Kwantyfikacja adhezji komórek śródbłonka in vitro

Podsumowanie

Opisujemy metodę in vitro, która pozwala na ilościowe określenie rzeczywistej liczby komórek adhezyjnych w monowarstwie komórek śródbłonka.

Streszczenie

Jednym z głównych procesów zapalnych jest infiltracja komórek odpornościowych ze światła naczynia krwionośnego do otaczającej tkanki. Dzieje się tak, gdy komórki śródbłonka, które wyściełają naczynia krwionośne, stają się adhezyjne do krążących komórek odpornościowych, takich jak monocyty. Pomiar tej adhezji in vitro był do tej pory wykonywany poprzez ilościowe określenie całkowitej liczby monocytów, które przylegają do warstwy śródbłonka, albo jako bezpośrednie zliczenie, albo poprzez pośredni pomiar fluorescencji przylegających monocytów. Chociaż takie pomiary wskazują na średnią adhezjalność populacji komórek śródbłonka, są one zaburzone przez szereg czynników, takich jak liczba komórek, i nie ujawniają proporcji komórek śródbłonka, które są faktycznie adhezyjne. W tym artykule opisano i zademonstrowano metodę, która pozwala na wyliczenie komórek adhezyjnych w badanej populacji monowarstwy śródbłonka. Komórki śródbłonka są hodowane na szklanych szkiełkach nakrywkowych, a po pożądanym leczeniu są poddawane monocytom (które mogą być znakowane fluorescencyjnie). Po inkubacji, procedurze płukania, obejmującej wiele rund zanurzania i drenażu, komórki są utrwalane. Adhezyjne komórki śródbłonka, które są otoczone monocytami, są łatwo identyfikowane i zliczane, co daje wskaźnik adhezji, który ujawnia rzeczywistą proporcję komórek śródbłonka w populacji, które są adhezyjne.

Wprowadzenie

Infiltracja komórek odpornościowych, takich jak monocyty, przez warstwę komórek śródbłonka, które wyściełają naczynia krwionośne, jest ważnym krokiem w procesie zapalenia^{. 1}. Pozwala to na naprowadzanie komórek odpornościowych (immunocytów) do miejsca urazu. W innych przypadkach i lokalizacjach, takich jak tętnica wieńcowa i tętnica szyjna, naciekanie monocytów przez warstwę śródbłonka może prowadzić do niepożądanego długotrwałego przebywania tych komórek w ścianie tętnicy, potencjalnie prowadząc do tworzenia się blaszek miażdżycowych². We wszystkich przypadkach naciekania immunocytów pierwszym krokiem jest aktywacja komórek śródbłonka w zlokalizowanym obszarze naczynia krwionośnego. Komórki śródbłonka są aktywowane przez cytokiny prozapalne, takie jak TNF-α i IL-6, w celu zwiększenia ekspresji białek powierzchniowych komórek, takich jak VCAM, ICAM i E-selektyna, które ułatwiają rekrutację i przyłączanie immunocytów do powierzchni komórki śródbłonka^3-6.

