Artykuł metodologiczny

Charakterystyczne działanie kapilarne przez mikrokanały w matrycach przypominających kości może poprawić rekrutację komórek w celu przywrócenia dużego ubytku kostnego

DOI:

10.3791/52947

⸱

11 września 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Oral and Maxillofacial Surgery, Columbia University, 2Endodontics, Columbia University, 3Mechanical Engineering, Kyung Hee University, South Korea, 4Orthodontics, The Ohio State University, 5Pathology, Weill Cornell Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono ogólny proces tworzenia krok po kroku szablonu przypominającego kość z zaprojektowanymi mikrokanałami. Wysokie zdolności absorpcyjne i retencyjne matrycy wykazują działanie kapilarne za pośrednictwem mikrokanałów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bez aktywnej, dobrze rozwijającej się populacji komórek, która jest dobrze rozmieszczona i stabilnie zakotwiczona we wstawionym szablonie, wyjątkowa regeneracja kości nie następuje. W przypadku konwencjonalnych szablonów brak wewnętrznych mikrokanałów powoduje brak infiltracji komórek, dystrybucji i zasiedlenia głęboko w szablonach. W związku z tym wysoce porowaty i jednolicie połączony szablon przypominający beleczkowatą kość z mikrokanałami (matryca mikrośrodowiska biogennego; BMT) został opracowany w celu wyeliminowania tych przeszkód. Nowatorski BMT został stworzony w oparciu o innowacyjne koncepcje (działanie kapilarne) i wyprodukowany przy użyciu techniki powlekania gąbką i szablonem. BMT składa się z kilku elementów strukturalnych: połączonych ze sobą porów pierwotnych (300-400 μm), które naśladują pory w kości beleczkowej, mikrokanałów (25-70 μm) w każdej beleczce oraz nanoporów (100-400 nm) na powierzchni, które umożliwiają zakotwiczenie komórek. Co więcej, w badaniach testów mechanicznych udokumentowano, że BMT ma podobne właściwości wytrzymałości mechanicznej do ludzkiej kości beleczkowej (~3,8 MPa)12.

BMT wykazywało wysoką absorpcję, retencję i zamieszkiwanie komórek w szablonach w kształcie mostu (Π) (3 cm wysokości i 4 cm długości). Komórki, które początkowo zostały zasiane na jednym końcu matryc, natychmiast zmobilizowały się na drugi koniec (odległość 10 cm) przez kapilarne działanie BMT na pożywkę komórkową. Po 4 godzinach komórki jednorodnie zajmowały cały BMT i wykazywały normalne zachowanie komórkowe. Działanie kapilarne odpowiadało za infiltrację komórek zawieszonych w pożywce i dystrybucję (aktywną migrację) w całym BMT. Obserwując te możliwości BMT, przewidujemy, że BMT będą wchłaniać komórki szpiku kostnego, czynniki wzrostu i składniki odżywcze z obwodu w warunkach fizjologicznych.

BMT może rozwiązać obecne ograniczenia poprzez szybką infiltrację, jednorodne rozmieszczenie i zasiedlenie komórek w dużych, objętościowych szablonach w celu naprawy masywnych wad szkieletu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ostatecznym celem inżynierii tkanki kostnej za pomocą syntetycznych konstruktów jest włączenie konstruktów do kości gospodarza, ponowne zasiedlenie konstruktów komórkami gospodarza oraz odtworzenie wymiany gazów i płynów ustrojowych w celu przywrócenia normalnej funkcji kości. W ciągu ostatniej dekady przeprowadzono wiele badań nad zastosowaniem biomateriałów polimerowych i ceramicznych do produkcji rusztowań1,2. Jednak idealny materiał i technika wytwarzania dla optymalnej regeneracji tkanki kostnej nie zostały jeszcze zidentyfikowane. Ponadto nie ma ogólnego sukcesu we wprowadzaniu tych technologii do kliniki, zwłaszcza w przypadku rekonstrukcji i odbudowy dużych ubytków kostnych. W związku z tym przywrócenie krytycznych ubytków kostnych nadal pozostaje wyzwaniem klinicznym1-5.

Idealnie, rusztowania do regeneracji tkanki kostnej powinny wykazywać biokompatybilność bez powodowania reakcji zapalnych lub reakcji na ciała obce/toksyczne, mieć ściśle dopasowane właściwości mechaniczne w porównaniu do natywnych kości i posiadać mechanizm umożliwiający dyfuzję i/lub transport jonów i składników odżywczych. Równie pożądane jest silne wiązanie z kością gospodarza, dynamiczny wzrost kości, wrastanie naczyń krwionośnych i biodegradacja rusztowań. Chociaż zastosowanie biodegradowalnych rusztowań polimerowych wykazało postęp w zakresie wrastania tkanek, istnieją kontrowersje dotyczące ich stosowania do regeneracji kości.

