające wielowartościowe ugrupowania cukrowe wykazują znacznie wyższą skuteczność wiązania lektyn w porównaniu z węglowodanami jednowartościowymi, są one bardzo poszukiwane w dziedzinie glikobiologii3. Szczególnie interesujące w badaniach klinicznych jest zastosowanie glikopolimerów fluorescencyjnych do scharakteryzowania wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny z węglowodanami dostępnymi na powierzchni ludzkich komórek oddechowych i glikoproteinami śluzówki. We wczesnych badaniach in vitro wykorzystano dostępne na rynku glikopolimery na bazie poliakrylamidu w testach wiązania bakteryjnego. Kilka z tych sond wykazało obiecujące wyniki, ale wzbudziło obawy dotyczące możliwości uzyskania i różnic między partiami zarówno w masie cząsteczkowej polimeru, jak i zawartości glikoepitopu. Opracowano ekonomiczny protokół laboratoryjny, który zapewniłby zadowalającą kontrolę struktury, wielkości i czystości syntetycznych glikopolimerów przeznaczonych do lektyn bakteryjnych.

W poszukiwaniu odpowiedniego podejścia do syntezy glikopolimerów, przetestowano stosunkowo nową technikę polimeryzacji przy użyciu typu kontrolowanej polimeryzacji rodnikowej, która wykorzystywała odwracalne środki do przenoszenia łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT)4. Takie odczynniki RAFT są ostatnio stosowane w kilku preparatach glikopolimerowych5-7. W porównaniu z innymi protokołami przygotowania glikopolimerów, polimeryzacja za pośrednictwem raft wykazuje kilka zalet, w tym tolerancję na różne struktury monomerów i warunki reakcji, potencjalną kompatybilność z roztworami wodnymi oraz niską dyspersję pożądanych produktów polimerowych8,9. Na uwagę zasługują protokoły otrzymywania trójskładnikowych glikopolimerów na bazie tratwy, pozwalające na kontrolę składu różnych monomerów, z których każdy może pełnić odrębne funkcje10-13. Jednak większość wcześniejszych przedsięwzięć badawczych albo nie zawierała anomerycznych węglowodanów wiszących10, albo wykorzystywała polimeryzacje stopniowane, w wyniku których powstały kopolimery trójblokowe, które składają się z kowalencyjnie połączonych homopolimerów, które często służą innym celom niż polimery statystyczne, które są kopolimerami, w których sekwencja reszt monomerów jest zgodna z regułą statystyczną9-13.

Niedawno, stosując tiokarbonylotiotio-raft (kwas 4-cyjanopentanowy)-4-ditiobenzoesan w środowisku wodnym, zgłoszono przygotowanie grupy liniowych trójskładnikowych statystycznych glikopolimerów na bazie RAFT zawierających określone cukry wiszące i ich zastosowanie w testach wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny14. Ogólnym celem tej metody, przedstawionym w sposób wizualny, jest otrzymanie trójskładnikowych statystycznych glikopolimerów fluorescencyjnych poprzez kopolimeryzację sterowaną RAFT. Ze względu na łatwość jednoetapowego protokołu polimeryzacji, precyzyjną kontrolę nad długością i składem polimeru oraz wysoką odtwarzalność reakcji, protokół ten można łatwo zastosować do innych syntez glikopolimerów opartych na tratwie o pożądanych strukturach.

