Artykuł metodologiczny

Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0

20.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52941

⸱

25 maja 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Institute for Systems Genetics, 2Roche Life Science, USA

W tym artykule

Podsumowanie

Designerskie chromosomy projektu Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, można odróżnić od swoich natywnych odpowiedników za pomocą testu genotypowania opartego na PCR zwanego PCRTagging, który ma punkt końcowy obecności/braku. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag.

Streszczenie

Projekt Syntetycznego Genomu Drożdży (Sc2.0) ma na celu zbudowanie 16 designerskich chromosomów drożdży i połączenie ich w jedną komórkę drożdży. Do tej pory skonstruowano jeden syntetyczny chromosom, synIII1, i jedno ramię syntetycznego chromosomu, synIXR2, a ich działanie in vivo zostało potwierdzone przy braku odpowiadających im chromosomów typu dzikiego. Ważną cechą konstrukcyjną chromosomów Sc2.0 jest wprowadzenie PCRTags, które są krótkimi, przekodowanymi sekwencjami w otwartych ramkach odczytu (ORF), które umożliwiają różnicowanie syntetycznych chromosomów od ich odpowiedników typu dzikiego. Startery PCRTag wyżarzają się selektywnie do chromosomów syntetycznych lub dzikich, a obecność/brak każdego typu DNA można przetestować za pomocą prostego testu PCR. Standardowy odczyt testu PCRTag ma na celu ocenę obecności/braku amplikonów za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Jednak przy średniej gęstości amplikonów PCRTag wynoszącej jeden na 1,5 kb i rozmiarze genomu ~12 Mb, ukończony genom Sc2.0 zakoduje około 8,000 PCRTagów. Aby zwiększyć przepustowość, opracowaliśmy test wykrywania oparty na PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania PCRTag, który nazywamy analizą qPCRTag. Przepływ pracy określa 500 reakcji nl na 1,536 płytce wielodołkowej, co pozwala nam przetestować do 768 PCRTags z parami starterów typu syntetycznego i dzikiego w jednym eksperymencie.

Wprowadzenie

Sc2.0, czyli Projekt Syntetycznego Genomu Drożdży (www.syntheticyeast.org), wyznaczył sobie cel zaprojektowania i zbudowania całkowicie syntetycznego genomu eukariotycznego. Wykorzystując jako punkt wyjścia starannie opracowaną sekwencję genomu Saccharomyces cerevisiae3, każdy z szesnastu liniowych chromosomów został zaprojektowany na nowo, aby spełnić zestaw zasad projektowych, które określają utrzymanie kondycji komórek, poprawę stabilności genomu oraz zwiększenie elastyczności genetycznej. Na przykład z chromosomów Sc2.0 usunięto elementy destabilizujące, takie jak powtórzenia. Wszystkie wystąpienia kodonów stop TAG zostały zakodowane na nowo jako TAA, aby „zwolnić” kodon w końcowym szczepie dla wprowadzenia aminokwasu niezakodowanego genetycznie. Dodatkowo indukowalny system ewolucji, SCRaMbLE, oparty na systemie Cre-lox, umożliwia bezprecedensową zdolność generowania genomów pochodnych o nowych strukturach4.

Kolejnym głównym elementem projektu genomu Sc2.0 jest wprowadzenie PCRTags, które służą jako znaki wodne DNA, umożliwiające śledzenie syntetycznego i naturalnego DNA. PCRTags to krótkie, przekodowane segmenty w ORF na chromosomach syntetycznych; podczas gdy sekwencje PCRTag różnią się na poziomie DNA między chromosomami syntetycznymi a naturalnymi, kodowane białka mają identyczną sekwencję aminokwasową, a tym samym, prawdopodobnie, taką samą funkcję. Sekwencje PCRTag są specjalnie zaprojektowane jako miejsca wiązania starterów, aby ułatwić selektywną amplifikację (Rycyna 1A). Projektowanie PCRTag jest realizowane przy użyciu algorytmu „most different” w programie GeneDesign5,6, co pozwala na uzyskanie przekodowanych sekwencji syntetycznych, które różnią się zazwyczaj o ~60% od sekwencji natywnych (minimum 33%), z temperaturami topnienia między 58 °C a 60 °C i długością amplikonów od 200-500 par zasad2. Przekodowanie nie jest dozwolone w obrębie pierwszych 100 bp każdego ORF, ponieważ wiadomo, że regiony te wykazują szczególne preferencje w zakresie użycia kodonów7. Wspólnie reguły projektowe te sprzyjają wysokiej wydajności niemal wszystkich PCRTags w ramach jednego zestawu warunków PCR, w których pary starterów PCRTag dla DNA syntetycznego i naturalnego wiążą i amplifikują wyłącznie odpowiednio DNA syntetyczne i natywne (Rycyna 1B).