Pomimo tych rozległych wysiłków, wysoce zorganizowane strukturalne syntetyczne konstrukty nadal mają ograniczony potencjał w pokonywaniu przeszkód w postaci pasywnej penetracji komórek. Większość z tych podejść doprowadziła do wrastania tkanek in vitro o przekrojach od mniej niż kilku μm do kilku mm od powierzchni zewnętrznej, niepełnej integracji z kością gospodarza i tylko częściowej regeneracji kości in vivo6,7. Pionierskie komórki nie migrują głęboko w głąb konstruktów z powodu braku początkowej siły, która wciąga je do środka, zanim rozpocznie się kolonizacja komórki. W związku z tym kolonizacja komórek zachodzi ściśle na obrzeżach rusztowania, stając się przeszkodą od obwodu do środka rusztowania. W ten sposób dyfuzja tlenu i składników odżywczych do wewnętrznych części matryc staje się ograniczona8. Dlatego jasne jest, że architektura rusztowań (wielkość porów, porowatość, wzajemne połączenia i przepuszczalność), która wpływa na transport i dyfuzję substancji w rusztowaniach, ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia dobrze rozłożonej proliferacji i różnicowania komórek9,10. Chociaż fosforany wapnia były używane w przeszłości do produkcji rusztowań, różne procesy i procedury często skutkowały rusztowaniami z fosforanu wapnia o różnej architekturze. W związku z tym wybór procesu produkcyjnego staje się ważny w dyktowaniu architektury rusztowania potrzebnej do skutecznej regeneracji tkanki kostnej.

Podsumowując, nadal istnieją dwa główne niedociągnięcia inżynierii tkanki kostnej, którymi należy się zająć: początkowa rekrutacja komórek do matrycy przed przyłączeniem i kolonizacją komórki oraz jakość przepływu substancji zarówno do szablonu, jak i z niego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie gąbki poliuretanowej (PU) jako szablon

  1. Użyj gąbek PU do wytworzenia szablonów hydroksyapatytu zawierających łączące się pory. Użyj każdej gąbki, aby zapewnić pierwotne beleczki do tworzenia rozpórek szablonowych, a także do tworzenia mikrokanałów w beleczkach.
  2. Wytnij i przytnij gąbki o powierzchni 80 ppi (pory na cal) w 2 kształty mostków o wymiarach 3,5 cm wysokości x 5 cm długości x 1,5 cm szerokości.
    Uwaga: Wymiary i kształty można wybrać zgodnie z żądanym rozmiarem porów podstawowych: 100 ppi, 80 ppi i 60 ppi.
  3. Przygotować 100 ml 4% (m/v) roztworu NaOH za pomocą zlewki o pojemności 150 ml; następnie zanurzyć i wycisnąć, aż przygotowane gąbki całkowicie nasiąkną.
  4. Po namoczeniu umieścić zlewkę z gąbkami w ultrasonografie (42 kHz).
  5. Ultradźwiękowo poddaj gąbki PU obróbce wstępnej przez 15-20 minut bez podgrzewania, aby zmodyfikować właściwości powierzchni.
  6. Płukać wodą destylowaną przez 5-10 min. Podczas płukania ściśnij gąbki i pozwól im rozszerzyć się 5 do 7 razy, aby usunąć resztki NaOH znajdujące się wewnątrz gąbek.
  7. Ściskaj gąbki ręcznikami papierowymi w celu usunięcia nadmiaru wody, a następnie susz je w piekarniku w temperaturze 60-80 °C.

