Implantacja pomp miniosmotycznych i dostarczanie znaczników dróg oddechowych w celu zbadania reorganizacji mózgu w stanach patofizjologicznych

Podsumowanie

Aby zbadać reorganizację mózgu w warunkach patologicznych, użyliśmy pomp miniosmotycznych do bezpośredniego dostarczania białka do mózgu, omijając barierę krew-mózg. Następnie wstrzykuje się znaczniki dróg oddechowych w celu zbadania zmian w połączeniach mózgowych pod wpływem białka.

Streszczenie

Leczenie farmakologiczne w zwierzęcych modelach choroby mózgu narzuca problem powtarzających się protokołów iniekcji, które mogą wywoływać stres u zwierząt i skutkować nietrwałym poziomem leku w tkankach. Dodatkowo dostarczanie leków do mózgu jest delikatne ze względu na barierę krew-mózg (BBB), co znacznie zmniejsza domózgowe stężenia selektywnych leków po podaniu ogólnoustrojowym. W związku z tym system, który umożliwia zarówno stałe dostarczanie leków bez szczytowych stężeń, jak i obchodzenie bariery krew-mózg, ma na celu osiągnięcie wystarczająco wysokich stężeń domózgowych leków, które są nieprzepuszczalne dla bariery krew-mózg. W tym kontekście, pompy miniosmotyczne stanowią idealny system do ciągłego dostarczania leków w ustalonym, znanym tempie, który pozwala uniknąć problemu codziennego stresu związanego z iniekcjami u zwierząt i który może być również wykorzystywany do bezpośredniego dostarczania leków do mózgu. W tym miejscu opisujemy metodę implantacji pompy miniosmotycznej i opieki pooperacyjnej, którą należy zapewnić zwierzętom, aby skutecznie zastosować tę technikę. Osadzamy wyżej wymieniony paradygmat eksperymentalny w standardowych procedurach, które są używane do badania neuroplastyczności w mózgu myszy C57BL6. W ten sposób wystawiliśmy zwierzęta na 30-minutowy zawał mózgu i wszczepiliśmy im pompy miniosmotyczne połączone z czaszką za pomocą kaniuli w celu dostarczenia leku proplastycznego. Testy behawioralne przeprowadzono podczas 30 dni leczenia. Po usunięciu zwierzętom podano zastrzyki ze znaczników dróg następczych w celu analizy plastyczności neuronalnej w przewlekłej fazie rekonwalescencji. Wyniki wskazują, że neuroprotekcji przez podawany lek towarzyszył wzrost włókien ruchowych przecinających linię środkową mózgu w strukturach docelowych. Wyniki potwierdzają wartość tych technik w badaniach nad podawaniem leków i plastycznością mózgu we współczesnej neurobiologii.

Wprowadzenie

Dostarczanie białek i związków farmakologicznych do mózgu to ważne strategie badania mechanizmów leżących u podstaw chorób mózgu i oceny potencjalnych cząsteczek do nowych terapii ^1,2. W neuronaukach eksperymentalnych dostarczanie wektorów, takich jak plazmidy lub adenowirusy, stało się ważnym narzędziem do badania długoterminowych działań białek w mózgu ^3,4. Pojedyncze wstrzyknięcia wektorów mają tę zaletę, że system sam w sobie utrzymuje bardzo stabilny poziom środka terapeutycznego w mózgu ⁴. Jednak w przypadku długotrwałych eksperymentów z oczyszczonymi lekami ogólnoustrojowe podawanie przez wstrzyknięcie dootrzewnowe wywołuje stres u myszy lub szczurów i nie jest najlepszym wyborem, gdy potrzebna jest ukierunkowana reakcja mózgu, wymagająca również dużych dawek leku⁵. Pompy miniosmotyczne stanowią idealny system do długotrwałego bezpośredniego dostarczania leku do mózgu, omijając zarówno niską dostępność do mózgu, jak i szczyty stężenia leku, ponieważ dostarczanie leku odbywa się bezpośrednio do docelowego miejsca w mózgu i przy stałym natężeniu przepływu określonym przez wybrany model pompy^2,6,7. Rzeczywiście, system ten pozwolił nam z powodzeniem badać regenerację mózgu po udarze poprzez dostarczanie kilku leków, takich jak rekombinowana ludzka erytropoetyna (rhEpo) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego ^6,7.

