Opracowanie osadu sulfidogennego z osadów morskich i redukcja trichloroetylenu w reaktorze z przepływem atmosferycznym z przepływem atmosferycznym

Podsumowanie

Mikrobiologiczna redukcja siarczanów jest procesem o wielkim znaczeniu w biotechnologii środowiskowej. Powodzenie reaktorów sulfidogennych zależy m.in. od składu mikrobiologicznego osadu. W tym miejscu przedstawiamy protokół zagospodarowania osadu sulfidogennego z osadów kominów hydrotermalnych w reaktorze UASB do celów odchlorowania redukcyjnego.

Streszczenie

Znaczenie redukcji mikrobiologicznych siarczanów zależy od różnych zastosowań, które oferuje w biotechnologii środowiskowej. Inżynierska redukcja siarczanów jest stosowana w oczyszczaniu ścieków przemysłowych w celu usunięcia dużych stężeń siarczanów wraz z chemicznym zapotrzebowaniem na tlen (ChZT) i metalami ciężkimi. Najpowszechniejszym podejściem do tego procesu są bioreaktory beztlenowe, w których osad sulfidogenny uzyskuje się poprzez adaptację metanogennego osadu granulowanego do sulfidogenezy. Proces ten może trwać długo i nie zawsze eliminuje konkurencję o substrat ze względu na obecność metanogenów w osadzie. W niniejszej pracy proponujemy nowatorskie podejście do otrzymywania osadów sulfidogennych, w których pierwotnym źródłem mikroorganizmów są osady kominów hydrotermalnych. Społeczność drobnoustrojów rozwinięta w obecności siarczanów i lotnych kwasów tłuszczowych jest wystarczająco szeroka, aby utrzymać redukcję siarczanów przez długi czas bez wykazywania zahamowania przez siarczek.

Ten protokół opisuje procedurę generowania szlamu z osadów w reaktorze typu UASB (ang. upflow anaerobic sludge blanket). Ponadto w protokole przedstawiono procedurę mającą na celu wykazanie zdolności osadu do usuwania za pomocą redukcyjnego odchlorowania modelu wysoce toksycznego zanieczyszczenia organicznego, takiego jak trichloroetylen (TCE). Protokół jest podzielony na trzy etapy: (1) tworzenie się osadu i określenie jego aktywności redukującej siarczany w UASB, (2) eksperyment mający na celu usunięcie TCE przez osad oraz (3) identyfikacja mikroorganizmów w osadzie po redukcji TCE. Chociaż w tym przypadku osady zostały pobrane z miejsca znajdującego się w Meksyku, wytwarzanie osadu sulfidogennego przy użyciu tej procedury może zadziałać, jeśli weźmie się inne źródło osadów, ponieważ osady morskie są naturalną pulą mikroorganizmów, które mogą być wzbogacone w bakterie redukujące siarczany.