2. Przygotowanie gnojowicy hydroksyapatytu (HA) do powlekania

  1. Przed przygotowaniem zawiesiny kwasu hialuronowego należy zmierzyć wagę zlewki za pomocą mieszadła magnetycznego. Pomiar ten zostanie wykorzystany do obliczenia stosunku proszku do cieczy.
  2. Odmierz 10 g proszku HA o rozmiarach nano.
  3. Dodać 20 ml wody destylowanej do zlewki o pojemności 50 ml. Podgrzać do temperatury 120-140 °C i wymieszać za pomocą mieszadła magnetycznego z płytą grzejną.
  4. Dodaj 0,3 g (3% w/w) alkoholu poliwinylowego (PVA) (89 000-98 000 MW) na proszek do wody destylowanej, mieszając przy 300-400 obr./min.
  5. Mieszaj, aż PVA całkowicie się rozpuści. Roztwór powinien być klarowny po całkowitym rozpuszczeniu PVA.
  6. Wyłącz ogień i dodaj 0,1 g (1% w/w) karboksymetylocelulozy sodowej (CMC) (o bardzo niskiej lepkości) na proszek, mieszając przy 400-500 obr./min. Roztwór powinien być klarowny po całkowitym rozpuszczeniu PVA.
  7. Mieszaj, aż CMC całkowicie się rozpuści i ostudź do temperatury pokojowej.
  8. Dodać 0,3 g (3% w/w) dyspergatora amonowo-poliakrylowego na proszek, mieszając przy 300-400 obr./min. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
  9. Dodaj 0,2 g (2% w/w) gliceryny na proszek, mieszając przy 300-400 obr./min. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
  10. Powoli rozprowadź proszek HA w roztworze, mieszając z prędkością 600-900 obr./min i mieszaj przez 5 minut.
  11. Sonikować przez 5 minut za pomocą ultradźwięków, aby zapewnić dyspersję jakiejkolwiek aglomeracji proszku HA.
  12. Dodać dodatkowe 5 ml wody destylowanej do mieszaniny, mieszając przy 600-900 obr./min i podgrzewać w temperaturze 90-100 °C.
  13. Mieszaj mieszaninę za pomocą mieszadła magnetycznego z prędkością 600-800 obr./min w temperaturze 90-100 °C, aby odparować zawartość wody.
  14. Od czasu do czasu odmierzać całą masę, łącznie ze zlewką i mieszanką, aż do uzyskania stosunku proszek/ciecz 1,75-1,8.
  15. Formatując stosunek proszku do cieczy, podzielić masę proszku przez całkowitą masę mieszaniny (2.14), łącznie z proszkiem, odczynnikami i wodą, pomniejszoną o masę zlewki i mieszadła (2.1) i pomniejszoną o proszek kwasu hialuronowego (2.2).
    Uwaga: Na przykład: Jeśli A (cała mieszanina wraz z proszkiem, odczynnikami i wodą) wynosi 49,05 g, B (zlewka z mieszadłem) wynosi 33,5 g, a C (proszek HA) wynosi 10 g,
    C/(A-B-C) = 10/(49,05-33,5-10) = 1,80
  16. Poczekaj, aż gnojowica ostygnie do temperatury pokojowej przed użyciem do powlekania.

3. Powlekanie HA, suszenie i spiekanie

  1. Przygotowane gąbki PU pokryć zawiesiną powlekającą HA za pomocą szpatułki ze stali nierdzewnej, aż gnojowica zostanie równomiernie rozprowadzona w gąbce PU na szklanej płycie.
    Uwaga: Po usunięciu nadmiaru gnojowicy niektóre pory mogą być nadal zatkane gnojowicą ze względu na wysoką lepkość gnojowicy.
  2. Aby zapewnić wzajemne połączenia, jednorodność i otwarte pory, należy lekko przedmuchać szablony pokryte HA za pomocą sprężarki powietrza. Proces ten zapewnia, że szablony są jednorodnie pokryte zarówno na wewnętrznej, jak i zewnętrznej powierzchni gąbki PU.
    Uwaga: Jeśli nie zostanie uzyskana jednorodna powłoka, szablony pokryte HA zapadną się podczas procesu spiekania, a także mogą pękać podczas przenoszenia z powodu niskiej wytrzymałości mechanicznej. Dodatkowo jednorodna powłoka ma kluczowe znaczenie w tworzeniu mikrokanalików w beleczkach.
  3. Szablony pokryte kwasem hialuronowym należy suszyć przez co najmniej 5 godzin w warunkach chłodzenia (20-25 °C) z delikatną cyrkulacją powietrza. Wydłuż jednak czas schnięcia w zależności od rozmiaru szablonu.
    Uwaga: Po wyschnięciu szablony pokryte kwasem hialuronowym zazwyczaj kurczą się o około 8% do 10% w każdym wymiarze.
  4. Po zakończeniu procesu suszenia umieścić szablony pokryte kwasem hialuronowym w tyglu z tlenku glinu. Następnie umieść je w piecu wysokotemperaturowym i użyj następującego 8-stopniowego profilu spiekania.
    1. Podgrzewać 2 °C/min do 230 °C.
    2. Podgrzewać 1 °C/min do 280 °C.
    3. Podgrzewać 0,5 °C/min do 400 °C.
    4. Podgrzewać 3 °C/min do 600 °C. Przechowywać w temperaturze 600 °C przez 1 godzinę.
    5. Podgrzewać 5 °C/min do 1230 °C. Utrzymywać temperaturę 1 230 °C przez 3 godziny.
    6. Chłodzenie 5 °C/min do RT.
      Uwaga: Spiekanie dodatkowo zmniejszy szablony gąbek pokrytych HA o około 22% – 25% w każdym wymiarze.