Plastyczność mózgu jest niezbędna do przeprogramowania połączeń w odpowiedzi na urazy mózgu. Plastyczność to szerokie pojęcie, które obejmuje tworzenie lub eliminowanie kontaktów synaptycznych, wzrost kolców dendrytycznych, a także wydłużanie lub cofanie połączeń na duże odległości^8,9. Wcześniej uważano, że mózg nie jest w stanie zrekonstruować połączeń po zmianie. Jednak wiele podejść wykazało, że jeśli jest odpowiednio stymulowany, może przywrócić łączność ^6,7,10. Jedną z technik, która jest szczególnie przydatna do badania tego zjawiska, jest stosowanie znaczników dróg oddechowych. Znaczniki dróg następczych to związki, które mogą wnikać do neuronów w somie, a następnie rozprowadzać się wzdłuż aksonów, aż dotrą do docelowych struktur. Dwa przykłady to błękit kaskadowy (CB) i biotynylowana dekstran amina (BDA). I odwrotnie, znaczniki dróg wstecznych, takie jak toksyna B (CTB) lub fluorogold (FG), dostają się do neuronu przez zakończenie aksonu, a następnie rozprowadzają się z powrotem do somy, ujawniając w ten sposób miejsce pochodzenia neuronów celujących w miejsce wstrzyknięcia.

Tutaj prezentujemy metody, których używamy do implantacji pomp miniosmotycznych do bezpośredniego dostarczania białek lub leków, które mają potencjalny wpływ na plastyczność neuronalną, a także wstrzykiwania BDA i FG w celu odsłonięcia połączeń wejściowych i wyjściowych do kory ruchowej. BDA zostanie również wykorzystany jako przykład znacznika drogowego stosowanego do wykazania zwiększonej plastyczności aksonów wyłaniających się z co po udarze mózgu pod leczeniem rhEpo.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą rządu (G1361/13, AZ84-02.04.2013.A192 i G1362/13, AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierung Düsseldorf) w oparciu o wytyczne NIH dotyczące opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie pomp miniosmotycznych

1. W sterylnym środowisku (tj. kapturze do hodowli komórkowych) należy zaopatrzyć się w pompę, cewnik, moderator przepływu, kaniulę infuzyjną mózgu i krążki dystansowe, które mają być użyte (ryc. 1).
2. Do podawania leków bezpośrednio do komór należy użyć jednego krążka dystansowego, tak aby tylko końcówka igły kaniuli stykała się z komorą. Przytrzymaj kaniulę do góry nogami za pomocą kleszczy. Dodaj dwie krople kleju cyjanoakrylowego (CA) i wprowadź jeden krążek dystansowy.
3. Pozostaw kaniulę na płaskiej powierzchni skierowanej do góry, aby klej między krążkiem dystansowym a kaniulą wyschł.
4. Przeciąć cewnik na odcinki około 2,5 cm.
5. Dla każdej pompy należy przygotować co najmniej 300-350 μl roztworu, który Cię interesuje, ponieważ będzie on potrzebny do całkowitego napełnienia pompy, a tym samym wytłoczenia całego powietrza z jej wnętrza, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków w cewniku. Bąbelki utrudniają przepływ roztworu do mózgu.
6. Ostrożnie podłącz cewnik do moderatora przepływu.
7. Za pomocą strzykawki o pojemności 2 ml podłączonej do igły dołączonej do zestawu do infuzji mózgu, należy napełniać pompę do momentu, aż niewielka ilość roztworu wydostanie się z pompy, zapobiegając w ten sposób przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do jej wnętrza.
8. Ostrożnie napełnij moderator przepływu i cewnik, zwracając uwagę, aby nie pozostały pęcherzyki wewnątrz cewnika.
9. Wprowadzić moderator przepływu do wnętrza pompy.
10. Po napełnieniu ostrożnie podłącz kaniulę do końca cewnika. Jeśli zaobserwuje się, że tworzy się pęcherzyk, wyjmij kaniulę i ostrożnie napełnij cewnik roztworem nośnika lub leku, a następnie ponownie wprowadź kaniulę.
11. Umieścić pompę w pojemniku ze sterylnym roztworem soli fizjologicznej i pozostawić w temperaturze 37 °C O/N.
12. Przed implantacją należy ponownie sprawdzić, czy nie tworzą się pęcherzyki. W razie potrzeby (tj. zaobserwowano pęcherzyki) wyjmij kaniulę i ponownie napełnij probówkę. Podłącz ponownie kaniulę. Powinno to zająć tylko kilka mikrolitrów roztworu.

2. Implantacja pomp miniosmotycznych

Uwaga: W tych eksperymentach zwierzęta były znieczulane 1% izofluranem (30% O₂, 70% N₂O). Jeśli jednak nie jest to możliwe, możliwe jest również zastosowanie dootrzewnowych iniekcji znieczulających¹¹.

