Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych

8.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52925

⸱

24 września 2015

 , 
1Broad Institute, 2Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy cyfrowy test końcowy do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych za pomocą uproszczonego (analogowego) odczytu. Mierzymy fluorescencję masową kropelkowych testów cyfrowych za pomocą standardowej maszyny qPCR, a nie specjalistycznego oprzyrządowania, i potwierdzamy nasze wyniki za pomocą mikroskopii.

Streszczenie

Testy cyfrowe to potężne metody, które umożliwiają wykrywanie rzadkich komórek i liczenie pojedynczych cząsteczek kwasu nukleinowego. Jednak testy cyfrowe nadal nie są rutynowo stosowane ze względu na koszty i specyficzny sprzęt związany z dostępnymi na rynku metodami. W tym miejscu przedstawiamy uproszczoną metodę odczytu cyfrowych testów kropelkowych przy użyciu konwencjonalnego instrumentu PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru fluorescencji masowej cyfrowych testów kropelkowych.

Charakteryzujemy wydajność testu masowego odczytu za pomocą syntetycznych mieszanin kropel i cyfrowego testu wielokrotnego wzmacniania przemieszczenia kropelkowego (MDA). Ilościowe MDA szczególnie korzystają z cyfrowego formatu reakcji, ale nasza nowa metoda ma zastosowanie do każdego testu cyfrowego. W przypadku uznanych protokołów testów cyfrowych, takich jak cyfrowy PCR, metoda ta służy przyspieszeniu i uproszczeniu odczytu testu.

Nasza metodologia masowego odczytu przynosi korzyści z testów partycjonowanych bez potrzeby specjalistycznego oprzyrządowania do odczytu. Głównymi ograniczeniami metodologii odczytu masowego są zmniejszony zakres dynamiki w porównaniu z platformami do liczenia kropel oraz potrzeba standardowej próbki, chociaż wymagania dotyczące tego standardu są mniej rygorystyczne niż w przypadku konwencjonalnego eksperymentu w czasie rzeczywistym. Ilościowa amplifikacja całego genomu (WGA) służy do badania zanieczyszczeń w reakcjach WGA i jest najbardziej czułym sposobem wykrywania obecności fragmentów DNA o nieznanych sekwencjach, co daje tej metodzie duże nadzieje w różnych obszarach zastosowań, w tym w farmaceutycznej kontroli jakości i astrobiologii.

Wprowadzenie

Cyfrowe testy do oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych (digital PCR)1-4 i kolejności zasadowej (sekwencjonowania) mają duży wpływ na nauki przyrodnicze i medycynę. Testy cyfrowe zapewniają kwantyfikację liczby molekularnej w skali bezwzględnej (nie w stosunku do kontroli), zapewniając wysoką czułość, umożliwiając łatwe porównania między eksperymentami i, co najważniejsze, umożliwiając budowę dużych baz danych zawierających porównywalne dane5 (Tabela 1).

W ciągu ostatnich 15 lat, amplifikacja całego genomu (WGA) pojawiła się obok PCR jako ogólne narzędzie do amplifikacji kwasów nukleinowych. Podobnie jak PCR, WGA jest przydatny w zastosowaniach analitycznych i preparatywnych poprzez amplifikację drobnych elementów próbki do poziomu, który można łatwo wykryć lub wykorzystać do późniejszych analiz, takich jak sekwencjonowanie zasadowe. W przeciwieństwie do PCR, WGA nie jest specyficzny dla konkretnego locus DNA, a raczej umożliwia amplifikację wszystkich sekwencji w próbce, w tym nieznanych sekwencji. Ta zasadnicza różnica między PCR a WGA sprawia, że metody te wzajemnie się uzupełniają i stwarzają różne wyzwania w ich stosowaniu.

Wysoka wydajność reakcji WGA6 umożliwia rutynową amplifikację genomowego DNA z pojedynczych cząsteczek7, pojedynczych komórek8 i innych próbek o niskiej biomasie9 w celu kwantyfikacji lub dalszej analizy. Głównymi wyzwaniami związanymi z chemią WGA są jej ekstremalna wrażliwość na zanieczyszczenia i nierównomierna amplifikacja w poszczególnych cząsteczkach matrycowych6. Jednak WGA zyskuje na popularności, ponieważ sekwencjonowanie pojedynczych komórek stało się "zabójczym zastosowaniem" technologii WGA10, a kwantyfikacja matryc przez WGA jest ważna w wielu dziedzinach zastosowań7.

