Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek

16.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52959

⸱

17 sierpnia 2015

 ,  , 
1Cellular Networks Proteomics Unit, Laboratory of Systems Biology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzać bezwzględne testy kwantyfikacyjne docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych przy użyciu monitorowania wybranych reakcji. Wykorzystano go do dokładnego ilościowego określenia białek szlaku sygnałowego chemotaksji makrofagów myszy. Szczegółowo opisano wybór peptydów docelowych, opracowywanie testów oraz testy jakościowe i ilościowe.

Streszczenie

Bezwzględna kwantyfikacja docelowych białek w złożonych próbkach biologicznych jest kluczowa dla szerokiego zakresu badań i zastosowań klinicznych. Protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące opracowywania i stosowania testów ilościowych przy użyciu spektrometrii mas (MS) z monitorowania wybranych reakcji (SRM). Po pierwsze, prawdopodobne kwantyotypowe peptydy docelowe są identyfikowane na podstawie wielu kryteriów. Obejmuje to identyfikację peptydów proteotypowych, unikanie miejsc modyfikacji potranslacyjnej i analizę unikalności docelowego peptydu w stosunku do docelowego białka. Następnie syntetyzuje się surowe zewnętrzne wzorce peptydowe i wykorzystuje je do opracowania testów SRM, a uzyskane testy wykorzystuje się do przeprowadzenia analiz jakościowych próbek biologicznych. Na koniec przygotowuje się oczyszczone, ilościowe, znakowane ciężkimi izotopami wewnętrznymi wzorce peptydów i wykorzystuje się je do przeprowadzenia testów SRM z rozcieńczeniem izotopów. Przedstawiono analizę wszystkich uzyskanych danych z MS. Protokół ten został wykorzystany do dokładnego oznaczenia bezwzględnej obfitości białek szlaku sygnałowego chemotaksji w komórkach RAW 264.7 (linia komórkowa monocytów / makrofagów myszy). Szczegółowo opisano oznaczanie ilościowe Gi2 (heterotrimerycznej podjednostki α białka G).

Wprowadzenie

Eksperymenty proteomiczne wykorzystujące spektrometrię mas (MS) mogą być zaprojektowane tak, aby używały metod nieukierunkowanych (strzelba) lub ukierunkowanych. Proteomika odkrywcza zasadniczo opiera się na oddolnym stwardnieniu rozsianym, przy użyciu tradycyjnego trybu akwizycji zależnej od danych lub przy użyciu jednej z niedawno opracowanych technik niezależnych od danych (np. MSE, SWATH)1,2. Proteomika typu shotgun jest potężnym narzędziem do wysokoprzepustowej identyfikacji peptydów i względnej kwantyfikacji, ale generalnie nie nadaje się do bezwzględnej kwantyfikacji lub do celowania w małe, zdefiniowane zestawy (~dziesiątki) białek. Metodą MS najczęściej stosowaną w proteomice celowanej jest monitorowanie wybranych reakcji (SRM) ze względu na jej wysoką czułość, szybkość i zakres dynamiki3-5. Alternatywą dla SRM jest równoległe monitorowanie reakcji, które wykorzystuje pełne skanowanie MS o wysokiej rozdzielczości6.

SRM jest zwykle wykonywany przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami nano-przepływowymi (nano-RP-LC) sprzężonego ze źródłem jonów jonizacji nano-elektronowej (nano-ESI) podłączonym do potrójnego kwadrupolowego spektrometru masowego (QqQ-MS). W typowym eksperymencie białka próbki są trawione proteolitycznie, a powstałe peptydy są chromatograficznie rozdzielane, desorbowane i jonizowane. Powstałe jony prekursorowe są filtrowane m/z przez pierwszy kwadrupol (Q1) i rozdrabniane w drugim kwadrupolu (q2) poprzez zderzenie ich z gazem zderzeniowym. Powstałe jony fragmentacyjne są filtrowane m/z w trzecim kwadrupolu (Q3) i oznaczane ilościowo za pomocą dynode. Każda para jonów prekursorowych i fragmentacyjnych jest określana jako przejście, a każde przejście jest monitorowane przez określony czas (czas przebywania; zwykle 2-50 ms). Podczas LC-SRM QqQ-MS przechodzi przez predefiniowaną listę przejść (cykl pracy wynosi zwykle ≤3 sekundy) i tworzony jest chromatogram każdego przejścia.

Alternatywne strategie oznaczania ilościowego białek zazwyczaj wykorzystują testy immunologiczne, takie jak plamy punktowe, plamy zachodnie, ELISA, mikromacierze przeciwciał, mikromacierze białek w odwróconej fazie, mikroprzepływowe testy immunologiczne, cyfrowe testy ELISA i testy immunologiczne oparte na mikrosferze7. Najlepsze testy immunologiczne mogą być znacznie bardziej czułe niż LC-SRM, a przepustowość próbek testów immunologicznych może być znacznie wyższa niż w przypadku LC-SRM5. Jednak opracowanie testów immunologicznych może być kosztowne i/lub czasochłonne, a uzyskane testy mogą być podatne na reaktywność krzyżową i / lub interferencję, niezgodne z metodami lizy/homogenizacji komórek/tkanek i/lub niepodatne na multipleksowanie5,8. Niektóre z tych problemów można rozwiązać, stosując techniki sprzęgania oparte na przeciwciałach i stwardnieniu rozsianym. Na przykład białka docelowe można wzbogacić za pomocą immunoprecypitacji przed proteolizą i LC-SRM9-12. Alternatywnie, technika SISCAPA wykorzystuje immunoprecypitację po proteolizie na poziomie peptydu13,14. Oprócz strategii wzbogacania immunologicznego, zubożenie immunologiczne białek o wysokiej liczebności można zastosować w celu zwiększenia czułości LC-SRM poprzez zmniejszenie interferencji przez koelucję analitów15,16.