Proces edycji genów; porównanie WT i SYN ORF, wyniki PCRTag, analiza gDNA, schemat.
Rycina 1: Schemat PCRTag. (A) PCRTagi to sekwencje zakodowane na nowo w obrębie otwartych ramek odczytu (ORF) genów na chromosomach Sc2.0. (B) Primery PCRTag dla wersji syntetycznej (SYN) i typu dzikiego (WT) wiążą się i amplifikują wyłącznie odpowiednio syntetyczne i dzikie genomowe DNA (gDNA). Przedstawiono tutaj analizę fragmentu o długości ~30 kb lewego ramienia chromosomu sześć, w której przetestowano trzynaście par primerów PCRTag, wykorzystując jako matrycę gDNA WT lub semi-synVIL2. W wielu przypadkach jedna ORF koduje więcej niż jeden PCRTag. Obecność lub brak amplikonów PCRTag ocenia się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Wielkość amplikonów PCRTag mieści się w zakresie od 200 bp do 500 bp. Szybciej migrujące prążki na dole paneli to dimery primerów.

Analiza PCRTag okazała się istotnym narzędziem w procesie składania chromosomów Sc2.0. W typowym eksperymencie 30-50 kb syntetycznego DNA, kodującego 20-30 sekwencji PCRTag, wprowadza się do komórek drożdży w celu zastąpienia odpowiadającego im DNA typu dzikiego1,2,8. Następnie analiza PCRTag jest wykorzystywana do zidentyfikowania transformantów, które kodują syntetyczne, a nie dzikie sekwencje PCRTag obejmujące ten fragment DNA, tzw. „zwycięzców” (winners). Zazwyczaj konieczne jest przetestowanie wielu transformantów w celu zidentyfikowania „zwycięzców”, dlatego przepustowość i koszt analizy PCRTag są kluczowymi kwestiami. Obecnie ukończono dwa chromosomy Sc2.0 (synIII1 oraz synIXR2), co stanowi mniej niż 10% genomu Sc2.0, choć ponad połowa pozostałych chromosomów jest obecnie w trakcie syntezy i składania. Skala analizy PCRTag wymagana dla tego projektu szybko przerasta możliwości prowadzenia elektroforezy i ręcznego oceniania obecności syntetycznego DNA oraz braku DNA typu dzikiego.

Aby zwiększyć przepustowość testu PCRTag, opracowaliśmy schemat postępowania z wykorzystaniem PCR w czasie rzeczywistym, co pozwala uniknąć stosowania elektroforezy w żelu agarozowym. Procedura ta wykorzystuje dozownik cieczy do dużych objętości do rozdzielenia mastermixu qPCR do każdego dołka płytki 1536-dołkowej, nanoskaloowy akustyczny dozownik cieczy do przenoszenia matrycy DNA oraz starterów, a także termocykler qPCR 1536-dołkowy, co pozwala nam zminiaturyzować reakcje do 500 nl i zmaksymalizować przepustowość. Co więcej, analiza może zostać zautomatyzowana. Ten rodzaj protokołu genotypowania o wysokiej przepustowości powinien być możliwy do zastosowania w każdym projekcie wymagającym analizy wielu klonów w wielu loci.