Początkowo pomiar adhezji komórek śródbłonka był przeprowadzany poprzez liczenie monocytów, które przylegały do monowarstwy ⁷ śródbłonka. Ograniczenia tej metody pod względem precyzji doprowadziły do zastosowania znakowanych radioaktywnie limfocytów lub monocytów, a następnie do oznaczania ilościowego materiału promieniotwórczego, który odpowiada adhezji limfocytów lub monocytów ⁴. Metoda ta została ostatecznie zastąpiona metodą opartą na fluorescencji, w której interesujące immunocyty znakowano barwnikiem fluorescencyjnym i poddawano tej samej procedurze, co powyżej, z tą różnicą, że mierzy się fluorescencję zamiast radioaktywności ⁸. Obecnie ta metoda stała się najwygodniejsza i jest sprzedawana w formie zestawu przez kilku komercyjnych dostawców. Chociaż test ten może mierzyć względne poziomy adhezji między próbkami kontrolnymi i eksperymentalnymi, nie ujawnia, czy zmiana fluorescencji jest spowodowana jednolitą zmianą adhezji w całej populacji komórek śródbłonka, czy też zmiana jest spowodowana różnicą adhezji w subpopulacji komórek. Oczywiste jest również, że rygorystyczność mycia wywiera głęboki wpływ na wynik, a co ważniejsze, równomierność spłukiwania niezwiązanych monocytów między różnymi monowarstwami komórek śródbłonka będzie miała duży wpływ na bliskość wyników z powtórzeń i odtwarzalność wyników między próbkami. Niedawno wykorzystano kilka systemów, które pompują monocyty w pożywce przez monowarstwę komórek śródbłonka, aby rozwiązać ten problem ⁹. Ponadto te systemy przepływu podsumowują również wpływ siły ścinającej na komórki śródbłonka. Chociaż zalety takich systemów są oczywiste i bardzo atrakcyjne, ważne jest również, aby zdać sobie sprawę, że podczas gdy adhezja komórek śródbłonka może być znacznie zwiększona, jak ma to miejsce w przypadku ostrego zapalenia, przez czynniki takie jak TNFα, niektóre inne aktywatory, takie jak promieniowanie jonizujące¹⁰ wywołują zmiany, które nie są łatwo wykrywalne w in vitro eksperymentalnych ram czasowych przez te bardzo rygorystyczne systemy. Chociaż takie drobne zmiany w adhezji komórek śródbłonka są łatwe do przeoczenia lub odrzucenia in vitro, niekoniecznie są one łagodne in vivo, gdzie takie małe zmiany w ciągu życia, które są charakterystyczne dla przewlekłego stanu zapalnego, mogą mieć bardzo znaczące skutki. W związku z tym potrzebna jest solidna, a jednocześnie czuła i specyficzna metoda wykrywania i pomiaru adhezji komórek śródbłonka.

Tutaj przedstawiamy metodę bezpośredniego pomiaru adhezji komórek śródbłonka. Metoda ta nie opiera się na pomiarze fluorescencji jako pośrednim zastępczym wskaźniku adhezji komórek śródbłonka. Ujawnia, czy zmiany adhezji są spowodowane jednolitą zmianą we wszystkich komórkach, czy też ograniczają się do subpopulacji. Ponadto umożliwia jednoczesne barwienie komórek śródbłonka markerami, takimi jak beta-galaktozydaza związana ze starzeniem się, marker żywotności komórek, Calcien AM i przeciwciała przeciwko białkom powierzchniowym i wewnątrzkomórkowym, umożliwiając asocjację poszczególnych adhezyjnych komórek śródbłonka z określonymi stanami komórkowymi lub ekspresją określonych białek.

Protokół

1. Przygotowanie szklanych szkiełek nakrywkowych

1. Szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm należy wysterylizować, mocząc je w 70% etanolu przez co najmniej 10 minut, od czasu do czasu mieszając, aby zapewnić całkowite narażenie wszystkich szkiełek nakrywkowych na działanie etanolu. Wlej szklane szkiełka nakrywkowe i etanol do sterylnego naczynia do hodowli komórkowych (o średnicy 6 cm lub 10 cm).
2. Za pomocą pary sterylnych cienkich kleszczyków 5B podnieś i umieść każde pojedyncze szklane szkiełko nakrywkowe w dołku z 24-dołkową płytką zbiorczą. Należy upewnić się, że szkiełka nakrywkowe nie dotykają boków studzienki i znajdują się mniej więcej pośrodku studzienki.
3. Pozostawić odkrytą 24-dołkową płytkę zbiorczą ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi do wyschnięcia w komorze przepływowej. Trwa to około 10 minut
4. W tym okresie należy przygotować mieszankę otoczkową, rozcieńczając 10 mg/ml ludzkiej fibronektyny w roztworze soli Hanka (HBSS) do 0,1 mg/ml.
5. Gdy szkiełka nakrywkowe wyschną, odpipetować 100 μl roztworu powlekającego na każde szklane szkiełko nakrywkowe, tak aby roztwór pokrywał tylko szkło, nie gromadząc się na zewnątrz studzienki. Umieścić przykrytą 24-dołkową płytkę zbiorczą w inkubatorze do hodowli komórkowych na co najmniej godzinę.
6. Tuż przed użyciem usuń roztwór powlekający. Ten sam roztwór powlekający można przenieść do sterylnej probówki i użyć do trzech razy bez widocznej utraty skuteczności.