1. Zlokalizuj zwierzę w urządzeniu stereotaktycznym pod narkozą i zakryj oczy maścią ochronną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Potwierdź znieczulenie, obserwując brak reakcji w tylnej łapie po naciśnięciu palcami lub kleszczami. Nie kontynuuj, dopóki zwierzę całkowicie nie zaśnie.
2. Przytnij futro nad głową nożyczkami lub maszyną do golenia. Wytnij jak najwięcej, nie uszkadzając skóry.
3. Oczyść skórę 70% etanolem i środkiem dezynfekującym o właściwościach przeciwbakteryjnych i grzybobójczych.
4. Skalpelem otwórz 1 cm nacięcie lekko na prawo od linii środkowej i odsłoń czaszkę.
5. Oczyść czaszkę bawełnianym wacikiem. Namocz go 70% etanolem i przełóż na czaszkę. To skłoni czaszkę do wyschnięcia.
6. Jeśli czaszka ma lekkie krwawienie, użyj kauteryzatora, aby wyeliminować wszelkie punkty krwawienia. Krew zapobiega prawidłowemu wysuszeniu CA nad kością po wszczepieniu kaniuli.
7. Użyj urządzenia stereotaktycznego, aby zaznaczyć punkt czaszki, w którym zostanie wszczepiona kaniula. W przypadku wlewów komorowych na lewej półkuli współrzędne wynoszą -0,2 mm ogonowo, 0,9 mm bocznie do bregmy (ryc. 2A).
8. Delikatnie nawiercić nad czaszką, ustawiając ją pod kątem 45°, zapobiegając przypadkowemu wejściu wiertła do mózgu. Kilkakrotnie wiercić przez kilka sekund, a następnie sprawdź, jak głęboki jest otwór. Przerwij wiercenie, gdy czaszka zostanie przerzedzona, ale nadal nie w pełni spenetrowana.
9. Rozbij opony mózgowe końcówką sterylnej igły, aż do uzyskania pełnego dostępu do mózgu. Rób to delikatnie, aby nie uszkodzić mózgu.
10. Oczyść czaszkę 70% etanolem za pomocą bawełnianego wacika.
11. Wprowadź proste kleszcze pod skórę zwierzęcia w kierunku przednio-ogonowym. Użyj kleszczy, aby otworzyć przestrzeń pod skórą z tyłu zwierzęcia, w której zostanie wszczepiona pompa. Wprowadzić pompę do tylnej części zwierzęcia, pozostawiając cewnik i kaniulę na zewnątrz (Rysunek 2B). Pompa pozostanie w tej pozycji, dopóki nie zostanie usunięta i nie będzie wymagała żadnego mocowania.
12. Ostrożnie umieść cztery małe krople kleju obok igły w kaniuli.
13. Ostrożnie wprowadzić igłę przez czaszkę, nie przesuwając jej na boki. Przytrzymaj go w tej pozycji przez 15-30 sekund, aż kaniula zostanie całkowicie przymocowana (Rysunek 2C.1). Po umieszczeniu na miejscu kaniula osiągnie 2,5 mm w kierunku grzbietowo-brzusznym, jeśli użyto jednego krążka dystansowego. Jeśli kaniula zostanie prawidłowo zamocowana, pozostanie przymocowana do kości do końca eksperymentu.
14. Umieść jeden palec na zdejmowanej zakładce, a następnie drugą ręką odetnij ją za szyję za pomocą zestawu nożyczek (Rysunek 2C.2).
15. Zamknij ranę na skórze szwem 5-0 i dodaj kilka kropli roztworu jodu powidonu (PVP-I) na wierzch rany, aby zapobiec infekcji (ryc. 2D).
16. Przenieś zwierzę do nowej klatki. Nie umieszczaj operowanych zwierząt ze zwierzętami, które jeszcze nie były operowane. Zwierzęta, którym wszczepiono pompy, należy trzymać same w klatkach na czas podawania leku.
17. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki się nie obudzą i nie odzyskają pozycji leżącej mostka.

3. Demontaż pompy

Uwaga: Zazwyczaj eksperyment kończy się na końcu czasu dostarczania dozwolonego przez pompę, jednak możliwe jest usunięcie pompy w celu przeprowadzenia dodatkowych eksperymentów jako kontynuacji dostarczania leku. W celu wykonania iniekcji znacznika drogowego konieczne jest zatem usunięcie pompy.

