Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Podsumowanie

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Streszczenie

Znaczenie migracji komórek można dostrzec poprzez rozwój ludzkiego życia. Kiedy komórki migrują, generują siły i przenoszą te siły na otoczenie, co prowadzi do ruchu komórek i migracji. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać i/lub wpływać na migrację komórek, można badać te siły. Teoretycznie zrozumienie podstawowych mechanizmów i sił leżących u podstaw migracji komórek daje nadzieję na skuteczne podejścia do leczenia chorób i promowania przeszczepów komórkowych. Niestety, nowoczesne komory chemotaksyjne, które zostały opracowane, są zwykle ograniczone do dwóch wymiarów (2D) i mają złożone gradienty dyfuzji, które utrudniają interpretację eksperymentu. W tym celu opracowaliśmy i opisaliśmy w tym artykule komorę z bezpośrednim widokiem do badań nad chemotaksją, która pozwala na pokonanie nowoczesnych przeszkód w komorze chemotaksji, zdolnej do pomiaru sił komórkowych i stężenia właściwego w komorze w środowisku 3D w celu badania migracji komórek 3D. Co bardziej przekonujące, podejście to pozwala z powodzeniem modelować dyfuzję za pomocą matryc kolagenu 3D i obliczać współczynnik dyfuzji chemoatraktantu przez wiele różnych stężeń kolagenu, przy jednoczesnym zachowaniu prostoty i przyjazności dla użytkownika systemu do mikroskopii sił trakcyjnych (TFM) i analizy cyfrowej korelacji objętości (DVC).

Wprowadzenie

Preferowany ruch komórek w kierunku gradientu stężeń, znany jako chemotaksja, odgrywa ważną rolę w procesach patologicznych i fizjologicznych w organizmie. Takimi przykładami są gojenie się ran skóry i błony śluzowej¹, morfogeneza², stan zapalny³ i wzrost guza^4,5. Wykazano również, że komórki nowotworowe mogą migrować zarówno poprzez indywidualne, jak i zbiorowe strategie migracji komórek⁶. Co więcej, mechanizmy niestabilności dyfuzyjnej mogą indukować oddzielanie pojedynczych lub skupionych komórek od ciała/obiektu nowotworowego, a następnie mogą migrować w kierunku źródła składników odżywczych, a tym samym atakować szersze obszary i tkanki⁷.

Ponadto wykazano, że różne mechanizmy migracji mogą być aktywne w 2D i 3D, ze względu na różne role cząsteczek adhezyjnych⁸. W związku z tym przejście na fizjologicznie istotne testy in vitro w celu zbadania ruchliwości komórek w mierzalny i prosty sposób ma znaczenie dla zrozumienia zjawisk ruchu komórek⁹. Niestety, trudność w analizie migracji komórek, kompleksowy, ilościowy test chemotaksji zwykle wymaga długiej, pracochłonnej metody, opartej na pomiarze bezstronnych modeli ruchliwości komórek i zjawisk transportowych.

Wcześniejsze eksperymentalne podejścia do badania chemotaksji komórek obejmują komorę Boydena¹⁰ i test pod agarozą¹¹. Jednak w tych wczesnych testach eksperymenty z migracją komórek nie monitorowały ruchu w odniesieniu do czasu. Co ważniejsze, gradienty stężeń użyte w eksperymentach nie były dobrze zdefiniowane ani w pełni zrozumiałe, a sygnalizacja utrzymywała się tylko przez nie więcej niż kilka godzin. Co więcej, wczesne próby komory chemotaksji ograniczyły migrację komórek do dwóch wymiarów i nie pozwoliły na monitorowanie kinetyki migracji¹². Patrząc na komorę Boydena, test końcowy nie pozwoliłby badaczowi na wizualną obserwację migracji i nie mógłby bezpośrednio odróżnić chemotaksji (ruchu kierunkowego) od chemokinezy (ruchu losowego). Dodatkowo, kilka zmiennych – różnice w wielkości porów i grubości błon – sprawiło, że komora była bardzo trudna do łatwego odtworzenia i ukryła reakcję migracyjną komórek na chemokiny^13,14.

