Opracowanie osadu sulfidogennego z osadów morskich i redukcja trichloroetylenu w reaktorze z przepływem atmosferycznym z przepływem atmosferycznym

Podsumowanie

Mikrobiologiczna redukcja siarczanów jest procesem o wielkim znaczeniu w biotechnologii środowiskowej. Powodzenie reaktorów sulfidogennych zależy m.in. od składu mikrobiologicznego osadu. W tym miejscu przedstawiamy protokół zagospodarowania osadu sulfidogennego z osadów kominów hydrotermalnych w reaktorze UASB do celów odchlorowania redukcyjnego.

Streszczenie

Znaczenie redukcji mikrobiologicznych siarczanów zależy od różnych zastosowań, które oferuje w biotechnologii środowiskowej. Inżynierska redukcja siarczanów jest stosowana w oczyszczaniu ścieków przemysłowych w celu usunięcia dużych stężeń siarczanów wraz z chemicznym zapotrzebowaniem na tlen (ChZT) i metalami ciężkimi. Najpowszechniejszym podejściem do tego procesu są bioreaktory beztlenowe, w których osad sulfidogenny uzyskuje się poprzez adaptację metanogennego osadu granulowanego do sulfidogenezy. Proces ten może trwać długo i nie zawsze eliminuje konkurencję o substrat ze względu na obecność metanogenów w osadzie. W niniejszej pracy proponujemy nowatorskie podejście do otrzymywania osadów sulfidogennych, w których pierwotnym źródłem mikroorganizmów są osady kominów hydrotermalnych. Społeczność drobnoustrojów rozwinięta w obecności siarczanów i lotnych kwasów tłuszczowych jest wystarczająco szeroka, aby utrzymać redukcję siarczanów przez długi czas bez wykazywania zahamowania przez siarczek.

Ten protokół opisuje procedurę generowania szlamu z osadów w reaktorze typu UASB (ang. upflow anaerobic sludge blanket). Ponadto w protokole przedstawiono procedurę mającą na celu wykazanie zdolności osadu do usuwania za pomocą redukcyjnego odchlorowania modelu wysoce toksycznego zanieczyszczenia organicznego, takiego jak trichloroetylen (TCE). Protokół jest podzielony na trzy etapy: (1) tworzenie się osadu i określenie jego aktywności redukującej siarczany w UASB, (2) eksperyment mający na celu usunięcie TCE przez osad oraz (3) identyfikacja mikroorganizmów w osadzie po redukcji TCE. Chociaż w tym przypadku osady zostały pobrane z miejsca znajdującego się w Meksyku, wytwarzanie osadu sulfidogennego przy użyciu tej procedury może zadziałać, jeśli weźmie się inne źródło osadów, ponieważ osady morskie są naturalną pulą mikroorganizmów, które mogą być wzbogacone w bakterie redukujące siarczany.

Wprowadzenie

Jednym z najważniejszych wkładów w biotechnologię środowiskową było zaprojektowanie bioreaktorów, w których użyty osad (inokulum) był w stanie działać w warunkach redukcji siarczanów. Redukcja siarczanów (SR) umożliwia oczyszczanie strumieni ścieków, które zawierają wysokie stężenia siarczanów, a także jednoczesne usuwanie ChZT, metali ciężkich i zanieczyszczeń organicznych, co sprawia, że SR jest pożądaną cechą osadu ¹. Niektóre przykłady ścieków zanieczyszczonych siarczanami pochodzą z przemysłu garbarskiego, papierniczego, farmaceutycznego i chemicznego ¹. Jednak większość literatury odnosi się do osadu sulfidogennego, gdy metanogenny osad granulowany został przystosowany do sulfidogenezy ². Adaptację tę zwykle osiąga się poprzez manipulowanie stosunkiem ChZT/_SO4^2- w bioreaktorze i dodawanie substancji chemicznych w celu zahamowania metanogenów w osadzie ^2,3. Oprócz długiego czasu, który może wymagać tworzenia granulek sulfidogennych, konkurencja między metanogenami a reduktorami siarczanów oraz tolerancja osadu na wysokie stężenia siarczków to tylko niektóre z głównych problemów, które mogą wystąpić, jeśli osad sulfidogenny stosowany w bioreaktorze jest uzyskiwany w wyniku adaptacji osadu z przewagą metanogennego do warunków redukcji siarczanów. W niniejszej pracy opisano procedurę otrzymywania osadu z przewagą sulfidogennego z osadów kominów hydrotermalnych (Punta Mita, Nayarit, Meksyk) w reaktorze z przepływem beztlenowym osadu (UASB), a następnie oceniamy jego aktywność redukującą siarczany w czasie i przeprowadzamy eksperyment w celu oceny jego zastosowania w odchlorowaniu redukcyjnym. Lokalizacja osadów została wybrana, ponieważ doniesiono, że w tym miejscu dochodzi do powstawania siarczków w wyniku aktywności redukującej siarczany, wykazywanej przez społeczność mikrobiologiczną zamieszkującą to konkretne miejsce⁴.