1. Umieść zwierzę w urządzeniu seeteraktycznym pod narkozą i przykryj oczy maścią ochronną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Potwierdź znieczulenie, obserwując brak reakcji w tylnej łapie po naciśnięciu palcami lub kleszczami. Nie kontynuuj, dopóki zwierzę całkowicie nie zaśnie.
2. Ostrożnie otwórz skórę, przecinając nacięcie wykonane w dniu implantacji pompy.
3. Za pomocą zacisku chirurgicznego przytrzymaj kaniulę i wyciągnij ją. Powinien być łatwo usunięty z czaszki. Ponieważ spodziewane jest delikatne krwawienie, zatrzymaj je, przykładając bawełniany wacik i odczekaj 1-2 minuty.
4. Wyciągnąć pompę za cewnik. Pomóż mu wyjść, popychając go, wywierając nacisk na skórę.
5. Ponownie zamknij ranę szwem 5-0 i dodaj kilka kropli PVP-I.
6. Przenieś zwierzę do nowej klatki. Nie należy umieszczać operowanych zwierząt ze zwierzętami, które jeszcze nie były operowane. Zwierzęta, które przeszły operację, można łączyć w grupy.
7. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki się nie obudzą i nie odzyskają pozycji leżącej mostka.
8. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez 10 dni przed przystąpieniem do wstrzykiwania znacznika przewodu pokarmowego.

4. Wstrzyknięcie znacznika przewodu ciśnieniowego pod kątem 45° na prawą korę silnikową

1. Umieść zwierzę na urządzeniu stereotaktycznym w znieczuleniu i zakryj oczy maścią ochronną, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia. Potwierdź znieczulenie, obserwując brak reakcji w tylnej łapie po naciśnięciu palcami lub kleszczami. Nie kontynuuj, dopóki zwierzę całkowicie nie zaśnie.
2. Otwórz ranę głowy.
3. Oczyść czaszkę 70% etanolem za pomocą bawełnianego wacika.
4. Umieścić szklaną strzykawkę o pojemności 5 μl (26S ga) na pionowym uchwycie urządzenia. Upewnij się, że dolny koniec uchwytu na szklankę znajduje się dokładnie na elemencie mocującym. Strzykawka nie może znajdować się zbyt głęboko pod nią, ponieważ wtedy niemożliwe będzie umieszczenie jej pod kątem 45° od pozycji pionowej i wykonanie wstrzyknięcia.
5. Ustawić strzykawkę bezpośrednio nad bregmą, a następnie zlokalizować żądane współrzędne. W przypadku iniekcji na korę ruchową współrzędne to: Punkt #1: +0,5 mm rostralny i 2,5 mm boczny względem bregmy. Punkt #2: +1,34 mm rostral, 2,5 mm boczny w stosunku do bregmy.
6. Po ustaleniu współrzędnych wskaż ich położenie nad czaszką za pomocą znacznika z cienką końcówką. Zrób tylko jedną kropkę w czaszce, ponieważ nadmierne uwalnianie atramentu może ukryć prawidłową współrzędną.
7. Ostrożnie wywierć czaszkę, trzymając wiertło pod kątem 45°. Podobnie jak w kroku 2.8, często sprawdzaj czaszkę, aby nie była całkowicie perforowana, aby uniknąć uszkodzenia mózgu spowodowanego przez wiertło. Użyj końcówki strzykawki, aby upewnić się, że cała kość została usunięta.
8. Do strzykawki załadować 600 nl rozcieńczonego znacznika przewodu pokarmowego.
9. Ustaw pozycję pionową na 45° w kierunku prawej strony zwierzęcia. Pod mikroskopem umieść końcówkę igły strzykawki tuż przed otworem.
10. Przesuń go w kierunku pionowym o 1,5 mm. Pozostaw igłę w tej pozycji na 30 sekund do 1 minuty przed wykonaniem wstrzyknięć ciśnieniowych.
11. Wstrzyknąć 300 nl rozcieńczonego znacznika w trzech etapach po 100 nl w odstępie 30 sekund. Po ostatnim wstrzyknięciu należy pozostawić strzykawkę nieruchomo przez 30 sekund do 1 minuty, aby uniknąć wydostania się znacznika z mózgu.
12. Powoli wyciągnąć strzykawkę, przenieść ją nad drugi otwór i powtórzyć ten sam proces z pozostałymi 300 nl znajdującymi się wewnątrz strzykawki.
13. Po drugim wstrzyknięciu wyjmij strzykawkę i przystąp do zamykania rany szwem 5-0 i dodaj kilka kropli PVP-I.
14. Przenieś zwierzę do nowej klatki. Nie należy umieszczać operowanych zwierząt ze zwierzętami, które jeszcze nie były operowane. Zwierzęta, które przeszły operację, można łączyć w grupy. Nie pozostawiaj myszy bez opieki, dopóki się nie obudzą i nie odzyskają pozycji leżącej mostka.
15. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie przez 10 dni przed uśmierceniem.