Oprzyrządowanie do cyfrowej kwantyfikacji kwasów nukleinowych zostało wcześniej opisane w różnych formatach mikroprzepływowych z zaworami i bez zaworów11-14, w tym w testach kropelkowych15,16 (Tabela 2). Jednak komercyjne systemy mikroprzepływowe do analizy cyfrowej wymagają specjalistycznego sprzętu do ustawiania reakcji i wykrywania produktów17. Niestandardowe mikrofluidyki z zaworami są elastyczne, ale wymagają precyzyjnej mikrofabrykacji i pneumatycznych systemów sterowania18. Chociaż wytwarzanie monodyspersyjnych mikrokropel do testów cyfrowych na bazie emulsji jest stosunkowo proste19,20, odczyt cyfrowy jest technicznie uciążliwy, wymagając albo obrazowania szerokokątnego na dużą skalę (podobnego do popularnych technologii sekwencjonowania nowej generacji)21,22, albo szybkiego wykrywania kropel w oparciu o przepływ23-25. Idealnie byłoby, gdyby test cyfrowy był prosty od konfiguracji do odczytu, zmniejszając potrzebę skomplikowanego oprzyrządowania i umożliwiając szybki odczyt dużej liczby próbek. W tym miejscu opisujemy uproszczoną metodę odczytu cyfrowych testów kropelkowych, która wykorzystuje konwencjonalny instrument do PCR w czasie rzeczywistym do pomiaru fluorescencji masowej cyfrowych testów kropelkowych.

Chociaż nowe podejście może być stosowane do cyfrowych testów PCR, jest szczególnie korzystne dla cyfrowych testów WGA, dla których analogowe testy amplifikacji w czasie rzeczywistym (dające doskonałe wyniki dla PCR) są problematyczne. WGA jest powszechnie stosowany do próbek z cząsteczkami matrycowymi, które są niejednorodne pod względem sekwencji, długości i zawartości zasady. Te różne cząsteczki matrycowe są amplifikowane w różnym tempie6, co wymaga użycia próbki referencyjnej ("standardowej") o pasujących właściwościach. Często taki standard nie jest dostępny lub charakterystyka napływających próbek jest nieznana. Niejednorodność materiału wejściowego i zależne od długości właściwości chemiczne WGA26 również komplikują interpretację wyników, tworząc niejednoznaczność w tym, co jest określane ilościowo – masa wejściowa, liczba wejściowa cząsteczek, kombinacja tych dwóch lub żadne. Wreszcie, niespecyficzność sekwencji sprawia, że ilościowa amplifikacja wielokrotnego przemieszczenia (MDA) jest bardziej wrażliwa na zanieczyszczenie niż ilościowy PCR, ponieważ cząsteczki zanieczyszczeń o dowolnej sekwencji mogą potencjalnie interferować. Cyfrowe testy mikroprzepływowe rozwiązują problem zanieczyszczenia poprzez segregację cząsteczek matrycowych i zmniejszenie objętości reakcji, dzięki czemu pobieranych jest mniej zanieczyszczeń.

Tutaj używamy popularnej metody izotermicznej WGA, MDA27. Warto zauważyć, że kilka innych substancji chemicznych WGA, w tym PicoPlex i MALBAC28, zależy w dużej mierze od początkowych etapów izotermicznego przemieszczania nici. Etapy izotermiczne zwiększają wyzwanie związane z zastosowaniem analogowych testów w czasie rzeczywistym do ilościowego WGA. WGA nie może być ani całkowicie zablokowane podczas konfiguracji, co prowadzi do niepożądanej zmiennej amplifikacji wstępnej, ani dyskretne ("cykliczne") w sposób, w którym replikacja heterogenicznych cząsteczek może być doprowadzona do końca i zatrzymana przed następnym cyklem, takim jak PCR11 (Rysunek 1). Cyfrowy format testu dla WGA uwzględnia typowe procedury konfiguracji reakcji ze względu na segregację każdej cząsteczki do wyliczenia w punkcie końcowym testu (więc wstępna amplifikacja nie wpływa na wyniki), oryginalny odczyt oznacza, że dokładność byłaby w dużej mierze niezależna od zmian w wydajności amplifikacji.