Istnieje kilka zalet w pozyskiwaniu tego osadu sulfidogennego z osadów w porównaniu z adaptacją metanogennego osadu granulowanego do sulfidogenezy. Niektóre z tych zalet to: (1) nie jest konieczne tworzenie granulek do działania bioreaktora, (2) osad toleruje stosunkowo wysokie stężenia siarczków w porównaniu z innymi UASB, które działają z przystosowanym osadem metanogennym, oraz (3) nie ma konkurencji o substrat z metanogenami, nawet jeśli octan jest stosowany w mieszaninie lotnych kwasów tłuszczowych zawartych w pożywce hodowlanej w celu sprzyjania tworzeniu się osadu.

Ta procedura została przeprowadzona w celu promowania sulfidogenezy, ponieważ osady morskie są naturalną pulą szerokiej gamy mikroorganizmów, takich jak bakterie redukujące siarczany, bakterie fermentujące i bakterie dehalogenujące, żeby wymienić tylko kilka ^5,6. Rodzaj konsorcjum opracowanego z osadów morskich przy użyciu tego protokołu może wykazywać skuteczność w redukcji siarczanów, a tym samym wysoką aktywność redukującą siarczany w czasie i wyższą tolerancję na siarczki w stężeniach wyższych niż zgłaszane jako toksyczne dla metanogenów i bakterii redukujących siarczany. Z drugiej strony, jest prawdopodobne, że zdolność do dehalogenacji jest również wykazywana w osadach zgodnie z proponowanym tutaj protokołem, ale może to zależeć od pierwotnej społeczności mikrobiologicznej. Założenie to opiera się na fakcie, że redukcyjne odchlorowanie może zachodzić zarówno w wyniku oddychania, jak i kometabolizmu, czyli warunków, które mogą być promowane w społeczności mikroorganizmów morskich ⁷. Uprawę osadów w celu uzyskania osadu przeprowadzono przy użyciu mieszaniny octanu, propionianu i maślanu jako substratu, ponieważ te lotne kwasy tłuszczowe są wykorzystywane przez kilka szczepów bakterii redukujących siarczany. Kwasy te są również rodzajem związków węgla często występujących w osadach morskich, zgodnie z kilkoma doniesieniami w literaturze na temat materiału węglowego w osadach morskich^5,6.