Protokół

1. Przygotowanie genomowego DNA drożdży (gDNA)

  1. Przygotuj zapas buforu do lizy drożdży9, który zawiera 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 1% SDS (w/v), 2% Triton X-100 (v/v), 1 mM EDTA pH 8,0.
  2. Jako materiał wyjściowy należy użyć ~2 x 106 komórek, co zwykle odpowiada ~100 μl nasyconej kultury dla szczepów laboratoryjnych na tle BY474110. Wyhodowane komórki należy zebrać przez odwirowanie przy 1 000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej w probówce do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Odessać supernatant.
  3. Dodać 200 μl buforu do lizy drożdży i ponownie zawiesić osad komórkowy przez pipetowanie.
  4. Dodać ~300 μl mytych kwasem kulek szklanych tak, aby poziom kulek znajdował się około 1 mm poniżej poziomu zawiesiny komórkowej.
  5. Do dygestorium dodać 200 μl fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (25:24:1). Zakryj rurkę do mikrofugi i upewnij się, że między nakrętką a rurką nie utknęły żadne koraliki, ponieważ spowoduje to wycieki podczas potrząsania (krok 1.6). Odwróć 3 razy, aby wymieszać i sprawdź, czy nakrętka jest szczelna.
  6. Potrząsaj probówką przez 10 minut w temperaturze pokojowej za pomocą miksera stołowego, takiego jak Eppendorf 5432.
  7. Wirować przy 20 800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  8. Przenieść 75 μl fazy wodnej do nowej probówki do mikrofugi zawierającej 1 ml 100% etanolu. Odwróć 10 razy, aby wymieszać.
  9. Osadzać DNA przez odwirowanie w temperaturze 20 800 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
  10. Odessać supernatant bez usuwania osadu DNA. Umyj granulat 500 μl 70% etanolu.
  11. Wirować przy 20 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  12. Odessać supernatant bez usuwania osadu DNA i wysuszyć go na powietrzu z otwartą nasadką do mikrofuge, aż nadmiar etanolu odparuje, co zwykle trwa około 10 minut.
  13. Ponownie zawiesić osad DNA w 75 μl 10mM Tris pH 7,4 i wirować do wymieszania. Przechowywać próbkę w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony. Zmierz stężenie DNA w próbce za pomocą fluorymetru laboratoryjnego, takiego jak Qubit, który odróżnia DNA od RNA. Upewnij się, że końcowe stężenie gDNA wynosi ~1-2 ng/μl.
  14. Przygotuj rozcieńczenie genomowego DNA w stosunku 1:10, używając wody i wiru do wymieszania.
  15. Podwielokrotność 30 μl rozcieńczonego gDNA do odpowiedniego dołka płytki źródłowej, która jest kompatybilna z dozownikiem cieczy akustycznej w nanoskali (etap 3). Jeśli używasz Labcyte Echo 550, użyj 384-dołkowej płytki polipropylenowej (płytka 384PP).
    UWAGA: Przy odpowiednim zamknięciu płytka ta może być przechowywana przez co najmniej jeden miesiąc w temperaturze -20 °C.

2. Przygotuj i dozuj qPCR Master Mix do 1,536 Multiwell Plate

  1. Przygotuj 850 μl głównej mieszanki qPCR, takiej jak LightCycler 1536 DNA Green Master, w 1,5 ml probówce do mikrofuge i wymieszaj wirowo. Odwirować główną mieszankę qPCR przez 2 minuty przy 20 800 x g w temperaturze pokojowej, aby usunąć wszelkie pęcherzyki. Składniki głównej mieszanki qPCR wymagane dla pojedynczej płytki wielodołkowej 1,536 są następujące:
    1. Połącz 170 μl głównej mieszanki enzymatycznej (Green Master Tube 1, 5x zagęszczona), 42,5 μl SYBR (Green Master Tube 4, 20x zagęszczona) i 637,5 μl wody.
  2. Dozować 500 nl/dołek do 1,536 płytki wielodołkowej za pomocą dozownika płynów luzem, takiego jak Art Robbins Cobra. (Zauważ, że kroki 2.2.1-2.2.4 odnoszą się konkretnie do Kobry.)
    1. Utwórz program dozowania z następującymi ustawieniami: klasa cieczy, woda; objętość ssania, 800 μl; objętość dozowania, 500 nl; czas prania, 20 sek. W ustawieniach dozowania sprawdź, czy prędkość dozowania jest ustawiona na 49.6 mm/s, przesunięcie dozowania wynosi 0.25 mm, a nadmiar zasysanej cieczy zostanie dozowany z powrotem do studzienki źródłowej.
    2. Umieścić probówkę do mikrofuge zawierającą główną mieszankę qPCR w studzience A1 w uchwycie probówki do mikrofuge, która znajduje się w pozycji pokładu 1. Odetnij nakrętkę rurki do mikrofuge lub po prostu pozostaw ją otwartą. Ustaw "Studnię zasysania" na A1, edytując ustawienia aspiracji.
    3. Wykonaj etap mycia przed dozowaniem głównej mieszanki qPCR, najpierw odznaczając kroki zasysania i dozowania programu skonfigurowanego w kroku 2.2.2, a następnie naciskając przycisk "uruchom". Po zakończeniu ponownie wybierz kroki zasysania i dozowania przed uruchomieniem pełnego programu w celu dozowania głównej mieszanki qPCR. Jeśli Cobra była bezczynna przez mniej niż 10 minut, początkowy etap mycia, który służy do zalania systemu, nie jest konieczny.
    4. Naciśnij "uruchom", aby dozować główną mieszankę qPCR do każdego dołka.
  3. Zebrać główną mieszankę qPCR na dnie każdej studzienki przez krótkie odwirowanie płytki wielodołkowej 1536 (30 sekund przy użyciu wirówki do PCR o niskiej prędkości).