Dzięki nowemu zrozumieniu mikrofluidyki, nowe komory i mikrourządzenia zostały zbadane jako instrument do badania lokomocji komórek w warunkach przepływu śródmiąższowego lub chemotaksji^15,16. W ramach tych nowych urządzeń wprowadzono i zbadano nowe wskaźniki ogniw, takie jak wpływ naprężeń ścinających na ogniwo^17,18. Niestety, przeszłe i obecne komory chemotaksji mikroprzepływowej ograniczały badania migracji komórek do substratów 2D - co jest ważnym niepowodzeniem, ponieważ wiele procesów biologicznych, w tym inwazja i przerzuty komórek nowotworowych oraz migracja komórek odpornościowych, obejmuje migrację 3D.

Bezpośrednie komory obserwacyjne - gdzie roztwór chemoatraktantu styka się z żelem 3D zawierającym komórki, również zostały zgłoszone^19,20. Komory te mają dwa przedziały, jeden zawierający chemoatraktant, a drugi zawierający komórki, są połączone obok siebie poziomo²¹ lub jako koncentryczne pierścienie²². Systemy te są skierowane we właściwym kierunku, ale nie utrzymują systemu chemotaksji przez dłuższy czas.

Ponadto, naukowcy badali również dyfuzyjność przez błony kolagenowe w komórkach dializacyjnych, a także dyfuzję cząsteczek znacznikowych przez próbki kolagenu poddane ciśnieniu hydrostatycznemu^23-25. Niektóre eksperymenty dyfuzyjne w żelach kolagenowych opierają się na fizycznych i chemicznych modyfikacjach żelu przy użyciu pól magnetycznych i inkorporacji chemicznej²⁶. Popularna metoda modelowania dyfuzyjności w tkankach kolagenowych opiera się na obrazowaniu fluorescencyjnym ciągłego fotowybielania punktowego. Metoda ta wykazała anizotropię współczynników dyfuzji makrocząsteczek w zorientowanych tkankach kolagenowych. Jednak fotowybielanie było stosowane w chrząstkach stawowych, a nie w matrycach kolagenowych. Chociaż są podobne, niezbędne eksperymenty modelowe muszą być przeprowadzone poprzez dokładne zrozumienie współczynnika dyfuzji żeli kolagenowych. Co ważniejsze, systemy te nie wykorzystują metody pomiaru siły wytwarzanej przez ogniwo.

Niestety, większość systemów wydaje się brakować jednego lub dwóch kluczowych elementów idealnego systemu: umożliwienia śledzenia komórek, zrozumienia gradientu dyfuzji z czynnikiem chemotaktycznym przez matrycę, stosunkowo prostej konfiguracji z łatwością odtwarzalności, minimalizacji interakcji komórka-komórka oraz możliwości mierzenia jednostek wymiarowych do kwantyfikacji (tj. prędkość, siła, stężenie właściwe). Moghe i wsp.^{W ramach projektu 27} zaproponowano system, który spełniałby większość tych wymagań, w którym komórki były początkowo rozproszone w żelu, a nie skoncentrowane na powierzchni filtra, ale trudno było zmierzyć siły generowane przez ogniwo.

W tym celu prezentujemy system dyfuzji gradientu płaskiego do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, który pozwala przezwyciężyć ograniczenia nowoczesnej komory dyfuzyjnej istniejących testów, która opiera się na mikroskopii poklatkowej, w połączeniu z technikami analizy obrazu do pomiaru sił komórek w środowisku 3D. Protokół ten zapewnia prosty, ale innowacyjny sposób tworzenia prostej komory dyfuzyjnej 3D, która może być wykorzystana do badania chemotaksji 3D w różnych komórkach.