Na koniec, jednymi z najbardziej toksycznych związków występujących w wodach gruntowych i innych zbiornikach wodnych na całym świecie są rozpuszczalniki chlorowane, takie jak trichloroetylen (TCE) czy perchloroetylen (PCE). Związki te są toksyczne nie tylko dla człowieka, ale także dla mikroorganizmów, w szczególności TCE, który jest nadal uważany za zanieczyszczenie priorytetowe przez Agencję Ochrony Środowiska w USA⁸. W niniejszej pracy zaproponowano doświadczenie, w którym osad sulfidogenny jest badany pod kątem jego zdolności do redukcji TCE przy stężeniach mieszczących się w zakresie zgłaszanym dla biodegradacji związków chlorowanych w warunkach metanogennych^9,10. Warto nadmienić, że większość badań nad biodegradacją związków chlorowanych prowadzona jest w warunkach metanogennych ^9,10. Uważamy, że eksperyment z TCE zaproponowany w tym protokole jest dobrym przykładem potencjalnych zastosowań osadu. Celem tego eksperymentu była ocena tolerancji osadu na TCE oraz wpływu TCE na aktywność redukującą siarczany. Biorąc pod uwagę, że większość badań nad biodegradacją związków chlorowanych prowadzona jest w warunkach metanogennych, protokół ten sugeruje, że tworzenie osadu może być wykorzystywane do równocześnie: (1) usuwania siarczanu, (2) usuwania ChZT i (3) usuwania związków chlorowanych. Kolejnym krokiem może być ocena osadu przy jednoczesnym usuwaniu TCE i metali ciężkich (oprócz siarczanów i ChZT), dwóch warunków, których nie można ocenić w warunkach metanogennych.

Protokół

Rysunek 1. Schemat kroków protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

1. Pobieranie osadów morskich do utworzenia szlamu

1. Zidentyfikuj dostępny obszar podmorski, znajdujący się albo w pobliżu kominów hydrotermalnych (ze względu na obecność siarczków, które mogą wskazywać na wyższą aktywność redukcji siarczanów), albo w rejonie, w którym wykrywalne są szczątki materii organicznej.
2. Na potrzeby niniejszej pracy pobierz około 3 lub 4 kg osadu i odlej wodę z próbek. Umieść próbki w ciemnych plastikowych workach. Chłodzenie nie jest wymagane.
3. Po dotarciu do laboratorium przechowuj worki z próbkami w lodówce, jeśli nie będą one użyte natychmiast. Na potrzeby niniejszej pracy próbki mogą być przechowywane w lodówce przez wiele tygodni lub miesięcy przed ich wykorzystaniem.
4. Pobierz dużą część próbki osadu (t.j. 1 lub 2 kg) i użyj odpowiedniego sita (0,2 cm), aby usunąć z osadów duże fragmenty materiału węglowego lub obecne w nich kamienie.
   Uwaga: W tym przypadku użyto sita o średnicy oczek 0,20 cm (0,0767 in), jednak jego rozmiar może być inny w zależności od wielkości cząstek w próbce.
   1. Po przesianiu osadu wymieszaj wybraną porcję, aby zapewnić jej homogeniczność.
   2. Pobierz oddzielne mniejsze próbki (t.j. 2 do 3 g), aby określić zawartość lotnych substancji zawieszonych (VSS), postępując zgodnie ze standardowymi metodami ¹¹.
      Uwaga: Kroki od 1.2 do 1.4 przedstawiono na Rysunku 2.

Rysunek 2. Fotografie próbek osadu. (A) Próbki osadu bezpośrednio po pobraniu. (B) Próbka osadu po przejściu przez sito. (C) Próbka pobrana do ważenia przed oznaczeniem zawiesiny organicznej (VSS). Szalka Petriego nie wymaga sterylizacji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Konfiguracja bioreaktora