5. Obserwacja szlaku

1. Znieczulenie zwierzęcia w pełni zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Potwierdź znieczulenie, obserwując brak reakcji w tylnej łapie po naciśnięciu palcami lub kleszczami. Nie kontynuuj, dopóki zwierzę całkowicie nie zaśnie.
2. Perfuzja zwierząt z 4% paraformaldehydem w PBS (pH 7) zgodnie ze standardowymi protokołami⁶.
3. Usuń mózg i utrwal go przez zanurzenie O/N w 4% paraformaldehydzie.
4. Krioprotekcja mózgów w sacharozie w 30%, aż mózgi opadną. Następnie wyjmij mózgi i zamroź je przez 10-sekundowe zanurzenie w ciekłym azocie. Utrzymuj mózgi w temperaturze -80 °C, aż do wytworzenia skrawków.
5. Wytwarzać skrawki o grubości 20 μm w przypadku analizy znacznika dróg wstecznych i w odległości 40 μm w przypadku analizy znaczników dróg następczych poprzez cięcie na kriostatenie.

Uwaga: Neurony oznaczone FG można zaobserwować jako białe krwinki pod wpływem wzbudzenia światłem ultrafioletowym. BDA wykrywa się przez inkubację O/N z kompleksem awidyna-biotyna-peroksydaza i 3,3' diaminobenzydyna z dodatkiem niklu w stężeniu 0,4% w celu zwiększenia kontrastu włókien^6,7.

Wyniki

Zastosowano u zwierząt 30-minutową okluzję środkowej tętnicy mózgowej metodą szwu wewnątrznaczyniowego, co wywołało uszkodzenie w lewym prążkowiu, a następnie podawano rhEpo bezpośrednio do mózgu za pomocą pomp miniosmotycznych (Rysunek 1, Rysunek 3) przez okres 30 dni, rozpoczynając 3 dni po udarze⁶. Rysunek 4 przedstawia schemat drogi korowo-rdzeniowej, którą prześledzono po wstrzyknięciu CB i BDA, oraz obszar, w którym wstrzyknięto znaczniki. Wykazaliśmy poprawę siły chwytu i sprawności motorycznej (Rysunek 5) odpowiednio po 14 i 42 dniach podawania rhEpo. Wprowadzenie BDA do prawej kory motorycznej zwierząt, u których wywołano udar w lewym prążkowiu, wykazało zwiększoną liczbę włókien ruchowych przekraczających linię środkową na poziomie jądra czerwonego i nerwu twarzowego (Rysunek 5), co dowodzi skutecznego barwienia rozrastających się włókien w wyniku leczenia farmakologicznego za pomocą pomp miniosmotycznych. Leczenie rhEpo zwiększyło również przeżywalność neuronów, opóźniło rozlaną astrocytozę, zmniejszyło tworzenie blizny glejowej i zwiększyło angiogenezę w badanym okresie⁶. Stosując tę samą technikę wstrzykiwania znaczników dróg, możemy skutecznie wykryć jądra wzgórza połączone z korą poprzez wstrzyknięcie retrogradnego znacznika dróg FG (Rysunek 6).

