Planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenowej 3D

Podsumowanie

Migracja komórek jest ważną częścią rozwoju i życia człowieka. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać migrację komórek, przedstawiamy planarny system dyfuzji gradientowej do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, co pozwala przezwyciężyć nowoczesne ograniczenia komory dyfuzyjnej istniejących testów.

Streszczenie

Znaczenie migracji komórek można dostrzec poprzez rozwój ludzkiego życia. Kiedy komórki migrują, generują siły i przenoszą te siły na otoczenie, co prowadzi do ruchu komórek i migracji. Aby zrozumieć mechanizmy, które mogą zmieniać i/lub wpływać na migrację komórek, można badać te siły. Teoretycznie zrozumienie podstawowych mechanizmów i sił leżących u podstaw migracji komórek daje nadzieję na skuteczne podejścia do leczenia chorób i promowania przeszczepów komórkowych. Niestety, nowoczesne komory chemotaksyjne, które zostały opracowane, są zwykle ograniczone do dwóch wymiarów (2D) i mają złożone gradienty dyfuzji, które utrudniają interpretację eksperymentu. W tym celu opracowaliśmy i opisaliśmy w tym artykule komorę z bezpośrednim widokiem do badań nad chemotaksją, która pozwala na pokonanie nowoczesnych przeszkód w komorze chemotaksji, zdolnej do pomiaru sił komórkowych i stężenia właściwego w komorze w środowisku 3D w celu badania migracji komórek 3D. Co bardziej przekonujące, podejście to pozwala z powodzeniem modelować dyfuzję za pomocą matryc kolagenu 3D i obliczać współczynnik dyfuzji chemoatraktantu przez wiele różnych stężeń kolagenu, przy jednoczesnym zachowaniu prostoty i przyjazności dla użytkownika systemu do mikroskopii sił trakcyjnych (TFM) i analizy cyfrowej korelacji objętości (DVC).

Wprowadzenie

Preferowany ruch komórek w kierunku gradientu stężeń, znany jako chemotaksja, odgrywa ważną rolę w procesach patologicznych i fizjologicznych w organizmie. Takimi przykładami są gojenie się ran skóry i błony śluzowej¹, morfogeneza², stan zapalny³ i wzrost guza^4,5. Wykazano również, że komórki nowotworowe mogą migrować zarówno poprzez indywidualne, jak i zbiorowe strategie migracji komórek⁶. Co więcej, mechanizmy niestabilności dyfuzyjnej mogą indukować oddzielanie pojedynczych lub skupionych komórek od ciała/obiektu nowotworowego, a następnie mogą migrować w kierunku źródła składników odżywczych, a tym samym atakować szersze obszary i tkanki⁷.

Ponadto wykazano, że różne mechanizmy migracji mogą być aktywne w 2D i 3D, ze względu na różne role cząsteczek adhezyjnych⁸. W związku z tym przejście na fizjologicznie istotne testy in vitro w celu zbadania ruchliwości komórek w mierzalny i prosty sposób ma znaczenie dla zrozumienia zjawisk ruchu komórek⁹. Niestety, trudność w analizie migracji komórek, kompleksowy, ilościowy test chemotaksji zwykle wymaga długiej, pracochłonnej metody, opartej na pomiarze bezstronnych modeli ruchliwości komórek i zjawisk transportowych.

Wcześniejsze eksperymentalne podejścia do badania chemotaksji komórek obejmują komorę Boydena¹⁰ i test pod agarozą¹¹. Jednak w tych wczesnych testach eksperymenty z migracją komórek nie monitorowały ruchu w odniesieniu do czasu. Co ważniejsze, gradienty stężeń użyte w eksperymentach nie były dobrze zdefiniowane ani w pełni zrozumiałe, a sygnalizacja utrzymywała się tylko przez nie więcej niż kilka godzin. Co więcej, wczesne próby komory chemotaksji ograniczyły migrację komórek do dwóch wymiarów i nie pozwoliły na monitorowanie kinetyki migracji¹². Patrząc na komorę Boydena, test końcowy nie pozwoliłby badaczowi na wizualną obserwację migracji i nie mógłby bezpośrednio odróżnić chemotaksji (ruchu kierunkowego) od chemokinezy (ruchu losowego). Dodatkowo, kilka zmiennych – różnice w wielkości porów i grubości błon – sprawiło, że komora była bardzo trudna do łatwego odtworzenia i ukryła reakcję migracyjną komórek na chemokiny^13,14.