3. Dozuj matrycę DNA i startery do 1,536 płytki wielodołkowej

  1. Dozować 5 nl rozcieńczonego gDNA (krok 1.3) do żądanych dołków płytki wielodołkowej 1536 za pomocą akustycznego systemu przenoszenia cieczy, takiego jak Echo 550.
    1. W przypadku Echo 550 użyj oprogramowania Plate Formatat lub alternatywnie dostarcz niestandardowy arkusz kalkulacyjny Excel, aby zaprogramować transfer. Upewnij się, że wybrane źródło gDNA w programie dobrze pasuje do źródła, do którego fizycznie dozowałeś gDNA (krok 1.3). Wybierz typ płytki źródłowej "384PP_AQ_BP2", co oznacza, że ciecz w płytce 384PP jest buforem bez środków powierzchniowo czynnych.
  2. Dozować 10 nl starterów, wstępnie zmieszanych do przodu i do tyłu do końcowego stężenia 50 μM każdy, do żądanych dołków płytki wielodołkowej 1536 za pomocą akustycznego systemu przenoszenia cieczy, takiego jak Echo 550.
    1. W przypadku systemu przenoszenia cieczy użyj oprogramowania Plate Formatat lub alternatywnie udostępnij niestandardowy arkusz kalkulacyjny Excel, aby zaprogramować transfer.
      UWAGA: W tym przypadku możliwe jest dozowanie starterów w taki sposób, aby układ na 1,536 płytce wielodołkowej odpowiadał kolejności chromosomów starterów, dzięki czemu łatwo jest później wizualnie sprawdzić wyniki PCR w czasie rzeczywistym (krok 6).
    2. Wstępnie wymieszaj podkłady w płytce kompatybilnej z dozownikiem płynu akustycznego. W przypadku Echo 550 użyj płytki Labcyte 384LDV (niska objętość martwa) i wybierz typ płytki źródłowej "384LDV_AQ_B" podczas programowania Echo, aby wskazać, że ciecz jest prostym buforem bez białek.

4. Uszczelnij i odwiruj płytkę wielodołkową 1536

  1. Korzystając z systemu zgrzewania mikropłytek, takiego jak Plateloc Thermal Microplate Sealer, natychmiast uszczelnij płytkę wielodołkową 1,536 za pomocą optycznie przezroczystego uszczelnienia, które jest kompatybilne z urządzeniem do zgrzewania. Nie dotykaj powierzchni uszczelki, aby uniknąć smug.
    1. W przypadku korzystania z termicznego zgrzewarki do mikropłytek Plateloc należy zastosować następujące ustawienia: czas zgrzewania 2,0 s, temperatura zgrzewu 162 °C, ciśnienie powietrza 82 psi. Ten instrument nagrzewa się ~5 minut, dlatego należy go wcześniej włączyć.
    2. W przypadku korzystania z termicznego uszczelniacza do mikropłytek Plateloc należy użyć adaptera w celu podniesienia wysokości płytki wielodołkowej 1536 na stoliku instrumentu, aby zapewnić dobre uszczelnienie.
      UWAGA: Chociaż lepiej jest zakupić płytkę Stage do termicznego uszczelniacza do mikropłytek Plateloc, alternatywnym rozwiązaniem jest włożenie czterech standardowych podkładek o grubości ~ 2 mm dostępnych w każdym sklepie z narzędziami w rogach, aby podnieść wysokość płytki wielodołkowej 1,536.
  2. Natychmiast odwirować szczelnie zamkniętą płytkę wielodołkową 1,536 o masie 2,000 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, aby zebrać wszystkie odczynniki na dnie każdej studzienki.