Rysunek 1. Elementy pompy miniosmotycznej użytej w tym protokole. Widoczne są: dysk dystansowy, kaniula z usuwalną zakładką, cewnik, modulator przepływu oraz pompa miniosmotyczna. Wygląd w pełni złożonej pompy przedstawiono na Rysunku 2A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Podsumowanie kluczowych etapów implantacji pompy. (A) Mysz umieszczona na urządzeniu stereotaktycznym wraz z w pełni przygotowaną pompą miniosmotyczną obok niej. Strzałka wskazuje współrzędne wybrane do implantacji. (B) Pompa została wprowadzona w grzbiet zwierzęcia; na zewnątrz pozostaje jedynie kaniula. Czaszka została już nawiercona. (C) Wygląd głowy po implantacji. (C.1) Kaniula znajduje się na miejscu, ale odcinany zaczep nie został jeszcze przecięty. (C.2) Odcinany zaczep został przecięty, można teraz rozpocząć zszywanie rany. (D) Gwiazdka (*) wskazuje zwierzę bezpośrednio po implantacji w porównaniu do zwierzęcia 30 dni po zabiegu (#). Przy prawidłowym utrzymaniu rana powinna pozostać zamknięta aż do końca procedury, co przedstawiono na obrazie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Barwienie metodą Nissla wskazujące miejsce implantacji w korze mózgowej. W części lewej kory widoczne jest niewielkie nacięcie (strzałka). Szerokość obszaru penetracji wynosi około 50 μm. Na podstawie barwienia metodą Nissla nie stwierdzono wyraźnych, poważnych zmian tkankowych w porównaniu z odpowiadającym mu obszarem przeciwległym (*). R: Półkula prawa. L: Półkula lewa. Pasek skali = 300 μm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4. Strategia wstrzykiwania znacznika szlaków, opublikowana wcześniej przez Reitmeiera et al.^6,7. (A) Schemat wskazujący miejsca wstrzykiwania znacznika szlaków BDA do przeciwległej kory ruchowej, podczas gdy CB wstrzyknięto do kory ruchowej półkuli z zawodem. Śledzono włókna prowadzące do jądra czerwonego (niewykazane) oraz jądra twarzowego (patrz Rycina 5). (B) Przedstawiono miejsce wstrzyknięcia antegradnego znacznika szlaków BDA w sąsiedztwie kory ruchowej. Czerwona strzałka wskazuje tor igły, natomiast czarna strzałka wskazuje kilka komórek korowych znakowanych BDA. Cx: kora. CC: ciało modzelowate. V: komora. FN: jądro twarzowe. Pasek skali w B = 200 µm. Rycina 4A została powielona za uprzejmą zgodą⁶. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rysunek 5. Regeneracja zmiażdżonego mózgu po podaniu rhEpo. (A) BDA wstrzyknięty do przeciwstronnej kory ruchowej jest następnie wykrywany w włóknach korowo-rdzeniowych na poziomie jądra nerwu twarzowego (Bregma -5.8 mm do -6.3 mm). Linie przecięcia na każdej półkuli wykreślono równolegle do linii środkowej, a włókna przekraczające każdą linię w kierunku półkuli ipsilesjonalnej i przeciwstronnej policzono i wyrazono jako procent całkowitej liczby oznakowanych włókien w drodze korowo-rdzeniowej. Erytropoetyna zwiększyła liczbę włókien przekraczających w kierunku przeciwstronnego jądra twarzowego. Dane przedstawiają średnie +- SD. Dane analizowano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testów najmniejszych istotnych różnic, §P<0.05 w porównaniu z myszami nie niedokrwiennymi traktowanymi nośnikiem. (B) Zachowanie ruchowe wykazało poprawę siły uścisku dłoni oraz koordynacji w teście rotarod. Dane przedstawiają wartości średnie +- SD. Dane analizowano za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji z powtarzanymi pomiarami (ANOVA), a następnie jednoczynnikowej analizy ANOVA/testów najmniejszych istotnych różnic dla każdego punktu czasowego. §P<0.05 w porównaniu z poziomem bazowym przed niedokrwieniem; *P<0.05 w porównaniu z niedokrwiennymi myszami traktowanymi nośnikiem. Rysunki 5A i B zostały powielone za uprzejmą zgodą⁶. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Struktury docelowe osiągnięte po wstrzyknięciu fluorozłota (FG). (A) Miejsce wstrzyknięcia FG obok kory ruchowej, jak wskazano na Rysunku 1. Czerwona strzałka wskazuje tor igły, a biała strzałka wskazuje kilka znakowanych komórek w korze. (B) FG wstrzyknięte w pobliżu kory ruchowej jest wykrywane w VPL. Fi: Fimbria. IC: Toreb wewnętrzna. RT: Jądro siatkowate wzgórza. VPL: Brzuszno-boczne jądro tylne wzgórza. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przez wiele lat badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak udar niedokrwienny mózgu lub urazowe uszkodzenie mózgu, koncentrowały się na opracowywaniu terapii neuroprotekcyjnych, które mają na celu promowanie przeżycia neuronów w fazie ostrego udaru. Zdecydowana większość terapii lekowych, które okazały się skuteczne w modelach gryzoni, nie powiodła się po przeniesieniu do kliniki. Przyczyny tego niepowodzenia terapeutycznego obejmują między innymi brak trwałych efektów działania leku, co skutkuje utrzymującą się funkcjonalną regeneracją neurologiczną. Dlatego ważne jest, aby opracować strategie promujące przebudowę mózgu w dłuższej perspektywie. Ponieważ samo promowanie przeżycia neuronów nie jest wystarczające, aby umożliwić pomyślny powrót do zdrowia po udarze, jak sugeruje duża liczba nieudanych prób neuroprotekcji, stymulacja plastyczności neuronów zyskała ostatnio duże zainteresowanie w tej dziedzinie.