Dzięki nowemu zrozumieniu mikrofluidyki, nowe komory i mikrourządzenia zostały zbadane jako instrument do badania lokomocji komórek w warunkach przepływu śródmiąższowego lub chemotaksji^15,16. W ramach tych nowych urządzeń wprowadzono i zbadano nowe wskaźniki ogniw, takie jak wpływ naprężeń ścinających na ogniwo^17,18. Niestety, przeszłe i obecne komory chemotaksji mikroprzepływowej ograniczały badania migracji komórek do substratów 2D - co jest ważnym niepowodzeniem, ponieważ wiele procesów biologicznych, w tym inwazja i przerzuty komórek nowotworowych oraz migracja komórek odpornościowych, obejmuje migrację 3D.

Bezpośrednie komory obserwacyjne - gdzie roztwór chemoatraktantu styka się z żelem 3D zawierającym komórki, również zostały zgłoszone^19,20. Komory te mają dwa przedziały, jeden zawierający chemoatraktant, a drugi zawierający komórki, są połączone obok siebie poziomo²¹ lub jako koncentryczne pierścienie²². Systemy te są skierowane we właściwym kierunku, ale nie utrzymują systemu chemotaksji przez dłuższy czas.

Ponadto, naukowcy badali również dyfuzyjność przez błony kolagenowe w komórkach dializacyjnych, a także dyfuzję cząsteczek znacznikowych przez próbki kolagenu poddane ciśnieniu hydrostatycznemu^23-25. Niektóre eksperymenty dyfuzyjne w żelach kolagenowych opierają się na fizycznych i chemicznych modyfikacjach żelu przy użyciu pól magnetycznych i inkorporacji chemicznej²⁶. Popularna metoda modelowania dyfuzyjności w tkankach kolagenowych opiera się na obrazowaniu fluorescencyjnym ciągłego fotowybielania punktowego. Metoda ta wykazała anizotropię współczynników dyfuzji makrocząsteczek w zorientowanych tkankach kolagenowych. Jednak fotowybielanie było stosowane w chrząstkach stawowych, a nie w matrycach kolagenowych. Chociaż są podobne, niezbędne eksperymenty modelowe muszą być przeprowadzone poprzez dokładne zrozumienie współczynnika dyfuzji żeli kolagenowych. Co ważniejsze, systemy te nie wykorzystują metody pomiaru siły wytwarzanej przez ogniwo.

Niestety, większość systemów wydaje się brakować jednego lub dwóch kluczowych elementów idealnego systemu: umożliwienia śledzenia komórek, zrozumienia gradientu dyfuzji z czynnikiem chemotaktycznym przez matrycę, stosunkowo prostej konfiguracji z łatwością odtwarzalności, minimalizacji interakcji komórka-komórka oraz możliwości mierzenia jednostek wymiarowych do kwantyfikacji (tj. prędkość, siła, stężenie właściwe). Moghe i wsp.^{W ramach projektu 27} zaproponowano system, który spełniałby większość tych wymagań, w którym komórki były początkowo rozproszone w żelu, a nie skoncentrowane na powierzchni filtra, ale trudno było zmierzyć siły generowane przez ogniwo.

W tym celu prezentujemy system dyfuzji gradientu płaskiego do badania chemotaksji w matrycy kolagenu 3D, który pozwala przezwyciężyć ograniczenia nowoczesnej komory dyfuzyjnej istniejących testów, która opiera się na mikroskopii poklatkowej, w połączeniu z technikami analizy obrazu do pomiaru sił komórek w środowisku 3D. Protokół ten zapewnia prosty, ale innowacyjny sposób tworzenia prostej komory dyfuzyjnej 3D, która może być wykorzystana do badania chemotaksji 3D w różnych komórkach.