2. Przygotowanie monowarstwy komórek śródbłonka

1. Hodowla ludzkich komórek śródbłonka tętnicy wieńcowej (EC) w pożywce w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla.
2. Odessać pożywkę hodowlaną i przepłukać monowarstwę EC 10 ml HBSS
3. Odessać HBSS i dodać 2 ml 0,5% roztworu trypsyny, 0,2% EDTA. Inkubować w temperaturze pokojowej przez około 5 minut.
4. Gdy EC można usunąć za pomocą kranu z boku kolby, dodać 5 ml inhibitora trypsyny sojowej i za pomocą pipety spryskać powierzchnię kolby, aby dalej usunąć komórki.
5. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut.
6. Odessać sklarat nad osadem i ponownie zawiesić osad EC w 5 ml pożywki. Policz komórki za pomocą hemocytometru i dostosuj stężenie komórek do 50 000 EC na ml pożywki EC.
7. Dozować 1 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka z 24-dołkowej płytki zawierającej szkiełka nakrywkowe ze szkła powlekanego. Inkubować komórki O/N w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C plus 5% dwutlenku węgla.
8. Komórki są gotowe do użycia w eksperymentach, gdy w ciągu 3 dni utworzy się zlewająca się monowarstwa.

3. Przygotowanie monocytów

1. Przenieś komórki HL-60, które są hodowane w RPMI, uzupełnione 10% płodową surowicą cielęcą, jako hodowlę zawiesinowa, do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut.
2. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w pożywce o pojemności 5 ml i dostosować stężenie komórek z pożywką do 2 milionów komórek/ml. Jeśli pożądane jest znakowanie fluorescencyjne HL-60, ponownie zawiesić komórki w RPMI bez surowicy i postępować zgodnie z opisem w sekcji 4.
3. Dodać 0,5 ml zawiesiny komórek HL-60 do każdego dołka 24-dołkowej płytki zbiorczej zawierającej monowarstwę EC i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla przez wybrany ustalony okres czasu między 1 a 3 godziną. Obserwuje się niewielką różnicę między punktem czasowym 1 godzina a 3 godzina, gdzie osiągane jest nasycenie wiązania.
4. Przygotuj się do mycia/zbierania komórek: Napełnij probówkę o pojemności 120 ml 100 ml HBSS. Dozować 1 ml formaliny do każdego dołka świeżej 24-dołkowej płytki.
5. Po okresie inkubacji użyj pary ostrych kleszczyków i podnieś szklane szkiełko nakrywkowe ze studzienki i przytrzymaj szkiełko nakrywkowe pionowo i przetrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego na kawałku chusteczki na stole przez 3 sekundy, uważając, aby nie dotknąć tkanką pokrytej komórkami powierzchni szkiełka nakrywkowego.
6. Mocno przytrzymując szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków, zanurz szkiełko nakrywkowe w HBSS i wyjmuj je z HBSS pięć razy.
7. Po piątym zanurzeniu w HBSS natrzyj krawędź szkiełka nakrywkowego na chusteczce przez 3 sekundy.
8. Powtórz procedury zanurzania i wkłuwania opisane w ppkt 3.6 i 3.7, wykonując w sumie trzy serie po 5 wsadów, po których następuje uderzenie.
9. Przenieś szkiełko nakrywkowe do studzienki zawierającej 10% formaliny, aby utrwalić komórki w temperaturze pokojowej. Szkiełko nakrywkowe jest gotowe do sporządzenia spisu, do długotrwałego przechowywania lub do poddania innym procedurom opisanym poniżej.