Sposobem dostarczania leku jest wstrzyknięcie dootrzewnowe, wstrzyknięcie donaczyniowe do ogona, wstrzyknięcie kości udowej, pojedyncze stereotaktyczne wstrzyknięcie wektorów do mózgu i ciągłe dostarczanie przez pompy miniosmotyczne. To ostatnie może obejmować dostarczanie ogólnoustrojowe, jeśli pompa nie ma kaniuli lub które może być kierowane na narządy, jak wykazaliśmy w przypadku dostarczania do mózgu. Z wyjątkiem pomp miniosmotycznych i stosowania wektorów wirusowych, wszystkie inne strategie będą indukować wahania stężeń leków. W przypadku długotrwałych eksperymentów konieczne staje się zatem poddanie zwierzęcia stresowi związanemu z otrzymywaniem częstych zastrzyków. Bariera krew-mózg stanowi istotną przeszkodę w wychwytywaniu przez mózg białek lub leków z krwi, co powoduje potrzebę stosowania ogromnych dawek białek lub leków w celu osiągnięcia stężeń terapeutycznych w mózgu. Na przykład Pellegrini i wsp. (2013) ⁵ podawano rhEpo we wstrzyknięciu dootrzewnowym w dawce odpowiadającej 75 j.m./dobę dla zwierzęcia o wadze 30 g (750 j.m./dobę dla szczura o wadze 300 g). Dla porównania, ukierunkowane dostarczanie rhEpo do mózgu pozwoliło nam na zastosowanie znacznie niższej dawki wynoszącej zaledwie 10 j.m./dobę w naszym badaniu w celu pomyślnego powrotu do zdrowia po udarze, co umożliwiło nam osiągnięcie powrotu do zdrowia w dużej skali czasowej w ustalonym tempie 0,25 μl/godz.

W niniejszej pracy przedstawiono metodę implantacji minipomp z kaniulą połączoną z czaszką w celu dostarczenia białka sprzyjającego plastyczności rhEpo bezpośrednio do komory, omijając w ten sposób barierę krew-mózg. Dzięki tej metodzie rhEpo wspomaga powrót do zdrowia neurologicznego na wiele sposobów, w tym zmniejszenie rozmiaru zawału, zmniejszenie tworzenia się blizn glejowych i indukcję angiogenezy. rhEpo promował również przeżycie neuronów i zwiększał projekcje z przeciwległej kory ruchowej w kierunku odnerwionego jądra czerwonego i jąder twarzowych. Kiełkowanie włókien ujawniło się przez wstrzyknięcie znacznika drogi następczej BDA do kory ruchowej (ryc. 4A i 5A). Funkcjonalny korelat kiełkowania włókien jest zapewniony przez poprawę zdolności motorycznych (ryc. 5B). Ponadto wykazaliśmy, że to samo podejście do wstrzykiwania znacznika drogowego można zastosować do odsłonięcia połączeń wzgórzowo-korowych poprzez wstrzyknięcie znacznika wstecznego przewodu FG (Figura 6B).

Przygotowując pompę miniosmotyczną, należy wziąć pod uwagę punkt docelowy i użycie przekładek. Używamy jednego dystansera, aby zmniejszyć długość igły o 0,5 mm, ponieważ w ten sposób sama końcówka igły styka się z komorą na podanych współrzędnych (-0,2 mm ogonowa, 0,9 mm boczna, 2,5 mm grzbietowa brzuszna, w stosunku do bregmy). Jeśli jednak celem badań są głębsze konstrukcje, wówczas przekładki nie będą potrzebne. Podobnie, jeśli pożądany jest bardziej zewnętrzny punkt dostarczania (tj. kora), konieczne będzie więcej krążków dystansowych. Cewnik musi być na tyle długi, aby pompka nie znajdowała się zbyt blisko głowy, ponieważ będzie utrudniać ruchy myszy, ale także nie za długa, ponieważ raz wszczepiona nadmierna długość może spowodować wygięcie cewnika, zwiększając w ten sposób ryzyko usunięcia kaniuli przez naturalny ruch myszy. Przekrój cewnika o długości 2 cm daje bardzo dobre wyniki w zakresie ruchomości i stabilności implantu (ryc. 1 i 2). Inkubacja pompy w temperaturze 37 °C O/N pozwala pompie natychmiast rozpocząć pompowanie leku do mózgu w momencie implantacji.