Protokół

1. Projekt i części formy 3D

1. Forma
   1. Przed rozpoczęciem pracy należy przygotować zestaw elastomeru silikonowego, komorę do obrazowania żywych komórek, szklaną lamellkę o średnicy 22 mm oraz obrobioną aluminiową kostkę o wymiarach 10,07 mm x 3,95 mm x 5,99 mm. Przygotować komorę do obrazowania żywych komórek do formowania, umieszczając lamellkę w dolnym uchwycie i montując resztę komory zgodnie z instrukcją producenta.
   2. Następnie, używając pincety, umieścić obrobioną aluminiową kostkę na środku obudowy komory do obrazowania żywych komórek, na wierzchu lamellki, a następnie odstawić.
   3. Wymieszać roztwory elastomeru silikonowego zgodnie z protokołem producenta, aby przygotować 5 ml elastomeru.
   4. Za pomocą jednorazowej szpatułki laboratoryjnej wlać roztwór elastomeru silikonowego do przygotowanej komory do obrazowania żywych komórek, uważając, aby nie przesunąć umieszczonej aluminiowej kostki. Umieścić system na blacie laboratoryjnym w bezpiecznym miejscu na noc (O/N) w celu utwardzenia.
   5. Następnego ranka rozłożyć komorę do obrazowania żywych komórek, zgodnie z zaleceniami producenta, i wyciągnąć formę za pomocą pincety. Używając pincety, ostrożnie wyjąć obrobioną aluminiową kostkę z formy. Płukać formę w zlewie wodą dejonizowaną. Położyć formę na ręczniku papierowym do wyschnięcia.
   6. Po wyschnięciu, za pomocą nożyka modelarskiego, wyciąć w formie nacięcia w odstępach 2,34 mm od każdego końca podłużnego, wewnątrz silikonowej formy. Przechowywać formę w bezpiecznym i suchym miejscu do czasu przygotowania systemu do eksperymentu.
2. Przygotowanie hydrofilowych i hydrofobowych szklanych lamellek
   1. Aby umożliwić przyleganie macierzy kolagenowej do powierzchni, przygotować lamellki hydrofilowe:
      1. Za pomocą jednorazowej pipety odmierzyć 150 µl 3-aminopropylotrimetoksysilanu i wlać roztwór do probówki 50 ml. Dodać 30 ml 100% etanolu do probówki 50 ml za pomocą drugiej jednorazowej pipety i zamknąć pokrywkę. Mieszać roztwór na wirówce typu vortex przez 2 min, aż do całkowitego wymieszania. Wlać roztwór do szklanej płytki Petriego i odstawić.
      2. Wlać 15 ml 100% alkoholu etylowego do drugiej płytki Petriego i odstawić (pamiętając o opisaniu płytek).
      3. Za pomocą nowej jednorazowej pipety odmierzyć 30 ml wody dejonizowanej i wlać roztwór do probówki 50 ml. Następnie, za pomocą nowej jednorazowej pipety, odmierzyć 1,875 µl glutaraldehydu i wlać roztwór do tej samej probówki 50 ml i zamknąć pokrywkę. Mieszać roztwór na wirówce typu vortex przez 2 min, aż do całkowitego wymieszania. Wlać mieszaninę do trzeciej płytki Petriego i odstawić.
      4. Używając pincety, wyjąć jedną okrągłą szklaną lamellkę o średnicy 22 mm i opłukać obie strony mieszaniną 100% etanolu za pomocą jednorazowej pipety.
      5. Umieścić opłukaną szklaną lamellkę w płytce z roztworem 3-aminopropylotrimetoksysilanu w 30 ml 100% etanolu i pozostawić w roztworze na 5 min.
      6. Wyjąć szklaną lamellkę pincetą i ponownie opłukać roztworem 100% etanolu za pomocą jednorazowej pipety.
      7. Włożyć opłukaną szklaną lamellkę do mieszaniny 1,875 µl glutaraldehydu i 30 ml wody dejonizowanej i odstawić na 30 min.
      8. Po 30 min wyjąć szklaną lamellkę pincetą, opłukać wodą dejonizowaną i położyć na suchej chusteczce na noc (O/N) do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT).
      9. Powtórzyć proces zanurzania i przenoszenia dla takiej liczby lamellek, jaka jest potrzebna, korzystając z tych samych przygotowanych roztworów.
   2. Przygotować lamellki hydrofobowe zgodnie z poniższym protokołem:
      1. Dodać 500 µl tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktylu, 100 µl kwasu octowego i 19,4 ml heksanu do probówki 50 ml i mieszać na wirówce typu vortex przez 2 min. Wlać roztwór do szklanej płytki Petriego i odstawić.
      2. Używając czystej pincety, wyjąć jedną szklaną lamellkę i zanurzyć w przygotowanym roztworze na 2 min. Po upływie 2 min wyjąć szklaną lamellkę pincetą, opłukać wodą dejonizowaną za pomocą jednorazowej pipety i położyć lamellkę na suchej chusteczce na noc (O/N) do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT). Przechowywać lamellki w plastikowych płytkach Petriego do momentu użycia.
      3. Powtórzyć proces zanurzania i przenoszenia dla takiej liczby lamellek, jaka jest potrzebna, korzystając z tych samych przygotowanych roztworów.