1. Do niniejszej pracy należy wykorzystać szklany reaktor UASB o całkowitej objętości roboczej 3 L. Alternatywnie można zastosować szklany reaktor o objętości 1 lub 2 L.
2. Na podstawie zawartości VSS w osadach należy obliczyć ilość osadu do wykorzystania jako inokulum, aby uzyskać 5 g VSS w 1 L.
3. Należy wziąć pod uwagę, że jeżeli obliczona ilość osadu okaże się zbyt duża, osady powinny zamiast tego zajmować około 25% do 30% objętości bioreaktora.
   1. Należy zapisać zawartość VSS, ponieważ ulegnie ona zmianie w miarę wzbogacania społeczności mikrobiologicznej w bioreaktorze. Zawartość VSS jest niezbędna do obliczeń aktywności redukcji siarczanów w bioreaktorze.
4. Należy upewnić się, że końcowe stężenie pożywki podstawowej i roztworu buforującego w bioreaktorze jest zbliżone do wartości zgłoszonych przez Guerrero-Barajas et al. (2014)¹².
   1. Należy dopilnować, aby końcowe objętości osadów, pożywki podstawowej, roztworu buforującego oraz lotnych kwasów tłuszczowych były równe końcowej objętości roboczej reaktora. Przepis na pożywkę podstawową¹² zawiera odpowiednie stężenia roztworu metali śladowych i witamin.
   2. Należy przygotować roztwór zapasowy pożywki podstawowej i roztworu buforującego w stężeniu dostosowanym do objętości roboczej stosowanego reaktora (t.j. 2, 3 lub 4 krotnie bardziej stężone niż opisane w punkcie 2.4), aby po rozcieńczeniu uzyskać stężenie zgłoszone przez Guerrero-Barajas et al. (2014)¹²).
      Uwaga: Roztwór zapasowy pożywki podstawowej jest zawsze niezbędny, natomiast roztwór buforujący jest potrzebny jedynie podczas rozruchu. Po tym czasie dodawanie roztworu buforującego nie jest konieczne.
   3. Należy przygotować roztwór zapasowy lotnych kwasów tłuszczowych: octanu, propionianu i maślanu w proporcji ChZT 2,5:1:1. W obliczeniach należy uwzględnić octan sodu zawarty w pożywce podstawowej. Końcowe stężenie ChZT w reaktorze musi wynosić 2,7 g/L.
      Przestroga: Roztwór ten należy przygotowywać w dygestorium. Podczas przygotowywania roztworu należy stosować rękawice nitrylowe i okulary ochronne. Należy uwzględnić stechiometrię reakcji siarczanów z lotnymi kwasami tłuszczowymi przedstawioną na Rysunku 3.
   4. Należy przygotować roztwór zapasowy siarczanu sodu (Na₂SO₄) w stężeniu umożliwiającym dostarczenie do reaktora końcowego stężenia jonów siarczanowych (SO₄^2-) wynoszącego 4 000 mg/L. Alternatywnie można zamiast dodawania z roztworu zapasowego uwzględnić wymaganą ilość siarczanów w pożywce podstawowej, o ile końcowe stężenie siarczanów (SO₄^2-) będzie prawidłowe.
5. Osady należy umieścić w reaktorze, mieszając je z częścią pożywki podstawowej, aby upewnić się, że dotrą one do dna reaktora.
   1. Należy dodać resztę pożywki podstawowej i roztworu buforującego zmieszanych z roztworem lotnych kwasów tłuszczowych oraz roztworem siarczanów. Należy upewnić się, że roztwór lotnych kwasów tłuszczowych jest wlewany do cieczy. Uwaga: Krok ten należy przeprowadzić w dygestorium.
   2. Należy podłączyć przyłącza i rurociągi reaktora do pompy recyrkulacyjnej. Przepływ recyrkulacyjny należy ustawić na 60 ml/min. Bioreaktor należy umieścić w komorze temperaturowej w temperaturze 34 °C. Należy regularnie sprawdzać, czy wahania temperatury są niewielkie (t.j. 34 ± 1,7 °C).
   3. Należy podłączyć układ do kolumny wyporowej gazu.
      Uwaga: Kroki od 2.1 do 2.5 przedstawiono na Rysunku 4.

Rysunek 3. Stechiometria redukcji siarczanów z wykorzystaniem VFA (octanu, propionianu i maślanu). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4. Reaktor UASB. (A) Czas początkowy. (B) Tryb ciągły po 300 dniach pracy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Obsługa reaktora w celu promowania sulfidogenezy i wzrostu mikroorganizmów

Uwaga: Należy pozwolić szczepionce na zużycie lotnych kwasów tłuszczowych i siarczanów. W tym celu należy odczekać jeden tydzień przed przeprowadzeniem pierwszej analizy zużycia siarczanów, siarczków oraz ChZT.

