Artykuł metodologiczny

Wizualny zapis potencjału wywołanego w szczurzym modelu eksperymentalnej demielinizacji nerwu wzrokowego

DOI:

10.3791/52934

⸱

29 lipca 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Australian School of Advanced Medicine, Macquarie University, 2Save Sight Institute, The University of Sydney

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogniskowa demienizacja jest indukowana w nerwie wzrokowym za pomocą mikroiniekcji lizolecytyny. Wzrokowe potencjały wywołane są rejestrowane za pomocą elektrod czaszkowych wszczepionych w korę wzrokową w celu zbadania przewodzenia sygnału wzdłuż szlaku wzrokowego in vivo. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury chirurgiczne leżące u podstaw implantacji elektrod i mikroiniekcji nerwu wzrokowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapis wizualnego potencjału wywołanego (VEP) jest szeroko stosowany w praktyce klinicznej do oceny ciężkości zapalenia nerwu wzrokowego w jego ostrej fazie oraz do monitorowania przebiegu choroby w okresie obserwacji. Zmiany parametrów VEP ściśle korelują z patologicznym uszkodzeniem nerwu wzrokowego. Protokół ten zawiera szczegółowy opis modelu mikroiniekcji nerwu wzrokowego u gryzoni, w którym w nerwie wzrokowym wytwarzana jest częściowa zmiana demielinizacyjna. Omówiono również techniki nagrywania VEP. Za pomocą elektrod z wszczepioną czaszką jesteśmy w stanie uzyskać powtarzalne ślady VEP w trakcie sesji i między sesjami. VEP mogą być rejestrowane u poszczególnych zwierząt przez pewien okres czasu w celu oceny zmian funkcjonalnych w nerwie wzrokowym wzdłużnie. Model demielinizacji nerwu wzrokowego, w połączeniu z protokołem rejestracji VEP, stanowi narzędzie do badania procesów chorobowych związanych z demielinizacją i remielinizacją i może być potencjalnie wykorzystany do oceny skutków nowych leków remielinizacyjnych lub terapii neuroprotekcyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapalenie nerwu wzrokowego jest jedną z najczęstszych form neuropatii nerwu wzrokowego, powodującą całkowitą lub częściową utratę wzroku1. Histologicznie charakteryzuje się demielinizacją zapalną, utratą aksonów komórek zwojowych siatkówki i różnym stopniem remielinizacji nerwu wzrokowego2. Zapalenie nerwu wzrokowego jest zwykle oczywistym początkiem stwardnienia rozsianego. Wzrokowy potencjał wywołany (VEP) jest nieinwazyjnym narzędziem do badania funkcji układu wzrokowego. Odzwierciedla funkcję zasiatkówkową od siatkówki do pierwotnej kory wzrokowej i jest dotknięta w wielu stanach związanych z chorobami nerwu wzrokowego3. VEP jest stosowany głównie u pacjentów z zapaleniem nerwu wzrokowego w celu oceny integralności drogi wzrokowej4.

Opóźnienie VEP, które odzwierciedla prędkość przewodzenia sygnału wzdłuż ścieżki wzrokowej, jest uważane za dokładny pomiar poziomu zmian związanych z mieliną w nerwie wzrokowym5; podczas gdy amplituda VEP jest uważana za ściśle skorelowaną z aksonalnym uszkodzeniem komórek zwojowych siatkówki (RGC)6. Hipoteza ta została dość dobrze ugruntowana przy użyciu szczurzego modelu demielinizacji nerwu wzrokowegowywołanej lizolecytyną 5.

Tutaj wyjaśniamy kompleksowy protokół techniki mikroiniekcji nerwu wzrokowego u gryzoni, który może zminimalizować związane z manipulacją chirurgiczną uszkodzenie nerwu per se, jak również sąsiednich tkanek, takich jak mięśnie zewnątrzgałkowe i naczynia krwionośne. Opisano również operację wszczepienia elektrody czaszki do rejestracji VEP u zwierząt7. Zapisy VEP mogą być wielokrotnie przeprowadzane na zwierzętach przez pewien okres czasu w celu oceny zmian związanych z demielinizacją/remielinizacją, a także wpływu na integralność aksonalną nerwu wzrokowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oświadczenie etyczne: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Australijskim Kodeksem Postępowania w Opiece i Wykorzystywaniu Zwierząt do Celów Naukowych oraz wytycznymi Oświadczenia ARVO dotyczącymi Wykorzystania Zwierząt w Badaniach Okulistycznych i Wzrokowych, i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Macquarie.