2. Montaż formy

1. Przed użyciem form, za pomocą jednorazowej pipety przepłukać formę 90% etanolem nad pojemnikiem na odpady chemiczne. Następnie umieścić formę w szalce Petri wypełnionej wodą dejonizowaną i pozostawić na noc.
2. Wyjąć formę z roztworu za pomocą pęsety i położyć na ręczniku do wyschnięcia przed rozpoczęciem montażu formy.
3. Podczas wysychania formy, przy użyciu precyzyjnego diamentowego rysika, pociąć kwadratowe szkiełka zakrywkowe hydrofilowe na dwa prostokąty nieco większe niż 3,95 mm x 5,99 mm. Wsunąć każde pocięte prostokątne szkiełko w szczeliny wycięte w silikonowej formie.
4. Odwrócić formę do góry dnem i za pomocą jednorazowej pipety nanieść smar próżniowy wzdłuż spodu silikonowej formy. Następnie odwrócić formę z powrotem i docisnąć jej spód do okrągłego hydrofilowego szkiełka zakrywkowego, aby stworzyć uszczelnienie.
5. W jednorazowych rękawiczkach podnieść zmontowaną formę, umieścić w jednorazowej szalce Petri, a następnie włożyć do komory z laminarnym przepływem powietrza (bio-hood). Włączyć lampę UV w komorze na 1 hr w celu sterylizacji formy przed rozpoczęciem eksperymentu.

3. Mieszanina kolagenu i macierz 3D

1. Przed przygotowaniem mieszaniny kolagenowej należy zbarwić i przygotować komórki do obrazowania zgodnie ze standardowymi protokołami²⁸.
2. Stosując standardowe techniki i protokoły laboratoryjne^29,30, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, zmieszać pożywkę komórkową i chemoatraktant w probówce o objętości 15 ml do pożądanego stężenia chemoatraktanta. Pipetować 5 ml roztworu pożywki komórkowej o konkretnym stężeniu chemoatraktanta do probówki 15 ml i przenieść roztwór do podgrzewanej kąpieli wodnej.
3. Za pomocą pipety pobrać 5 ml samej pożywki komórkowej do drugiej probówki 15 ml i umieścić w podgrzewanej kąpieli wodnej w celu ogrzania roztworu do eksperymentów mikroskopowych.
4. W komorze z laminarnym przepływem powietrza pipetować 30 µl 10x roztworu soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do probówki do mikrocentryfugi. Dodać 6 µl 1 N wodorotlenku sodu (NaOH) do tej samej probówki i mieszać w wortexie przez 15 s.
5. Wyjąć z lodówki roztwór kolagenu I z ogona szczura i przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrza, stosując standardowe techniki i protokoły laboratoryjne²⁹. Upewnić się, że kolagen jest nadal zimny. Pipetować 168,3 µl kolagenu do tej samej probówki do mikrocentryfugi.
6. Następnie, za pomocą pipety dodać 18 µl żółto-zielonych fluorescencyjnych mikrosfer modyfikowanych karboksylowo do tej samej probówki do mikrocentryfugi. Mieszać probówkę z wszystkimi roztworami w wortexie przez 30 s.
7. Dodać 77,7 µl pożądanej mieszaniny pożywki i komórek (stężenie około 2 x 10⁶ komórek/ml) do probówki do mikrocentryfugi i mieszać końcówką pipety przez 20 s. W razie potrzeby zmienić gęstość macierzy, korzystając z tabeli dostosowanej mieszaniny kolagenowej dla dodatku fluorescencyjnych kulek i żywotności komórek (Table 1).
8. Pipetować 300 µl mieszaniny kolagenu i komórek do środkowej studni (studnia nr 2) przygotowanego zestawu formy. Umieścić formę na jednorazowej płytce Petriego i przenieść do standardowego inkubatora na 20 min w temperaturze 37 °C przy 5% CO₂.
9. Wyjąć system z inkubatora i przenieść z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza. Za pomocą pęsety usunąć obie hydrofobowe szkiełka nakrywki, chwytając za górną krawędź każdego szkiełka i pociągając je do góry, z dala od formy.
10. Przenieść cały system pod wybrany mikroskop i wykonać obrazowanie, aby upewnić się, że ścianki formy kolagenowej są nadal proste, co zapewni planarny gradient dyfuzyjny.
11. Przy systemie wciąż znajdującym się pod mikroskopem, za pomocą jednokanałowej pipety 100 µl, dodać 100 µl pożywki komórkowej do studni nr 1. Następnie, za pomocą jednokanałowej pipety 100 µl, dodać 100 µl pożywki komórkowej z pożądanym stężeniem chemoatraktanta do studni nr 3.
12. Natychmiast po dodaniu roztworów do obu studni rozpocząć obrazowanie.