Protokół

1. Synteza 2-laktobionamidoetylometakryloamidu glikomonomeru

  1. Rozpuścić 2 g kwasu laktobionowego w 3,0 ml bezwodnego metanolu i powoli dodawać absolutny etanol w kroplach, aż roztwór stanie się mętny, a następnie usunąć rozpuszczalniki przez odparowanie rotacyjne.
  2. Rozpuścić pozostałość z kroku 1.1 w 3,0 ml bezwodnego metanolu i ponownie powoli dodawać absolutny etanol aż do zmętnienia, a następnie odparować rozpuszczalniki przez odparowanie rotacyjne. Powtórz ten krok 3 razy, aby uzyskać laktobiono-1,5-lakton (1,94 g, 98% wydajności). Produkt ten ma wystarczającą czystość, aby można go było stosować w następujących reakcjach.
  3. Dodać 1,0 g laktobionolaktonu w 3,0 ml metanolu do N-(2-aminoetylo)metakryloamidu (AEMA, 0,58 g) i hydrochinonu eteru monometylowego (MEHQ, 1,0 mg), inhibitora samopolimeryzacji, w 2,0 ml metanolu, a następnie 1,0 ml trietyloaminy. Mieszaj w RT przez 48 godzin.
  4. Dodać 20 ml dejonizowanegoH2O(dH2O) do kolby reakcyjnej, następnie usunąć metanol i wolną trietyloaminę przez odparowanie do sucha przez odparowanie rotacyjne.
  5. W celu usunięcia pozostałości kwasu laktobionowego dodać 20 ml dH2O, a następnie przepuścić roztwór wodny przez kolumnę anionowymienną (forma OH, 10 mm x 20 mm) do zlewki odbiorczej zawierającej 1,0 mg MEHQ.
  6. Usunąć trietyloaminę, wytworzoną w kroku 1.5, poprzez odparowanie do sucha w procesie odparowania rotacyjnego.
  7. Dodać 20 mldH2O i usunąć nieprzereagowaną AEMA, powoli dodając 1 mg porcji żywicy kationowymiennej (forma H+), aż do momentu, gdy nie będą wykrywalne żadne materiały reagujące z ninhydryną. Monitorować usuwanie, pobierając 1 μl podwielokrotności roztworu po dodaniu każdej żywicy, nakładając go na cienkowarstwową płytkę chromatograficzną, a następnie spryskując płytkę 2% ninhydryną w roztworze etanolu. Jeżeli nie zaobserwuje się rozwoju ciemnoniebieskiego koloru po podgrzaniu płytki do 90 °C przez 1 minutę, oznacza to, że osiągnięto punkt końcowy.
  8. Przefiltrować roztwór przez lejek ze spiekanego szkła, przenieść filtrat do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać liofilizowaniu.
  9. Usunąć MEHQ z próbki, rozpuszczając liofilizowany materiał w minimalnej ilości metanolu (~0,5 ml), a następnie dodać zimny bezwodny aceton (-20 °C, 15 ml) w celu wytrącenia produktu. Zebrać osad przez filtrację za pomocą lejka ze spiekanego szkła, a następnie wysuszyć osad w eksykatorze pod próżnią, aby otrzymać 2-laktobionamidoetylometakryloamid (LAEMA) w postaci białawego proszku (0,94 g, wydajność 68%). Produkt ten ma wystarczającą czystość, aby można go było stosować w następujących reakcjach.

2. Synteza monomeru 2-glukonamidoetylometakryloamidu

Uwaga: Przygotowanie 2-glukonamidoetylometakryloamidu (GAEMA), który nie posiada cukru wiszącego, zostało zaadaptowane z opublikowanej metody15.

  1. Dodać 2,0 g AEMA rozpuszczonego w 10 ml metanolu do roztworu D-glukonolaktonu (1,6 g) w 30 ml metanolu i mieszając, powoli dodawać 1,6 ml trietyloaminy.
  2. Mieszać reakcję w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
  3. Przefiltrować wytrącony produkt za pomocą lejka ze spiekanego szkła i przepłukać osad trzykrotnie po 10 ml izopropanolu, a następnie przemyć 10 ml suchego acetonu. Wysuszyć wytrącony produkt w eksykatorze w próżni.

3. Synteza glikopolimeru RAFT

  1. Aby usunąć inhibitor MEHQ obecny w dostępnym na rynku N-(2-hydroksyetylo)akrylamidzie (HEAA), należy dodać 1 ml HEAA do probówki mikrowirówki o pojemności 2 ml, a następnie dodać 0,5 g nanocząstek tlenku glinu. Odwirować probówkę o masie 300 x g przez 30 sekund i użyć górnej warstwy HEAA w następnej reakcji.
  2. Ostrożnie dodać 32,8 mg LAEMA (70,0 μmol), 1,7 mg AEMA (10,5 μmol) i 27,5 μl HEAA (270 μmol), wszystkie rozpuszczone w 0,4 mldH2O, do dobrze oczyszczonej probówki Schlenka o pojemności 1 ml, o stosunku molowym monomeru 20:3:77.
  3. W reakcji równoległej, w celu wytworzenia polimerów kontrolnych, które nie zawierają cukru wiszącego, zamiast stosować LAEMA w kroku 3.2, należy zastąpić 21,4 mg GAEMA (70,0 μmol) w reakcji.
  4. Do odpowiedniej probówki Schlenka (tj. 3.2 lub 3.3) dodać kolejno 50 μl DMF zawierającego 0,53 mg (kwasu 4-cyjanopentanowego)-4-ditiobenzoesanu (1,9 μmol, czynnik RAFT) i 50 μl DMF zawierającego 250 μg 4,4′-azobis-(kwasu 4-cyjanowalerynowego) (0,9 μmol, inicjator). Delikatnie wymieszaj, stukając palcem.
  5. Zamrozić zawartość zawartą w probówce Schlenka za pomocą kąpieli suchy lód-etanol (75 g suchego lodu w 100 ml etanolu), zastosować podciśnienie z dokładnością do 10-50 mTorr, następnie zamknąć zawór Schlenka i pozwolić, aby roztwór powoli rozmroził się do RT. Powtórz ten cykl zamrażania-ewakuacji-rozmrażania jeszcze dwa razy. Upewnij się, że wszystkie odczynniki zostały rozpuszczone po ostatnim rozmrożeniu.
  6. Umieść rurkę Schlenk w zamykanej plastikowej torbie, spuść powietrze z worka, a następnie zamknij ją. Przenieść worek zawierający probówkę Schlenka do łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 70 °C i inkubować przez 24 godziny.
  7. Ostrożnie przenieść roztwór z probówki Schlenka do przygotowanego worka do dializy (MWCO = 3 500) i dializować w stosunku dodH 2O (10 x 2 L) przez 24 godziny, zmieniającdH2O co godzinę przez pierwsze 8 godzin. Po dializie przenieść próbkę z rurki dializacyjnej do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać ją liofilizacji.