5. PCR w czasie rzeczywistym

  1. Zaprogramuj urządzenie do 1,536 qPCR, takie jak LightCycler 1536, z dwuetapowym protokołem amplifikacji, po którym następuje analiza krzywej topnienia. Korzystając z oprogramowania LightCycler 1 536, skonfiguruj program w następujący sposób:
    1. Wstępna inkubacja: 95 °C, 1 min zatrzymania, szybkość narastania 4,8 °C/s, bez akwizycji.
    2. Wzmocnienie dwuetapowe: 30 cykli [95 °C, bez zatrzymania, szybkość narastania 4,8 °C/s, bez akwizycji; 64 °C, zatrzymanie 30 sekund, szybkość narastania 2,5 °C/s, pojedyncza akwizycja].
    3. Krzywa topnienia: 95 °C, 10 s, szybkość narastania 4,8 °C/s, bez akwizycji; 60 °C, 1 min, szybkość narastania 2,5 °C/s, bez akwizycji; 97 °C, szybkość narastania 0,1 °C/s, 5 akwizycji/°C (ciągła).
    4. Chłodzenie: 40 °C, 30 s, szybkość narastania 2,5 °C/s, bez akwizycji.
  2. Ustaw Format wykrywania na "Zielony barwnik interkalacyjny" na karcie Definicja uruchamiania.
  3. Ustaw kontrolkę pipetowania na "Sterowanie główne" na karcie Run Definition (Definicja przebiegu). Ta funkcja służy jako kontrola wewnętrzna i wykrywa obecność głównej mieszanki qPCR w każdym dołku z 1,536 płytki wielodołkowej, co jest przydatne do identyfikacji przypuszczalnych wyników fałszywie ujemnych.
  4. Włóż płytkę wielodołkową 1536 przygotowaną w krokach 2-4 do przyrządu 1,536 qPCR i uruchom program.

6. Analiza danych

  1. Wykonaj oględziny danych w oprogramowaniu qPCR.
    UWAGA: Oprogramowanie 1,536 umożliwia wizualizację zarówno krzywych wzmocnienia, jak i topnienia, a także mapę cieplną pokazującą wywołanie (dodatnie, ujemne, nieprawidłowe, nie dotyczy; Rysunek 2), wartość punktu przecięcia (przesuwająca się skala koloru dla dodatniego lub szary dla ujemnego; Rysunek 3) lub wartość fluorescencji punktu końcowego (EPF) (przesuwająca się skala kolorów).
  2. Eksport danych z oprogramowania 1,536 w postaci pliku .txt (tabela wyników) lub pliku .xml z danymi surowymi lub danymi obliczeniowymi do przetwarzania w trybie offline z urządzenia.
    UWAGA: Opatentowany algorytm wywoływania automatycznego punktu przecięcia (Cp) wbudowany w oprogramowanie 1,536 bierze pod uwagę kształt i nachylenie krzywej amplifikacji, określając wywołania wartości dodatnich/ujemnych i Cp z dużą pewnością, przy niskich objętościach reakcji submikrolitrowych przy stosunkowo niskich wartościach fluorescencji.
  3. Jeśli do qPCR użyto LightCycler DNA Green Master, sprawdź, czy wszystkie studzienki przeszły "kontrolę główną". Niepowodzenie oznacza, że studnia nie otrzymała głównej mieszanki qPCR, a brakujący punkt danych należy uznać za potencjalny wynik fałszywie ujemny. Sprawdź, czy wszystkie studzienki przeszły "kontrolę główną". Niepowodzenie oznacza, że studnia nie otrzymała wzorcowego DNA i uważa brakujący punkt danych za potencjalny fałszywie ujemny.

Wyniki

Przetestowano pary starterów PCRTag1 dla syntetycznego i dzikiego typu chromosomu 3 z wykorzystaniem genomowego DNA (gDNA) drożdży wyekstrahowanego z czterech różnych szczepów. Chromosom 3 posiada 186 par starterów PCRTag obejmujących całą długość chromosomu (synIII ma ok. 270 kb, a chromosom 3 typu dzikiego ok. 315 kb). Aby przetestować każdy z czterech szczepów przy użyciu obu zestawów starterów, podzielono płytkę wielodołkową na cztery kwadranty, po jednym dla każdego typu gDNA, przypisując syntetyczne startery PCRTag do górnej połowy każdego kwadrantu, a startery typu dzikiego do dolnej połowy. DNA genomowe wyekstrahowano ze szczepów drożdży, z których dwa kodują chromosom 3 typu dzikiego (typ dziki, synIXR2), natomiast pozostałe dwa kodują syntetyczny chromosom 3 (synIII1, synIII synIXR). Mieszaninę master mix do qPCR rozprowadzono do każdego dołka płytki wielodołkowej 1536 za pomocą dozownika cieczy masowych, a następnie dodano gDNA i startery PCRTag przy użyciu Echo 550. Startery rozmieszczono identycznie w każdym kwadrancie płytki wielodołkowej w celu ułatwienia porównania wizualnego. Płytkę wielodołkową uszczelniono termicznie za pomocą optycznie przejrzystej folii i poddano analizie PCR w czasie rzeczywistym.