Wprowadzenie

Jednym z najważniejszych wkładów w biotechnologię środowiskową było zaprojektowanie bioreaktorów, w których użyty osad (inokulum) był w stanie działać w warunkach redukcji siarczanów. Redukcja siarczanów (SR) umożliwia oczyszczanie strumieni ścieków, które zawierają wysokie stężenia siarczanów, a także jednoczesne usuwanie ChZT, metali ciężkich i zanieczyszczeń organicznych, co sprawia, że SR jest pożądaną cechą osadu ¹. Niektóre przykłady ścieków zanieczyszczonych siarczanami pochodzą z przemysłu garbarskiego, papierniczego, farmaceutycznego i chemicznego ¹. Jednak większość literatury odnosi się do osadu sulfidogennego, gdy metanogenny osad granulowany został przystosowany do sulfidogenezy ². Adaptację tę zwykle osiąga się poprzez manipulowanie stosunkiem ChZT/_SO4^2- w bioreaktorze i dodawanie substancji chemicznych w celu zahamowania metanogenów w osadzie ^2,3. Oprócz długiego czasu, który może wymagać tworzenia granulek sulfidogennych, konkurencja między metanogenami a reduktorami siarczanów oraz tolerancja osadu na wysokie stężenia siarczków to tylko niektóre z głównych problemów, które mogą wystąpić, jeśli osad sulfidogenny stosowany w bioreaktorze jest uzyskiwany w wyniku adaptacji osadu z przewagą metanogennego do warunków redukcji siarczanów. W niniejszej pracy opisano procedurę otrzymywania osadu z przewagą sulfidogennego z osadów kominów hydrotermalnych (Punta Mita, Nayarit, Meksyk) w reaktorze z przepływem beztlenowym osadu (UASB), a następnie oceniamy jego aktywność redukującą siarczany w czasie i przeprowadzamy eksperyment w celu oceny jego zastosowania w odchlorowaniu redukcyjnym. Lokalizacja osadów została wybrana, ponieważ doniesiono, że w tym miejscu dochodzi do powstawania siarczków w wyniku aktywności redukującej siarczany, wykazywanej przez społeczność mikrobiologiczną zamieszkującą to konkretne miejsce⁴.

Istnieje kilka zalet w pozyskiwaniu tego osadu sulfidogennego z osadów w porównaniu z adaptacją metanogennego osadu granulowanego do sulfidogenezy. Niektóre z tych zalet to: (1) nie jest konieczne tworzenie granulek do działania bioreaktora, (2) osad toleruje stosunkowo wysokie stężenia siarczków w porównaniu z innymi UASB, które działają z przystosowanym osadem metanogennym, oraz (3) nie ma konkurencji o substrat z metanogenami, nawet jeśli octan jest stosowany w mieszaninie lotnych kwasów tłuszczowych zawartych w pożywce hodowlanej w celu sprzyjania tworzeniu się osadu.

Ta procedura została przeprowadzona w celu promowania sulfidogenezy, ponieważ osady morskie są naturalną pulą szerokiej gamy mikroorganizmów, takich jak bakterie redukujące siarczany, bakterie fermentujące i bakterie dehalogenujące, żeby wymienić tylko kilka ^5,6. Rodzaj konsorcjum opracowanego z osadów morskich przy użyciu tego protokołu może wykazywać skuteczność w redukcji siarczanów, a tym samym wysoką aktywność redukującą siarczany w czasie i wyższą tolerancję na siarczki w stężeniach wyższych niż zgłaszane jako toksyczne dla metanogenów i bakterii redukujących siarczany. Z drugiej strony, jest prawdopodobne, że zdolność do dehalogenacji jest również wykazywana w osadach zgodnie z proponowanym tutaj protokołem, ale może to zależeć od pierwotnej społeczności mikrobiologicznej. Założenie to opiera się na fakcie, że redukcyjne odchlorowanie może zachodzić zarówno w wyniku oddychania, jak i kometabolizmu, czyli warunków, które mogą być promowane w społeczności mikroorganizmów morskich ⁷. Uprawę osadów w celu uzyskania osadu przeprowadzono przy użyciu mieszaniny octanu, propionianu i maślanu jako substratu, ponieważ te lotne kwasy tłuszczowe są wykorzystywane przez kilka szczepów bakterii redukujących siarczany. Kwasy te są również rodzajem związków węgla często występujących w osadach morskich, zgodnie z kilkoma doniesieniami w literaturze na temat materiału węglowego w osadach morskich^5,6.

