Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

Podsumowanie

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Streszczenie

Testy cyfrowe to potężne metody, które umożliwiają wykrywanie rzadkich komórek i liczenie pojedynczych cząsteczek kwasu nukleinowego. Jednak testy cyfrowe nadal nie są rutynowo stosowane ze względu na koszty i specyficzny sprzęt związany z dostępnymi na rynku metodami. W tym miejscu przedstawiamy uproszczoną metodę odczytu cyfrowych testów kropelkowych przy użyciu konwencjonalnego instrumentu PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru fluorescencji masowej cyfrowych testów kropelkowych.

Charakteryzujemy wydajność testu masowego odczytu za pomocą syntetycznych mieszanin kropel i cyfrowego testu wielokrotnego wzmacniania przemieszczenia kropelkowego (MDA). Ilościowe MDA szczególnie korzystają z cyfrowego formatu reakcji, ale nasza nowa metoda ma zastosowanie do każdego testu cyfrowego. W przypadku uznanych protokołów testów cyfrowych, takich jak cyfrowy PCR, metoda ta służy przyspieszeniu i uproszczeniu odczytu testu.

Nasza metodologia masowego odczytu przynosi korzyści z testów partycjonowanych bez potrzeby specjalistycznego oprzyrządowania do odczytu. Głównymi ograniczeniami metodologii odczytu masowego są zmniejszony zakres dynamiki w porównaniu z platformami do liczenia kropel oraz potrzeba standardowej próbki, chociaż wymagania dotyczące tego standardu są mniej rygorystyczne niż w przypadku konwencjonalnego eksperymentu w czasie rzeczywistym. Ilościowa amplifikacja całego genomu (WGA) służy do badania zanieczyszczeń w reakcjach WGA i jest najbardziej czułym sposobem wykrywania obecności fragmentów DNA o nieznanych sekwencjach, co daje tej metodzie duże nadzieje w różnych obszarach zastosowań, w tym w farmaceutycznej kontroli jakości i astrobiologii.

Wprowadzenie

Cyfrowe testy do oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych (digital PCR)^1-4 i kolejności zasadowej (sekwencjonowania) mają duży wpływ na nauki przyrodnicze i medycynę. Testy cyfrowe zapewniają kwantyfikację liczby molekularnej w skali bezwzględnej (nie w stosunku do kontroli), zapewniając wysoką czułość, umożliwiając łatwe porównania między eksperymentami i, co najważniejsze, umożliwiając budowę dużych baz danych zawierających porównywalne dane⁵ (Tabela 1).

W ciągu ostatnich 15 lat, amplifikacja całego genomu (WGA) pojawiła się obok PCR jako ogólne narzędzie do amplifikacji kwasów nukleinowych. Podobn....

Protokół

Uwaga: Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego nie jest konieczne do tego testu, ponieważ kropelki dla tego protokołu mogą być formowane z istniejącymi komercyjnymi maszynami do wytwarzania kropel^23,29.

1. Zbuduj urządzenie mikroprzepływowe tworzące kropelki

1. Przygotuj formę wzorcową dla kanałów z protokołem SU-8 Master Fabrication opisanym wcześniej³¹, ale ze wzorem maski generatora kropel³².
2. Wytwarzanie urządzeń w PDMS z wykorzystaniem technik miękkiej litografii^32,33.

2. Przygotuj mieszaninę reakcyjną do odczytu kropel zbiorczych

Wyniki

Choć konwencjonalne odczyty zbiorcze/w czasie rzeczywistym mogą być stosowane zarówno w ilościowej PCR, jak i w ilościowych testach WGA (Rysunek 1), cyfrowe testy ilościowe zapewniają określone korzyści (Tabela 1). W opisanej metodzie odczytujemy testy cyfrowe w formacie mikrokropel za pomocą prostego zbiorczego pomiaru punktu końcowego (Rysunek 2). Chociaż metoda ta ma szerokie zastosowanie, skupiamy się na ilościowej WGA (MDA), ponieważ metoda ta stawia szczególne wyzw.......

Dyskusja

Testy cyfrowe to potężne metody, które umożliwiają wykrywanie rzadkich komórek i zliczanie pojedynczych cząsteczek kwasu nukleinowego. Jednak testy cyfrowe nadal nie są rutynowo stosowane w laboratoriach analitycznych, częściowo ze względu na koszt specjalistycznego sprzętu związanego z dostępnymi na rynku metodami. W tym miejscu opisujemy cyfrowy test punktu końcowego do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych z uproszczonym odczytem analogowym przy użyciu standardowej ilościowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym........

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Evagreen Dye	Biotium	31000
Albumina surowicy bydlęcej	New England Biotechnologies	B9000S
Phi29 Bufor reakcyjny polimerazy DNA	New England Biotechnologies	B0269S	Wirować okresowo, aż agregat się rozpuści
Lambda DNA	New England Biotechnologies	N3011S	Podgrzany do 50 oC i wygaszony lód przed rozcieńczeniem
Randomizowane oligonukleotydy MDA	Zintegrowane technologie		Startery 5'-NNNNN*N-3'PCR
	Zintegrowane technologie DNA 5		'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' i 5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'
UltraPure Woda wolna od nukleaz	Life Technologies	10977-015	Poddawana działaniu promieni UV przez 30 minut w Stratalinker 2400 przed użyciem (opcjonalnie)
Barwnik referencyjny ROX	Life Technologies	12223-012
Nasadki na paski optyczne do PCR	Life Technologies	4323032
Probówki do PCR	Agilent Technologies	401428
dNTP (25 mikromolowców każda)	Agilent Technologie	200415
Termocykler - system qPCR Mx3000P	Agilent Technologies	401403
Barierowe końcówki do pipet	VWR	89003-046
Olej Bio-rad do evagreen	Bio-rad	186-4005
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893-100RXN

DNA