W tym eksperymencie qPCRTag zaobserwowaliśmy w większości przypadków amplifikację zgodną z oczekiwaniami, w której primery syntetyczne amplifikowały wyłącznie DNA syntetyczne i vice versa (Rycina 2 oraz 3). Zaobserwowaliśmy jednak również kilka odchyleń od oczekiwanego wzorca, co sugeruje obecność wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich w zbiorze danych. W tym eksperymencie kontrola główna została wykryta w 100% studni, co wskazuje, że dozownik cieczy masowych pomyślnie rozprowadził mastermix do każdej studni na płytce (dane nie przedstawiono). Wyklucza to jedno z potencjalnych źródeł wyników fałszywie ujemnych. Dodatkowo wiadomo, że niektóre PCRTagi chromosomu 3 nie działają (pokazano na Rysunkach S6 i S7 w pracy Annaluru et al.1), w tym co najmniej 2 pary primerów SYN i 1 para WT; zatem studnie te można pominąć w każdym kwadrancie. Prawdziwe wyniki fałszywie ujemne mogłyby wynikać z braku przeniesienia matrycowego gDNA lub primerów, jednak w naszym doświadczeniu, przy prawidłowej kalibracji Echo 550 oraz przygotowaniu gDNA i primerów zgodnie z opisem, nie stanowiło to głównego źródła błędów. Ogólnie w tym eksperymencie wskaźnik wyników fałszywie ujemnych był niezwykle niski dla primerów WT z matrycą WT (~2%), choć nieco wyższy dla primerów SYN z DNA SYN (~8%).

Wyniki fałszywie dodatnie, czyli wykrycie sygnału w studzienkach, w których startery SYN są zmieszane z gDNA WT (i odwrotnie), mogą wynikać z amplifikacji krzyżowej lub powstawania dimerów starterów. Rzeczywiście, dimery starterów są często widoczne w elektroforezie żelowej (Rysunek 1B) i stanowią prawdopodobne źródło błędów. W przypadku zastosowania qPCR użyteczne może być badanie krzywych topnienia, aby określić, czy różne gatunki produktów, takie jak dimery starterów, mogą przyczyniać się do sygnału. Ponadto przeprowadzenie eksperymentu kontrolnego, w którym startery są dozowane wobec braku matrycowego DNA, może pomóc w zidentyfikowaniu starterów wykazujących tendencję do dimeryzacji. Amplifikację krzyżową można zaobserwować w elektroforezie żelowej, w szczególności jeśli przeprowadzono zbyt wiele cykli PCR lub jeśli temperatura przyłączania jest zbyt niska. Staraliśmy się zminimalizować liczbę wyników fałszywie dodatnich wynikających z amplifikacji krzyżowej poprzez optymalizację obu tych parametrów dla protokołu qPCRTag. Wreszcie, analiza wartości punktu przecięcia (Cp) dla każdej studzienki może pomóc w zidentyfikowaniu starterów, które nie nadają się do detekcji w czasie rzeczywistym (Rysunek 3, np. Bb22, Fb22, Bb46, Fb46). Ogólnie w tym eksperymencie odsetek wyników fałszywie dodatnich był niski dla starterów SYN z matrycą WT (~5%) i wyższy dla starterów WT z matrycą SYN (~10%).