4. Etykietowanie komórek HL-60 za pomocą Cell Tracker (opcjonalnie)

1. Policz i przenieś odpowiednią ilość komórek HL-60 (np. 10 milionów) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Odwirować komórki HL-60 przy 200 x g przez 5 min. Usunąć supernatant.
2. Zawiesić osad komórkowy w Cell Tracker w pożywce RPMI bez surowicy w stężeniu 1 miliona komórek/ml. Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 1 godzinę.
3. Odwirować komórki o masie 200 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do stężenia 2 milionów komórek/ml.
4. Dodaj 0,5 ml HL-60 znakowanego Cell Tracker do każdej studzienki zawierającej komórki śródbłonka wyhodowane na szklanym szkiełku nakrywkowym. Kontynuuj w punkcie 3.3.

5. Wyliczanie adhezyjnych komórek śródbłonka

1. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych z przeciwbarwieniem DAPI, aby zidentyfikować poszczególne komórki.
2. Używając mikroskopu odwróconego z obiektywem 4X lub 10X, uzyskaj obrazy kilku pól (np. 5 pól) i policz największą liczbę monocytów, które agregują się na nienapromieniowanych komórkach śródbłonka (zwykle powinno to być 3-5).
3. Ustaw dwukrotność tej liczby jako próg monocytów na komórce śródbłonka, który ma być zdefiniowany jako klaster. W razie potrzeby do zdefiniowania klastra można użyć innego kryterium w zależności od charakteru eksperymentu.
4. Policz liczbę skupisk i liczbę komórek śródbłonka w polu. Podziel te pierwsze przez drugie, aby uzyskać procent adhezyjnych komórek śródbłonka. Ocenianie liczby pól, aby uzyskać średnią i odchylenie standardowe zliczeń.

6. Barwienie przeciwdziałające przeciwciałom

1. Po oznaczeniu adhezji i utrwaleniu komórek na szkiełku nakrywkowym w 10% formalinie przez 15 minut w temperaturze pokojowej, należy poddać szkiełka nakrywkowe immunofluorescencji przy użyciu standardowej procedury¹⁰ i przeciwciał z wyboru.
2. Dodawaj i usuwaj różne roztwory bardzo delikatnie, aby uniknąć przemieszczania monocytów, które są przyczepione do komórek śródbłonka.

7. Barwienie przeciwdziałające aktywności beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem

się

1. Po wykonaniu testu adhezyjnego i utrwaleniu komórek na szkiełku nakrywkowym w formalinie przez 15 minut, wybarwić pod kątem aktywności beta-galaktozydazy związanej ze starzeniem, zgodnie z opisem w instrukcji dołączonej do zestawu do barwienia. Dodawaj i usuwaj różne roztwory bardzo delikatnie, aby uniknąć przemieszczania monocytów, które są przyczepione do komórek śródbłonka.

Wyniki

Ta metoda pozwala na wykrycie pojedynczych adhezyjnych komórek śródbłonka w obrębie populacji. Na przykład, podczas gdy monowarstwa nienaświetlanych komórek śródbłonka zachowała kilka sporadycznych monocytów HL-60 po inkubacji i przemyciu, monowarstwa śródbłonka 7 dni po naświetlaniu dawką 10Gy przed inkubacją z monocytami była związana przez monocyty tworzące skupiska wokół pojedynczych komórek śródbłonka (Rysunek 1). Chociaż zjawisko to jest łatwo dostrzegalne w mikroskopii kontrastowej, mikroskopia fluorescencyjna pozwala na uzyskanie jeszcze wyraźniejszego obrazu skupisk monocytów.