1. Implantacja elektrody VEP

  1. Znieczulić zwierzę dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy (75 mg/kg) i medetomidyny (0,5 mg/kg).
    Uwaga: Po indukcji znieczulenia należy obserwować odruchy odstawienia (próba szczypania, odruch rogówkowy i powiekowy itp.) oraz ich brak jako wskazanie do rozpoczęcia operacji. Stale monitoruj zwierzęta przez cały czas trwania operacji i podawaj dodatkowy lek znieczulający (10% początkowej dawki ketaminy na uzupełnienie), jeśli występują odruchy. W eksperymentach wykorzystuje się dorosłe szczury (>12 tygodni).
  2. Ogolić skórę w obszarze operacyjnym. Umieść zwierzę na podkładce rozgrzewającej (37 °C), aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu. Przygotuj skórę poprzez miejscowe stosowanie jodu powidonu. Zastosuj obłożenie chirurgiczne. Stosować miejscowo maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu rogówki w znieczuleniu ogólnym. Utrzymuj aseptykę za pomocą sterylnych narzędzi.
  3. Wykonaj podłużne nacięcie skóry na linii środkowej skóry głowy. Oczyść tkankę łączną, aby uzyskać dobrą odsłonę czaszki.
  4. Ostrożnie wywierć małe otwory w zadziorach ręcznie za pomocą mikro wiertarki ręcznej na wysokości 7 mm za bregmą i 3 mm z boku do linii środkowej.
  5. Implant wkręca elektrody przez czaszkę do kory mózgowej (obszar 17), wnikając w korę na głębokość około 0,5 mm. Wszczepić referencyjną elektrodę śrubową na linii środkowej 3 mm rostral do bregma. Nałóż cement dentystyczny, aby otoczyć i przykręcić (nie zawsze jest to wymagane).
  6. Zszyj skórę głowy, nałóż maść z antybiotykiem na skórę i pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu na podkładce rozgrzewającej.
    Uwaga: Alternatywnie, elektrody mogą pozostać odsłonięte, dzięki czemu skóra nie musi być ponownie otwierana przy każdym nagraniu. Natychmiast po zaprzestaniu operacji, ale przed rekonwalescencją anestezjologiczną, należy podać niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ) (jeśli nie został podany przed operacją) lub opioidowy lek przeciwbólowy. Należy stale monitorować zwierzęta, aż do pełnego wyzdrowienia po znieczuleniu i pełnego chodzenia.
  7. Należy odczekać co najmniej 1 tydzień, aby zwierzęta doszły do siebie po operacji przed rejestracją VEP.

2. Iniekcja nerwu wzrokowego

  1. Znieczulić zwierzę, przygotować skórę i nałożyć drapowanie jak powyżej (1.1 i 1.2).
  2. Wykonaj od 1 do 1,5 cm nacięcia w skórze powyżej oczodołu losowo wybranego oka. Otwórz tkankę podskórną, aby dotrzeć do jamy oczodołu za pomocą cienkich nożyczek do tęczówki. Otwórz spojówkę i przednią torebkę czopa pod mikroskopem operacyjnym.
  3. Wycofaj mięśnie zewnątrzgałkowe i śródobitalne gruczoły łzowe, aby odsłonić nerw wzrokowy o długości około 3 mm. Otwórz warstwy opony twardej i pajęczynówki wokół nerwu wzrokowego wzdłużnie za pomocą ostrza okulistycznego.
  4. Włożyć szklaną pipetę do nerwu wzrokowego w odległości 2 mm za gałką oczną. Szklana mikropipeta jest dołączona do strzykawki Hamiltona.
  5. Wstrzyknij 1% lizolecytyny (0,4 - 1,0 μl, z 0,02% Evan's Blue, który nie ma wpływu na mielinizację) powoli do nerwu przez około 30 sekund.
  6. Zszyj nacięcie skóry. Zastosuj maść z antybiotykiem, aby zapobiec infekcji. Oczy innych kolegów mogą służyć jako wewnętrzna kontrola zapisów elektrofizjologicznych.
  7. Umieść zwierzęta na podkładce rozgrzewającej, aby wyzdrowiały po znieczuleniu.