Schemat macierzy wyników PCR pokazujący skuteczność starterów w próbkach DNA; zielony oznacza wynik dodatni, czerwony ujemny.
Rysunek 2: Mapa ciepła płytki przedstawiająca wyniki obecności/braku dla eksperymentu qPCRTag. Cztery różne typy genomowego DNA (kwadranty oddzielone ciągłymi białymi liniami) poddano analizie PCRTag z użyciem syntetycznych (SYN) oraz dzikiego typu (WT) starterów PCRTag dla chromosomu 3 (przerywane białe linie oddzielają SYN (góra) i WT (dół) w każdym kwadrancie). gDNA WT oraz synIXR kodują chromosom 3 typu dzikiego, co daje amplifikację z użyciem starterów PCRTag WT. gDNA synIII oraz synIII synIXR kodują syntetyczny chromosom 3, co daje amplifikację z użyciem starterów PCRTag SYN. Startery są ułożone zgodnie z ich pozycją na chromosomie od lewej do prawej i rozmieszczone identycznie w czterech kwadrantach w celu porównania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Diagram macierzowy przedstawiający wyniki amplifikacji DNA; analiza genetyczna synIII, synIXR.
Rycina 3: Mapa ciepła płytki przedstawiająca wartość punktu przecięcia (Cp) dla eksperymentu qPCRTag. Jest to ten sam zestaw danych, co na Rycini 2, zatem układ płytki jest identyczny. N/A oznacza „brak amplifikacji”. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Włączenie wykrywania PCR w czasie rzeczywistym do testu genotypowania PCRTag jest ważnym osiągnięciem dla projektu Sc2.0, ponieważ umożliwia znacznie większą przepustowość. Poprzedni przepływ pracy określał reakcje 2,5 μl w 384 dołkowych płytkach PCR, 1,5-godzinny czas trwania cykli termicznych, elektroforezę w żelu agarozowym i ręczną adnotację żelu.

Przedstawiony tutaj przepływ pracy, zwany analizą qPCRTag, pozwala przezwyciężyć kilka głównych wąskich gardeł. Po pierwsze, seria qPCRTag kondensuje 4 x 384 płytki dołkowe w pojedynczy eksperyment, który można przetworzyć od początku do końca (ustawienie płytki plus czas trwania) w ciągu około godziny. Należy zauważyć, że koszt odczynnika na studzienkę do analizy qPCRTag jest porównywalny z podejściem opartym na żelu agarozowym o niższej przepustowości. Jednak dzięki obejściu elektroforezy żelowej i ręcznej adnotacji, przepływ pracy qPCRTag zapewnia znaczne oszczędności czasu i pracy, co jest główną zaletą. Co ważne, przepływ pracy qPCRTag jest w pełni kompatybilny z automatyzacją.

Głównym problemem związanym z wykorzystaniem wykrywania w czasie rzeczywistym jako wyników testu PCRTag jest odsetek wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych. Ponieważ startery PCRTag nie zostały pierwotnie zaprojektowane do użytku w PCR w czasie rzeczywistym, oczekuje się, że nie wszystkie pary starterów będą odpowiednie do użycia z tym wyjściem. W tym celu ważne jest, aby z góry zweryfikować funkcję i swoistość wszystkich par starterów PCRTag, aby wykluczyć podzbiór, który nie działa w teście opartym na czasie rzeczywistym. Na przykład wyniki fałszywie dodatnie i ujemne PCRTag chromosomu 3 są w zasadzie odtwarzalne w danych PCR w czasie rzeczywistym (ryc. 2 i 3) i można je wykluczyć z dalszych analiz. Co więcej, pary starterów, o których wiadomo, że ulegają uszkodzeniu (oceniane za pomocą elektroforezy żelowej i pokazane na rysunkach S6 i S7 Annaluru i wsp.1) można również wykluczyć. Można to łatwo osiągnąć, po prostu wykluczając wadliwe pary starterów podczas ustawiania protokołu transferu akustycznego.

Podobnie jak w przypadku większości testów o wysokiej przepustowości, zamierzamy wykorzystać detekcję PCRTag w czasie rzeczywistym jako podstawowe badanie przesiewowe do identyfikacji transformantów, które zasługują na dalszą walidację. W związku z tym złotym standardem wtórnego badania przesiewowego pozostanie analiza PCRTag z elektroforezą żelową jako odczytem. Poza zastosowaniem analizy PCRTag dla Sc2.0, połączenie najnowocześniejszych nanoskalowych systemów obsługi cieczy z technologią Real Time PCR o wysokiej przepustowości umożliwia szybką i zautomatyzowaną analizę i może mieć wpływ na wiele dziedzin. Na przykład ten przepływ pracy można zastosować do wysokoprzepustowych badań przesiewowych bibliotek, diagnostyki chorób zakaźnych, analizy mikrobiomu i najnowocześniejszych podejść do edycji genomu próbujących jednocześnie modyfikować wiele loci.