1. Po jednym tygodniu inkubacji pobrać próbkę 5 do 7 ml cieczy w celu przeprowadzenia analizy zawartości ChZT, siarczanów i siarczków oraz pomiaru pH zgodnie z metodami standardowymi ^{11, 13}.
   1. Oznaczyć zawartość siarczków w cieczy spektrofotometrycznie (przy długości fali (λ) 670 nm) metodą błękitu metylenowego ¹³.
      1. Do kolby miarowej o pojemności 25 ml wlać 5 ml roztworu octanu cynku (2% m/m), a następnie szybko dodać 200 µl próbki do roztworu octanu cynku.
      2. Dodać 2,5 ml roztworu szczawianu N,N-dimetylo-p-fenylenediamine (DMP) (0,2% m/m w 20% H₂SO₄) oraz 125 µl roztworu siarczanu amonu żelaza(III) (10% m/m w 2% H₂SO₄) i uzupełnić kolbę miarową do 25 ml wodą destylowaną. Odczekać 30 min do zajścia reakcji, po tym czasie barwa niebieska ulega stabilizacji. ¹³.
         Uwaga: Odczekać co najmniej 15 min, ale nie więcej niż 60 min przed badaniem próbek w spektrofotometrze. Odczytać wartość absorbancji końcowego niebieskiego roztworu w spektrofotometrze.
   2. Oznaczyć zawartość siarczanów zgodnie z metodami standardowymi ¹¹. W tym przypadku ilość siarczanów określić jako siarczan baru metodą turbidymetryczną.
      1. Do kolby miarowej o pojemności 25 ml wlać 5 ml roztworu kondycjonującego (kwas solny HCl 1:1), dodać 1 ml uprzednio odwirowanej próbki (przy 11 320 × g), uzupełnić objętość kolby miarowej do 25 ml wodą destylowaną i dodać 1 g chlorku baru.
      2. Mieszać roztwór przez 1 min w wstrząsaniu typu vortex. Odczekać 4 min do utworzenia się siarczanu baru i odczytać wartość próbki w spektrofotometrze przy długości fali (λ) 420 nm ¹¹.
   3. Oznaczyć ChZT zgodnie z metodami standardowymi ¹¹. Alternatywnie można zastosować zestaw do oznaczania ChZT.
      1. Przed oznaczaniem ChZT dokładnie odwirować próbkę (przy 11 320 x g), aby usunąć pozostałe siarczki, które mogą zakłócać oznaczanie. W razie potrzeby odwirować dwukrotnie: pierwszy raz natychmiast po pobraniu próbki, a drugi raz po odczekaniu 6 lub 8 h, a następnie przeprowadzić analizę ChZT.
      2. Do fiolki reakcyjnej z zestawu do oznaczania ChZT dodać 2 ml próbki, zamknąć fiolkę i zhomogenizować mieszaninę poprzez delikatne potrząsanie. Przygotować próbę ślepą, dodając 2 ml wody destylowanej do drugiej fiolki reakcyjnej i zhomogenizować mieszaninę.
      3. Umieścić fiolki w reaktorze do mineralizacji w temperaturze 150 °C na 2 h. Wyjąć fiolki i pozostawić do ostygnięcia w ciemności. Odczytać wartości z fiolek w spektrofotometrze przy długości fali 620 nm.
   4. Odczytać objętość gazu z kolumny wypierającej gaz.
2. Odczekać kolejne 5 do 7 dni do momentu zużycia siarczanów. Siarczany i ChZT muszą zostać zużyte w około 85% do 90% przed rozpoczęciem nowej partii w trybie fed-batch.
3. Po zużyciu siarczanów (i ChZT) całkowicie powtórzyć krok 2.4. Dla każdej partii dostarczyć świeżą pożywkę i nowe składniki odżywcze.
4. Powtórzyć kroki 3.1 i 3.2. Na tym etapie każda partia powinna trwać od 7 do 10 dni.
5. Po ukończeniu 3 do 4 partii powtórzyć krok 2.4, zwiększając stężenie ChZT do 4 g/L.
6. Powtórzyć krok 3.1 oraz krok 3.2.
   1. Powtórzyć krok 3.3, zwiększając stężenie ChZT do 6 g/L.
   2. Powtarzać kroki 3.6 i 3.6.1, stopniowo zwiększając stężenie ChZT aż do osiągnięcia 10 g/L.
      Uwaga: Wykreślić wykres przedstawiający stężenie siarczanów (mg/L) w funkcji czasu (d).
7. Gdy zużycie siarczanów przekroczy 80% w czasie krótszym niż 24 h i stan ten utrzyma się przez ponad tydzień, przełączyć pracę reaktora na tryb ciągły. Dla trybu ciągłego ustawić hydrauliczny czas zatrzymania (HRT) na 24 h i utrzymać stężenie siarczanów na poziomie 4 g/L oraz ChZT na poziomie 10 g/L.
   Uwaga: Z czasem zużycie siarczanów powinno być szybsze.