Na koniec, jednymi z najbardziej toksycznych związków występujących w wodach gruntowych i innych zbiornikach wodnych na całym świecie są rozpuszczalniki chlorowane, takie jak trichloroetylen (TCE) czy perchloroetylen (PCE). Związki te są toksyczne nie tylko dla człowieka, ale także dla mikroorganizmów, w szczególności TCE, który jest nadal uważany za zanieczyszczenie priorytetowe przez Agencję Ochrony Środowiska w USA⁸. W niniejszej pracy zaproponowano doświadczenie, w którym osad sulfidogenny jest badany pod kątem jego zdolności do redukcji TCE przy stężeniach mieszczących się w zakresie zgłaszanym dla biodegradacji związków chlorowanych w warunkach metanogennych^9,10. Warto nadmienić, że większość badań nad biodegradacją związków chlorowanych prowadzona jest w warunkach metanogennych ^9,10. Uważamy, że eksperyment z TCE zaproponowany w tym protokole jest dobrym przykładem potencjalnych zastosowań osadu. Celem tego eksperymentu była ocena tolerancji osadu na TCE oraz wpływu TCE na aktywność redukującą siarczany. Biorąc pod uwagę, że większość badań nad biodegradacją związków chlorowanych prowadzona jest w warunkach metanogennych, protokół ten sugeruje, że tworzenie osadu może być wykorzystywane do równocześnie: (1) usuwania siarczanu, (2) usuwania ChZT i (3) usuwania związków chlorowanych. Kolejnym krokiem może być ocena osadu przy jednoczesnym usuwaniu TCE i metali ciężkich (oprócz siarczanów i ChZT), dwóch warunków, których nie można ocenić w warunkach metanogennych.

Protokół

Rysunek 1. Schemat kroków protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Zbieraj osady morskie do tworzenia szlamu

1. Zidentyfikuj dostępny obszar podmorski w pobliżu kominów hydrotermalnych (ze względu na obecność siarczków, które mogą wskazywać na wyższą aktywność redukującą siarczany) lub do obszaru, w którym wykrywane są szczątki materii organicznej.
2. Do celów tej pracy należy pobrać około 3 lub 4 kg osadu i spuścić wodę z próbek. Umieść próbki w ciemnych plastikowych torebkach. Nie jest potrzebne chłodzenie.
3. Po wejściu do laboratorium trzymaj torby z próbkami w lodówce, jeśli nie mają być natychmiast zużyte. Na potrzeby tej pracy próbki mogą znajdować się w lodówce przez tygodnie lub miesiące przed ich użyciem.
4. Pobrać dużą część próbki osadu (tj. 1 lub 2 kg) i użyć odpowiedniej siatki (0,2 cm) w celu wyeliminowania z osadów dużych zanieczyszczeń materiału węglowego, które mogą zostać znalezione, lub niektórych skał, które mogą być obecne.
   Uwaga: W tym przypadku użyto siatki o średnicy 0,20 cm (0,0767 cala), ale może ona mieć różny rozmiar w zależności od wielkości cząstek w próbce.
   1. Po przepuszczeniu osadu przez siatkę należy wymieszać wybraną porcję, aby zapewnić jednorodność porcji.
   2. Pobrać oddzielone mniejsze próbki (tj. 2-3 g) w celu oznaczenia zawartości lotnych zawiesin (VSS), postępując zgodnie ze standardowymi metodami ¹¹.
      Uwaga: Patrz rysunek 2, aby zapoznać się z krokami od 1.2 do 1.4.

Rysunek 2. Fotografie próbek osadów. (A) Próbki osadów bezpośrednio po ich pobraniu. (B) Próbka osadu po przejściu przez siatkę. (C) Próbka pobrana do ważenia przed oznaczeniem lotnej zawiesiny (VSS). Szalka Petriego nie musi być sterylizowana. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Konfiguracja bioreaktora