Oświadczenia

L.A.M., N.A.P., J.A.M. i J.D.B. nie mają nic do ujawnienia. R.C. i A.L. są zatrudnieni przez Roche Life Science w USA i pracowali nad opracowaniem aplikacji we współpracy z L.A.M. w ramach eksperymentu potwierdzającego słuszność zasady.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez National Science Foundation Grant MCB-0718846 oraz Defense Advanced Research Projects Agency Contract N66001-12-C-4020 (dla J.D.B.). L.A.M. został sfinansowany przez stypendium podoktoranckie z Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada. Publikacja tego artykułu jest sponsorowana przez Roche.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przygotowanie drożdży gDNA
drożdże niestandardowyszablon gDNA do PCR w czasie rzeczywistym
Koraliki szklane płukane kwasem (0,5 mm)SigmaG8772liza komórek drożdży
Ultraczysty fenol:Chloroform:Alkohol izoamylowy (25:24:1, v/v)Invitrogen15593-031liza komórek drożdży
5432 MieszalnikEppendorf5432liza komórek drożdży
Mikrowirówka 5417REppendorf22621807liza komórek drożdży
Qubit 3.0 FluorometrLife TechnologiesQ33216Kwantyfikacja gDNA
Zestaw testowy Qubit dsDNA BRLife TechnologiesQ32850Kwantyfikacja gDNA
Płytka Labcyte 384PPLabcyteP-05525Płytka źródłowa gDNA
DNA Green Mastermix prep i dozowanie
LightCycler 1536 DNA GreenRoche5573092001real time PCR mastermix
1,5 ml Uchwyt na probówkę do mikrofugeARIEST BD060314-1uchwyt na probówkę do mikrofugi do pokładu Cobra
LightCycler 1536 Multiwell Plate
CobraArt Robbins Instruments630-1000-10dozuje główną mieszankę qPCR do 1536 płytka
PCR Plate SpinnerVWR89184-608cenzuracja 1536 plate
Dozowanie szablonów i
starterów PCRTag starteryIDTniestandardowewstępnie zmieszane do przodu i do tyłu, 50 i mu; M każda
folia uszczelniająca przebijana TempPlate, sterylnaUSA Scientific2923-0110tymczasowe uszczelnienie do płytek starterowych PCRTag
Płytka dołkowa Labcyte LDV 384LabcyteLP-0200wstępnie zmieszana płytka źródłowa startera
Echo 550 Liquid HandlerLabcyteprzenosi 2,5 nl kropli startera i matrycy DNA do płytki 1536
Plateloc Thermal Microplate SealerAgilentUszczelka termiczna G5402-90001do płyty 1536 przed uruchomieniem LC1536
Przezroczysta uszczelka trwałaAgilent24212-001optycznie przezroczysta uszczelka termiczna do płytki wielodołkowej LC1536
PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Stolik płytowyAgilentG5402-20008może zastąpić podkładki o grubości ~2 mm
Sorvall Legend XTRThermo Scientfic75-004-521wirówka zgrzewana płyta 1536
Przemysłowa sprężarka powietrzaJun Air1795011do uruchomienia Echo and Heat Sealer
Real Time PCR
LightCycler 1536Rochewymaga gniazdka 220 V
System obsługi cieczy Roche 5358639001

Bibliografia

  1. Annaluru, N., et al. Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome. Science. 344 (6179), 55-58 (2014).
  2. Dymond, J. S., et al. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design. Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).
  3. Goffeau, A., et al. Life with 6000 genes. Science. 274 (5287), 546-547 (1996).
  4. Dymond, J., Boeke, J. The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization. Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).
  5. Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit. Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).
  6. Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. Design-A-Gene with GeneDesign. Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).
  7. Lajoie, M. J., et al. Probing the limits of genetic recoding in essential genes. Science. 342 (6156), 361-363 (2013).
  8. Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast. Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).
  9. Dymond, J. S. Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae. Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).
  10. Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

syntetyczny genom dro d ygenotypowanie PCRTagakustyczny wyrzut kroplip ytka wielodo kowa 1536ekstrakcja DNA dro d ysyntetyczny chromosomstartery typu dzikiegoanaliza wysokoprzepustowa
Analiza qPCRTag - Wysokoprzepustowy test PCR w czasie rzeczywistym do genotypowania Sc2.0
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.