Protokół

1. 3D Projekt formy i części

1. pleśń
   1. Przed przystąpieniem do pracy należy zaopatrzyć się w zestaw elastomerów silikonowych, komorę do obrazowania żywych komórek, szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm oraz obrabianą maszynowo aluminiową metalową kostkę o wymiarach 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Przygotuj komorę obrazowania żywych komórek do formowania, umieszczając szkiełko nakrywkowe w dolnym uchwycie i montując resztę komory zgodnie z zaleceniami dostawcy.
   2. Następnie za pomocą kleszczy umieść obrobioną aluminiową metalową kostkę na środku obudowy komory obrazowania żywych komórek i na wierzchu szkiełka nakrywkowego, a następnie odłóż na bok.
   3. Wymieszaj roztwory elastomerów silikonowych zgodnie z protokołem producenta, aby uzyskać 5 ml elastomeru.
   4. Za pomocą jednorazowej szpatułki laboratoryjnej wlej roztwór elastomeru silikonowego do komory obrazowania żywych komórek i upewnij się, że nie przesuwasz umieszczonej obrabianej maszynowo aluminiowej metalowej kostki. Umieść system na stole laboratoryjnym, w bezpiecznym miejscu O/N do utwardzenia.
   5. Następnego ranka zdemontuj komorę obrazowania żywych komórek, zgodnie z zaleceniami producenta i wyciągnij pleśń za pomocą kleszczy. Za pomocą kleszczy ostrożnie wyjmij obrobioną aluminiową metalową kostkę z formy. Podejdź do zlewu i spłucz formę wodą dejonizowaną. Umieść foremkę na ręczniku papierowym do wyschnięcia.
   6. Po wyschnięciu, za pomocą hobbystycznego noża uniwersalnego, wytnij szczeliny w formie, oddalone od siebie o 2,34 mm od każdego podłużnego końca, wewnątrz silikonowej formy. Upewnij się, że pleśń pozostaje w bezpiecznym i suchym miejscu, dopóki nie będziesz gotowy do skonstruowania systemu do eksperymentu.
2. Przygotowanie hydrofilowych i hydrofobowych szkiełek nakrywkowych
   1. Aby macierz kolagenowa przylegała do powierzchni, utwórz hydrofilowe szkiełka nakrywkowe:
      1. Za pomocą jednorazowej pipety odmierz 150 μl 3-aminopropylotrimetoksysilanu i wlej roztwór do probówki o pojemności 50 ml. Dodać 30 ml 100% etanolu do probówki o pojemności 50 ml za pomocą drugiej jednorazowej pipety i zamknąć pokrywkę. Wiruj roztwór przez 2 minuty, zapewniając całkowite wymieszanie. Wlej roztwór do szklanej szalki Petriego i odstaw na bok.
      2. Wlej 15 ml 100% alkoholu etylowego do drugiej szalki Petriego i odstaw na bok (pamiętaj o oznaczeniu potraw).
      3. Za pomocą nowej jednorazowej pipety odmierz 30 ml wody dejonizowanej i wlej roztwór do probówki o pojemności 50 ml. Następnie za pomocą nowej jednorazowej pipety odmierz 1,875 μl aldehydu glutarowego i wlej roztwór do tej samej probówki o pojemności 50 ml i zamknij pokrywkę. Wiruj roztwór przez 2 minuty, zapewniając całkowite wymieszanie. Wlej mieszaninę na trzecią szalkę Petriego i odstaw na bok.
      4. Za pomocą kleszczy wyjmij jedno okrągłe szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 22 mm i spłucz obie strony mieszaniną 100% etanolu za pomocą jednorazowej pipety.
      5. Umieścić opłukane szkło nakrywkowe w naczyniu z 3-aminopropylotrimetoksysilanem z 30 ml roztworu 100% etanolu i pozostawić w roztworze na 5 minut.
      6. Za pomocą kleszczyków wyjmij szklane szkiełko nakrywkowe i ponownie spłucz 100% roztworem etanolu za pomocą jednorazowej pipety.
      7. Wrzuć spłukane szklane szkiełko nakrywkowe do 1,875 μl aldehydu glutarowego i 30 ml mieszaniny wody dejonizowanej i odstaw na 30 minut.
      8. Po 30 minutach usunąć szklane szkiełko nakrywkowe kleszkami i spłukać wodą dejonizowaną, a następnie umieścić na suchej chusteczce O/N do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.
      9. Powtórz zanurzanie i przesuwanie szkiełek nakrywkowych dla tylu szkiełek nakrywkowych, ile potrzeba, przy użyciu tych samych wygenerowanych roztworów.
   2. Wykonaj hydrofobowe szkiełka nakrywkowe zgodnie z podanym protokołem.
      1. Dodać 500 μl tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylu, 100 μl kwasu octowego i 19,4 ml heksanu do probówki o pojemności 50 ml i mieszać przez 2 minuty. Wlać roztwór do szklanej szalki Petriego i odstawić.
      2. Za pomocą czystych kleszczyków wyjmij jedno szklane szkiełko nakrywkowe i wrzuć do przygotowanego roztworu mieszanego na 2 minuty. Po upływie 2 minut wyjąć szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszków i spłukać wodą dejonizowaną za pomocą jednorazowej pipety i umieścić szkiełko nakrywkowe na suchej chusteczce O/N do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Przechowuj szkiełko nakrywkowe na plastikowych szalkach Petriego do czasu użycia.
      3. Powtórz zanurzanie i przesuwanie szkiełek nakrywkowych dla tylu szkiełek nakrywkowych, ile potrzeba, przy użyciu tych samych wygenerowanych roztworów.