Uwaga: Otrzymano wynikowe statystyczne kopolimery polimetakrylamidu/akrylamidu (PMA) zawierające wisiorek 4-O-β-D-galaktopiranozylo-D-glukonamid (laktobionamid) (z Kroku 3.2) lub D-glukonamid (z Kroku 3.3). Dla wygody dyskusji, te dwa glikopolimery są skracane odpowiednio jako PMA-LAEMA i PMA-GAEMA.

4. Modyfikacja glikopolimerów za pomocą fluoroforów

  1. Rozpuścić 5,0 mg glikopolimeru PMA-LAEMA lub PMA-GAEMA zawierającego ~0,9 μmola pierwszorzędowych aminowych grup funkcyjnych w 0,9 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, 0,1 M fosforan sodu, 0,15 M NaCl, pH 7,5).
  2. Powoli dodawać 0,6 mg estru sukcynimidylu karboksyfluoresceiny w 100 μl DMF do roztworów, szybko mieszając. Delikatnie mieszaj reakcje przez 16 godzin w ciemności w temperaturze pokojowej.
  3. Chroniąc ją przed światłem, załadować próbkę do przygotowanego rurki do dializy (MWCO = 3 500) i dializować w stosunku dodH 2O (2 L) przez 16 godzin, zmieniając roztwór dializacyjny co godzinę przez pierwsze 8 godzin. Po dializie przenieść próbkę z rurki dializacyjnej do probówki, zamrozić próbkę w temperaturze -80 °C, a następnie poddać ją liofilizacji.

Uwaga: Po liofilizacji otrzymuje się fluorescencyjne glikopolimery PMA-LAEMA-Fluoresceina i PMA-GAEMA-Fluoresceina, odpowiednio.

5. Charakterystyka glikopolimerów

  1. Oznaczyć średnią liczbową masę cząsteczkową (Mn), średnią wagowo masę cząsteczkową (Mw) i dyspersję (Mw/Mn) glikopolimerów w komercyjnym systemie HPLC wyposażonym w oprogramowanie do chromatografii żelowej (GPC), kolumnę GPC odpowiednią do masy cząsteczkowej będącej przedmiotem zainteresowania oraz detektor indeksu refrakcji, używając 0,1 M Tris/0,1 M buforu chlorku sodu (pH 7) jako eluentu o natężeniu przepływu 0,6 ml/min14. Jako wzorce masy cząsteczkowej należy stosować wzorce glikolu polietylenowego (MW: 200-1 200 000 g/mol).
  2. Określić ilościowo rzeczywiste stężenia pierwszorzędowych aminowych grup funkcyjnych w glikopolimerach16. Przeanalizować całkowitą zawartość węglowodanów w zsyntetyzowanych glikopolimerach zgodnie z opublikowaną metodą17.
  3. Wykonać badania składu strukturalnego i czystości glikomonomerów LAEMA, GAEMA i glikopolimerów PMA-LAEMA, PMA-GAEMA wD2Ometodą spektroskopii NMR14.