4. Test aktywności redukcji siarczanów

1. Przed rozpoczęciem tego testu należy upewnić się, że bioreaktor pracujący w trybie ciągłym wykazuje wariancję pozostałego stężenia siarczanów poniżej 10%.
2. W wybranym dniu należy zatrzymać reaktor po jednym cyklu HRT i przeprowadzić krok 2.4. W kroku 2.4.3 należy zastosować stężenie COD wynoszące 10 g/L.
3. Po zasileniu bioreaktora należy pobierać próbki cieczy o objętości od 5 do 7 ml i co godzinę przeprowadzać analizę COD, siarczanów, siarczków (krok 3.1) oraz pH. Należy rejestrować objętość wytworzonego gazu.
4. Aktywność redukcji siarczanów należy obliczyć zgodnie z literaturą ¹⁴.
    
   

SRA = aktywność redukcji siarczanów (mg COD-H₂S)/gVSS*d

m H₂S = stężenie siarczków wyrażone jako mg COD-H₂S

VSS = stężenie lotnych zawiesin

t = czas (d lub hr)

5. Sporządź odpowiednie wykresy przedstawiające procent zużycia siarczanów w zależności od stężenia siarczków w czasie w mg/L. Wykonaj wykresy przedstawiające procent zużycia ChZT w czasie. Wykonaj wykresy przedstawiające zmiany pH w czasie.

5. Test redukcji trichloroetylenu (TCE)

1. Przed przystąpieniem do tego testu należy upewnić się, że bioreaktor pracuje w trybie ciągłym, a wariancja pozostałego stężenia siarczanów wynosi mniej niż 10%. Nie należy rozpoczynać testu, jeśli redukcja siarczanów w bioreaktorze jest mniejsza niż 90%.
2. Przygotować roztwór zapasowy trichloroetylenu (TCE), uwzględniając, że końcowe stężenie tego związku w fazie ciekłej bioreaktora musi wynosić 300 μM. Należy uwzględnić rozdział związku do przestrzeni nad cieczą, korzystając z bezwymiarowej stałej prawa Henry'ego (H´) dla TCE w temperaturze 34°C. °C. H´at 34 °Wartość C dla TCE wynosi 0,4722.
   
   Uwaga: Roztwór należy przygotować w dygestorium, używając rękawic i okularów ochronnych.
   1. Na przykład dla 5 000 μroztwór stokowy M, obliczyć w następujący sposób:
      