1. Do celów tej pracy należy użyć szklanego reaktora UASB o całkowitej objętości roboczej 3 l. Alternatywnie należy użyć szklanego reaktora o pojemności 1 lub 2 l.
2. Na podstawie zawartości VSS w osadach obliczyć ilość osadu, która ma być użyta jako inokulum, aby uzyskać 5 g VSS w 1 L.
3. Należy wziąć pod uwagę, że jeśli ilość osadu po obliczeniach jest zbyt duża, wówczas około 25% do 30% objętości bioreaktora powinno być zajęte przez osady.
   1. Zapisz zawartość VSS, ponieważ zmieni się ona, gdy społeczność drobnoustrojów zostanie wzbogacona w bioreaktorze. Zawartość VSS jest potrzebna do obliczeń aktywności redukującej siarczany w bioreaktorze.
4. Upewnij się, że końcowe stężenie podłoża podstawowego i roztworu buforowego w bioreaktorze jest podobne do stężenia podanego przez Guerrero-Barajasa i wsp. (2014)^{Rozdział 12}.
   1. Upewnij się, że końcowe objętości osadów, podłoża podstawowego, roztworu buforowego i lotnych kwasów tłuszczowych są równe końcowej objętości roboczej reaktora. Receptura podłoża podstawowego¹² zawiera odpowiednie stężenia dla roztworu metali śladowych i witamin.
   2. Przygotować roztwór podstawowy składający się z pożywki podstawowej i roztworu buforowego o stężeniu odpowiednim do objętości roboczej użytego reaktora (tj. 2, 3 lub 4 razy bardziej stężonym niż podane w kroku 2.4), aby zapewnić, że po rozcieńczeniu osiągnie stężenie podane przez Guerrero-Barajas i wsp. (2014)^{Rozdział 12}).
      Uwaga: Roztwór podstawowy dla podłoża podstawowego jest zawsze konieczny, jednak roztwór buforowy jest potrzebny tylko przy rozruchu. Po tym czasie nie ma potrzeby dodawania roztworu buforowego.
   3. Przygotować roztwór podstawowy lotnych kwasów tłuszczowych: octanu, propionianu i maślanu w proporcji 2,5:1:1 ChZT. W obliczeniach należy uwzględnić octan sodu zawarty w pożywce podstawowej. Końcowe stężenie ChZT w reaktorze musi wynosić 2,7 g/L.
      Uwaga: Przygotuj ten roztwór w dygestorium. Do przygotowania tego roztworu należy nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne. Weź pod uwagę stechiometrię reakcji siarczanu z lotnymi kwasami tłuszczowymi, która jest pokazana na rysunku 3.
   4. Przygotować roztwór podstawowy siarczanu sodu (Na_2SO4) o odpowiednim stężeniu, aby dostarczyć do reaktora końcowe stężenie 4 000 mg/l jonu siarczanowego (_SO42^-). Alternatywnie, należy uwzględnić wymaganą ilość siarczanu w pożywce podstawowej zamiast dodawać go z roztworu podstawowego, o ile końcowe stężenie siarczanu (SO₄^2-) jest prawidłowe.
5. Umieść osady w reaktorze wymieszane z częścią podłoża podstawowego, aby upewnić się, że dotrą do dna reaktora.
   1. Dodać pozostałą część podłoża podstawowego i roztwór buforowy zmieszany z roztworem lotnych kwasów tłuszczowych i roztworem siarczanu. Upewnij się, że roztwór lotnych kwasów tłuszczowych wlewa się do płynu. Uwaga: Wykonaj ten krok w dygestorium.
   2. Ustawić połączenia i rurociągi reaktora z pompą recyklingową. Ustaw natężenie przepływu recyklingu na 60 ml/min. Ustawić bioreaktor w komorze temperaturowej na 34 °C. Regularnie sprawdzać, czy wahania temperatury są niewielkie (tj. 34 ± 1,7 °C)
   3. Ustaw połączenia z kolumną wyporową gazu.
      Uwaga: Patrz Rysunek 4, aby zapoznać się z krokami od 2.1 do 2.5.

Rysunek 3. Stechiometria redukcji siarczanów za pomocą LKT (octan, propionian i maślan). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Reaktor UASB. oraz Czas początkowy. (B) Reżim ciągły po 300 dniach eksploatacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Działanie reaktora w celu wspomagania sulfidogenezy i wzrostu mikroorganizmów

Uwaga: Pozwól, aby inokulum spożyło lotne kwasy tłuszczowe i siarczany. W tym celu należy odczekać tydzień, aby przeprowadzić pierwszą analizę spożycia siarczanów, siarczków i ChZT.