Test zależy od kropelek wytwarzanych w oleju o jednakowych objętościach, ponieważ poziom sygnału na kroplę na końcu testu będzie zależał od objętości kropli, a my nie chcemy, aby spójność wyników zależała od uśredniania w rozkładzie wielkości kropel. Wytwarzanie kropelek monodyspersyjnych jest obecnie standardową procedurą (od 2013 r. opublikowano około 3500 prac na temat kropel monodyspersyjnych), ale wymaga oprzyrządowania mikroprzepływowego25. W rzeczywistości ponad sześć firm opracowało niezależne produkty komercyjne, które opierają się na produkcji takich kropel, a na rynku dostępne są mikroprzepływowe chipy wytwarzające kropelki23,29. W tym badaniu użyliśmy niestandardowych urządzeń mikroprzepływowych wyprodukowanych we własnym zakresie (patrz Protokół). Pompy strzykawkowe do napędzania przepływu przez urządzenia są również dostępne na rynku, ale alternatywnie można je zastąpić pojedynczą jednorazową strzykawką do przepływu napędzanego podciśnieniem w celu obniżenia kosztów30.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Wytwarzanie urządzenia mikroprzepływowego nie jest konieczne do tego testu, ponieważ kropelki dla tego protokołu mogą być formowane z istniejącymi komercyjnymi maszynami do wytwarzania kropel23,29.

1. Zbuduj urządzenie mikroprzepływowe tworzące kropelki

  1. Przygotuj formę wzorcową dla kanałów z protokołem SU-8 Master Fabrication opisanym wcześniej31, ale ze wzorem maski generatora kropel32.
  2. Wytwarzanie urządzeń w PDMS z wykorzystaniem technik miękkiej litografii32,33.

2. Przygotuj mieszaninę reakcyjną do odczytu kropel zbiorczych


Uwaga: Protokół może być stosowany do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych przy użyciu wielu rodzajów reakcji amplifikacji. Jako przykład podano odczynniki potrzebne do MDA o kilku stężeniach DNA Lambda. Szczegółowe informacje na temat odczynników znajdują się w Tabeli Odczynników Specyficznych. Rozmieszczenie matrycy w kropelkach zależy od wystarczającego wymieszania próbki.

  1. Otrzymać lub oczyścić polimerazę DNA Phi29.
    1. Oczyść Phi29 zgodnie z wcześniejszym opisem7 lub kup od dostawcy. Phi29 użyty w pokazanych eksperymentach został oczyszczony.
  2. Przygotuj 10 ml buforu denaturacyjnego składającego się z 65 mM KOH, 1,65 mM EDTA i 14 mM DTT.
  3. Przygotować 10 ml buforu neutralizacyjnego składającego się z 65 mM HCl, 0,21 M Tris-Cl pH 7,0 i 9 mM Tris-Cl pH 8,0.
  4. Przygotuj dwa wzorce, jeden bez kontroli matrycy (NTC), taki jak woda wolna od nukleaz, i jeden o wysokim stężeniu matrycy (około 4 pg/μl DNA Lambda). Denaturacja 3,3 μl każdego wzorca za pomocą 3,3 μl buforu denaturacyjnego w probówce qPCR. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Ugasić każdy z 3,3 μl buforu neutralizującego.
  5. Denaturować 3,3 μl interesującej nas matrycy za pomocą 3,3 μl buforu denaturacyjnego w probówce qPCR. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Ugasić 3,3 μl buforu neutralizującego.
  6. Przygotować 11 μl mieszaniny wzorcowej na próbkę na lodzie. Mieszanina 2x MDA składa się z 2x barwnika wiążącego dwuniciowe DNA (dsDNA), 2x barwnika referencyjnego qPCR, 50 μM randomizowanego oligogo, 2 mg / ml BSA, 2x buforu reakcyjnego polimerazy DNA Phi29, 4,8 mM dNTP, wody wolnej od nukleaz i 40 μg / ml polimerazy DNA Phi29. Dodaj polimerazę DNA Phi29 na końcu, aby upewnić się, że polimeraza nie napotka poziomu pH znacznie wyższego lub niższego niż 7,5. Dobrze wymieszaj.
  7. Opcjonalnie: Aby uzyskać mniej wyników fałszywie dodatnich, przed utworzeniem kropel należy naświetlić mieszankę wzorcową światłem UV34.
    1. Przygotować 10 μl mieszaniny wstępnej na próbkę w przezroczystej probówce o pojemności 0,5 ml lub 1,5 ml na lodzie. Mieszanka wstępna składa się z 55 μM randomizowanego oligo, 2,2 mg / ml BSA, 1,1x buforu reakcyjnego polimerazy DNA Phi29, 5,3 mM dNTP i wody wolnej od nukleaz.
    2. Umieścić probówkę w wodzie na lodzie zgodnie z opisem34 i wystawić na działanie światła UV (254 nm) o skumulowanej dawce 5,7 J/cm2.
    3. Dodaj barwnik wiążący dsDNA do 1x, barwnik referencyjny do 1x i Phi29 do 40 μg/ml w mieszaninie wstępnej. Dobrze wymieszaj.
  8. Połączyć 10 μl denaturowanej matrycy lub wzorca i 10 μl mieszanki wzorcowej. Dobrze wymieszaj.