      Stężenie TCE w fazie gazowej = (0,4722) * (5 000) = 2 361 μM. Należy uwzględnić to stężenie podczas przygotowywania roztworu zapasu, ponieważ taka ilość TCE znajdzie się w przestrzeni nad cieczą.
      Wówczas w cieczy (wodzie) roztworu zapasowego rzeczywiste stężenie TCE wyniesie: 5 000 + 2 139 = 7 139 μGęstość M. TCE = 1,43 g/ml. Przelicz 7139 μPrzelicz M na mg, a następnie, korzystając z gęstości TCE, oblicz objętość TCE potrzebną do przygotowania roztworu zapasu.
      Uwaga: Stężenie roztworu zapasu TCE może być niższe niż 5 000 μM, t. j., 3000 lub 1000 μM, zależy to od tego, jaka objętość tego roztworu może zostać dostarczona do bioreaktora w stosunku do objętości jego fazy ciekłej.
3. Przygotować krzywe wzorcowe w chromatografie gazowym dla TCE, cis-1,2-dichloroetylen, Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.-1,2-dichloroetylen, chlorek winylu i eten. Przygotuj cis-1,2-dichloroetylen i Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.Krzywe wzorcowe dla 1,2-dichloroetylenu z roztworu zapasowego tych związków, zgodnie z procedurą opisaną w punkcie 5.2 dla roztworu zapasowego TCE. Przygotować krzywe wzorcowe dla chlorku winylu i etenu poprzez rozcieńczenie stężenia każdego gazu z wzorców (butli gazowych).
   1. Przygotować krzywe wzorcowe tych związków w zakresie od 20 do 300 μM. Zastosować metodę opisaną przez Guerrero-Barajasa i wsp.. (2011)¹⁵ do analizy tych związków w chromatografie gazowym.
      Uwaga: Roztwory wzorcowe należy przygotować w dygestorium, używając rękawic i okularów ochronnych.
4. W dowolnym dniu należy zatrzymać reaktor po jednym cyklu HRT i przeprowadzić krok 2.4. W kroku 2.4.3 należy zastosować stężenie ChZT wynoszące 10 g/L.
5. Po zasileniu bioreaktora należy dodać TCE bezpośrednio do cieczy w bioreaktorze z roztworu zapasowego przygotowanego w punkcie 5.2; końcowe stężenie TCE w fazie ciekłej bioreaktora musi wynosić 300 μM. Ustaw HRT na 12 h.
   1. Po zakończeniu jednego cyklu HRT pobierz próbki cieczy (od 500 do 1 000 μl) i przeprowadzić analizę ChZT, siarczanów i siarczków (kroki 3.1.1, 3.1.2 i 3.1.3). Pobrać próbki przestrzeni nad cieczą (od 100 do 250 μl) i przeprowadzić analizę w kierunku TCE, cis-1,2-dichloroetylen, Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.-1,2-dichloroetylen, chlorek winylu i eten w chromatografie gazowym.
6. Powtórz krok 2.4. W kroku 2.4.3 zastosuj stężenie ChZT wynoszące 10 g/L.
7. Nie należy powtarzać żadnego testu redukcji TCE do czasu, aż w bioreaktorze wystąpi ponad 90% redukcji siarczanów oraz wariancja mniejsza niż 10% zarówno dla redukcji siarczanów, jak i zawartości pozostałych w bioreaktorze siarczanów.
8. Powtórzyć kroki 5.4, 5.5 i 5.6 jeszcze dwa lub trzy razy.
9. Pobierz próbki osadu (0,5 g) w celu przeprowadzenia identyfikacji mikroorganizmów bezpośrednio po zakończeniu testu redukcji TCE. Czynność tę należy wykonać po 2 lub 3 testach redukcji TCE.