4. Obrazowanie i modelowanie dyfuzji

1. Jeśli chce się wyznaczyć współczynnik dyfuzji dla konkretnej gęstości kolagenu w celu obliczenia specyficznego stężenia, należy postępować zgodnie z poniższym protokołem:
   1. Zgodnie z opisanym powyżej protokołem zatytułowanym „Mieszanina kolagenu i macierz 3D”, zamiast przygotowywania pożywki komórkowej z pożądanym stężeniem chemoatraktanta, należy przygotować 5 µM rodaminy w probówce 15 ml, stosując standardowe obliczenia i protokoły³⁰.
   2. Należy obrazować trójwymiarowe macierze kolagenowe za pomocą systemu konfokalnego zamontowanego na mikroskopie odwróconym, wykorzystując laser argonowy (488 nm) do rejestracji fluorescencji. Obrazowanie powinno odbywać się co 2 lub 3 s przez maksymalnie 7 h.
2. Modelowanie dyfuzji: Wykorzystując przedstawiony poniżej model matematyczny, należy napisać kod oprogramowania obliczeniowego do przetwarzania i analizy danych, obejmujący następujące ogólne kroki.
   
   1. Zaimportować obrazy do oprogramowania obliczeniowego w celu przeskalowania i normalizacji według maksymalnej intensywności. Konwertować obrazy na mapę kolorów w skali szarości, aby wyznaczyć krawędź. Wybrać oś przebiegającą przez środek obrazu, po prawej i lewej stronie centrum.
   2. Za pomocą kodu oprogramowania obliczeniowego wykreślić znormalizowaną intensywność wraz z intensywnością rzeczywistą oraz różnicą między nimi.
   3. Następnie wprowadzić parametry niezbędne do dopasowania (stężenie, czas i długość).
   4. Wykreślić zależność znormalizowanego stężenia od czasu oraz profil stężenia wzdłuż osi x z dopasowaniem wielomianowym do danych.
   5. Obliczyć współczynnik dyfuzji przy użyciu kodu oprogramowania obliczeniowego.

5. Pomiary eksperymentalne

1. Nawiązując do równania dyfuzji, przekształć równanie, aby wyznaczyć konkretne stężenie w dowolnym miejscu w obrębie układu, zgodnie z poniższym wzorem.
   
   Gdzie:
   L = długość macierzy kolagenowej
   x = badane miejsce
   D = współczynnik dyfuzji
   t = czas upływowy
2. Podczas eksperymentów z chemotaksją należy dokładnie odnotować czas dodania chemokiny do układu. Po stwierdzeniu ruchu migracyjnego komórek należy rozpocząć rejestrację confocal time-lapse oraz odnotować dokładny czas i odległość od krawędzi, w której wykonano obrazowanie.
3. Podczas analizy danych podstaw odnotowany czas upływowy, lokalizację oraz współczynnik dyfuzji dla danej komórki do równania, aby obliczyć znormalizowane stężenie w dowolnym punkcie w obrębie kolagenu zarówno dla eksperymentów dyfuzyjnych, jak i komórkowych.

6. Śledzenie migracji komórek z wykorzystaniem TFM

1. Aby śledzić migrację komórek przy użyciu technik TFM/DVC, należy postępować zgodnie z poniższym protokołem:
   1. Po dodaniu pożądanej stężenia chemoatraktanta do dołka nr 3, rozpocząć obrazowanie trójwymiarowych macierzy kolagenowych za pomocą systemu konfokalnego zamontowanego na mikroskopie odwróconym, aby zlokalizować komórkę do badania.
   2. Po znalezieniu przemieszczającej się komórki, umieścić ją w centrum pola widzenia i wykorzystując silnik piezoelektryczny (do obrazowania w osi z), wykonywać zdjęcia co 1 lub 2 min.
   3. W celu obliczenia generowanej siły i deformacji komórki, stworzyć kod obliczeniowy pozwalający wyznaczyć przemieszczenia kulek fluorescencyjnych zgodnie z protokołami TFM/DVC³¹.