Kwantyfikacja białek oparta na MS może być podzielona na względną i bezwzględną, a także na bezznacznikowe i stabilne izotopy (np. znakowanie metaboliczne, znakowanie chemiczne oraz ciężkie znakowane wewnętrzne standardy białek i peptydów). Techniki bezznacznikowe mogą być przydatne do względnej kwantyfikacji białek, ale nie nadają się do dokładnej bezwzględnej kwantyfikacji. Dla porównania, techniki znakowania zmniejszyły błędy związane z przygotowaniem próbki i wariancją stwardnienia rozsianego i są często stosowane do względnej kwantyfikacji białka17. Na przykład wzorce proteomu znakowanego stabilnymi izotopami (SILAP) przygotowane przy użyciu hodowlanej linii komórek ludzkich umożliwiły względną kwantyfikację potencjalnych biomarkerów za pomocą LC-SRM ludzkiej surowicy18. Dokładna bezwzględna ocena ilościowa białka przez MS wymaga, aby oczyszczone, kwantyfikowane, znakowane izotopowo wzorce wewnętrzne białek lub peptydów zostały wzbogacone w próbki biologiczne przed MS. Włączenie wzorców wewnętrznych znakowanych ciężkimi izotopami do przepływu pracy LC-SRM umożliwia bezwzględną kwantyfikację, która, jak wykazano, jest wysoce odtwarzalna i możliwa do przeniesienia między laboratoriami16,19.

Standardy wewnętrzne znakowane stabilnym izotopem do bezwzględnej kwantyfikacji białek przez MS obejmują wzorce peptydów przygotowane przy użyciu syntezy fazy stałej20, białka złożone ze skonkatenowanych standardów peptydów rozszczepialnych proteazą21 oraz standardy białek o pełnej długości22. Modyfikacja kowalencyjna białka docelowego i niepełne przygotowanie próbki (tj. niekompletna liza i homogenizacja próbki oraz niepełna solubilizacja, denaturacja, alkilowanie i proteoliza białka) mogą podważyć dokładną kwantyfikację. Wewnętrzne wzorce białkowe są najmniej narażone na większość z tych potencjalnych problemów, ale zwykle są one najtrudniejsze do przygotowania. Alternatywą jest analiza każdego białka docelowego przy użyciu wielu wewnętrznych wzorców peptydowych, które są zaprojektowane tak, aby zawierały natywne reszty flankujące amino- i karboksylowe. Niezależnie od tego, jaki rodzaj wzorca wewnętrznego zostanie zastosowany, powinien on zostać wprowadzony do próbek biologicznych na jak najwcześniejszym etapie przygotowania próbki. Należy również przetestować wiele technik przygotowania próbek (np. różne warunki denaturacji). Zastosowanie wielu ortogonalnych technik eksperymentalnych (eksperymentalna walidacja krzyżowa) jest realną strategią przezwyciężania większości potencjalnych wyzwań związanych z kwantyfikacją23-25.

Ilościowa ocena białek LC-SRM jest bardzo elastyczną techniką, która była używana w wielu różnych zastosowaniach. Warto zauważyć, że został on wykorzystany do badania biomarkerów peptydowych i białkowych w próbkach klinicznych, takich jak surowica, biopsje gruboigłowe i aspiraty cienkoigłowe5. LC-SRM został również wykorzystany do pomiaru stechiometrii kompleksów białkowych5,26, do wykrywania neurotoksyn botulinowych27, do ilościowego określenia dynamiki fosforylacji białek w szlakach sygnałowych5 oraz do ilościowego określenia zmian w konformacji białek28.

Nasze laboratorium używa LC-SRM do ilościowego oznaczania białek sygnałowych, które pośredniczą w chemotaksji makrofagów, aby wspierać rozwój symulacji szlaku chemotaksji. Ogólny schemat protokołu (ryc. 1) rozpoczyna się od uszeregowania wstępnych peptydów docelowych. Następnie syntetyzowane są surowe zewnętrzne wzorce peptydowe, które są wykorzystywane do opracowania testów LC-SRM do analiz jakościowych próbek biologicznych. W przypadku wykrycia docelowego peptydu pochodzącego z próbki biologicznej, przygotowuje się oczyszczone, znakowane ciężkim wewnętrznym wzorcem peptydowym do ilościowego LC-SRM. Protokół ten może być wykorzystany do dokładnego ilościowego oznaczania białek z szerokiej gamy próbek biologicznych oraz do wspierania badań nad szeroką gamą docelowych białek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Ta metoda została już wcześniej opisana56.

1. Wybór celu peptydowego

  1. Sporządź listę białek docelowych i uwzględnij niewielką liczbę białek porządkowych w celu normalizacji w próbkach biologicznych, a także uwzględnij wewnętrzny wzorzec białka (np. lucyferazę świetlika). Trawienie docelowych białek do peptydów tryptycznych in silico za pomocą narzędzia programowego, takiego jak Protein Digestion Simulator29,30.
  2. Wymagaj, aby peptydy były w pełni tryptyczne i nie zawierały brakujących miejsc rozszczepienia trypsyny. Unikaj peptydów z sąsiednimi miejscami rozszczepienia trypsyny, aby uniknąć potencjalnie niepełnego trawienia trypsyny31.
  3. Wymagaj, aby długość każdego peptydu wynosiła 5-20 reszt. Rozważ dłuższe peptydy, ale pamiętaj, że są one na ogół droższe w syntezie.
  4. Unikaj peptydu, jeśli odpowiada on naturalnemu wariantowi genetycznemu (np. polimorfizmowi pojedynczego nukleotydu). Upewnij się również, że miejsca trypsyny nie są naruszone (krok 1.2).
  5. Unikaj peptydu, jeśli odpowiada on miejscu modyfikacji potranslacyjnej (PTM). Podobnie, należy unikać peptydu, jeśli byłby podatny na modyfikacje chemiczne podczas przygotowywania próbki LC-MS. W szczególności unikaj peptydów podatnych na utlenianie cysteiny i metioniny, deamidację asparaginy i glutaminy oraz aminokońcowe tworzenie glutaminy piroglutaminianu. Upewnij się, że miejsca trypsyny nie są naruszone (krok 1.2).
    1. Ponadto należy unikać peptydów pochodzących z białek amino- i karboksylowych, ponieważ końce białek są podatne na modyfikacje potranslacyjne (utrata i acetylacja amino-końcowej metioniny oraz amidacja karboksylowo-końcowa).
  6. Wymagaj, aby każdy peptyd docelowy był unikalny dla każdego białka docelowego. Jeżeli nie jest to możliwe, wymagaj, aby peptyd był unikalny dla zestawu izoform/homologów. Traktuj peptydy różniące się tylko podstawieniem leucyny/izoleucyny tak, jakby były identyczne przy określaniu unikalności peptydów, ponieważ działają one prawie identycznie podczas LC-SRM.
    1. Jeśli przeprowadzono kompleksową analizę transkryptomiczną wszystkich próbek biologicznych (np. sekwencjonowania RNA), należy określić unikalność peptydów za pomocą translacji in silico sekwencji transkryptów32 zamiast wykorzystywać cały proteom gatunku.
  7. Wymagaj, aby peptydy docelowe były proteotypowe. Zidentyfikuj peptydy proteotypowe za pomocą spektrometrii mas typu shotgun1,2 badanych próbek biologicznych. Alternatywnie, pobierz identyfikacje peptydów proteotypowych z internetowych baz danych proteomicznych, takich jak biblioteki spektrometrii mas NIST33 (http://peptide.nist.gov/), The Global Proteome Machine34 (X! Biblioteki spektralne HUNTER z http://www.thegpm.org/HUNTER/index.html oraz identyfikacje peptydów GPMDB z http://gpmdb.thegpm.org/), PeptideAtlas35 (http://www.peptideatlas.org/) i bazy danych PRIDE36 (http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/).
  8. Jeśli przeprowadzono ilościowe analizy na poziomie transkryptu próbek biologicznych (np. sekwencjonowanie RNA, qPCR), należy unikać celowania w peptydy, które odpowiadają transkryptom o stosunkowo niskiej liczebności.
  9. W razie potrzeby należy wybrać peptydy docelowe, które można wykorzystać do testów LC-SRM ortologów białka docelowego (np. do oznaczania zarówno ludzkiej, jak i mysiej formy białka docelowego).
  10. Wybierz co najmniej dwa peptydy docelowe na białko docelowe (jeśli to możliwe).