3. Nagrywanie VEP

  1. Znieczulić zwierzę i przygotować skórę jako 1,1 i 1,2.
    Uwaga: Do zapisu elektrofizjologicznego można zastosować niższą dawkę środków znieczulających (ketamina 40 mg/kg i medetomidyna 0,25 mg/kg).
  2. Umieść szczura w ciemnym pomieszczeniu i pozwól mu przystosować się do ciemności przez 5 - 30 minut. W niektórych przypadkach szczury mogą być odpowiednio przystosowane do ciemności, O/N do skotopowych lub jasne przystosowane do fotopowych zapisów VEP8.
  3. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą systemu homeotermicznych z sondą termometru doodbytniczego.
  4. Rozszerz źrenice za pomocą 1,0% kropli do oczu z tropikamidu. Otwórz skórę nad czaszką, aby uzyskać dostęp do wstępnie umieszczonych elektrod śrubowych in situ.
  5. Podłącz nad przeciwległą korą wzrokową stymulowanego oka i odniesienia do amplifier. Włóż elektrodę igłową do ogona jako masę. Zmierz i utrzymuj impedancję elektrody poniżej 5 kΩ.
  6. Umieść mini-stymulator Ganzfelda bezpośrednio na skórze wokół powiek, aby zapewnić lepszą izolację oczu7. Oświetlenie stymulatora należy wcześniej skalibrować za pomocą fotometru.
  7. Dostarczaj stymulację fototyczną poprzez błyski światła 100 razy z częstotliwością 1 Hz, z ustawieniami filtra pasmowoprzepustowego o niskim i wysokim poziomie odpowiednio 1 i 100 Hz. Częstotliwość próbkowania sygnału wynosi 5 kHz.
    Uwaga: Sygnały powinny być próbkowane co najmniej z częstotliwością około 250–300 Hz, aby zapewnić pobranie więcej niż dwóch próbek podczas każdego cyklu.
  8. Zszyj skórę z powrotem i trzymaj zwierzęta na podkładce rozgrzewającej, aby dojść do siebie po znieczuleniu. Zapis może być wielokrotnie nagrywany na poszczególnych zwierzętach w celu monitorowania zmian funkcjonalnych w danym okresie czasu.
  9. W punkcie końcowym należy podać wstrzyknięcie pentobarbitonu sodu (100 mg/kg, i.p.) w celu eutanazji zwierzęcia. Potwierdzić eutanazję przez zatrzymanie akcji serca, zatrzymanie oddechu i obniżenie temperatury ciała.

4. Przygotowanie tkanek i histologia

  1. Usuń nerwy wzrokowe od zwierząt poddanych eutanazji pod mikroskopem i utrwal tkankę w 1% paraformaldehydzie O/N.
  2. Dokładnie umyj chusteczkę solą fizjologiczną. Potraktuj tkankę w automatycznym procesorze tkanek i zanurz w parafinie. Ciąć odcinki (5 - 10 μm) za pomocą mikrotomu obrotowego.
    Uwaga: W celu badania immunohistochemicznego utrwalić tkankę w 1% paraformaldehydzie, przemyć solą fizjologiczną i inkubować z 30% sacharozą O / N. Zanurz tkankę w pożywce do zatapiania OCT i wykonaj kriosekcje za pomocą kriostatu.
  3. Inkubować skrawki w 0,1% szybkim niebieskim roztworze, takim jak Luxol (w 95% etanolu) O/N w temperaturze 56 °C. Różnicować skrawki w 0,05% węglanie litu przez 30 sekund, a następnie w 70% etanolu przez kolejne 30 sekund. Na koniec przed montażem sekcji należy zabarwić przeciwbarwnie w 0,1% roztworze fioletu krezylowego przez 30 sekund. Użyj szybkiego barwienia na niebiesko, aby zidentyfikować mielinę w nerwie wzrokowym5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Powtarzalne ślady VEP w trakcie sesji są pokazane na rysunku 1, a po wstrzyknięciu nerwu wzrokowego można zauważyć znaczne opóźnienie w opóźnieniu N1. Częściowe uszkodzenia nerwu wzrokowego w wyniku demielinizacji można zaobserwować na odcinkach histologicznych przy użyciu szybkiego barwienia na niebiesko Luxol5. Rycina 2 przedstawia reprezentatywny wycinek z małą ogniskową zmianą zdemielinizowaną w środku nerwu wzrokowego. Należy pamiętać, że przekrój poprzeczny nie reprezent...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nerw wzrokowy jest bardzo podatny na uszkodzenia mechaniczne. Uszkodzenie nerwu wzrokowego w czasie 1 s może prowadzić do około 75% utraty RGC w okresie 2 tygodni10. Dlatego podczas wykonywania zabiegów chirurgicznych wymagana jest szczególna ostrożność. Zgodnie z doświadczeniem autorów, znacznie lepiej jest zastosować podejście preparacyjne, aby odsłonić i przebić się przez tkanki wokół nerwu wzrokowego wzdłuż orientacji nerwu, niż penetrować w orientacji prostopadłej do nerwu wzrokowego. Ponadto opona twarda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma sprzecznych interesów ani sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Ophthalmic Research Institute of Australia (ORIA). Dziękujemy prof. Algisowi Vingrysowi i dr. Bang Bui z Uniwersytetu w Melbourne za początkową pomoc w opracowaniu techniki nagrywania VEP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ketamina 100 mg / ml (Ketamil)Troy LaboratoriesAC 116
Medetomidine 1 mg / ml (Domitor)Pfizersc-204073
Tropikamid 1,0% (Mydriacyl)Alconsc-202371
System homeotermicznychAparat HarvardNC9203819
Miernik impedancji TrawaF-EZM5
Elektrody śrubowe Mikro łącznikiM1.0 i razy; 3mm Csk Slot M/T 304 S/S
Podskórne elektrody igłowe TrawaF-E3M-72
Szybka naprawa DeguDent GmbH
Dioda elektroluminescencyjna Biowzmacniacz NichiaNSPG300A
CWE, Inc.BMA-400
CEDCambridge Electronic Design, Ltd.Power1401
Hamilton Hamilton87930
LizolecytynaSigmaL4129
Evan' s niebieski SigmaE2129
System Strzykawka powiedział:

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balcer, L. J. Clinical practice. Optic neuritis. N Engl J Med. 354 (12), 1273-1280 (2006).
  2. Lassmann, H. Multiple sclerosis as a neuronal disease. Waxman, S. G. , Elsevier. 153-164 (2005).
  3. Fahle, M., Bach, M. Principles and practice of clinical electrophysiology of vision. Heckenlively, J., Arden, G. , MIT Press. 207-234 (2006).
  4. Halliday, A. M., McDonald, W. I., Mushin, J. Delayed visual evoked response in optic neuritis. Lancet. 1, 982-985 (1972).
  5. You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Latency delay of visual evoked potential is a real measurement of demyelination in a rat model of optic neuritis. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (9), 6911-6918 (2011).
  6. You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Gupta, V. K., Graham, S. L. Axonal loss in a rat model of optic neuritis is closely correlated with visual evoked potential amplitudes using electroencephalogram based scaling. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 3662(2012).
  7. You, Y., Klistorner, A., Thie, J., Graham, S. L. Improving reproducibility of VEP recording in rats: electrodes, stimulus source and peak analysis. Doc Ophthalmol. 123 (2), 109-119 (2011).
  8. Heiduschka, P., Schraermeyer, U. Comparison of visual function in pigmented and albino rats by electroretinography and visual evoked potentials. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 246 (11), 1559-1573 (2008).
  9. You, Y., Thie, J., Klistorner, A., Gupta, V. K., Graham, S. L. Normalization of visual evoked potentials using underlying electroencephalogram levels improves amplitude reproducibility in rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1473-1478 (2012).
  10. Levkovitch-Verbin, H. Animal models of optic nerve diseases. Eye (Lond). 18 (11), 1066-1074 (2004).
  11. Henry, K. R., Rhoades, R. W. Relation of albinism and drugs to the visual evoked potential of the mouse). J Comp Physiol Psychol. 92 (2), 271-279 (1978).
  12. Murrell, J. C., Waters, D., Johnson, C. B. Comparative effects of halothane, isoflurane, sevoflurane and desflurane on the electroencephalogram of the rat. Lab Anim. 42 (2), 161-170 (2008).
  13. Makela, K., Hartikainen, K., Rorarius, M., Jantti, V. Suppression of F-VEP during isoflurane-induced EEG suppression. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 100 (3), 269-272 (1996).
  14. Boyes, W. K., Padilla, S., Dyer, R. S. Body temperature-dependent and independent actions of chlordimeform on visual evoked potentials and axonal transport in optic system of rat. Neuropharmacology. 24 (8), 743-749 (1985).
  15. Hetzler, B. E., Boyes, W. K., Creason, J. P., Dyer, R. S. Temperature-dependent changes in visual evoked potentials of rats. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 70 (2), 137-154 (1988).
  16. Mitchell, J. The effects of lysolecithin on non-myelinated axons in vitro. Acta Neuropathol. 58 (4), 243-248 (1982).
  17. Meyer, R., et al. Acute neuronal apoptosis in a rat model of multiple sclerosis. J Neurosci. 21 (16), 6214-6220 (2001).
  18. Lachapelle, F., et al. Failure of remyelination in the nonhuman primate optic nerve. Brain Pathol. 15 (3), 198-207 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Visual Evoked PotentialsVEP RecordingSkull Implanted ElectrodesOptic Nerve MicroinjectionFocal DemyelinationElectrode ImpedancePhotic StimulationLuxol Fast Blue

Powiązane artykuły