6. Testy wiązania syntetycznych glikopolimerów z kulkami agarozowymi pokrytymi lektyną

  1. Dodać 1,5 ml PBS do 50 μl zawiesiny kulek agarozowych pokrytych lektyną Erythrina crista-galli (ECL), odwirować przy 300 x g przez 1 minutę, a następnie ostrożnie usunąć i usunąć sklarowany osad. Powtórz ten krok dwukrotnie, a następnie ponownie zawieś kulki w 0,5 ml PBS.
  2. Dodać 3 μg PMA-LAEMA-Fluoresceiny lub PMA-GAEMA-Fluoresceiny (kontrola ujemna) w 6 μl PBS do zawiesiny kulek i inkubować mieszaniny, w ciemności, w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  3. Umyj mieszaniny trzykrotnie 1,5 ml PBS i ponownie zawieś kulki w 0,2 ml PBS. Załadować podwielokrotność (4 μl) do studzienki na szkiełku mikroskopu immunofluorescencyjnego (pokrytym teflonem), przykryć szkiełkiem nakrywkowym i obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu filtra FITC (długość fali wzbudzenia: 467-498 nm, długość fali emisji: 513-566 nm) i obiektywu 10X, aby zbadać wiązanie fluorescencyjnych glikopolimerów z kulkami14.

Wyniki

Synteza glikomonomeru

W niniejszej pracy kwas laktobionowy posłużył jako przykład do otrzymania glikomonomerów. Stosując metody opisane w pierwotnym raporcie dotyczącym syntezy LAEMA11, zaobserwowano zmienne wydajności preparatyki przy niezadowalającej czystości. Zmodyfikowana metoda oczyszczania z wykorzystaniem jonitów kationowych i anionowych do usunięcia nieprzereagowanego substratu pozwoliła uzyskać stabilną wydajność produktu oraz wysoką czystość, co potwierdzono za pomocą spektroskopii NMR 1H i 13C (Rysunek 1).

Synteza glikopolimerów metodą RAFT i post-modyfikacja glikopolimerów fluoroforami

W przeciwieństwie do glikopolimerów blokowych przygotowanych poprzez stopniową polimeryzację RAFT, ten jednowykrokowy protokół kopolimeryzacji zapewnia jednorodny rozkład glikomonomeru w całym szkielecie polimeru. Przedstawione tutaj glikopolimery zawierają 20 mol% glikomonomeru, 77 mol% HEAA jako łącznika oraz 3 mol% AEMA jako punkt docelowy dla późniejszych modyfikacji (patrz Rysunek 2). Spektroskopia 1H- i 13C-NMR potwierdziła struktury PMA-LAEMA i PMA-GAEMA (Rysunki 3 i 4). Jak pokazano na Rysunku 5, po zestawieniu z profilami elucji GPC glikopolimeru zsyntetyzowanego bez RAFT, zarówno PMA-LAEMA, jak i PMA-GAEMA wykazują niskie dyspersyjności, co dowodzi skuteczności metody RAFT. Zgodnie z oczekiwaniami, PMA-GAEMA posiada mniejszą wartość Mn niż PMA-LAEMA ze względu na brak bocznego cukru w PMA-GAEMA. Analiza zawartości węglowodanów i grup funkcyjnych amin pierwszorzędowych w glikopolimerach RAFT wykazała, że stosunek monomerów w otrzymanych glikopolimerach jest zgodny ze stosunkiem stechiometrycznym monomerów wyjściowych zastosowanych w reakcji polimeryzacji prowadzonej za pomocą RAFT (Tabela 1). Oznacza to ścisłą kontrolę składu monomerowego w zsyntetyzowanych glikopolimerach, zgodnie z założeniami.

Reakcja grup funkcyjnych amin pierwszorzędowych z aktywowanymi fluoroforami jest powszechnie stosowaną techniką znakowania białek. Technikę tę zastosowano tutaj do znakowania oczyszczonych glikopolimerów karboksyfluoresceiną. W wyniku modyfikacji otrzymano polimery fluorescencyjne (Rysunek 6). Analiza GPC nie wykazała degradacji polimerów znakowanych fluoresceiną w trakcie reakcji (dane nie zostały przedstawione).

Testy wiązania syntetycznych glikopolimerów z kuleczkami agarozowymi powlekanymi lektynami

W celu oceny specyficzności wiązania lektynowego syntetyzowanych glikopolimerów wykorzystano kulki agarozowe powlekane lektynami o znanej specyficzności wiązania węglowodanów. Lektyna z Erythrina crista-galli (ECL), zastosowana w eksperymentach, wykazuje specyficzność wiązania wobec β-D-galaktozydu. Rycina 7A wyraźnie pokazuje, że PMA-LAEMA-Fluoresceina, zawierająca β-D-galaktozyd jako węglowodan boczny, wykazała silne wiązanie z lektyną ECL. Z kolei na Rycynie 7B przedstawiono brak wiązania z ECL w przypadku glikopolimeru PMA-GAEMA-Fluoresceina, który nie posiada cukru bocznego. Wynik ten egzemplifikuje efektywność wiązania i powinowactwo syntetyzowanego fluorescencyjnego glikopolimeru.