2. Przygotowanie wzorców peptydowych

UWAGA: Ta sekcja protokołu opisuje przygotowanie zestawu dwudziestu liofilizowanych wzorców peptydów (każdy o wielkości 1 nmol) do dalszych analiz. W przypadku innej liczby peptydów lub różnych ilości peptydów należy ją odpowiednio dostosować.

  1. Przygotować liofilizowane wzorce peptydów (≥1 nmol) przy użyciu technologii syntezy peptydów, takiej jak synteza SPOT20,37.
    1. Upewnij się, że reszty cysteiny zewnętrznych wzorców peptydowych są karbamidometylowane (struktura chemiczna utworzona przez alkilowanie jodoacetamidu). W przeciwieństwie do tego, upewnij się, że reszty cysteiny wewnętrznych wzorców peptydowych są niezmodyfikowane (zostaną one alkilowane podczas przygotowywania próbki, opisane poniżej).
    2. Zaprojektuj wewnętrzne wzorce peptydowe tak, aby zawierały natywne reszty flankujące amino- i karboksylowe (w celu kontrolowania wydajności trawienia trypsyny; każda z nich ma zwykle długość od trzech do sześciu reszt).
    3. Zaprojektuj wewnętrzne wzorce peptydowe tak, aby były stabilne znakowane izotopem. Przy wyborze strategii znakowania peptydów należy wziąć pod uwagę naturalny profil izotopowy docelowego peptydu i dokładność pomiaru masy przez MS. Nie należy stosować deuterowanych wzorców peptydowych, ponieważ deuteracja peptydów powoduje przesunięcie czasu retencji LC w odwróconej fazie o38,
      Uwaga: Zazwyczaj tryptyczne wzorce peptydów wewnętrznych są syntetyzowane przy użyciu ~ 98% czystych [13C6, 15N4] Arg i [13C6,15 N 2] Lys włączonych do karboksylowych końców.
    4. Oczyść wewnętrzne wzorce peptydowe za pomocą HPLC39 i dokładnie określ je ilościowo40.
  2. Dodaj 100 μl 0,1% v/v kwasu mrówkowego, 20% v/v acetonitrylu (ACN) do każdego liofilizowanego wzorca peptydu 1 nmol, aby uzyskać stężenie peptydu 10 μM (należy zachować ostrożność, ponieważ liofilizowany peptyd może mieć bardzo niską gęstość i łatwo go utracić). Wirować próbki przez 2 minuty i zanurzać je w sonikacji przez 5 minut, aby upewnić się, że rozpuszczenie peptydów jest całkowite.
  3. Zebrać rozpuszczone peptydy i stężyć otrzymaną mieszaninę w koncentratorze próżniowym do końcowej objętości 80 μl. Dodać 20 μl ACN do rozpuszczenia wytrąconego peptydu.
    Uwaga: Próbka zawiera teraz 10 μM każdego peptydu i 20% v/v ACN.
  4. Dla wewnętrznych wzorców peptydowych należy przygotować serię rozcieńczeń dla ilościowego LC-SRM:
    1. Przygotować 100 μl rozcieńczenia 1 μM: połączyć 90 μl 20% v/v ACN i 10 μl mieszaniny peptydów 10 μM.
    2. Przygotować 100 μl rozcieńczenia 100 nM: połączyć 90 μl 20% v/v ACN i 10 μl mieszaniny peptydów 1 μM.
  5. Dla zewnętrznych wzorców peptydowych należy przygotować 100 μl rozcieńczenia 1 μM dla LC-MS, łącząc 90 μl 0,1% v/v kwasu mrówkowego i 10 μl mieszaniny peptydów 10 μM.
    Uwaga: Próbka zawiera teraz 1 μM każdego peptydu, 0,1% v/v kwasu mrówkowego i 2% v/v ACN i jest gotowa do wykorzystania do opracowania testu LC-SRM.