2. Montaż formy

1. Przed użyciem foremek za pomocą jednorazowej pipety przepłucz formę 90% alkoholem etylowym nad pojemnikiem na odpady chemiczne. Następnie umieść formę na szalce Petriego wypełnionej wodą dejonizowaną i pozostaw do o/N.
2. Wyjmij pleśń z roztworu za pomocą kleszczy i umieść na ręczniku do wyschnięcia na powietrzu przed rozpoczęciem montażu formy.
3. Podczas suszenia formy pokrój kwadratowe hydrofilowe szkiełka nakrywkowe na dwa prostokąty nieco większe niż 3,95 mm x 5,99 mm za pomocą precyzyjnego narzędzia do rysowania diamentów. Wsuń każde wycięte prostokątne szkiełko nakrywkowe w szczeliny wycięte w silikonowej formie.
4. Odwróć formę do góry nogami i nałóż tłuszcz próżniowy wzdłuż dna silikonowej formy za pomocą jednorazowej pipety. Następnie odwróć formę z powrotem prawą stroną do góry i dociśnij spód formy do okrągłego szkiełka nakrywkowego ze szkła hydrofilowego, aby utworzyć uszczelnienie.
5. Za pomocą jednorazowych rękawiczek podnieś zmontowaną formę i umieść ją na jednorazowej szalce Petriego, a następnie w biokapturze. Włącz lampę UV Bio-hood na 1 godzinę, aby wysterylizować pleśń przed eksperymentami.

3. Mieszanina kolagenu i matryca 3D

1. Przed przygotowaniem mieszaniny kolagenowej należy wybarwić i przygotować komórki do obrazowania zgodnie ze standardowymi protokołami²⁸.
2. Stosując standardowe techniki i protokoły laboratoryjne^29,30, w kapturze biologicznym, wymieszać pożywkę komórkową i chemoatraktant w probówce o pojemności 15 ml do pożądanego stężenia chemoatraktantu. Odpipetować 5 ml roztworu o stężeniu pożywki komórkowej i chemoatraktantu do probówki o pojemności 15 ml i przenieść roztwór do podgrzanej łaźni wodnej.
3. Za pomocą pipety wyekstrahuj 5 ml samej pożywki komórkowej do drugiej probówki o pojemności 15 ml i umieść w podgrzanej łaźni wodnej w celu podgrzania roztworu do eksperymentów mikroskopowych.
4. W biokapturze odpipetować 30 μl 10-krotnego roztworu buforowego fosforanu (PBS) do mikroprobówki wirówkowej. Dodać 6 μl 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) do tej samej probówki z mikrowirówką i wirować przez 15 sekund.
5. Pobrać roztwór z ogona szczura kolagenu I z lodówki i przenieść do biokaptura przy użyciu standardowych technik laboratoryjnych i protokołów²⁹. Upewnij się, że kolagen jest nadal zimny. Odpipetować 168,3 μl kolagenu do tej samej mikroprobówki wirówkowej.
6. Następnie dodaj 18 μl żółto-zielonych mikrosfer modyfikowanych karboksylanem fluorescencyjnym za pomocą pipety do tej samej probówki mikrowirówkowej. Wirować probówkę mikrowirówki ze wszystkimi roztworami przez 30 sekund.
7. Dodać 77,7 μl żądanej mieszaniny pożywki komórkowej i komórek (stężenie około 2 x 10⁶ komórek/ml) do probówki mikrowirówki i mieszać za pomocą końcówki pipety przez 20 sekund. W razie potrzeby zmień gęstość matrycy, postępując zgodnie z niestandardową mieszaniną kolagenu dostosowaną do dodawania kulek fluorescencyjnych i tabeli żywotności komórek (Tabela 1).
8. Odpipetować 300 μl mieszaniny kolagenu i komórek do środkowej studzienki (studzienka #2) przygotowanego zespołu formy. Umieścić formę na jednorazowej szalce Petriego i przenieść ją do standardowego inkubatora na 20 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
9. Wyjąć system z inkubatora i umieścić go z powrotem w kapturze biologicznym. Za pomocą kleszczy usuń oba hydrofobowe szkiełka nakrywkowe, zaciskając je na górnej części każdego szkiełka nakrywkowego i pociągając w górę i odciągając od formy.
10. Przenieś cały system do żądanej mikroskopii i obrazu, aby upewnić się, że boki formy kolagenowej są nadal proste, aby umożliwić płaski gradient dyfuzji.
11. Trzymając system nadal pod mikroskopem, za pomocą jednokanałowej pipety o pojemności 100 μl, dodaj 100 μl pożywki komórkowej do studzienki #1. Następnie, za pomocą pipety jednokanałowej o pojemności 100 μl, dodaj 100 μl pożywki komórkowej o pożądanym stężeniu chemoatraktantu do studzienki #3.
12. Natychmiast po dodaniu roztworów do obu studzienek rozpocznij obrazowanie.