Wyniki

Zdolność tego testu do dokładnej oceny migracji komórek zależy od prawidłowej konfiguracji układu. Dlatego kluczowe jest precyzyjne zaprojektowanie formy układu dyfuzyjnego oraz zachowanie szczególnej staranności podczas rozmieszczania szkiełek nakrywkowych hydrofobowych i hydrofilowych, jak pokazano na Rysunku 1. Jeśli układ zostanie odpowiednio zaprojektowany, a podczas etapu modelowania dyfuzji zostanie wyznaczona bardzo dobra linia startowa, możliwe jest uzyskanie wysokiej jakości obrazów fluorescenc...

Dyskusja

Najważniejszymi krokami dla udanych eksperymentów dyfuzyjnych z komórkami lub bez nich są: prawidłowe ustawienie zespołu formy; rozwijanie niezbędnej sprawności manualnej, aby zapobiec uszkodzeniom podczas ekstrakcji hydrofobowych szkiełek nakrywkowych; zapewnienie znalezienia bardzo dobrej liniowej linii startowej w celu prawidłowego obliczenia współczynnika dyfuzji; prawidłowe obliczenia eksperymentalne zarówno kolagenu, jak i chemoatraktantu; prawidłowe stosowanie systemu obrazowania żywych komórek, aby zapewnić, że m...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw elastomerów silikonowych	Dow Corning Corp	182 SIL ELAST KIT .5KG	dwuczęściowa mistura z mieszanką 10:1
Komora do obrazowania żywych komórek	Przyrząd	CM-B18-1	CMB do 18  mm szkiełka nakrywkowe
okrągłe 22  mm Szkiełko nakrywkowe	szklane Fisher Scientific	NC0180281	Neuvitro Corp. szkiełko nakrywkowe 22  mm 1,5
Obrabiana maszynowo aluminiowa metalowa kostka
Nóż uniwersalny	Hobby X-Acto	X3201
3-(aminopropylo) trimetoksysilan	Sigma-Aldrich	281778-5ML
Aldehyd glutarowy	Polysciences, Inc	00216A-10	Aldehyd glutarowy, klasa EM,
tubka 8%50 ml	Fisher Scientific	14-432-22	Podłoga standardowa model i wirówki stołowe
Szklana szalka Petriego	Fisher Scientific	08-747A	Szalki Petriego wielokrotnego użytku: Kompletne (60 x 15  mm)
Kleszcze	Fisher Scientific	22-327-379	Kleszcze do cienkich końcówek
Okulary nakrywkowe	Fisher Scientific	12-518-105A	Prostokąt; 30 x 22  Mm; Grubość nr 1
Tridekafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooktyl	Gelest	SIT8174.0
Kwas octowy	Sigma-Aldrich	320099	Odczynnik ACS kwasu octowego, ≥ 99,7%
Hexan	Sigma-Aldrich	296090	bezwodny, 95%
alkohol etylowy	Sigma-Aldrich	E7023	200 proof, do biologii molekularnej
Precyzyjna diamentowa trasarka do trasowania	Lunzer	PV-081-3	Prosta rysiarka z przedłużoną końcówką, .020" (.50  mm) średnicy o .200" (5.0  mm) długość końcówki
Smar próżniowy	Dow Corning	14-635-5C	Smar wysokopróżniowy
tubka 15 ml	Fisher Scientific	14-959-49D	15 ml stożkowe probówki wirówkowe z hydrofobową, biologicznie obojętną powierzchnią
10x roztwór buforowany fosforanem	Fisher Scientific	BP399-500	1,37 M chlorek sodu, 0,027 M chlorek potasu i 0,119 M bufor fosforanowy
1  N wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	38215	Koncentrat wodorotlenku sodu
Kolagen I, ogon szczura	BD Biosciences	354236	Ogon szczura
Mikroprobówka wirówkowa	Fisher Scientific	02-681-332	Pojemność: 2,0 ml; O.D. x L: 13  x  40  Mm; sterylny; pojedynczo owinięte
[nagłówek]
Mikrosfery modyfikowane karboksylanem	Invitrogen	F-8813	Mikrosfery modyfikowane karboksylanem, 0,5 i mikro; m, żółto-zielona fluorescencyjna (505/515), 2% ciał stałych
Rhodamine	Sigma-Aldrich	83689	Rhodamina B do fluorescencji

do obrazowania żywych komórek