3. Rozwój testu LC-SRM

  1. Analizować mieszaniny zewnętrznych wzorców peptydów (około 1-10 pmol każdego peptydu na wstrzyknięcie) za pomocą MS shotgun przy użyciu nanoprzepływowego systemu HPLC sprzężonego z potrójnym kwadrupolowym spektrometrem masowym (LC-QqQ-MS(/MS)).
    1. Użyj systemu LC-MS wyposażonego w kolumnę kapilarną wypełnioną mediami C-18 (średnica ≤5 μm, pory ~200 A, długość ≥10 cm, średnica wewnętrzna = 50-100 μm) i końcówkę nano-ESI (zwykle wytwarzaną za pomocą ściągacza laserowego). Upewnij się, że każdy przebieg LC-MS obejmuje ~60-minutowy gradient liniowy (zazwyczaj 0-40% rozpuszczalnika B), etap regeneracji kolumny (~ 80% rozpuszczalnika B) i etap re-równoważenia kolumny (~0% rozpuszczalnika B) (rozpuszczalnik A = 0,1% v/v kwas mrówkowy w H2O, rozpuszczalnik B = 0,1% v/v kwasu mrówkowego w ACN, natężenie przepływu = 200-800 nl/min, napięcie ESI = 1,800 V, Q3 szerokość izolacji = 0,7 m/z, q2 ciśnienie argonu = 1,5 mTorr).
    2. Dla każdego skanowania jonów prekursorowych dynamicznie wybieraj ~10 najbardziej intensywnych jonów prekursorowych do tandemowej spektrometrii mas (MS/MS). Uruchom każdą próbkę w dwóch powtórzeniach, tak aby użyć dwóch różnych ramp energii zderzenia: jednej zaprojektowanej do optymalnej fragmentacji jonów prekursorowych +2, a drugiej dla jonów prekursorowych+3 41.
    3. Wykonaj analizy LC-QqQ-MS(/MS) za pomocą skanowania jonów prekursorowych Q3 (skanowanie jonów prekursorowych Q1 może powodować ogonowanie pików jonów prekursorowych wynikające ze zderzeń argonu o niskiej energii w Q2).
    4. Upewnij się, że system LC-MS działa prawidłowo, analizując próbki QC i repliki techniczne. Zapobiegaj przenoszeniu próbek, używając świeżo wykonanych kolumn LC i uruchamiając wiele ślepych prób między próbkami.
  2. Przeanalizuj wynikowe dane LC-QqQ-MS(/MS) za pomocą bazy danych, przeszukując sekwencje zewnętrznych wzorców peptydowych42. W razie potrzeby należy odrzucić niejednoznaczne identyfikacje peptydów, korzystając z ocen ufności identyfikacji peptydów (np. wartości oczekiwanych) lub stosując modelowanie statystyczne42. Niezależnie od tego, ręcznie przejrzyj wszystkie identyfikacje peptydów43, aby upewnić się, że wszystkie są jednoznaczne.
  3. Użyj identyfikacji peptydów MS za pomocą strzelby, aby skonstruować bibliotekę widma za pomocą oprogramowania, takiego jak Skyline.
    1. Przygotuj listę przejść LC-SRM, używając 3-10 najbardziej intensywnych przejść na jon prekursorowy (jony prekursorowe +2 i +3; jony fragmentacyjne +1 i +2; jony y, b i a o długości ≥2 reszt).
    2. Odrzucić przejście, jeśli wartości jonów prekursorowych i fragmentacyjnych m/z pokrywają się w zakresie dokładności pomiaru masy QqQ-MS (fragmentacja jonów prekursorowych jest czasami niepełna; należy pamiętać o uwzględnieniu form monoizotopowych i ciężkich izotopów naturalnych, a także form nieznakowanych i znakowanych ciężko
      3. ).
    3. Podobnie, odrzuć przejście, jeśli jon fragmentacyjny m/z nakłada się na jon innego jonu fragmentacyjnego z tego samego jonu prekursorowego.
  4. Korzystając z otrzymanych list przejścia, należy przeprowadzić analizy LC-SRM mieszanin zewnętrznych wzorców peptydowych (należy przeprowadzić spektrometrię mas zgodnie z opisem w kroku 3.1; Szerokość izolacji Q1 i Q3 = 0,7 m/z; czas przebywania = 2-50 ms).
  5. Ręcznie przejrzyj wynikowe dane LC-SRM i usuń wszelkie słabo działające testy (analiza danych LC-SRM jest opisana w sekcji 5).