4. Wejście i zamieszkiwanie komórek do szablonu

  1. Hodowla przedosteoblastycznych komórek MC3T3 w pożywce nieosteogennej składającej się z α-MEM, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykami (streptomycyną i penicyliną) w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5%CO2.
  2. Dodać 10 ml zawiesiny komórek o gęstości 2 x 106 komórek do pojedynczego dołka w płytce 6-dołkowej.
  3. Umieść szablon w kształcie mostka o wymiarach 3 cm x 4 cm x 1 cm pionowo na płytce 6-dołkowej. Umieścić jedną nogę szablonu na płytce zawierającej zawiesinę komórek, a drugą nogę w sąsiednim pustym dołku.
  4. Pozostawić matrycę do wchłonięcia zawiesiny komórek przez 10 minut.
  5. Następnie dodać 5 ml pożywki do studzienki, która była pierwotnie wypełniona zawiesiną komórkową.
  6. Uzupełniaj pożywkę w obu studzienkach co 2 lub 3 dni, aż do upływu 7 dni.
  7. Określ skuteczność ruchliwości komórek za pomocą barwienia hematoksyliną i eozyną11.
    1. Napraw komórki i rusztowanie, zanurzając je w 100% EtOH na 20-30 minut.
    2. Barwienie hematoksyliną przez 1-2 min.
    3. Płukać wodą destylowaną przez 1-2 minuty dwa razy.
    4. Odwodnić przez zanurzenie w 70%, następnie 95%, a następnie 100% EtOH przez 1-2 minuty każdy.
    5. Barwienie Eozyną przez 20-30 sek.
    6. Płukać wodą destylowaną przez 12 minut przez dwa razy.
    7. Odwodnić przez zanurzenie w 70%, 80%, 90% i 100% EtOH na 1-2 minuty każdy.
    8. Osadź rusztowanie w żywicy akrylowej w celu przekrojenia i obrazowania.
  8. Określić żywotność komórek za pomocą testu żywotności komórek bromku 3-[4,5-dimetylotiazol-2-ylo]-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) i testu żywych/martwych komórek (zestaw do barwienia żywych/martwych komórek) w punktach czasowych 3 i 711,
    Uwaga: Schemat protokołów wytwarzania szablonów przypominających kości jest przedstawiony w sesji "Reprezentatywne wyniki".

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólna struktura BMT wykazuje unikalny trójwymiarowy szablon z wewnętrznymi strukturami przypominającymi kości beleczkowe. BMT zawiera makropory, mikrokanały i nanopory. Przejrzyste konfiguracje w pełni połączonych makroporów (średnia wielkość 320 μm), mikrokanałów (średnia średnica 50 μm) i nanoporów (średnia wielkość 100 nm) zostały zweryfikowane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (EVO-40; ZEISS), a także za pomocą mikrotomografii.

Rysunek 1 pokazuje szczegółowe protokoły krok po kroku podczas tworzenia BMT. Poprzez precyzyjną kontrolę protokołów od przygotowania gąbek PU do procesu spiekania (P1 – P7; Rysunek 1), można uzyskać następujące cechy: bardzo gęstą i gładką powierzchnię po pokryciu kwasem hialuronowym i wyschnięciu; precyzyjnie ukształtowany i zwymiarowany szablon 3D; w pełni połączona porowata sieć beleczkowa podobna do kości beleczkowej; oraz mikrokanały w obrębie każdej beleculi, które naśladują kanały wewnątrzkostne, takie jak kanały Haversa i kanały Volkmanna (ryc. 2 i 3). Ponadto w teście wytrzymałości na ściskanie zmierzono stosunkowo wysoką wytrzymałość mechaniczną (~3,8 MPa), podobną do wytrzymałości ludzkiej kości beleczkowej. Bardzo zbliżone parametry histomorfometryczne do parametrów kości beleczkowej kręgów lędźwiowych człowieka potwierdzono za pomocą analizy mikrotomografii komputerowej12. Na rysunku 4 wykazano różne wielkości działania kapilar za pomocą różnych średnic kapilar za pomocą symulacji obliczeniowej. Dzięki tym symulacjom przewidywaliśmy, że BMT będzie wykazywać różne szybkości absorpcji w obrębie porów pierwotnych (300-400 μm) i mikrokanałów (25-70 μm) w zależności od średnic. Mniejsze naczynia włosowate wykazywały silniejsze zdolności absorpcyjne. Założenie to zostało zweryfikowane w tym eksperymencie, jak pokazano na rysunku 5.