1. Po tygodniu inkubacji pobrać próbkę 5-7 ml cieczy w celu przeprowadzenia analizy ChZT, zawartości siarczanów i siarczków oraz pH zgodnie ze standardowymi metodami ^{11, 13}.
   1. Analizować siarczek w cieczy spektrofotometrycznie (przy długości fali (λ) 670 nm), stosując metodę błękitu metylenowego ¹³.
      1. Umieścić 5 ml roztworu octanu (2% w/w) w kolbie pomiarowej o pojemności 25 ml, szybko dodać 200 μl próbki do roztworu octanu.
      2. Dodać 2,5 ml roztworu szczawianuN,N-dimetylo-p-fenylenodiaminy (DMP) (0,2% m/m w 20% H 2 SO₄) i 125 μl roztworu siarczanu amonu (10% m/w 2% H₂SO₄) i uzupełnić wodą destylowaną 25 ml w kolbie miarowej. Odczekaj 30 minut, aż zajdzie reakcja, czas, w którym kolor niebieski się stabilizuje. ¹³.
         Uwaga: Odczekać co najmniej 15 minut, ale nie dłużej niż 60 minut, aby przetestować próbki w spektrofotometrze. Przeprowadzić odczyt niebieskiego roztworu końcowego w spektrofotometrze.
   2. Analizować siarczan zgodnie ze standardowymi metodami ¹¹. Tutaj określ ilościowo siarczan jako siarczan baru przy użyciu metody turbidymetrycznej.
      1. Umieścić 5 ml roztworu kondycjonującego (kwas solny HCl 1:1) w kolbie miarowej o pojemności 25 ml, dodać 1 ml uprzednio odwirowanej próbki (o masie 11,320 × g), uzupełnić 25 ml kolby miarowej wodą destylowaną i dodać 1 g chlorku baru.
      2. Mieszaj roztwór przez 1 minutę w wirze. Odczekać 4 minuty, aż utworzy się siarczan baru i odczytać próbkę w spektrofotometrze na długości fali (λ) 420 nm ¹¹.
   3. Analizuj ChZT zgodnie ze standardowymi metodami ¹¹. Alternatywnie użyj zestawu do oznaczania ChZT.
      1. Przed oznaczeniem ChZT dokładnie odwirować próbkę (przy 11,320 x g) w celu usunięcia pozostałego siarczku, który może zakłócać oznaczenie. W razie potrzeby odwirować dwukrotnie: pierwszy raz natychmiast po pobraniu próbki, a drugi raz odczekać 6 lub 8 godzin, a następnie przeprowadzić analizę ChZT.
      2. Dodać 2 ml próbki do fiolki reakcyjnej z zestawu do oznaczania ChZT, zamknąć fiolkę i homogenizować mieszaninę przez delikatne mieszanie. Przygotować ślepą próbę, dodając 2 ml wody destylowanej do innej fiolki reakcyjnej i homogenizować mieszaninę.
      3. Umieścić fiolki w reaktorze do wyminażania w temperaturze 150 °C na 2 godziny. Wyjąć fiolki i pozostawić do ostygnięcia w ciemności. Dokonać odczytów fiolek w spektrofotometrze o długości fali 620 nm.
   4. Uzyskaj objętość gazu z kolumny wyporności gazu.
2. Poczekaj do kolejnych 5 do 7 dni, aż siarczan zostanie zużyty. Siarczany i ChZT muszą być spożyte w około 85% do 90% przed rozpoczęciem nowej porcji karmienia.
3. Po spożyciu siarczanu (i ChZT) całkowicie powtórz krok 2.4. Dostarczaj świeżą pożywkę i nowe składniki odżywcze dla każdej partii.
4. Powtórz kroki 3.1 i 3.2. W tym momencie każda partia powinna wystarczyć na od 7 do 10 dni.
5. Po skompletowaniu 3 do 4 partii powtórzyć krok 2.4, ale zwiększyć stężenie ChZT do 4 g/l.
6. Powtórz kroki 3.1 i 3.2.
   1. Powtórzyć krok 3.3, ale zwiększyć stężenie ChZT do 6 g/l.
   2. Powtórzyć czynności opisane w ppkt 3.6 i 3.6.1, stopniowo zwiększając stężenie ChZT, aż osiągnie 10 g/l,
      Uwaga: Sporządź wykres przedstawiający stężenie siarczanów (mg/L) w funkcji czasu (d).
7. Gdy zużycie siarczanów przekracza 80% w czasie krótszym niż 24 godziny i trwa to dłużej niż tydzień, przełącz pracę reaktora w tryb ciągły. Dla trybu ciągłego ustaw hydrauliczny czas retencji (HRT) na 24 godziny i utrzymuj stężenie siarczanów na poziomie 4 g/l, a ChZT na poziomie 10 g/l.
   Uwaga: Z biegiem czasu zużycie siarczanów powinno być szybsze.