Po przeprowadzeniu opisanego testu adhezji można przystąpić do barwienia białek błonowych, cytoplazmatycznych lub jądrowych (Rysunek 2>) przy użyciu odpowiednich przeciwciał ze standardowymi metodami immunofluorescencji. Ponadto można przeprowadzić testy enzymatyczne, takie jak test na beta-galaktozydazę związaną ze starzeniem (Rysunek 3>).

Ponieważ każdy skupisko monocytów odpowiada pojedynczej komórce śródbłonka, wyliczenie tych skupisk pozwoli określić rzeczywistą liczbę adhezyjnych komórek śródbłonka w obrębie monowarstwy (Rysunek 4), a tym samym procent adhezyjnych komórek śródbłonka w populacji (Tabela 1, Rysunek 6). Jest to jedyna znana dotychczas metoda umożliwiająca taką kwantyfikację adhezyjności komórek śródbłonka. Należy zauważyć, że komórki śródbłonka wykorzystane w niniejszych eksperymentach wykazują hamowanie kontaktowe i nie zwiększają swojej liczby po osiągnięciu konfluencji. Eliminuje to potencjalną komplikację związaną ze wzrostem liczby komórek śródbłonka w późniejszych punktach czasowych. W razie potrzeby monocyty przyłączone do monowarstw śródbłonka można odczepić za pomocą roztworu 0,5% trypsyny i 0,2% EDTA (zamiast utrwalania w punkcie 3.9), a następnie zmierzyć ich fluorescencję za pomocą czytnika płytek, podobnie jak ma to miejsce w współczesnych metodach (Rysunek 5).

Rycina 1. Adhezja monocytów do monowarstwy komórek śródbłonka. Na nienapromieniowanych komórkach śródbłonka monocyty przylegały jako pojedyncze komórki w sposób sporadyczny i losowy (panele lewe) oraz w skupiskach na poszczególnych komórkach śródbłonka w monowarstwie 7 dni po napromieniowaniu dawką 10 Gy (panele prawe). Dolne panele przedstawiają obrazy fluorescencyjne odpowiadające panelom górnym, co potwierdza, że małe i jasne sferyczne komórki widoczne w kontraście fazowym są rzeczywiście monocytami, które uprzednio oznakowano barwnikiem Cell-Tracker Green. Niektóre skupiska monocytów wskazano białymi strzałkami. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 10X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 2. Barwienie komórek śródbłonka na obecność białek po teście adhezji. Po przeprowadzeniu opisanego testu adhezji, komórki na szkiełkach podstawowych poddano immunofluorescencji w celu wykrycia (A) białka błonowego (CD44), b) białka cytoplazmatycznego (Tubulina) lub c) białka jądrowego (γ-H2AX). Lewe panele (A) i (B) (obrazowane obiektywem 20X) przedstawiają monocyty uprzednio znakowane barwnikiem Cell Tracker Green, a analogiczne obrazy na prawych panelach ukazują CD44 i mikrotubule (czerwone) oraz jądra barwione DAPI (niebieskie). Białe strzałki w (C) wskazują jądra napromieniowanych komórek śródbłonka, które zostały zabarwione przeciwciałami przeciwko γ-H2AX. Jądra monocytów, zabarwione przez DAPI na jaśniejszy niebieski kolor, są łatwo odróżnialne od owalnych jąder komórek śródbłonka. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 20X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 3. Barwienie komórek śródbłonka na beta-galaktozydazę związaną z senescencją. Po teście adhezji komórki na szkiełkach podstawowych poddano barwieniu na beta-galaktozydazę związaną z senescencją, co powoduje zabarwienie lizosomów komórek senescentnych na niebiesko, co jest widoczne w komórce śródbłonka selektywnie związanej z licznymi monocytami, które są łatwo identyfikowalne ze względu na mały rozmiar i sferyczny kształt. Obraz uzyskany przy użyciu obiektywu 20X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Wyliczanie skupisk monocytów na poszczególnych komórkach śródbłonka. Po przeprowadzeniu testu adhezji wykonano zdjęcia komórek z kilku różnych pozycji, a następnie zidentyfikowano i zakreślono (na zielono) skupiska monocytów. Skupisko zdefiniowano jako aglomerację 10 lub więcej monocytów na jednej komórce śródbłonka. Policzono liczbę skupisk monocytów oraz liczbę komórek śródbłonka 12 dni po napromieniowaniu (oznaczone czerwonymi kropkami) na zdjęciu, a następnie obliczono procent przywierających komórek śródbłonka, jak przedstawiono w Tabeli 1. Zdjęcie wykonano przy użyciu obiektywu 10X. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Ilościowe oznaczenie fluorescencji adherentnych monocytów. Po przeprowadzeniu testu adhezji komórki na szkiełkach przedmiotowych poddano trypsynizacji, a następnie zmierzono fluorescencję monocytów uprzednio znakowanych barwnikiem CellTracker Green za pomocą płytkowego czytnika fluorescencji, co służyło jako pośredni wskaźnik adhezyjności warstwy endotelialnej. Wyniki takich pomiarów w określonych dniach po napromienianiu zostały zestawione i naniesione na powyższy wykres.