BMT wykazywało wysoce efektywną absorpcję i zatrzymywanie płynów poprzez kapilarne działanie struktur mikrokanałowych; niebieskie plamy Stevenela były używane jako płynne medium do łatwego śledzenia przepływu (Rysunek 5). Na podstawie symulacji obliczeniowej zaobserwowano, że BMT w tych konfiguracjach absorbuje i utrzymuje zawiesiny komórek na odległość do 8,5 cm w ciągu 10 sekund. Ze względu na silne działanie kapilarne wywołane przez struktury wewnętrzne, zabarwione podłoże dotarło do przeciwległego końca szablonu w kształcie mostu o wymiarach 3 cm (wysokość) x 4 cm (długość) x 1 cm (szerokość) w ciągu 1 minuty i 40 sekund. Ponadto zaobserwowano aktywną mobilizację komórek i włączenie do BMT (ryc. 6). Następnie jednorodna mobilizacja i przyłączenie komórek spowodowało zwiększoną proliferację i tworzenie macierzy w równomiernie rozłożonej formacji. Co więcej, długodystansowa (~ 10 cm) migracja komórek przez BMT została zwalidowana natychmiast po nasyceniu BMT zawiesiną komórkową. Wysiane komórki przetrwały w segmencie matrycy, który był wystawiony na działanie powietrza i nie był zanurzony w pożywce hodowlanej. W tym eksperymencie pożywka hodowlana została dostarczona do komórek wyłącznie w studzienkach dotykających tylko nóg rusztowania. Działanie kapilarne wykazywane przez mikrokanaliki pozwoliło następnie świeżemu medium dotrzeć do górnej, mostkowej części rusztowania. Po 3 dniach hodowli matryca została zajęta przez szybko proliferujące komórki. Po 7 dniach hodowli każdy bełeczka został owinięty przez matryce pozakomórkowe i osadzony w komórkach13.

figure-results-1
Rysunek 1. Ogólny protokół wytwarzania szablonu przypominającego kość, od wstępnej obróbki gąbki PU (P1) do końcowej obróbki cieplnej (P7). Utrzymanie precyzyjnego profilu spiekania po P7 ma kluczowe znaczenie dla uzyskania korzystnej wytrzymałości mechanicznej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2. Reprezentatywny mikroskop stereoskopowy (AmScope; SM-2TZ-M) (x4) gąbki PU o rozmiarze 80 ppi (po lewej), pokrytej HA i suszonej BMT (w środku) oraz spiekanej BMT (po prawej). (Wymiary: 3 cm wysokości x 4 cm długości x 1 cm szerokości). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Obrazy SEM i mikro-CT matrycy biogennej: (A) ogólny obraz matrycy biogennej, (B, C, D) obrazy mikrokanałów. W celu uwidocznienia wyraźnych mikrokanalików w beleczkach matrycę poddano granulacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4. Obliczenia obliczeniowe działania kapilar o różnych średnicach kanałów. W tym samym okresie czasu (0,4 ms), podczas gdy największa kapilara (d=300 μm: odnosi się do porów pierwotnych) wchłonęła medium (niebieskie) do 0,16 mm wysokości, najmniejsza kapilara (d=30 μm: odnosi się do mikrokanału) wchłonęła pożywkę do 0,415 mm wysokości. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5. Obrazy wykazały różnice w zdolnościach absorpcyjnych działania kapilarnego w zależności od różnych rozmiarów porów pierwotnych i mikrokanałów (wielkość porów pierwotnych odnosi się do średniej średnicy: 60 ppi ≈ 470 μm, 80 ppi ≈ 320 μm, 100 ppi ≈ 200 μm). Żółte linie reprezentują działanie kapilarne wywołane przez połączenie porów pierwotnych i mikrokanałów. Czerwone linie reprezentują działanie kapilarne indukowane głównie przez mikrokanaliki wykazywane w każdej beleczce. Jak pokazano w (F), matryca 100 ppi indukowała najsilniejsze działanie kapilarne, co skutkowało całkowitym nasyceniem matrycy w ciągu 39 sekund. Następnie przetestowano szablony 80 ppi i 60 ppi. (B) 0 s, (C) 0,5 s, (D) 1,5 s, (E) 17,0 s, (F) 39,0 s, (G) 50,0 s i (H) 1 min 18 s po zanurzeniu. (Wymiar szablonu: 1 cm x 1 cm x 4 cm wysokości prostopadłościanu). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6. Wnikanie i imigracja komórek z dołków z nasionami (część I) do studzienek niezasiewanych (część V) przez matryce biogenne indukowane działaniem kapilarnym. Początkowo wysiane komórki dotarły do końca nieobsianej nogi (część V) natychmiast po pełnym nasyceniu. Po 3 dniach zbieg komórek był widoczny w całym szablonie. Po 7 dniach w populacjach komórkowych doszło do powstania czasoprzestrzennej macierzy kolagenowej (barwienie H&E). (Wymiary szablonu: 3 cm wysokości x 4 cm długości x 1 cm szerokości). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wieloskładnikowy szablon zawierający komórki, czynniki wzrostu, składniki odżywcze itp. jest potrzebny do skutecznej regeneracji kości i funkcjonalnego przywrócenia krytycznych ubytków kostnych o dużych rozmiarach. W ramach tych czynników niezbędne są anatomicznie zgodne właściwości biologiczne. Aby osiągnąć funkcjonalność biologiczną, matryca musi wykazywać biozgodność, przewodnictwo kostne, integralność mechaniczną, wystarczającą powierzchnię, odpowiednią teksturę powierzchni oraz środki transportu tlenu i składników odżywczych. Na poziomie komórkowym następujące cechy są szczególnie istotne dla funkcjonalnego przywrócenia masywnych ubytków kostnych: ułatwiona penetracja do matrycy (aktywna rekrutacja), równomierne rozmieszczenie w całej matrycy (retencja), przyspieszona proliferacja i wysoka żywotność (zamieszkiwanie). Wreszcie, późniejsze tworzenie znacznej macierzy zewnątrzkomórkowej i wyzwalanie ekspresji genów ma kluczowe znaczenie w podstawowych procesach biologicznych, takich jak szybkie unaczynienie i osteogeneza.