4. Test aktywności redukującej siarczany

1. Przed tym testem należy upewnić się, że bioreaktor w trybie ciągłym wykazuje mniej niż 10% zmiany w pozostałym stężeniu siarczanów.
2. Każdego dnia należy zatrzymać reaktor po jednym cyklu HTZ i przeprowadzić krok 2.4. Dla kroku 2.4.3 należy przyjąć stężenie ChZT wynoszące 10 g/l.
3. Po nakarmieniu bioreaktora należy pobrać od 5 do 7 ml próbek cieczy i co godzinę przeprowadzać analizę pod kątem ChZT, siarczanów, siarczków (krok 3.1) i pH. Zapisać objętość wyprodukowanego gazu.
4. Obliczyć aktywność redukującą siarczany zgodnie z literaturą ¹⁴.
   
   

= aktywność redukująca siarczany (mg ChZT-H₂S)/gVSS*d

m H₂S = stężenie siarczku wyrażone jako mg ChZT-H₂S

VSS = stężenie lotnych zawiesin

t = czas (d lub godz.)

5. Wykonaj odpowiednie wykresy, które pokazują procentowe zużycie siarczanów w stosunku do stężenia siarczków w czasie w mg / L. Wykonaj wykresy, które pokazują procentowe spożycie ChZT w czasie. Zrób wykresy, które pokazują zmiany pH w czasie.

5. Test redukcji trichloroetylenu (TCE)

1. Przed tym testem upewnij się, że bioreaktor pracuje w trybie ciągłym i wykazuje mniej niż 10% odchylenia w pozostałym stężeniu siarczanów. Nie rozpoczynaj tego testu, jeśli redukcja siarczanów w bioreaktorze jest mniejsza niż 90%.
2. Przygotować roztwór podstawowy trichloroetylenu (TCE), biorąc pod uwagę, że końcowe stężenie tego związku w fazie ciekłej bioreaktora musi wynosić 300 μM. Rozważ podział związku na przestrzeń nad roztworem przy użyciu stałej bezwymiarowej prawa Henry'ego (H') dla TCE w temperaturze 34 °C. H'at 34 °C dla TCE wynosi 0,4722,
   
   Uwaga: Przygotuj ten roztwór w oparach i załóż rękawice i okulary.
   1. Na przykład dla roztworu podstawowego 5 000 μM oblicz w następujący sposób:
      