6. Test aktywności redukcji siarczanów po eksperymencie redukcji TCE

1. Powtórz w całości krok 4.

7. Identyfikacja mikroorganizmów

1. Pobrać próbki osadu o masie około 0,5 g każda i przeprowadzić całkowitą ekstrakcję RNA zgodnie ze standardową metodą ¹².
2. Przeprowadzić amplifikację genu 16S rRNA z odwrotną transkrypcją i wykonać jednoetapową reakcję łańcuchową polimerazy (RT-PCR) ¹².
3. Zaprojektować startery do amplifikacji lub w ramach podejścia wstępnego wykorzystać te sugerowane w literaturze ¹¹. Postępować zgodnie z procedurą amplifikacji opisaną w literaturze ¹².
4. skonstruować biblioteki 16S rRNA. Amplikony PCR można sklonować przy użyciu zestawu do klonowania ¹¹. Zazwyczaj klonuje się 10 kolonii z każdej płytki (każda kolonia reprezentuje jeden produkt PCR). Przygotować plazmidowe DNA do sekwencjonowania zgodnie z procedurą sugerowaną w literaturze ¹².
5. Przeprowadzić sekwencjonowanie fragmentów. Ponownie amplifikować około 1 400 bp zewnętrznych produktów PCR zgodnie z wcześniej opisanym protokołem amplifikacji PCR (krok 7.4) i sklonować zgodnie z procedurą sugerowaną w literaturze ¹². Wyizolować rekombinowany plazmid z kolonii E. coli zgodnie z sugestiami w literaturze ¹². Wykonać częściową procedurę sekwencjonowania z użyciem uniwersalnych starterów M13 ¹².
6. Przeprowadzić analizę sekwencji. Wyrównać sekwencje nukleotydowe za pomocą programu Clustal X i skorygować je ręcznie w edytorze tekstu. Wykonać wyszukiwania BLAST w bazie danych NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) ¹².
7. Uzyskać numery akcesyjne sekwencji nukleotydowych. Zdeponować sekwencje nukleotydowe zidentyfikowanych klonów w bazie danych sekwencji nukleotydowych EMBL (Gen-Bank/EMBL/DDBJ) pod odpowiadającymi im numerami akcesyjnymi (np. JQ713915eJQ713925 dla sekwencji z amplikonów) ¹².

Wyniki

Typowy przebieg redukcji siarczanów w bioreaktorze przedstawiono na Rysunku 5. Należy zauważyć, że w pierwszych tygodniach pracy redukcja siarczanów przebiega powolnie. Mimo to, zużycie ponad 90% siarczanów w czasie wskazuje, że inokulum rozwija społeczność drobnoustrojów zdolnych do redukcji siarczanów, a tym samym jest wzbogacone w bakterie redukujące siarczany. Różne okresy zaznaczone na rysunku wskazują, że tempo redukcji siarczanów wzrastało z biegiem czasu. Na początku redukcja siarczanów w trybie ...

Dyskusja

Istnieje kilka zastosowań sulfidogenezy w biotechnologii środowiskowej, jednym z najczęściej stosowanych zastosowań metabolizmu bakterii redukujących siarczany w konsorcjach z bakteriami fermentującymi jest oczyszczanie ścieków. Reaktory UASB są jednym z głównych podejść inżynieryjnych do oczyszczania ścieków przemysłowych o wysokich stężeniach siarczanów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół otrzymywania osadu sulfidogennego z osadów morskich w reaktorze UASB. Kluczowymi etapami w protokole w celu uzyskania osadu s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
trichloroetylen	sigma Aldrich	251402
cis-1,2-dichlorotehylene	sigma Aldrich
trans-1,2-dichloroetylen	sigma	Aldrich D-62209
chlorek winylu Scotty Standard	Supelco		1,000 ppm v/v w azocie
Ethene Scotty Standard	Supelco		99% czystości
pompa	Masterflex		Model 7553-75
spektrofotometr	dowolna
mikrowirówka	dowolne
gazoszczelne strzykawki	dowolny		pojemności 100 i 200 mikrolitrów
			w trakcie projektowania
	dowolny		detektor FID
kolumna kapilarna SPB-624	supelco
pH-metr
rurka vitonowa	Masterflex
	wszelkie
odczynniki metali śladowych	dowolne
witamin	dowolne
siarczan sodu	wszelkie
lotne kwasy tłuszczowe	dowolny
zestaw do oznaczania ChZT	HACH		0-15 000 mg/l
Zestaw do klonowania TOPO-TA, pCR® 4.0	Invitrogen, US
S.N.A.P. TM Zestaw do miniprzygotowania	Invitrogen, Wielka Brytania
Pure link TM Szybki zestaw do miniprzygotowania plazmidu	Invitrogen

szklany reaktor UASB o , dowolny chromatograf gazowy dowolny odczynniki podłoża podstawowego odczynniki roztworu zakres