Zaproponowano wiele różnych rodzajów syntetycznych substytutów w celu zastąpienia przeszczepów auto-/allo-kostnych. Jednak obecna organizacja rusztowań nie wykazuje wewnętrznego mikrośrodowiska zawierającego mikrokanały i nanopory, a zatem nie ułatwia aktywnie infiltracji, dystrybucji i zasiedlenia komórek w głąb syntetycznych substytutów, które są większe niż 10 mm. Nie dostarczają one fizycznych wskazówek dla pionierskich komórek, aby wydajnie, szybko i równomiernie migrować w głąb matrycy kostnej. Zamiast tego ograniczona pasywna rekrutacja komórek tworzy nierównomiernie rozmieszczone populacje komórek między zewnętrznymi i wewnętrznymi obszarami rusztowania. To nie tylko pogarsza początkowe wyzwanie związane z dotarciem komórek do wewnętrznego rdzenia matrycy, ale także utrudnia przepływ składników odżywczych i komunikację komórek z drugim końcem syntetycznego substytutu. Ten rodzaj nieproporcjonalnej rekrutacji i zasiedlenia komórek powoduje śmierć komórki i niepełny wzrost kości po wszczepieniu rusztowania do organizmu14,15.

W związku z tym wprowadziliśmy koncepcję działania kapilarnego jako podstawową fizyczną wskazówkę do rozwiązania tych przeszkód. Dokładnie zaprojektowaliśmy mikrokanały w BMT, aby indukować działanie kapilarne, które będzie odpowiadać za główną siłę ciągnącą, odpowiedzialnie za aktywną rekrutację komórek w głąb BMT.

Technika powlekania gąbką PU ma kilka unikalnych właściwości. Po pierwsze, pozwala na łatwe przygotowanie dobrze kontrolowanych porowatych struktur beleczkowych, które z kolei zależą od predefiniowanych struktur szablonowych (tj. szablon 80 porów na cal dla 300-400 μm). Jest to bardzo ważne dla optymalizacji wielkości porów pod kątem infiltracji osteoblastów15. Po drugie, technika ta umożliwia budowę połączonych ze sobą mikrokanałów, które odpowiadają za znaczącą rolę inicjalizacji relokacji komórek11. Po trzecie, nie ma prawie żadnych ograniczeń podczas korzystania z gąbki PU w zakresie tworzenia niestandardowych kształtów i rozmiarów szablonów. Producent może użyć nożyczek do prostych kształtów, a nawet do komputerowego cięcia laserowego do skomplikowanych geometrii. Korzystając z tych precyzyjnie kontrolowanych technologii, stworzyliśmy BMT. Kwas hialuronowy został wybrany jako materiał wyjściowy ze względu na jego biokompatybilność i zdolność osteokondukcyjną17.