Widmo NMR, 1H i 13C, ustalenie struktury, przesunięcia chemiczne, schemat analizy cząsteczkowej.
Rysunek 1. Przypisane 1H- (a) oraz 13C-NMR (b) widma (D2O) dla LAEMA. (Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Wang et al.14) Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Schemat procesu syntezy chemicznej z reakcją polimeryzacji i strukturą fluoresceiny.
Rycina 2. Schematyczna ilustracja syntezy fluorescencyjnego glikopolimeru PMA-LAEMA zawierającego β-galaktozyd jako cukier boczny. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat spektroskopii NMR dla analizy struktury cząsteczkowej, przedstawiający przesunięcia chemiczne w ppm.
Rysunek 3. Przypisane 1H- (A) i 13C-NMR (B) widma (D2O) dla glikopolimeru PMA-LAEMA. (Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Wang et al.14) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wyniki spektroskopii NMR; analiza struktury chemicznej; widma NMR protonów i węgla; identyfikacja cząsteczkowa.
Rycina 4. Przypisane widma 1H-NMR (A) oraz 13C-NMR (B) (D2O) dla PMA-GAEMA. (Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Wang et al.14) Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres chromatograficzny przedstawiający czas retencji polimeru wraz z analizą rozkładu masy cząsteczkowej.
Rysunek 5. Przebiegi chromatografii przenikania żelu dla PMA-GAEMA oraz PMA-LAEMA otrzymanych metodą RAFT, a także ich odpowiedników przygotowanych bez użycia czynnika RAFT.W przeciwieństwie do PMA-LAEMA przygotowanego bez czynnika RAFT (kolor niebieski), PMA-LAEMA otrzymany metodą RAFT (kolor zielony) wykazuje znacznie niższą dyspersyjność (Mw/Mn). PMA-GAEMA (kolor czerwony) oraz PMA-LAEMA otrzymane metodą RAFT mają podobne profile GPC, jednak w pierwszym przypadku Mn jest mniejsza ze względu na brak cukrów bocznych. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Fluorescencja związków chemicznych w probówkach; eksperyment spektroskopowy z emisją widzialną.
Rysunek 6. PMA-LAEMA przed i po modyfikacji fluorophorem. (A) W porównaniu z białym, nieznakowanym glikopolimerem (lewa probówka), PMA-LAEMA znakowany fluoresceiną wykazuje intensywny żółty kolor (prawa probówka). (B) W świetle UV nieznakowany PMA-LAEMA (lewa probówka, 1 mg/ml w PBS) jest ciemny i nie wykazuje fluorescencji, podczas gdy PMA-LAEMA znakowany fluoresceiną (prawa probówka, 1 mg/ml w PBS) wykazuje silną zieloną fluorescencję. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikrografia fluorescencyjna zielona kulistych komórek; eksperyment analizy morfologii komórek.
Rysunek 7. Erythrina crista-galli kuleczki agarozowe powlekane lektyną (ECL) wiążą glikopolimery zawierające β-D-galaktozyd, a nie te, które nie posiadają wiszącego cukru. (A) PMA-LAEMA-Fluoresceina (3 µg) wykazała silne wiązanie z ECL, podczas gdy w (B) PMA-GAEMA-Fluoresceina, która nie posiada wiszącej reszty β-D-galaktozydu, nie wykazała wiązania z kuleczkami powlekanymi lektyną. Pasek skali = 100 µm.

Tabela 1. Wartości docelowea parametrów syntetycznych oraz rzeczywisty skład glikopolimerów. a) Wartości docelowe, wartości pożądane dla produktów; b) DP, stopień polimeryzacji; c) NA, niedostępne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

DPb DispersyjnośćRzeczywista zawartość glikomonomerów
mol %		Rzeczywista zawartość aminy pierwotnej
mol %
Wartości docelowe100< 1.3203
PMA-LAEMA991.26193.2
PMA-GAEMA891.32NAc2.7