3. Tworzenie się kropel

Uwaga: Kropelki mogą być bardzo wrażliwe na elektryczność statyczną i naprężenia ścinające. Usuń ubrania, które mogą powodować elektryczność statyczną i uziemij się przed utworzeniem kropel. Z tubkami z emulsją należy obchodzić się od góry tuby, jak najdalej od emulsji. Emulsje pipetować bardzo powoli, najlepiej końcówką do pipety o szerokim otworze. Podczas dozowania z końcówki do pipet należy obserwować emulsję z boku końcówki, aby określić prędkość pipetowania.

  1. Tworzą kropelki. W przedstawionych eksperymentach urządzenie mikroprzepływowe ma wlot oleju i dwa wloty wodne ze złączem skupiającym przepływ do generowania kropel. Użyj dwóch pomp strzykawkowych, aby kontrolować natężenie przepływu 55 μl oleju ze środkiem powierzchniowo czynnym i 20 μl mieszaniny reakcyjnej przez chip mikroprzepływowy, aby wytworzyć 20 000 kropelek o mocy 1 NL.
  2. Uwaga: Możliwe jest wytwarzanie kropelek z wieloma rodzajami oleju ze środkiem powierzchniowo czynnym, ale skład znacznie wpłynie na stabilność kropel w wysokich temperaturach i z upływem czasu. Jedną z możliwych kombinacji jest olej fluorowany HFE 7500 z anionowym środkiem powierzchniowo czynnym19,35.
  3. Wytwarzać kropelki o dowolnej wielkości dowolną metodą13,36, ale zmienność wielkości w populacji kropelek będzie miała wpływ na fluorescencję objętościową, a tym samym na dokładność testu. W przedstawionych eksperymentach kropelki były monodyspersyjne o objętości 1 nl.
  4. Zbierz wszystkie kropelki i olej do probówek PCR. Dla każdej próbki należy przelać 30 μl oleju do świeżych probówek PCR z nasadkami optycznymi i przenieść 20 μl kropelek na wierzch oleju. Stałe objętości zapewniają, że test jest tak dokładny, jak to tylko możliwe.
  5. Zamknij szczelnie nakrętki rurki, ponieważ luźne nakrętki pozwolą na odparowanie oleju.

4. Wzmocnienie izotermiczne

  1. Za pomocą termocyklera PCR, termocyklera qPCR lub płyty grzejnej inkubować próbki w temperaturze 30 °C przez 7 godzin i inaktywować przez 1 minutę w temperaturze 75 °C. W tym momencie rurki z kropelkami można pozostawić w lodówce przykrytej folią na kilka godzin.

5. Akwizycja i analiza danych

  1. Natychmiast po inaktywacji reakcji zmierz poziomy fluorescencji barwnika dla wszystkich próbek za pomocą termocyklera qPCR. Optymalne ustawienia filtra będą zależeć od widm wzbudzenia i emisji barwnika. W tym przykładzie użyj zestawu filtrów 492 nm-516 nm dla barwnika wiążącego dsDNA i zestawu filtrów 585 nm-610 nm dla barwnika referencyjnego. Do ilościowego określenia fluorescencji można zastosować inne fluorescencyjne techniki pomiarowe.
  2. Dla każdej próbki należy podzielić intensywność fluorescencji barwnika wiążącego dsDNA przez intensywność fluorescencji barwnika wzorcowego. Odejmij fluorescencję tła lub znormalizowaną fluorescencję kontroli bez matrycy od wszystkich próbek.
  3. Utwórz liniową krzywą standardową, korzystając z skorygowanych pomiarów fluorescencji z wzorców. Wzorzec NTC reprezentuje fluorescencję dla próbki z 0% fluorescencyjnymi kropelkami ("wszystkie ujemne"), a pomiar fluorescencji o wysokim stężeniu matrycy jest oczekiwaną fluorescencją dla próbki ze 100% fluorescencyjnymi kropelkami ("wszystkie dodatnie"). Korzystając z odpowiedniej krzywej wzorcowej, przewiduj pośrednie stosunki dodatnich i ujemnych kropel na podstawie ich fluorescencji objętościowej.