4. Obrazowanie i modelowanie dyfuzji

1. Jeśli ktoś chce znaleźć współczynnik dyfuzji dla określonej gęstości kolagenu, aby obliczyć określone stężenie, postępuje zgodnie z poniższym protokołem:
   1. Postępuj zgodnie z podanym powyżej protokołem zatytułowanym "Mieszanina kolagenu i matryca 3D", zamiast generować pożywkę komórkową o pożądanym stężeniu chemoatraktantu, wykonaj 5 μM rodaminy w probówce o pojemności 15 ml, korzystając ze standardowych obliczeń i protokołów³⁰.
   2. Zobrazuj matryce kolagenowe 3D za pomocą systemu konfokalnego zamontowanego na odwróconym mikroskopie za pomocą lasera argonowego (488 nm) w celu uchwycenia fluorescencji. Obraz co 2 lub 3 sekundy przez maksymalnie 7 godzin.
2. Do modelowania dyfuzji: Korzystając z modelu matematycznego pokazanego poniżej, napisz kod oprogramowania obliczeniowego do przetwarzania i analizy, wykonując następujące ogólne czynności.
   
   1. Importuj obrazy do oprogramowania obliczeniowego w celu przeskalowania i normalizacji z maksymalną intensywnością. Konwertuj obrazy na szarą mapę kolorów obrazu, aby zaznaczyć krawędź. Wybierz oś biegnącą wzdłuż środka obrazu, po prawej stronie środka i po lewej stronie środka.
   2. Korzystając z kodu oprogramowania obliczeniowego, wykreśl znormalizowaną intensywność wraz z rzeczywistą intensywnością i różnicą między nimi.
   3. Następnie wprowadź parametry niezbędne do dopasowania (stężenie, czas i długość).
   4. Wykreśl znormalizowane stężenie w funkcji czasu i profil stężenia na osi x z wielomianowym dopasowaniem do danych.
   5. Oblicz współczynnik dyfuzji za pomocą kodu oprogramowania obliczeniowego.

5. Pomiary eksperymentalne

1. Odnosząc się do równania dyfuzji, przepisz równanie, aby znaleźć określone stężenie w dowolnym miejscu w układzie, jak pokazano poniżej.
   
   gdzie:
   L = długość matrycy kolagenowej
   x = badana lokalizacja
   D = współczynnik dyfuzji
   t = czas, który upłynął
2. Podczas eksperymentów z chemotaksją upewnij się, że zapisujesz konkretny czas, w którym chemokina została dodana do systemu. Po znalezieniu ruchu migracji komórek upewnij się, że zapisałeś konfokalne nagranie poklatkowe i zanotuj konkretny czas i miejsce od krawędzi, w którym nastąpiło obrazowanie.
3. Podczas analizy danych wprowadź do równania zanotowany czas, który upłynął, lokalizację i współczynnik dyfuzji dla konkretnej komórki, aby znaleźć znormalizowane stężenie właściwe w dowolnym punkcie kolagenu zarówno dla eksperymentów dyfuzyjnych, jak i komórkowych.