4. Testy LC-SRM próbek biologicznych

  1. Przygotuj naczynia z hodowanych komórek44. Jeśli porównywanych jest wiele warunków eksperymentalnych, zablokuj i zrandomizuj próbki, aby zmniejszyć wszelkie możliwe systematyczne odchylenia45.
  2. Dla każdej płytki komórkowej odessać pożywkę do hodowli komórkowej w celu zmarnowania i zawiesić komórki w buforze wolnym od surowicy44. Jeśli to konieczne, umyj komórki w buforze wolnym od surowicy, aby usunąć wszelkie pozostałe białka zewnątrzkomórkowe.
  3. Dla każdej próbki należy obliczyć liczbę żywotnych i całkowitą liczbę komórek, używając barwienia żywotności (np. błękitu trypanowego) i hemocytometru lub automatycznego licznika komórek44.
  4. Osadzać komórki przez odwirowywanie i odsysać supernatanty do marnowania44 (typowa objętość granulek komórkowych to ~30 μl).
  5. Dodać 400 μl buforu do lizy mocznika lub buforu do lizy środków powierzchniowo czynnych do każdej osadki komórkowej (100 mM HEPES∙NaOH pH 8, 10 μM chlorowodorku bestatyny, 10 μM pepstatyny A i 8 M mocznika lub 0,1% w/v środka powierzchniowo czynnego (odpowiednio); świeżo przygotowane; użyj labilnego kwasowo środka powierzchniowo czynnego kompatybilnego z MS, takiego jak RapiGest SF lub PPS Silent Surfaktant). Jeśli używasz innych inhibitorów proteazy, upewnij się, że nie hamują one trypsyny.
  6. Wymieszać każdą próbkę za pomocą delikatnego pipetowania i przenieść każdą do probówki o pojemności 2 ml (z nakrętką z pierścieniem uszczelniającym o przekroju okrągłym) zawierającej ~100 μl kulek cyrkonu/krzemionki o średnicy 0,1 mm (należy pamiętać, że kulki mogą powodować nieszczelność probówek z zatrzaskiem). Poddać komórki lizie, wirując próbki przez 5 minut z pełną prędkością (powoduje to lizę komórek przez ubijanie kulek).
    1. Alternatywnie, poddać komórki lizie przy użyciu innej metody mechanicznej (np. za pomocą prasy francuskiej lub końcówek homogenizacyjnych).
      Uwaga: Unikaj wirowania lizatów komórkowych, ponieważ może to spowodować osadzenie się wytrąconego białka, które w przeciwnym razie mogłoby zostać tryptycznie strawione i wykryte przez LC-MS.
  7. W przypadku próbek zdenaturowanych środkami powierzchniowo czynnymi należy je inkubować w temperaturze 90 °C przez 10 minut, aby wspomóc homogenizację próbki i denaturację białek.
  8. Sonikować próbki w kąpieli przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby wspomóc homogenizację i denaturację białek.
    Uwaga: Lizaty i bufor do lizy można przechowywać w temperaturze -80 °C (bufor do lizy będzie potrzebny w krokach 4.9 i 4.13).
  9. Przeprowadzić oznaczenie stężenia białka46 (np. oznaczenie kwasu bicinchoninowego) lizatów (i buforu do lizy jako eksperymentu kontrolnego).
  10. W przypadku analiz jakościowych (tj. do próbek nie zostaną wprowadzone żadne wewnętrzne wzorce peptydów), należy pobrać pipetę 200 μg (masy białkowej) lizatu komórkowego do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Do analiz ilościowych należy przygotować cztery takie próbki do serii rozcieńczeń stabilnych izotopów.
  11. Do każdej próbki dodaj wewnętrzny wzorzec białka (np. dodaj ~5 pmol ~98% czystej lucyferazy świetlika).
  12. Do celów analiz ilościowych dodać do próbek serię rozcieńczeń stabilnych izotopów równomolowej mieszaniny wewnętrznych wzorców peptydów (np. 0, 0,2, 2, 20 pmol każdego peptydu).
    1. Równolegle należy przygotować próbki kontrolne, stosując wyłącznie wewnętrzne wzorce peptydowe (tj. bez lizatu komórkowego) (np. 0, 0,2, 2, 20 pmol każdego peptydu).
    2. Przygotuj również próbki kontrolne przy użyciu zewnętrznych i wewnętrznych wzorców peptydowych (na przykład: 2 pmol każdego zewnętrznego wzorca peptydu oraz 0, 0,2, 2 i 20 pmol każdego wewnętrznego wzorca peptydowego).
      Uwaga: Upewnij się, że wzorce peptydowe są wolne od kwasu mrówkowego, ponieważ może on zakłócać trawienie trypsyny.
  13. Dodać bufor do lizy, tak aby wszystkie próbki miały identyczne objętości. Uwaga: Typowa objętość próbki wynosi 70 μl, więc ta objętość zostanie wykorzystana w tym protokole.
  14. Zredukować białkowe reszty cysteiny, dodając 0,7 μl 1 M DTT (świeżo przygotowanej) do każdej próbki (końcowe stężenie DTT wynosi 10 mM) i inkubując próbki w temperaturze 60 °C przez 30 minut.
  15. Alkilatowe cystyny białkowe poprzez dodanie 7 μl buforowanego jodoacetamidu (500 mM jodoacetamidu, 1 M HEPES∙NaOH pH 8; świeżo przygotowanego) do każdej próbki (końcowe stężenie jodoacetamidu wynosi 50 mM) i inkubację próbek w temperaturze pokojowej przez 20 minut w ciemności (jodoacetamid jest wrażliwy na światło). W razie potrzeby stłumić pozostały jodocetamid poprzez dodanie DTT do końcowego stężenia 50 mM.
  16. Do każdej z próbek skażonych mocznikiem dodać 482 μl 100 mM HEPES∙NaOH pH 8 tak, aby końcowe stężenie mocznika wynosiło 1 M (trypsyna jest znacznie hamowana przy >1 M moczniku47).
  17. Tryptycznie trawić białka do peptydów.
    1. Do każdej próbki zawierającej lizat komórkowy dodać 8 μl zmodyfikowanej trypsyny o stopniu sekwencjonowania 0,5 μg/μl tak, aby końcowe stężenie trypsyny wynosiło 1:50 (białko w:w) trypsyna:próbka i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 18 godzin.
    2. Do każdej próbki, która nie zawiera lizatu komórkowego, dodać 0,5 μl zmodyfikowanej trypsyny o stopniu sekwencjonowania 0,5 μg/μl i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny (każda z tych próbek jest przeznaczona do eksperymentów kontrolnych i zwykle zawiera tylko 10 ng-10 μg peptydu + masy białkowej).
  18. Do każdej z próbek skażonych mocznikiem dodać 440 μl 2% v/v kwasu mrówkowego (końcowe stężenie kwasu mrówkowego wynosi 1% v/v). Upewnij się, że te próbki mają pH ~3.
    1. Do każdej z próbek skażonych środkami powierzchniowo czynnymi dodać 914 μl 0,5% v/v TFA (końcowe stężenie TFA wynosi 0,5% v/v). Upewnij się, że te próbki mają pH ~1,5. Próbki te inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut w celu hydrolizy środka powierzchniowo czynnego.
  19. Mikrowirować wszystkie próbki o masie 21 000 × g przez 20 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia grupy ogonowej środka powierzchniowo czynnego i wszelkich innych osadów, które mogłyby zatkać wkład C-18 SPE.
  20. Ekstrahować każdy z supernatantów do fazy stałej za pomocą jednorazowego wkładu C-18 SPE (bufor A = 0,1% v/v kwasu mrówkowego; Bufor B = 0,1% v/v kwasu mrówkowego, 80% v/v ACN; ~100 mg żywicy C-18 na wkład). Przepchnąć fazy ruchome przez wkład C-18 SPE za pomocą gumowej bańki o płaskiej powierzchni, za pomocą kolektora ekstrakcyjnego lub przez odwirowanie wkładu w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przy 10 × g przez 5 minut.
    1. Zwilżyć kolumnę, nakładając 1 ml buforu B, zrównoważyć ją, dwukrotnie nakładając 1 ml buforu A, nałożyć próbkę i umyć wkład, nakładając dwukrotnie 1 ml buforu A. Eluować peptydy, stosując powoli 1 ml buforu B (~2 min).
  21. Zagęścić każdy eluat w koncentratorze próżniowym do końcowej objętości 100 μl w celu odparowania ACN. Dodać 200 μlH2Odo każdej próbki i zagęścić każdą z nich w koncentratorze próżniowym do końcowej objętości 98 μl, aby odparować wszelkie ewentualne pozostałe ACN.
  22. Do każdej próbki dodać 2 μl kwasu mrówkowego o sile 5% v/v w ACN (końcowe stężenia próbki wynoszą 0,1% v/v kwasu mrówkowego, 2% v/v ACN).
    Uwaga: Próbki mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C.
  23. Przeanalizować próbki za pomocą LC-SRM (jak w kroku 3.4). W przypadku jakościowych analiz LC-SRM uruchom próbki biologiczne i zewnętrzne wzorce peptydów, a następnie przeanalizuj wszystkie uzyskane dane razem. W przypadku ilościowych analiz LC-SRM należy uruchomić serię rozcieńczeń izotopów każdej próbki biologicznej, a także uruchomić próbki składające się z samych wzorców peptydowych i przeanalizować wszystkie uzyskane dane razem.