W przypadku implantacji pompy miniosmotycznej bardzo ważne jest, aby upewnić się, że czaszka jest odpowiednio wysuszona przed wszczepieniem kaniuli. Zwykle czyszczenie 70% etanolem spowoduje wyschnięcie kości, ale jeśli zostanie stwierdzone ciągłe krwawienie, delikatne dotknięcie czaszki kauteryzatorem całkowicie ją wysuszy. Bardzo ważne jest, aby upewnić się, że wprowadzanie igły jest tak pionowe i powolne, jak to możliwe. Po umieszczeniu na miejscu i podczas wysychania kleju, umieszczenie palca na kaniuli zapobiega jej przesuwaniu się na boki po czaszce. Szczególną uwagę należy zwrócić na ranę i umiejscowienie kaniuli. Ważne jest, aby nacięcie nie było wykonywane dokładnie nad linią środkową czaszki, ale nieco w prawą stronę. Podczas zamykania rany, jeśli nacięcie zostało wykonane na linii środkowej, skóra będzie nadmiernie rozciągnięta, co zwiększy ryzyko otwarcia się rany. Wykonanie nacięcia nieco w bok pozwoli na to, aby punkty szwów znajdowały się z dala od najwyższej części kaniuli. W konsekwencji będzie mniejsze napięcie w punktach szwów, a rana zagoi się prawidłowo. Zwierzęta powinny być trzymane w klatkach samodzielnie i sprawdzane codziennie, szczególnie w ciągu pierwszych 10-15 dni po implantacji. W przypadku rozejścia się rany, rany należy jak najszybciej zamknąć. Jeśli kaniula zostanie usunięta lub zwierzę wykaże infekcję, eksperyment musi zostać przerwany. Ponowna implantacja kaniuli nie jest zalecana. Dla udanej implantacji bardzo ważne jest użycie odpowiedniej ilości kleju tkankowego (nie za dużo!), ponieważ powoduje to degradację kości i zwiększa ryzyko usunięcia kaniuli. Jednak użycie zbyt małej ilości kleju również nie utrzyma kaniuli przyczepionej do kości. Pompy miniosmotyczne mogą przenosić leki rozpuszczone w szerokiej gamie substancji, przy czym jedynym ograniczeniem jest to, że rozpuszczalnik jest biokompatybilny. Dodatkowo, biorąc pod uwagę, że objętość jest niewielka (200 μl), należy określić, czy stężenie wymagane do eksperymentu jest odpowiednie i nie spowoduje wytrącania się powietrza wewnątrz pompy.

Śledzenie dróg za pomocą znaczników następczych lub wstecznych jest bardzo dobrze znaną techniką badania połączeń i plastyczności mózgu. Należy zachować ostrożność przy stosowaniu ramek stereotaktycznych podczas wstrzykiwania, aby zapewnić dokładność celowania w obszar mózgu, który chce się badać (tj. aby zapobiec wstrzyknięciu na ciało modzelowate podczas wstrzykiwania kory).

W przypadku wszystkich zabiegów chirurgicznych oraz w celu zmniejszenia bólu i stanu zapalnego zwierzęta powinny być leczone buprenorfiną w dawce 0,1 mg/kg mc. przed interwencją i kaprofenem w dawce 4 mg/kg mc. raz na dobę przez trzy dni po interwencji.

Podsumowując, podejście to stanowi właściwe narzędzie do badania wpływu białek lub związków farmakologicznych na uszkodzony mózg, reprezentując metodę, która dobrze nadaje się do badań nad plastycznością mózgu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pompa miniosmotyczna Alzet. Wzór 2004.	Alzet	000298	Pojemnik na lek
Zestaw do infuzji mózgu 3 1-3 mm	Alzet	0008851	System dostarczania leków do mózgu
Loctite  454 Żel Prism	Loctite	45404	Klej cyjanoakrylowy do przylegania kaniuli do czaszki
Strzykawka szklana 75N	Hamilton	87900/00	Wstrzykiwanie znaczników dróg pokarmowych
Biotyna Dekstran Amina (10 000 MW)	Sondy molekularne	N-7167	Znacznik drogi następczej
Fluorogold	Fluorochrome, LLC.		Znacznik dróg wstecznych
Kwintesencja wtryskiwacza stereotaktycznego (QSI)	Stoelting	53311	Stereotaktyczne urządzenie do określania współrzędnych, implantacji pompy i wstrzykiwania znacznika drogowego.