Dyskusja

W niniejszym raporcie przedstawiono łatwy i skuteczny protokół dla trójskładnikowych fluorescencyjnych glikopolimerów na bazie tratwy, z węglowodanami w wisiorku i bez niego, oraz ich zastosowanie w teście wiązania lektyny. Protokół rozpoczyna się od przygotowania glikomonomerów LAEMA i GAEMA. Poprzez jednoetapową kopolimeryzację sterowaną tratwą uzyskuje się glikopolimery o powtarzalnej wydajności, przewidywalnym składzie monomerów i niskiej dyspersji. Po późniejszej modyfikacji glikopolimerów estrem sukcynimidylu karboksyfluoresceiny, wiązanie otrzymanego odpowiedniego glikopolimeru znakowanego fluorescencyjnie można łatwo przetestować pod kątem jego specyficzności wiązania lektyny.

W początkowych etapach preparatywnych glikomonomerów, które mają być wykorzystane w kolejnych syntezach glikopolimerów, wykorzystano łatwo dostępny kwas laktobionowy i glukonolakton. Teoretycznie wszelkie interesujące nas węglowodany, od cukrów prostych po złożone oligosacharydy, mogą zostać przekształcone w glikomonomery poprzez sprzężenie docelowego cukru z pierwszorzędową grupą hydroksylową na C6 glukozy. Po utlenieniu reszty glukozy redukującej, a następnie jej odwodnieniu do laktonu, produkt może być następnie łatwo poddany reakcji z aminą pierwszorzędową na AEMA, tworząc odpowiedni glikomonomer. Dalsze przykłady tej trasy można znaleźć w niedawnym raporcie14. Należy zauważyć, że przed rozpoczęciem jakiegokolwiek etapu polimeryzacji, MEHQ, silny inhibitor polimeryzacji, musi zostać usunięty ze wszystkich preparatów monomerów i glikomonomerów tuż przed użyciem. Można to łatwo osiągnąć poprzez użycie minimalnej ilości metanolu do rozpuszczenia glikomonomeru, który posiada MEHQ, a następnie natychmiastowe potraktowanie go acetonem w temperaturze -20 °C w celu wytrącenia produktu wolnego od inhibitorów z wysoką wydajnością.

Niezbędne w każdym schemacie polimeryzacji rodnikowej jest podkreślenie dbałości o szczegóły i czystość monomerów. Jak to jest typowe dla systemu polimeryzacji RAFT, składa się on ze źródła rodnika, odczynnika RAFT, monomeru i rozpuszczalnika. W tej wizualizacji opisano jednoetapowy system polimeryzacji RAFT, który koncentruje się na wytwarzaniu statystycznych kopolimerów generowanych z mieszaniny reakcyjnej zawierającej trzy różne monomery w roztworze wodnym. Przedstawiono dwie oddzielne reakcje, w których pośredniczy RAFT, w jednej wykorzystuje się glikomonomer, który posiada wiszący, nieredukujący koniec węglowodanowy (tj. β-D-galaktozę), a drugi zawiera poliol bez związanej reszty węglowodanowej. Wspólne dla obu reakcji za pośrednictwem RAFT były monomery posiadające pojedynczą grupę hydroksylową, która służy jako cząsteczka dystansowa, oraz inne posiadające wolną aminę do późniejszej modyfikacji za pomocą amino-reaktywnego fluoroforu.

Ponieważ obecność tlenu w mieszaninie reakcyjnej i środowisku jest szkodliwa dla polimeryzacji za pośrednictwem RAFT, jego usunięcie do śladowych ilości można łatwo osiągnąć poprzez kilka cykli zamrażania-ewakuacji-rozmrażania, utrzymując naczynie reakcyjne rurki Schlenka w wysokiej próżni.

Należy zauważyć, że stosunek molowy różnych monomerów w reakcji można dostosować w razie potrzeby. Ponadto, zmieniając ilość użytego środka RAFT, można kontrolować długość powstałych polimerów18. Jednak stosunek molowy środka RAFT do inicjatora powinien być zawsze większy niż dwa, aby zapewnić niską dyspersję produktu. W tych warunkach ewolucja kopolimeryzacji jest stabilna, a powtarzalność reakcji jest bardzo wysoka. Biorąc to pod uwagę, jest mało prawdopodobne, aby uzyskać całkowicie równomierny rozkład wszystkich uczestniczących monomerów w statystycznym kopolimerze, ze względu na ich różne prędkości polimeryzacji. Scharakteryzowanie rozkładu różnych monomerów w polimerze jest nadal bardzo trudne.