5. Analiza danych LC-SRM

UWAGA: Identyfikacja i kwantyfikacja peptydów może być znacznie uproszczona i częściowo zautomatyzowana za pomocą oprogramowania takiego jak Skyline, ale nadal zaleca się, aby wszystkie adnotacje danych były przeglądane ręcznie. Najlepiej jest również wykluczyć informacje o poziomie białka podczas ręcznej adnotacji danych LC-SRM, aby zapobiec stronniczości.

  1. Dla każdej identyfikacji peptydu potwierdź, że kształt każdego profilu elucji przejściowej jest w przybliżeniu gaussowski. Dla każdego przejścia należy potwierdzić, że profil elucji jest iloczynem wielu sygnałów zmierzonych przez detektor MS (tj. nie jest iloczynem jednego lub dwóch losowych skoków szumu MS).
  2. Dla każdej identyfikacji peptydu należy upewnić się, że wybrany jest cały profil elucji peptydów. Należy unikać ręcznego dostosowywania granic profilu elucji podskładników identyfikacji peptydu (forma peptydu znakowana ciężko, forma nieznakowana, poszczególne jony prekursorowe i indywidualne przejścia).
  3. Upewnij się, że każdy profil elucji przejściowej ma stosunek sygnału do szumu (s/n) ≥3. Uwaga: "Szum" odnosi się do losowego szumu MS, a nie do powtarzalnego sygnału z analityów koeluujących. Funkcje wygładzania chromatogramu mogą znacznie pomóc w analizie zaszumionych danych.
  4. Dla każdej identyfikacji peptydu potwierdź, że wszystkie przejścia mają prawie identyczne profile elucji (nie tylko równe czasy wierzchołków pików; profile elucji mogą mieć różne amplitudy).
  5. W przypadku analiz LC-SRM dużej ilości wzorców peptydów (zwykle ≥100 fmol każdego peptydu) należy potwierdzić, że odpowiednie profile elucji peptydów są bardzo intensywne (zwykle s/n ≥100) oraz że identyfikacje peptydów są jednoznaczne. Uwaga: Te wysoce pewne identyfikacje będą miały kluczowe znaczenie dla identyfikacji odpowiednich peptydów pochodzących z próbek biologicznych.
  6. Dla każdej identyfikacji peptydu należy upewnić się, że względne intensywności przejścia są zgodne z pewnie zidentyfikowanym wzorcem peptydu. W razie potrzeby należy odrzucić hałaśliwe profile elucji przejściowej o stosunkowo niskiej intensywności, ale upewnić się, że nie brakuje żadnego ze stosunkowo intensywnych przejść. Zignorować stosunkowo intensywne profile elucji przejściowej, na które w znacznym i jednoznaczny sposób wpływa zanieczyszczenie koeluujące.
  7. Dla każdej identyfikacji peptydu należy oszacować prawdopodobieństwo, że został on wytworzony losowo przez sygnał tła (losowy szum MS plus odtwarzalny sygnał z analityków koeluujących).
    1. Oszacuj to prawdopodobieństwo ręcznie, badając cały chromatogram LC-SRM i szacując unikalność identyfikacji każdego peptydu. Wytwórz zestaw pewnych identyfikacji peptydów, który ma szacowany wskaźnik fałszywych wykryć (FDR) wynoszący 5%. Stosuj bardziej rygorystyczne kryteria (np. FDR ≤1%), jeśli wymagany jest zestaw identyfikacji o wyższym poziomie ufności (nie zaleca się stosowania luźniejszych kryteriów).
    2. Alternatywnie użyj algorytmu mProphet48 lub algorytmu AuDIT49, ale ręcznie przejrzyj wyniki.
  8. Dla każdej identyfikacji peptydu należy potwierdzić, że obserwowany czas elucji jest zgodny z hydrofobowością peptydu (Skyline jest przeznaczony do wykonania tego obliczenia).
  9. Dla każdego peptydu upewnij się, że jego czas elucji jest spójny we wszystkich ciągach LC.
    Uwaga: Analizy LC-SRM czasami dają profile elucji, które są systematycznie przekrzywiane między przebiegami. Należy spodziewać się systematycznych zmian po zmianach w przyrządach, takich jak wymiana kolumny. Ponadto peptydy wcześnie eluujące mogą być podatne na przesuwanie się (zwłaszcza jeśli kolumna jest obciążona blisko pojemności), a peptydy późno eluujące mogą być również podatne na przesuwanie. Identyfikacja peptydów została zakończona.
  10. Aby poprawić kwantyfikację peptydów, należy ponownie sprawdzić identyfikację każdego peptydu i odrzucić przejściowy profil elucji, jeśli jest on szczególnie hałaśliwy w porównaniu z innymi przejściowymi profilami elucji w identyfikacji peptydu. Odrzucić przejściowy profil elucji, jeśli jego względna intensywność przejścia jest nieprawidłowa (w porównaniu z wzorcem peptydowym).
  11. Sprawdzić granice każdego jonu prekursorowego i profilu elucji przejściowej. W razie potrzeby ostrożnie dostosuj granice profilu elucji, aby wyciąć sygnał tła (lub poprawić oszacowanie sygnału tła).
  12. Dla każdego wewnętrznego wzorca peptydu sprawdź, czy nie jest on zanieczyszczony wykrywalną ilością peptydu świetlnego (określoną na podstawie analiz LC-SRM samych wewnętrznych wzorców peptydowych, opisanych powyżej). Następnie należy wyrzucić wszelkie profile elucji peptydów świetlnych, które zostały znacznie naruszone przez zanieczyszczenie peptydami świetlnymi w obrębie wewnętrznych wzorców peptydów.
  13. Określ ilościowo każdy przejściowy profil elucji, obliczając jego powierzchnię piku LC. W razie potrzeby odejmij szacowany sygnał tła. Określić ilościowo każdy profil elucji peptydów, sumując odpowiednie wartości kwantyfikacji przejścia (w dalszej części określa się to jako wartość "Sum_Peak_Area"). Dla każdej wartości Sum_Peak_Area peptydu próbki biologicznej należy obliczyć obfitość molową peptydu próbki biologicznej, korzystając z danych z LC-SRM wewnętrznych lub zewnętrznych wzorców peptydów (należy używać tylko tych przejść, które udało się określić ilościowo zarówno za pomocą peptydu próbki biologicznej LC-SRM, jak i wzorca peptydu).
    1. Oznaczanie ilościowe przy użyciu zewnętrznych wzorców peptydowych (niezalecane):
      1. Wykreśl zewnętrzne wartości Sum_Peak_Area wzorca peptydu w porównaniu z wartościami maksymalnej liczebności standardowego peptydu zewnętrznego. Utwórz krzywą standardową, dopasowując regresję liniową do danych (zazwyczaj należy używać tylko składowej liniowej zakresu dynamicznego; każdy składnik nieliniowy powinien być używany z najwyższą ostrożnością). Dla każdej wartości Sum_Peak_Area peptydu próbki biologicznej użyj krzywej standardowej, aby obliczyć obfitość molową peptydu.
        Uwaga: Ta metoda oznaczania ilościowego nie jest zalecana, ponieważ wymaga, aby przygotowanie próbki i LC-SRM były odporne na wykazanie, ponieważ próbki biologiczne i zewnętrzne wzorce peptydowe są przygotowywane i analizowane przez LC-SRM oddzielnie. Nie uwzględnia również efektów matrycowych (efektów spowodowanych składnikami próbki innymi niż analit).
    2. Oznaczanie ilościowe przy użyciu wewnętrznych wzorców peptydowych (zalecane):