6. Śledzenie migracji komórek za pomocą TFM

1. Aby śledzić migrację komórek za pomocą technik TFM/DVC, postępuj zgodnie z poniższym protokołem:
   1. Po dodaniu pożądanego stężenia chemoatraktantu do studzienki #3, rozpocznij obrazowanie matryc kolagenu 3D za pomocą systemu konfokalnego zamontowanego na odwróconym mikroskopie, aby znaleźć komórkę do zbadania.
   2. Po znalezieniu poruszającej się komórki umieść ją w środku pola widzenia i użyj silnika piezoelektrycznego (do obrazowania w osi z), obrazuj co 1 lub 2 minuty.
   3. Aby obliczyć generowanie i odkształcanie siły ogniwa, wygeneruj kod obliczeniowy, aby znaleźć przemieszczenia kulek fluorescencyjnych zgodnie z protokołami TFM / DVC³¹.

Wyniki

Zdolność tego testu do dokładnej oceny migracji komórki zależy od dobrej konfiguracji systemu. Dlatego bardzo ważne jest, aby upewnić się, że dokładnie zaprojektowałeś formę systemu dyfuzyjnego i zachowaj szczególną ostrożność przy umieszczaniu zarówno hydrofobowych, jak i hydrofilowych szkiełek nakrywkowych, jak pokazano na rysunku 1. Jeśli system jest odpowiednio zaprojektowany i na etapie modelowania dyfuzji zapewnia znalezienie bardzo dobrej liniowej linii startowej, jest w stanie uzyskać ładne obraz...

Dyskusja

Najważniejszymi krokami dla udanych eksperymentów dyfuzyjnych z komórkami lub bez nich są: prawidłowe ustawienie zespołu formy; rozwijanie niezbędnej sprawności manualnej, aby zapobiec uszkodzeniom podczas ekstrakcji hydrofobowych szkiełek nakrywkowych; zapewnienie znalezienia bardzo dobrej liniowej linii startowej w celu prawidłowego obliczenia współczynnika dyfuzji; prawidłowe obliczenia eksperymentalne zarówno kolagenu, jak i chemoatraktantu; prawidłowe stosowanie systemu obrazowania żywych komórek, aby zapewnić, że m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	dwuczęściowa mistura z mieszanką 10:1
Komora do obrazowania żywych komórek	Przyrząd	CM-B18-1	CMB do 18  mm szkiełka nakrywkowe
okrągłe 22  mm Szkiełko nakrywkowe	szklane Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. szkiełko nakrywkowe 22  mm 1,5
Obrabiana maszynowo aluminiowa metalowa kostka
Nóż uniwersalny	Hobby X-Acto	X3201
3-(aminopropylo) trimetoksysilan	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Aldehyd glutarowy	Polysciences, Inc	00216A-10	Aldehyd glutarowy, klasa EM,
tubka 8%50 ml	Fisher Scientific	14-432-22	Podłoga standardowa model i wirówki stołowe
Szklana szalka Petriego	Fisher Scientific	08-747A	Szalki Petriego wielokrotnego użytku: Kompletne (60 x 15  mm)
Kleszcze	Fisher Scientific	22-327-379	Kleszcze do cienkich końcówek
Okulary nakrywkowe	Fisher Scientific	12-518-105A	Prostokąt; 30 x 22  Mm; Grubość nr 1
Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl	Gelest	SIT8174.0
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	320099	Odczynnik ACS kwasu octowego, ≥ 99,7%
Hexan	Sigma-Aldrich	296090	bezwodny, 95%
alkohol etylowy	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, do biologii molekularnej
Precyzyjna diamentowa trasarka do trasowania	Lunzer	PV-081-3	Prosta rysiarka z przedłużoną końcówką, .020" (.50  mm) średnicy o .200" (5.0  mm) długość końcówki
Smar próżniowy	Dow Corning	14-635-5C	Smar wysokopróżniowy
tubka 15 ml	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml stożkowe probówki wirówkowe z hydrofobową, biologicznie obojętną powierzchnią
10x roztwór buforowany fosforanem	Fisher Scientific	BP399-500	1,37 M chlorek sodu, 0,027 M chlorek potasu i 0,119 M bufor fosforanowy
1  N wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	38215	Koncentrat wodorotlenku sodu
Kolagen I, ogon szczura	BD Biosciences	354236	Ogon szczura
Mikroprobówka wirówkowa	Fisher Scientific	02-681-332	Pojemność: 2,0 ml; O.D. x L: 13  x  40  Mm; sterylny; pojedynczo owinięte
[nagłówek]
Mikrosfery modyfikowane karboksylanem	Invitrogen	F-8813	Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,5 i mikro; m, żółto-zielona fluorescencyjna (505/515), 2% ciał stałych
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamina B do fluorescencji