W tym badaniu należy zwrócić uwagę na kilka krytycznych kroków. Podczas przygotowywania zawiesiny kwasu hialuronowego, jeśli temperatura jest zbyt wysoka, a prędkość mieszania zbyt niska, gnojowica kwasu hialuronowego utknie na dolnych krawędziach zlewki i wyschnie. Po procesie powlekania podczas wydmuchiwania nadmiaru zawiesiny HA, zbyt wysokie ciśnienie powietrza może wywołać pęknięcia na powierzchni BMT. Ważne jest, aby utrzymać stosunkowo niskie ciśnienie powietrza, aby prawidłowo przewietrzyć tylko nadmiar gnojowicy HA. Wreszcie drugi i trzeci etap procesu spiekania są najważniejsze (podgrzewanie 1 °C/min do 280 °C i podgrzewanie 0,5 °C/min do 400 °C). W tym zakresie temperatur gąbka PU całkowicie się wypali, podczas gdy kwas hialuronowy stanie się gęsty. Jeśli ten protokół nie będzie ściśle przestrzegany, BMT zostanie zapadnięty lub pokruszony po spiekaniu się.

BMT opisany w tym badaniu ma kilka zalet. Po pierwsze, połączone ze sobą makropory (300-400 μm) naśladują te z ludzkiej kości beleczkowej i umożliwiają płynny przepływ szpiku kostnego. Po drugie, matryce składają się z mikrokanałów (25-50 μm) w każdej przegrodzie beleczkowej, aby przyspieszyć początkowe wnikanie komórek kostnych poprzez działanie kapilarne. Jak wykazano za pomocą symulacji obliczeniowej13, gdyby matryca miała tylko pory pierwotne 300 μm (pory pierwotne) i nie miała mikrokanałów, działanie kapilarne byłoby niewystarczające do pełnego nasycenia matrycy szpikiem kostnym. Dotyczy to zwłaszcza defektów o dużych rozmiarach, które wymagałyby szablonów o dużych rozmiarach. Kanały o rozmiarach mikrometrycznych wykazują wysoce efektywną absorpcję płynów, dlatego spodziewaliśmy się, że mikrokanały będą przede wszystkim odpowiedzialne za działanie kapilarne w naszym badaniu. Po trzecie, nasze BMT mają strategicznie rozmieszczone nanopory. Dane z literatury wskazują, że komórki są szczególnie wrażliwe na nanowzorce18,19; Dlatego spodziewaliśmy się, że nanopory na ściankach mikrokanałów będą odgrywać rolę w zwiększaniu przyczepiania komórek. Nanometryczne pory (100-400 nm) na powierzchni przegrody beleczkowej pozwoliły unieruchomionym komórkom zakotwiczyć się. Ogólnie rzecz biorąc, połączone efekty tych trzech wewnętrznych struktur skutkowały zwiększoną mobilizacją i adhezją komórek w całym szablonie. Istnieją jednak pewne ograniczenia protokołu i krytycznych kroków do wytworzenia idealnego BMT. Na przykład często przygotowuje się dużą ilość zawiesiny kwasu hialuronowego ze względu na trudności w utrzymaniu jednorodnej lepkości podczas powlekania. Istnieje również ograniczenie w wykonywaniu szablonów o objętości większej niż 5cm3 ze względu na czas pracy podczas powlekania. Grubość powłoki ma kluczowe znaczenie, które różni się w zależności od technik producenta.

Wyniki naszego badania sugerują, że BMT zdolne do wchłaniania i zatrzymywania komórek będzie oferować potencjalne korzyści w porównaniu z konwencjonalnymi rusztowaniami alloplastycznymi (lub syntetycznymi). Rozważane jest badanie prospektywne w celu zweryfikowania korzyści BMT dla osteogenezy i / lub angiogenezy wraz z czynnikami wzrostu związanymi z kośćmi. Dlatego twierdzimy, że nasze unikalne rusztowanie BMT może rozwiązać główne bariery związane z niewystarczającą infiltracją szpiku kostnego do syntetycznych konstruktów i niepełną regeneracją kości w dużych ubytkach.