      1. Dla każdej próbki biologicznej wartości Sum_Peak_Area peptydu i odpowiadającej jej wartości Sum_Peak_Area wzorca peptydu wewnętrznego znakowanego ciężkim obliczyć stosunek lekkiego do ciężkiego. Użyj tego stosunku jako miary odpowiedniego stosunku obfitości molowej peptydu lekkiego/ciężkiego, aby obliczyć obfitość molową peptydu próbki biologicznej. W szczególności obfitość molowa peptydu próbki biologicznej jest równa standardowej obfitości molowej peptydu wewnętrznego pomnożonej przez stosunek Sum_Peak_Area lekkiego do ciężkiego.
      2. Dla każdej kontrpróby biologicznej i peptydu docelowego zidentyfikuj zakres liniowy kwantyfikacji LC-SRM, tworząc krzywą standardową przy użyciu regresji liniowej. W szczególności należy wykreślić standardowe wartości molowej obfitości peptydów wewnętrznych w porównaniu z wartościami stosunku Sum_Peak_Area ciężkiego/lekkiego (należy pamiętać, że masa próbki biologicznej jest stała w całym zestawie danych). Wymagać, aby wartość Sum_Peak_Area peptydu każdej próbki biologicznej mieściła się w zakresie liniowym (zazwyczaj należy stosować tylko składową liniową zakresu dynamicznego; każdy składnik nieliniowy powinien być używany z najwyższą ostrożnością). Podobnie wykonaj ten krok dla każdego docelowego przejścia peptydowego.
        Uwaga: Kwantyfikacja analitu za pomocą LC-QqQ-SRM powinna być liniowa w szerokim zakresie dynamiki (~10 000). Na dolnym końcu sygnał tła (losowy szum MS plus odtwarzalny sygnał z analityków koeluujących) zmniejszy dokładność i precyzję kwantyfikacji. Na górnym końcu nasycenie detektora spowoduje nieliniowość (ostatecznie może to spowodować, że profile elucji będą płaskie, zaczynając od określonej intensywności sygnału).
  14. W razie potrzeby należy przeprowadzić globalną normalizację próbek, taką jak normalizacja tendencji centralnej50, aby skorygować niewielkie różnice w ilości próbki przed wprowadzeniem wewnętrznych wzorców peptydów. W razie potrzeby używaj tylko białek porządkowych z kroku 1.1.
  15. W razie potrzeby należy zimputować brakujące wartości kwantyfikacji51,52,
    Uwaga: Niewłaściwe jest po prostu zastępowanie brakujących wartości połową dolnej granicy oznaczalności (LLOQ) lub połową granicy wykrywalności (LOD), ponieważ spowodowałoby to sztuczne zmniejszenie wariancji kwantyfikacji i mogłoby spowodować, że test statystyczny (np. ANOVA) dałby fałszywie dodatni wynik (błąd typu I). Jednak ignorowanie brakujących wartości może być również problematyczne. Na przykład, jeśli połowa rzeczywistych wartości obfitości jest poniżej LOD, a druga połowa jest powyżej LLOQ, wówczas średnia obserwowana obfitość będzie zawyżać średnią rzeczywistą obfitość.
  16. Upewnij się, że testy są zgodne z szeroko przyjętymi wytycznymi dla LC-SRM23-25. W szczególności wymagają, aby współczynnik zmienności wartości kwantyfikacji wynosił zwykle ≤25% dla testów klinicznych i ≤35% dla testów nieklinicznych25. W przypadku testów LC-SRM związanych z produktami lub usługami zdrowotnymi lub weterynaryjnymi, które mają być brane pod uwagę przy zatwierdzaniu przez organy regulacyjne, wymagaj, aby testy spełniały bardziej rygorystyczne wymagania dotyczące precyzji dla takich testów: "Precyzja określona na każdym poziomie stężenia nie powinna przekraczać 15% współczynnika zmienności (CV), z wyjątkiem LLOQ, gdzie nie powinna przekraczać 20% CV"23,24.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowanie predykcyjnych modeli obliczeniowych szlaków transdukcji sygnału jest jednym z fundamentalnych celów biologii systemów53. Niestety, nawet w przypadku szlaków sygnałowych, które zostały obszernie zbadane i mają duże znaczenie kliniczne, nadal nie jest możliwe ogólne ilościowe przewidywanie zachowania szlaku w odpowiedzi na perturbacje (np. dotyczy to szlaku MAPK/ERK54). Niedawno w badaniu wykorzystano ukierunkowaną proteomikę, transkryptomikę oraz modelowanie i symulacje obliczeni...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Bezwzględna kwantyfikacja białek ma zasadnicze znaczenie dla bardzo różnorodnych zastosowań biomedycznych, takich jak walidacja biomarkerów i modelowanie szlaku transdukcji sygnału. Ostatnio ukierunkowana proteomika z wykorzystaniem LC-SRM skorzystała z ulepszeń wielu technologii, w tym przygotowywania wzorców peptydów, HPLC, analizy danych QqQ-MS i LC-SRM. W związku z tym stał się potężną alternatywą dla testów immunologicznych. Testy immunologiczne mogą być niezwykle czułe i wysokoprzepustowe, ale opracowanie solidnego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Acetonitryl (ACN), klasa LC-MSFisherA955-1
Zestaw do oznaczania białek BCA (kwas bicinchoninowy)Fisher23235
Koraliki do bicia kulek, tlenek cyrkonu-krzemionka, 0,1 mmBioSpec Products11079101z
Chlorowodorek bestatynySigmaB8385-10MG
Hodowla komórkowa DMEM (z glukozą, bez L-glutaminy)Lonza12-614F
Hodowla komórkowa EDTA, 500 mM, pH8Gibco15575
Hodowla komórkowa płodowej surowicy bydlęcej (FBS)Atlanta BiologicalsS11550
Hodowla komórkowa L-glutaminaSigmaG8540-25G
Hodowla komórkowa buforowana fosforanami soli fizjologicznej (PBS) pH 7,4Gibco10010-049
Plama żywotności kultur komórkowych Trypan Blue, 0,4% w/vLonza17-942E
Celometr Auto T4 licznik komórekNexcelom BioscienceCelometr Auto T4
Celometr Auto T4 jednorazowe komory licząceNexcelom BioscienceCHT4-SD100-014
Ditiothreitol (DTT)SigmaD5545-5G
Kwas mrówkowy, klasa LC-MS, ampułkiFisherA117-10X1AMP
Hemocytometr, ulepszony przez Neubauera, głębokość 0,1 mmMarienfeld-Superior0640030
HEPES, 1 M, pH 7,2Mediatech25-060-CI
Kwas solny, 37% w/wVWRBDH3028-2,5LG
JodoacetamidSigmaI1149-5G
Laserowy ściągacz do mikropipet SutterInstrument Co.pokryta P-2000
LC, 50 i mikro; m idPolymicro Technologies1068150017
fiolka LC, automatyczny podajnik próbek, polipropylen 12 mm x 32 mmSUN SRI200-268
LC fiolka zakrętka, autosampler, wstępnie nacięty PTFE/silikonSUN SRI500-061
Lucyferaza, z Photinus pyralisSigmaL9506-1MG
Pepstatyna AEMD Milipor516481-25MG
Paski pH colorpHast (pH 0,0-6,0)EMD Chemicals9586-1
Koktajl inhibitorów fosfatazy PhosStopRoche04906837001
RapiGest SFWaters186001861
Sep-Pak SPE, C18 1 ml kartusz 100 mgWodyWAT023590
Sep-Pak SPE, kolektor ekstrakcyjny, 20 pozycjiWodyWAT200609
Sep-Pak SPE, gumowa żarówka o płaskiej powierzchniFisher03-448-25
Wodorotlenek sodu (NaOH)FisherS318-500
Koncentrator próżniowy SpeedVacFisherSPD111V
Kwas trifluorooctowy (TFA), klasa LC-MSFisherA116-50
Trypsyna, stopień sekwencjonowania, modyfikowanaPromegaV5113
dekapler do probówek MicronicUSA Scientific1765-4000
Probówki, mikrowirówka 2 ml, nakrętka o-ring, sterylnaSarstedt72.694.006
MocznikSigmaU0631-500g
Woda, klasa LC-MSFisherW6-1
Kapilara krzemionkowa probówka