      Stężenie w fazie gazowej TCE = (0,4722)*(5,000) = 2,139 μM. Uwzględnij to stężenie w przygotowaniu roztworu podstawowego, ponieważ ta ilość TCE będzie znajdować się w przestrzeni nad roztworem.
      Następnie w cieczy (wodzie) roztworu podstawowego rzeczywiste stężenie TCE wyniesie: 5 000 + 2 139 = 7 139 μM. Gęstość TCE = 1,43 g/ml. Przelicz 7139 μM na mg, a następnie, korzystając z gęstości TCE, oblicz objętość TCE dla roztworu podstawowego.
      Uwaga: Stężenie roztworu podstawowego TCE może być niższe niż 5 000 μM, tj. 3 000 lub 1 000 μM, w zależności od tego, ile objętości tego roztworu można dostarczyć do bioreaktora zgodnie z objętością jego fazy ciekłej.
3. Przygotować krzywe wzorcowe w chromatografie gazowym dla TCE, cis-1,2-dichloroetylenu, trans-1,2-dichloroetylenu, chlorku winylu i etenu. Przygotować krzywe wzorcowe cis-1,2-dichloroetylenu i trans-1,2-dichloroetylenu z roztworu podstawowego tych związków, postępując zgodnie z tą samą procedurą, którą opisano w ppkt 5.2 dla roztworu podstawowego TCE. Przygotować wzorcowe krzywe dla chlorku winylu i etenu, rozcieńczając stężenie każdego gazu z wzorców (butli gazowych).
   1. Przygotować krzywe wzorcowe tych związków w zakresie od 20 do 300 μM. Należy zastosować metodę opisaną przez Guerrero-Barajas i wsp. (2011)¹⁵ do analizy tych związków w chromatografie gazowym.
      Uwaga: Przygotuj te roztwory wzorcowe w oparach i załóż rękawice i okulary.
4. Każdego dnia należy zatrzymać reaktor po jednym cyklu HTZ i przeprowadzić krok 2.4. Dla kroku 2.4.3 należy przyjąć stężenie ChZT wynoszące 10 g/l.
5. Po nakarmieniu bioreaktora dodać TCE bezpośrednio do cieczy w bioreaktorze z roztworu podstawowego przygotowanego w ppkt. 5.2, końcowe stężenie TCE w fazie ciekłej bioreaktora musi wynosić 300 μM. Ustawić HRT na 12 godzin.
   1. Pod koniec jednego cyklu HTZ pobrać próbki cieczy (500 do 1 000 μl) i przeprowadzić analizę na obecność ChZT, siarczanów i siarczków (etapy 3.1.1, 3.1.2 i 3.1.3). Pobrać próbki z przestrzeni nad roztworem (100–250 μl) i przeprowadzić analizę na obecność TCE, cis-1,2-dichloroetylenu, trans-1,2-dichloroetylenu, chlorku winylu i etenu w chromatografie gazowym.
6. Powtórz krok 2.4. Dla kroku 2.4.3 należy przyjąć stężenie ChZT wynoszące 10 g/l.
7. Nie należy powtarzać żadnego testu redukcji TCE, dopóki bioreaktor nie wykaże ponad 90% redukcji siarczanów i mniejszej niż 10% zmienności zarówno w redukcji siarczanów, jak i siarczanów pozostających w bioreaktorze.
8. Powtórz 5.4, 5.5 i 5.6 dwa lub trzy razy więcej.
9. Pobrać próbki osadu (0,5 g) w celu przeprowadzenia identyfikacji mikroorganizmów tuż po zakończeniu testu redukcji TCE. Zrób to po 2 lub 3 testach redukcji TCE.