Ostatecznym celem tego badania jest uproszczenie obecnego paradygmatu bioinżynierii w odbudowie kości i odbudowie funkcjonalnej w krytycznych ubytkach kostnych poprzez wyeliminowanie konieczności czasochłonnych / pracochłonnych procesów izolacji i ekspansji komórek zrębu szpiku kostnego. Wreszcie, naszym celem jest wykorzystanie anatomicznie zgodnych konstruktów 3D z mikrokanałami i nanoporami, które indukują szybką absorpcję komórek, jednorodną dystrybucję i zamieszkiwanie w celu rekonstrukcji kości.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
gąbka poliuretanowaPlastifoamPU-3215
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich167176
Hydroksyapatyt w proszkuOssgen
Alkohol poliwinylowySigma-Aldrich341584
sól sodowa karboksymetylocelulozySigma-Aldrich360384
poliakrylan amonuVanderbiltDARVAN 821A
GlicerynaSigma-AldrichG2289

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Petrie Aronin, E. C., et al. Comparative effects of scaffold pore size, pore volume, and total void volume on cranial bone healing patterns using microsphere-based scaffolds. J Biomed Mater Res A. 89 (3), 632-641 (2009).
  2. Guzmán, R., et al. Chitosan scaffolds containing calcium phosphate salts and rhBMP-2: in vitro and in vivo testing for bone tissue regeneration. PLoS One. 9 (2), e87149(1371).
  3. Cha, J. K., et al. Sinus augmentation using BMP-2 in a bovine hydroxyapatite/collagen carrier in dogs. J Clin Periodontol. 41 (1), 86-93 (2014).
  4. Karageorgiou, V., Kaplan, D. Porosity of 3D biomaterial scaffolds and osteogenesis. Biomaterials. 26 (27), 5474-5491 (2005).
  5. Fisher, M. B., Mauck, R. L. Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation. Tissue Eng Part B Rev. 19 (1), 1-13 (2013).
  6. Manassero, M., et al. Regeneration in Sheep Using Acropora Coral, a Natural Resorbable Scaffold, and Autologous Mesenchymal Stem Cells. Tissue Eng Part A. 19 (13-14), 1554-1563 (2013).
  7. Reichert, J. C., et al. A tissue engineering solution for segmental defect regeneration in load-bearing long bones. Sci Transl Med. 4 (141), 141ra93(2012).
  8. Sachlos, E., Czernuszka, J. T. Making Tissue Engineering Scaffolds Work. Review on The Application of Solid Freeform Fabrication Technology to The Production of Tissue Engineering Scaffolds. Eur Cell Mater. 5, 29-40 (2003).
  9. Woodard, J. R., et al. The mechanical properties and osteoconductivity of hydroxyapatite bone scaffolds with multi-scale porosity. Biomaterials. 28 (1), 45-54 (2007).
  10. Correia, C., et al. Acta Biomater. 8 (7), 2483-2492 (2012).
  11. Wang, H., Li, Y., Zuo, Y., Li, J., Ma, S., Cheng, L. Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 28 (22), 3338-3348 (2007).
  12. Oh, D. S., et al. Bone marrow absorption and retention properties of engineered scaffolds with micro-channels and nano-pores for tissue engineering: a proof of concept. Ceram Int. 39 (7), 8401-8410 (2013).
  13. Hong, M. H., Kim, Y. H., Ganbat, D., Kim, D. G., Bae, C. S., Oh, D. S. Capillary action: enrichment of retention and habitation of cells via micro-channeled scaffolds for massive bone defect regeneration.J. Mater Sci Mater Med. 25 (8), 1991-2001 (2014).
  14. Volkmer, E., et al. Hypoxia in static and dynamic 3D culture systems for tissue engineering of bone. Tissue Eng. Part A. 14 (8), 1331-1340 (2008).
  15. Malda, J., Klein, T. J., Upton, Z. The roles of hypoxia in the in vitro engineering of tissues. Tissue Eng. 13 (9), 2153-2162 (2007).
  16. Macchetta, A., Turner, I. G., Bowen, C. R. Fabrication of HA/TCP scaffolds with a graded and porous structure using a camphene-based freeze-casting method. Acta Biomater. 5 (4), 1319-1327 (2009).
  17. Cox, S. C., Thornby, J. A., Gibbons, G. J., Williams, M. A., Mallick, K. K. 3D printing of porous hydroxyapatite scaffolds intended for use in bone tissue engineering applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 47, 237-247 (2015).
  18. Wan, Y., et al. Adhesion and proliferation of OCT-1 osteoblast-like cells on micro- and nano-scale topography structured poly(l-lactide). Biomaterials. 26 (21), 4453-4459 (2005).
  19. Zhao, L., Mei, S., Chu, P. K., Zhang, Y., Wu, Z. The influence of hierarchical hybrid micro/nano-textured titanium surface with titania nanotubes on osteoblast functions. Biomaterials. 31 (19), 5072-5082 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Matryca kostnapow oka z hydroksyapatytuinfiltracja kom rkowako g bczastamatryca g bczastamigracja kom rekregeneracja ko ciin ynieria tkankowa

Powiązane artykuły