Bibliografia

  1. Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
  2. Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. 3rd Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
  3. Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
  4. Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
  5. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
  6. Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
  7. Wild, D. The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , 4th edn, Elsevier. (2013).
  8. Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
  9. Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
  10. Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
  11. Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
  12. Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
  13. Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
  14. Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
  15. Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605(2013).
  16. Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
  17. Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
  18. Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
  19. Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
  20. Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. Peptide synthesis and applications. , 2nd edn, Humana Press Springer. (2013).
  21. Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
  22. Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
  23. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration. Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm070107.pdf (2001).
  24. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , U.S. Food and Drug Administration; Revision 1 (draft). Available from: http://www.fda.gov/ucm/groups/fdagov-public/@fdagov-drugs-gen/documents/document/ucm368107.pdf (2013).
  25. Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
  26. Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
  27. Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
  28. Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
  29. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
  30. Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
  31. Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
  32. Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
  33. Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
  34. Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
  35. Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
  36. Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
  37. Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
  38. Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
  39. Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
  40. Alterman, M. A., Hunziker, P. Amino acid analysis : methods and protocols. , Humana Press. (2012).
  41. Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
  42. Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
  43. Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
  44. Freshney, R. I. Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , 6th edn, Wiley-Blackwell. (2010).
  45. Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
  46. Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
  47. Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
  48. Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
  49. Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
  50. Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
  51. Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, Suppl 16. S5(2012).
  52. Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
  53. Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
  54. Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
  55. Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
  56. Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. Mol Cell Proteomics. , Forthcoming.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Chromatografia cieczowastandardy peptydowerozcieńczanie izotopoweoznaczanie białkalizat komórkowytrawienie trypsynąSPE C18
Spektrometria mas do monitorowania wybranych reakcji do bezwzględnej kwantyfikacji białek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.