6. Test aktywności redukującej siarczany po eksperymencie redukcji TCE

1. Powtórz krok 4 w całości.

7. Identyfikacja mikroorganizmów

1. Pobrać próbki osadu o masie około 0,5 g każda i przeprowadzić całkowitą ekstrakcję RNA zgodnie ze standardową metodą ¹².
2. Amplifikuj gen 16S rRNA z odwrotną transkrypcją i przeprowadź amplifikację reakcji łańcuchowej polimerazy (RT-PCR) w jednym kroku ¹².
3. Zaprojektuj startery, aby wzmocnić lub użyć jako początkowego podejścia tych sugerowanych w literaturze ¹¹. Postępuj zgodnie z procedurą amplifikacji sugerowaną w literaturze ¹².
4. Skonstruuj biblioteki 16S rRNA. Amplikony PCR można klonować za pomocą zestawu do klonowania ¹¹. Zazwyczaj można sklonować 10 kolonii z każdej płytki (każda kolonia reprezentuje jeden produkt PCR). Przygotować plazmidowe DNA do sekwencjonowania zgodnie z procedurą sugerowaną w literaturze ¹².
5. Przeprowadź sekwencjonowanie fragmentów. Ponownie amplifikować około 1 400 pz zewnętrznych produktów PCR za pomocą protokołu amplifikacji PCR opisanego wcześniej (krok 7.4) i sklonować zgodnie z procedurą sugerowaną w literaturze ¹². Wyizolować rekombinowany plazmid z kolonii E. coli, jak sugerowano w literaturze ¹². Wykonaj częściową procedurę sekwencjonowania za pomocą uniwersalnych starterów M13 ¹².
6. Przeprowadź analizę sekwencji. Dopasuj sekwencje nukleotydowe za pomocą Clustal X i ręcznie dostosuj w edytorze tekstu. Wykonaj wyszukiwanie w bazie danych NCBI za pomocą BLAST. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi) ^{Rozdział 12}.
7. Uzyskaj numery dostępu do sekwencji nukleotydów. Zdeponuj sekwencje nukleotydowe klonów zidentyfikowanych w bazie danych sekwencji nukleotydów EMBL (Gen-Bank/EMBL/DDBJ) pod odpowiednimi numerami dostępu (tj. JQ713915eJQ713925 dla sekwencji z amplikonów) ¹².

Wyniki

Typowe zachowanie redukcji siarczanów w bioreaktorze pokazane jest na rysunku 5. Ważne jest, aby zauważyć, że w pierwszych tygodniach operacji redukcja siarczanów będzie powolna. Jakkolwiek powolne, spożycie ponad 90% siarczanu w czasie wskazuje, że inokulum rozwija społeczność mikrobiologiczną zdolną do redukcji siarczanów, a zatem wzbogaconą w bakterie redukujące siarczany. Różne okresy na rysunku wskazują, że redukcja siarczanów zwiększała swoje tempo w czasie. Na początku partia potrzebowała 20 dni n...

Dyskusja

Istnieje kilka zastosowań sulfidogenezy w biotechnologii środowiskowej, jednym z najczęściej stosowanych zastosowań metabolizmu bakterii redukujących siarczany w konsorcjach z bakteriami fermentującymi jest oczyszczanie ścieków. Reaktory UASB są jednym z głównych podejść inżynieryjnych do oczyszczania ścieków przemysłowych o wysokich stężeniach siarczanów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół otrzymywania osadu sulfidogennego z osadów morskich w reaktorze UASB. Kluczowymi etapami w protokole w celu uzyskania osadu s...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
trichloroetylen	sigma Aldrich	251402
cis-1,2-dichlorotehylene	sigma Aldrich
trans-1,2-dichloroetylen	sigma	Aldrich D-62209
chlorek winylu Scotty Standard	Supelco		1,000 ppm v/v w azocie
Ethene Scotty Standard	Supelco		99% czystości
pompa	Masterflex		Model 7553-75
spektrofotometr	dowolna
mikrowirówka	dowolne
gazoszczelne strzykawki	dowolny		pojemności 100 i 200 mikrolitrów
			w trakcie projektowania
	dowolny		detektor FID
kolumna kapilarna SPB-624	supelco
pH-metr
rurka vitonowa	Masterflex
	wszelkie
odczynniki metali śladowych	dowolne
witamin	dowolne
siarczan sodu	wszelkie
lotne kwasy tłuszczowe	dowolny
zestaw do oznaczania ChZT	HACH		0-15 000 mg/l
Zestaw do klonowania TOPO-TA, pCR® 4.0	Invitrogen, US
S.N.A.P. TM Zestaw do miniprzygotowania	Invitrogen, Wielka Brytania
Pure link TM Szybki zestaw do miniprzygotowania plazmidu	Invitrogen