6. Wytwarzanie kropel do pomiarów potwierdzających zasadność

  1. Wytwarzanie kropelek fluorescencyjnych (dodatnich): Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR składającą się z 0,1 ng DNA Lambda, 1x barwnika wiążącego dsDNA, 1x barwnika referencyjnego, 1,5 jednostki polimerazy Taq DNA, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP i 0,5 μM starterów. Poddać mieszaninę cyklowi termicznemu 30 razy (95 °C przez 20 sekund, 55 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 1 minutę), a następnie uformować kropelki, jak opisano powyżej.
  2. Wytwarzanie niefluorescencyjnych (ujemnych) kropel: Przygotuj mieszaninę reakcyjną PCR składającą się z 1x barwnika wiążącego dsDNA, 1x barwnika referencyjnego, 1,5 jednostki polimerazy Taq DNA, 10 mM Tris-HCl, 50mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP i 0,5 μM starterów. Mieszaninę należy poddać cyklowi termicznemu 30 razy (95 °C przez 20 sekund, 55 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 1 minutę), a następnie utworzyć kropelki.
  3. Tworzenie wstępnie zmieszanych proporcji kropel
    1. Rozprowadzić 20 μl oleju fluorowanego do probówek qPCR, przykryć nasadką optyczną, aby zapobiec parowaniu.
    2. Delikatnie odpipetować 10 μl dobrze wymieszanych kropelek w pożądanych proporcjach dodatnich i ujemnych na wierzchu oleju. W pokazanych wynikach stosunek liczby kropel dodatnich do ujemnych wynosił 1 (wszystkie dodatnie), 0,8, 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001, 0,0001 i 0 (wszystkie ujemne).
  4. Zmierz poziomy fluorescencji barwnika dla wszystkich próbek za pomocą termocyklera qPCR. W przypadku tego protokołu należy użyć zestawu filtrów 492 nm-516 nm dla barwnika wiążącego dsDNA oraz zestawu filtrów 585 nm-610 nm dla barwnika referencyjnego.
    1. Normalizuj fluorescencję barwnika wiążącego dsDNA za pomocą fluorescencji barwnika referencyjnego. Dalszą normalizację przez fluorescencję "całkowicie dodatniej" próbki.
  5. Utwórz liniową krzywą wzorcową, korzystając ze znormalizowanych pomiarów fluorescencji z próbek "wszystkie dodatnie" i "wszystkie ujemne". Korzystając z odpowiedniej krzywej wzorcowej, przewiduj pośrednie stosunki dodatnich i ujemnych kropel na podstawie ich fluorescencji objętościowej.
  6. Powtórzyć doświadczenie dla każdego stosunku (n = 3) z niezależnym tworzeniem kropel i mieszaniem dla każdej kontrpróby.