Przedstawiona tutaj metoda po modyfikacji jest zarówno prostsza, jak i bardziej podatna na zastosowanie szerszego wyboru znaczników fluorescencyjnych w porównaniu z innymi protokołami stosowanymi do znakowania glikopolimerów2,11. Obejmuje to wiele rozpuszczalnych w wodzie fluoroforów reagujących z aminami, kropek kwantowych, biotyn i innych. Specyfika wiązania zsyntetyzowanych, znakowanych glikopolimerów jest łatwa do zweryfikowania przy użyciu lektyn o znanym powinowactwie wiązania. PMA-GAEMA nie zawierający cukru w układzie macierzystym stanowi odpowiednią kontrolę negatywną. Glikopolimery o różnych znacznikach fluorescencyjnych otrzymane tą drogą zostały z powodzeniem wykorzystane w badaniach wiązania bakteryjnego za pośrednictwem lektyny14. Jak pokazano, to łatwe i wydajne przygotowanie statystycznych glikopolimerów fluorescencyjnych powinno zapewnić ogromny potencjał dla szerokiej gamy badań glikobiologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Laboratoria Chemiczne Stacji Doświadczalnej Uniwersytetu Missouri oraz przez Stowarzyszenie Mukowiscydozy w Missouri.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
odczynnik
Kwas laktobionowySigma-Aldrich153516
D-Glukonolakton Sigma-AldrichG2164
N-(2-hydroksyetylo)akryloamid (HEAA)SólSigma-Aldrich697931
Orange II Eter monometylowyhydrochinonu Sigma-AldrichO8126
MEHQ)Inhibitor polimeryzacjiSigma-Aldrich54050
N-(2-aminoetylo)metakryloamidu chlorowodorek (AEMA)Polysciences, Inc24833-5
TriethylamineFisher ScientificBP-616
Żywica anionowymienna IRN-78 w postaci wodorotlenku, 80 meshSigma-Aldrich10343-U
Żywica kationowymienna 50Wx8, 200 meshSigma-Aldrich217514
Tlenek glinu, ~150 oczek Sigma-AldrichA1522Typ WN-6, Neutralny, Klasa aktywności Super I
NinhydrinSigma-AldrichN4876W teście użyto roztworu etanolu 0,2% ninhydryny Kwas
4-cyjano-4-(fenylokarbomatioltio)pentanowySigma-Aldrich722995Środek RAFT
4,4′-Azobis(kwas 4-cyjanolerynowy)Sigma-Aldrich11588Inicjator polimeryzacji
Ester sukcynimidylowy karboksyfluoresceiny Life TechnologiesC1157
Koralik agarozowy pokryty lektyną Erythrina CristagalliVector LaboratoriesAL-1143 
Solvent
dH2OProdukowane przez system oczyszczania wody Barnstead, 18 megOhm-cm
IzopropanolFisher ScientificA461-4klasa ACS lub lepsza
MetanolFisher ScientificA454-4ACS lub lepszy
etanolFisher ScientificBP2818-100ACS klasa lub lepsza
DimetyloformamidSigma-Aldrich22705Klasa ACS lub lepsza
AcetonFisher ScientificA929-4ACS klasa lub lepsza
Equipment
membrana do dializy (MWCO: 3,500)Spectrum Labs132720
Standardowy standard analityczny glikolu polietylenowegoSigma-AldrichØ2393
Probówka Schlenka, 1 mltwarogowe
Dostosowane TSK-GEL G4000 PWxl Tosoh Bioscience 8022Używany do analizy GPC glikopolimerów
Empower 3 z pakietem GPC/SECWaters Corporation
Waters Alliance Waters CorporationWyposażony w detektor indeksu refrakcji (Waters 2414) i detektor fluorescencji (Waters 2475)
Spektrometr NMR Avance III 800 MHzBruker Corporation
BX43Olympus CorporationUżywany z filtrem FITC w teście wiązania glikopolimeru
Rotavap / Parownik RotoevaporHeidolph
Fritted lejek dyskowyFisher Scientific10-310-109
LiofilizatorLabconco
Szkiełko mikroskopu immunofluorescencyjnegoPolysciences18357-1
Revco Ultima Plus -80  ° C ZamrażarkaThermo Scientific
Plastikowy worek próżniowy i pompka ręcznaPompa próżniowa Ziploc
, napęd bezpośredni, wakuometr Maxima C PlusFisher Scientific
Sargent-Welch
sodowa ( Absolutny Szkło System HPLC Mikroskop fluorescencyjny