Rysunek 6. Przedstawienie wyników testu adhezji z Tabeli 1. Przylegające komórki śródbłonka w pięciu różnych miejscach na trzech szklanych zakryciach oceniono zgodnie z opisem na Rysunku 4; wyniki zestawiono w powyższej tabeli, wykazując, że 12 dni po irradiation 10 Gy, od 8 do 10 procent napromieniowanych komórek śródbłonka stało się przylegającymi.

	Procentowa zawartość kleju komórki śródbłonka
	Płyta 1	Płyta 2	Płyta 3
Pole 1	8.65	8.29	8.21
Pole 2	10.44	7.27	7.21
Pole 3	9.63	9.05	8.33
Pole 4	11.11	7.09	8.41
Pole 5	10.55	9.4	11.61
Średnia	10.07	8.22	8.75

Tabela 1. Wyniki testu adhezji. Adhezyjne komórki śródbłonka w pięciu różnych miejscach na trzech szkiełkach podstawkowych oceniono zgodnie z opisem w Rysunku 4, a wyniki zestawiono w powyższej tabeli, wykazując, że 12 dni po napromieniowaniu dawką 10 Gy od 8 do 10 procent napromieniowanych komórek śródbłonka stało się adhezyjnych.

Dyskusja

Opisany powyżej test adhezji monocytów został z powodzeniem wykorzystany w eksperymentach mających na celu zbadanie biologicznych skutków promieniowania jonizującego na monowarstwy śródbłonka¹⁰. Chociaż nie jest to jedyna dostępna metoda oceny adhezji monowarstwy śródbłonka, jest to jedyna metoda, która pozwala na ilościowe określenie proporcji lub procentu komórek śródbłonka w monowarstwie, która jest adhezyjna. Jest to ważne rozróżnienie, ponieważ globalną ilościową zmianę adhezji monocytów, mierzoną innymi metodami, można przypisać albo ogólnemu wzrostowi adhezji wszystkich komórek monowarstwy śródbłonka, albo wzrostowi adhezji subpopulacji komórek śródbłonka w monowarstwie, jak pokazano w powyższym przykładzie. O tym, jak ważne jest posiadanie tych informacji, świadczy fakt, że możliwość ilościowego określenia odsetka komórek śródbłonka, które wykazywały zwiększoną adhezję po napromieniowaniu, doprowadziła do nieuniknionego wniosku, że efekt ten nie jest spowodowany mutacją genetyczną konkretnego genu, ponieważ odsetek komórek, które były adhezyjne, był znacznie wyższy (ponad 1000 razy większy) niż ten, którego można by się spodziewać po losowej mutacji genu przez promieniowanie rentgenowskie dawka.