7. Eksperyment MDA potwierdzający słuszność zasady

  1. Zmierzyć stężenie roztworu podstawowego DNA Lambda za pomocą spektrofotometru.
    1. Obliczyć stężenie matrycy niezbędne do uśrednienia 10 cząsteczek matrycy na kroplę. W przypadku tego protokołu załóżmy, że objętość kropel wynosi 1 nl, a 1 ng DNA Lambda zawiera około 1,9 x 107 kopii. Dlatego 10 matryc na kroplę będzie równać się 10 kopiom na nl, czyli 526 fg Lambda DNA na μl. Matryca zostanie rozcieńczona ~6x, gdy utworzą się kropelki, dlatego początkowe najwyższe stężenie matrycy wyniesie 3,2 pg/μl.
  2. Seryjnie rozcieńczyć DNA Lambda do 3,2 pg/μl za pomocą buforu denaturacyjnego i buforu neutralizacyjnego o równej objętości. Aby uzyskać współczynnik rozcieńczenia 0,1, połączyć 10 μl próbki z 45 μl buforu denaturacyjnego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Dodać 45 l buforu neutralizującego do ugaszenia.
  3. Dalej rozcieńczyć próbkę zgodnie z opisem w kroku 7.2, aby uzyskać resztę próbek do doświadczenia. Początkowe stężenia matryc w pokazanych reakcjach wynosiły 3,2 pg, 320 fg, 160 fg, 32 fg, 16 fg, 3,2 fg i 1,6 fg na mikrolitr.
    Uwaga: Końcowe stężenia matryc po dodaniu mastermixu wynosiły 526 fg, 52,6 fg, 26,3 fg, 5,26 fg, 2,63 fg, 526 ag i 263 ag na mikrolitr. Oczekiwane kopie lambda na kroplę wynoszą odpowiednio 10, 1, 0,5, 0,1, 0,01 i 0,005 kopii lambda.
  4. Wygeneruj i przeanalizuj kropelki z każdej próbki zgodnie z opisem w krokach 2.5-5.3.
  5. Uzyskaj pokazane obrazy fluorescencyjne (rysunek 2,3) za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie epifluorescencyjnym z obiektywem 10x przy RT. Uzyskaj dwanaście pól widzenia dla każdej próbki. Koryguj obrazy fluorescencyjne za pomocą obrazu tła uzyskanego za pomocą szkiełka fluorescencyjnego.
  6. Do obrazowania37 należy użyć zamkniętej komory, ponieważ olej emulsyjny szybko odparuje.
  7. Analizuj intensywność poszczególnych kropel za pomocą makra ImageJ (plik kodu uzupełniającego).
    1. Wybierz progową intensywność fluorescencji, która najlepiej oddziela niefluorescencyjne kropelki na obrazach NTC od kropelek fluorescencyjnych na obrazach o wysokim stężeniu matrycy. Dla każdej nieznanej próbki należy obliczyć frakcję kropelek o intensywności fluorescencji powyżej wartości progowej.

8. Masowe reakcje PCR i MDA

  1. Przygotuj reakcję PCR.
    1. Seryjnie rozcieńczony matrycowy DNA o współczynniku rozcieńczenia 0,1. Dla każdego rozcieńczenia połączyć 10 μl matrycy z 45 μl buforu denaturacyjnego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Połączyć rozcieńczenie z 45 μl buforu neutralizującego.
    2. Przygotować 20 μl PCR mastermix na próbkę. Główna mieszanina reakcji 1,1x PCR składa się z 60 jednostek/μl polimerazy DNA Taq, 11 mM Tris-HCl, 55 mM KCl, 1,65 mM MgCl2, 0,22 mM dNTP, 1,1x barwnika wiążącego dsDNA, 1,1x barwnika referencyjnego i 550 nM każdy starter.
    3. Połączyć 2 μl rozcieńczonej matrycy i 20 μl mastermix.
      Uwaga: Końcowe stężenia matryc w pokazanych reakcjach PCR wynosiły 50 pg, 5 pg, 500 fg, 50 fg, 5 fg, 500 ag i 0 g Lambda DNA na mikrolitr i przeprowadzono je w trzech egzemplarzach.
    4. Termocykl reakcji PCR w maszynie qPCR z następującym programem. Uruchomić 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 30 sekund, 57 °C przez 20 sekund, 72 °C przez 30 sekund, a następnie 2 minuty w temperaturze 72 °C przez 2 minuty i utrzymać w temperaturze 4 °C.
    5. Normalizuj fluorescencję barwnika wiążącego dsDNA za pomocą fluorescencji barwnika referencyjnego przed dalszą analizą.
  2. Przygotuj reakcję MDA.
    1. Rozcieńczyć próbki zgodnie z opisem w kroku 8.1.1.
    2. Przygotować 11 μl mieszaniny wzorcowej na próbkę na lodzie. Mieszanina główna reakcji 2x MDA składa się z 2x barwnika wiążącego dsDNA, 2x barwnika referencyjnego, 50 μM randomizowanego oligo, 2 mg / ml BSA, 2x buforu reakcyjnego polimerazy DNA phi29, 4,8 mM dNTP, wody wolnej od nukleaz i 40 μg / ml polimerazy DNA Phi29.
    3. Na koniec dodać polimerazę DNA Phi29 do 40 μg/ml, aby upewnić się, że polimeraza nie napotka poziomu pH znacznie wyższego lub niższego niż 7,5. Dobrze wymieszaj.
    4. Denaturować 3,3 μl rozcieńczonej matrycy za pomocą 3,3 μl buforu denaturacyjnego w probówce qPCR. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Dodać 3,3 μl buforu neutralizującego.
    5. Połączyć 10 μl denaturowanej matrycy i 10 μl mieszanki wzorcowej. Dobrze wymieszaj.
    6. Uruchom reakcję MDA w maszynie qPCR za pomocą następującego programu.
    7. Utrzymywać w temperaturze 30 °C przez 4 godziny, mierzyć fluorescencję co 7,5 minuty.
    8. Dezaktywować w temperaturze 75 °C przez 1 min.
    9. Normalizuj fluorescencję barwnika wiążącego dsDNA za pomocą fluorescencji barwnika referencyjnego. Dalej normalizować przez maksymalną fluorescencję dla każdej próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Choć konwencjonalne odczyty zbiorcze/w czasie rzeczywistym mogą być stosowane zarówno w ilościowej PCR, jak i w ilościowych testach WGA (Rysunek 1), cyfrowe testy ilościowe zapewniają określone korzyści (Tabela 1). W opisanej metodzie odczytujemy testy cyfrowe w formacie mikrokropel za pomocą prostego zbiorczego pomiaru punktu końcowego (Rysunek 2). Chociaż metoda ta ma szerokie zastosowanie, skupiamy się na ilościowej WGA (MDA), ponieważ metoda ta stawia szczególne wyzw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Testy cyfrowe to potężne metody, które umożliwiają wykrywanie rzadkich komórek i zliczanie pojedynczych cząsteczek kwasu nukleinowego. Jednak testy cyfrowe nadal nie są rutynowo stosowane w laboratoriach analitycznych, częściowo ze względu na koszt specjalistycznego sprzętu związanego z dostępnymi na rynku metodami. W tym miejscu opisujemy cyfrowy test punktu końcowego do ilościowego oznaczania kwasów nukleinowych z uproszczonym odczytem analogowym przy użyciu standardowej ilościowej maszyny do PCR w czasie rzeczywistym....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Broad Institute może złożyć wniosek patentowy, który obejmuje aspekty tej pracy.