Bibliografia

  1. Scharfman, A., et al. Pseudomonas aeruginosa binds to neoglycoconjugates bearing mucin carbohydrate determinants and predominantly to sialyl-Lewis x conjugates. Glycobiology. 9 (8), 757-764 (1999).
  2. Song, E. H., et al. In vivo targeting of alveolar macrophages via RAFT-based glycopolymers. Biomaterials. 33 (28), 6889-6897 (2012).
  3. Wolfenden, M. L., Cloninger, M. J. Chapter 14. Multivalency in carbohydrate binding. Carbohydrate Recognition: Biological Problems, Methods, and Applications. Wang, B., Boons, G. .-J. , John Wiley, & Sons, Inc., Chapter. 349-370 (2011).
  4. Moad, G., Rizzardo, E., Thang, S. H. Radical addition-fragmentation chemistry in polymer synthesis. Polymer. 49 (5), 1079-1131 (2007).
  5. Spain, S. G., Gibson, M. I., Cameron, N. R. Recent advances in the synthesis of well-defined glycopolymers. J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 45 (11), 2059-2072 (2007).
  6. Bernard, J., Hao, X., Davis, T. P., Barner-Kowollik, C., Stenzel, M. H. Synthesis of various glycopolymer architectures via RAFT polymerization: From block copolymers to stars. Biomacromolecules. 7 (1), 232-238 (2006).
  7. Bulmus, V. RAFT polymerization mediated bioconjugation strategies. Polym. Chem. 2, 1463-1472 (2011).
  8. Ting, S. R. S., Chen, G., Stenzel, M. H. Synthesis of glycopolymers and their multivalent recognitions with lectins. Polymer Chemistry. 1, 1392-1412 (2010).
  9. Vazquez-Dorbatt, V., Lee, J., Lin, E. W., Maynard, H. D. Synthesis of glycopolymers by controlled radical polymerization techniques and their applications. Chembiochem. 13, 2478-2487 (2012).
  10. Jiang, X., Ahmed, M., Deng, Z., Narain, R. Biotinylated glyco-functionalized quantum dots: Synthesis, characterization, and cytotoxicity studies. Bioconjugate Chem. 20 (5), 994-1001 (2009).
  11. Deng, Z., Li, S., Jiang, X., Narain, R. Well-defined galactose-containing multi-functional copolymers and glyconanoparticles for biomolecular recognition processes. Macromolecules. 42 (17), 6393-6405 (2009).
  12. Qin, Z., et al. Galactosylated N-2-hydroxypropyl methacrylamide-b-N-3-guanidinopropyl methacrylamide block copolymers as hepatocyte-targeting gene carriers. Bioconjugate Chem. 22 (8), 1503-1512 (2011).
  13. Albertin, L., Wolnik, A., Ghadban, A., Dubreuil, F. Aqueous RAFT polymerization of N-acryloylmorpholine, synthesis of an ABA triblock glycopolymer and study of its self-association behavior. Macromol. Chem. Phys. 213 (17), 1768-1782 (2012).
  14. Wang, W., Chance, D. L., Mossine, V. V., Mawhinney, T. P. RAFT-based tri-component fluorescent glycopolymers: synthesis, characterization and application in lectin-mediated bacterial binding study. Glycoconj. J. 31 (2), 133-143 (2014).
  15. Deng, Z., Ahmed, M., Narain, R. Novel well-defined glycopolymers synthesized via the reversible addition fragmentation chain transfer process in aqueous media. J. Polymer Sci. Part A: Polym. Chem. 47 (2), 614-627 (2009).
  16. Noel, S., Liberelle, B., Robitaille, L., De Crescenzo, G. Quantification of primary amine groups available for subsequent biofunctionalization of polymer surfaces. Bioconjugate Chem. 22 (8), 1690-1699 (2011).
  17. Biermann, C. J., McGinnis, G. D. Preparation of alditol acetates and their analysis by gas chromatography (GC) and mass spectrometry (MS). Analysis of Carbohydrates by GLC and MS. , CRC Press. 87-170 (1989).
  18. Thomas, D. B., et al. Kinetics and molecular weight control of the polymerization of acrylamide via RAFT. Macromolecules. 37 (24), 8941-8950 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Polimeryzacja RAFTsynteza glikopolimerówprzygotowanie glikomonomerówtest wiązania lektynznakowanie fluorescencyjneoczyszczanie przez dializęanaliza masy cząsteczkowejrozpoznawanie węglowodanówcharakterystyka polimerów
Łatwe i wydajne otrzymywanie trójskładnikowych glikopolimerów fluorescencyjnych za pomocą polimeryzacji kontrolowanej przez RAFT
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.