Czynnikiem, który pozwala na dobrą powtarzalność wyników, jest reżim prania. Ponieważ procedura mycia polega na zanurzeniu szkiełka nakrywkowego w buforze do płukania, a następnie wklepaniu w tkankę, unika się zmienności turbulencji buforu, która nieuchronnie wynika ze starej metody pipetowania buforu do płukania do studzienki. W rzeczywistości to właśnie obserwacja nadmiernej zmienności między powtórzeniami uzyskanymi za pomocą metody pipetowania zmusiła nas do opracowania procedury mycia, która usunęła element zmienności z etapu mycia.

Trzeba przyznać, że ograniczenia tego testu polegają na konieczności ręcznego zliczania klastrów monocytów, co nie pozwala na dostosowanie go do analiz wysokoprzepustowych. Po drugie, decyzja o tym, ile monocytów składa się na klaster, musi być ustalana częściowo arbitralnie, a poziom może być zbyt wysoki i skutkować wykluczeniem niektórych prawdziwych klastrów. Brak siły ścinającej w tej metodzie może być również postrzegany jako ograniczenie w eksperymentach, w których indukowana jest znacznie zwiększona adhezja komórek śródbłonka (np. +TNFα). Jednak w innych sytuacjach brak siły tnącej jest zaletą, ponieważ pozwala na wykrycie mniej przesadnego zwiększenia przyczepności. Niewielki wzrost adhezji monocytów może być szczególnie ważny i istotny. In vivo nie można oczekiwać, że monocyty (w typowym czasie eksperymentalnym) będą przyczepiać się w dużych ilościach do komórek śródbłonka z niewielkim wzrostem adhezji, głównie z powodu siły ścinającej. Z czasem jednak niektóre monocyty prawdopodobnie by to zrobiły, a to z większym prawdopodobieństwem reprezentuje środowisko przewlekłego stanu zapalnego. W związku z tym brak siły ścinającej może być zaletą, ponieważ daje możliwość ujawnienia niewielkiego wzrostu adhezji komórek śródbłonka w eksperymentalnych ramach czasowych, które są zwykle krótkie i prawdopodobnie zbyt ulotne, aby można było zaobserwować umiarkowany wzrost adhezji pod wpływem naprężeń ścinających.

Możliwość poddania komórek po tym teście innym analizom, takim jak test starzenia i barwienie immunofluorescencyjne, zwiększa użyteczność tej metody, ponieważ umożliwia powiązanie adhezji określonych komórek śródbłonka z określonymi białkami komórkowymi lub stanami komórkowymi, jak wykazano powyżej, cecha, która nie jest dostępna w starszych testach adhezyjnych.

Metodę tę zastosowano w przypadku ludzkich komórek śródbłonka naczyń wieńcowych unieśmiertelnionych za pomocą est2, a podobne wyniki uzyskano również w przypadku pierwotnych ludzkich komórek śródbłonka wieńcowego¹⁰, co pokazuje, że nie jest ona specyficzna tylko dla określonej linii komórkowej. Ponadto przyjęcie tej metody oznaczania adhezji komórek śródbłonka nie wyklucza poddania tych samych komórek standardowemu testowi adhezji, który mierzy fluorescencję znakowanych immunocytów. Podsumowując, raport ten pokazuje, że metoda ta jest wszechstronna, kompleksowa i dostarcza znacznie więcej informacji niż standardowy test adhezji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hepes Buforowany roztwór soli fizjologicznej (HBSS)	Sigma	H6648
Szkiełka nakrywkowe szklane o średnicy 12 mm	Menzel-Glaser	CB00120RA1
24-dołkowa płytka klastrowa	Costar	3526
Mezo-Endo Cell	Media Zastosowania w komórkach	212-500
Trypsyna-EDTA	Sigma	T4174
Soja Inhibitor trypsyny	Life Technologies	17075-029
Cell Tracker Green	Life Technologies	C7025
RPMI	Sigma	R8758
Surowica cielęca płodu	Technologies	10500064
Zestaw do oznaczania beta glasctozydazy	Sygnalizacja komórkowa	9860
Fibronectin	Sigma	F0895

Life