Podziękowania

Autorzy dziękują Liyi Xu za dostarczenie odczynników i protokołów MDA. Dziękujemy również Davidowi Feldmanowi i Navpreetowi Ranu za dyskusje związane z tą pracą. Praca ta została częściowo wsparta nagrodą Burroughs Wellcome Career Award na Scientific Interface to PCB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Evagreen DyeBiotium31000
Albumina surowicy bydlęcejNew England BiotechnologiesB9000S
Phi29 Bufor reakcyjny polimerazy DNANew England BiotechnologiesB0269SWirować okresowo, aż agregat się rozpuści
Lambda DNANew England BiotechnologiesN3011SPodgrzany do 50 oC i wygaszony lód przed rozcieńczeniem
Randomizowane oligonukleotydy MDAZintegrowane technologieStartery 5'-NNNNN*N-3'PCR
Zintegrowane technologie DNA 5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3' i 5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'
UltraPure Woda wolna od nukleazLife Technologies10977-015Poddawana działaniu promieni UV przez 30 minut w Stratalinker 2400 przed użyciem (opcjonalnie)
Barwnik referencyjny ROXLife Technologies12223-012
Nasadki na paski optyczne do PCRLife Technologies4323032
Probówki do PCRAgilent Technologies401428
dNTP (25 mikromolowców każda)Agilent Technologie200415
Termocykler - system qPCR Mx3000PAgilent Technologies401403
Barierowe końcówki do pipetVWR89003-046
Olej Bio-rad do evagreenBio-rad186-4005
JumpStart Taq ReadyMixSigma-AldrichP2893-100RXN
DNA

Bibliografia

  1. Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution. Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).
  2. Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
  3. Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 96 (16), 9236-9241 (1999).
  4. Day, E., Dear, P. H., McCaughan, F. Digital PCR strategies in the development and analysis of molecular biomarkers for personalized medicine. Methods. 59 (1), 101-107 (2013).
  5. Tatusova, T., Ciufo, S., Fedorov, B., O'Neill, K., Tolstoy, I. RefSeq microbial genomes database: new representation and annotation strategy. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D553-D559 (2014).
  6. Blainey, P. C. The future is now: single-cell genomics of bacteria and archaea. FEMS Microbiol. Rev. 37 (3), 407-427 (2013).
  7. Blainey, P. C., Quake, S. R. Digital MDA for enumeration of total nucleic acid contamination. Nucleic Acids Res. 39 (4), e19(2011).
  8. Blainey, P. C., Quake, S. R. Dissecting genomic diversity, one cell at a time. Nat. Methods. 11 (1), 19-21 (2014).
  9. Binga, E. K., Lasken, R. S., Neufeld, J. D. Something from (almost) nothing: the impact of multiple displacement amplification on microbial ecology. ISME J. 2 (3), 233-241 (2008).
  10. Method of the Year 2013. Nature Methods. 11 (1), 1(2014).
  11. Ottesen, E. A., Hong, J. W., Quake, S. R., Leadbetter, J. R. Microfluidic digital PCR enables multigene analysis of individual environmental bacteria. Science. 314 (5804), 1464-1467 (2006).
  12. OpenArray Technology Overview. , Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-openarray/open-array-technology.html (2014).
  13. Shen, F., Du, W., Kreutz, J. E., Fok, A., Ismagilov, R. F. Digital PCR on a SlipChip. Lab Chip. 10 (20), 2666-2672 (2010).
  14. Heyries, K. A., et al. Megapixel digital PCR. Nat. Methods. 8 (8), 649-651 (2011).
  15. Dressman, D., Yan, H., Traverso, G., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Transforming single DNA molecules into fluorescent magnetic particles for detection and enumeration of genetic variations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (15), 8817-8822 (2003).
  16. Kiss, M. M., et al. High-throughput quantitative polymerase chain reaction in picoliter droplets. Anal. Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).
  17. Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nat. Methods. 9 (6), 3(2012).
  18. Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics. Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).
  19. Lee, M., et al. Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics. Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).
  20. Rhee, M., et al. Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems. Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).
  21. Hatch, A. C., et al. 1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR. Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).
  22. Illumina. , Technology. http://www.illumina.com/technology.html (2014).
  23. Droplet digital PCR applications guide. , Bio-Rad. Available from: http://www.bio-rad.com/en-us/category/digital-pcr (2014).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. A. Droplet microfluidics for high-throughput biological assays. Lab Chip. 12 (12), 2146-2155 (2012).
  26. Lage, J. M., et al. Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH. Genome Res. 13 (2), 294-307 (2003).
  27. Dean, F. B., et al. Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (8), 5261-5266 (2002).
  28. Zong, C., Lu, S., Chapman, A. R., Xie, X. S. Genome-wide detection of single-nucleotide and copy-number variations of a single human cell. Science. 338 (6114), 1622-1626 (2012).
  29. Mitos Dropix Systems. , Dolomite. http://www.dolomite-microfluidics.com/webshop/mitos_dropix_system (2014).
  30. Abate, A. R., Weitz, D. A. Syringe-vacuum microfluidics: A portable technique to create monodisperse emulsions. Biomicrofluidics. 5, 14107(2011).
  31. Eyer, K., Kuhn, P., Stratz, S., Dittrich, P. S. A microfluidic chip for the versatile chemical analysis of single cells. J Vis Exp. (80), e50618(2013).
  32. Fainman, Y. Optofluidics : fundamentals, devices, and applications. , McGraw-Hill. (2010).
  33. Xia, Y. W. G.M. Softlithographie. Angew Chem. 110 (5), 26(1998).
  34. Woyke, T., et al. Decontamination of MDA reagents for single cell whole genome amplification. PLoS One. 6 (10), e26161(2011).
  35. System for hot-start amplification via a multiple emulsion. US patent. , (2014).
  36. Utada, A. S., et al. Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device. Science. 308 (5721), 537-541 (2005).
  37. Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR. PLoS One. 8 (4), e62961(2013).
  38. Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device. PLoS One. 3 (8), e2876(2008).
  39. Shen, F., et al. Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load. J Am. Chem. Soc. 133 (44), 17705-17712 (2011).
  40. Link, D. R., Anna, S. L., Weitz, D. A., Stone, H. A. Geometrically mediated breakup of drops in microfluidic devices. Phys. Rev. Lett. 92 (5), 054503(2004).
  41. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  42. Romanowsky, M. B., Abate, A. R., Rotem, A., Holtze, C., Weitz, D. A. High throughput production of single core double emulsions in a parallelized microfluidic device. Lab Chip. 12 (4), 802-807 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analizy cyfrowefluorescencja zbiorczaanalizy cyfrowe w kropelkachinstrument do PCR w czasie rzeczywistymtworzenie kropelekpomiar fluorescencjianaliza krzywej wzorcowejilo ciowe MDAamplifikacja ca ego genomukwantyfikacja kropelek
Prosty masowy odczyt cyfrowych testów ilościowych kwasów nukleinowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.