Wytwarzanie przeciwciał poliklonalnych specyficznych dla Nurr-1 wolnych od reaktywności krzyżowej przeciwko jego bliskim homologom, Nor1 i Nur77

Podsumowanie

Tutaj selektywnie celujemy w przeciwciała przeciwko określonemu członkowi wysoce konserwatywnej rodziny białek, immunizując zwierzęta ich najbardziej rozbieżnymi regionami, a następnie usuwając przeciwciała reagujące krzyżowo przez wstępną adsorpcję.

Streszczenie

Podrodzina receptorów jądrowych 4 (NR4A) składa się z 3 powiązanych białek dzielących domenę wiążącą DNA (DBD) i domenę wiążącą ligand (LBD). Białko 1 związane z receptorem jądrowym (Nurr1 lub NR4A2) odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu układu dopaminergicznego. Dysfunkcje dopaminy związane z genem Nurr1 obejmują między innymi chorobę Parkinsona, schizofrenię i depresję maniakalną. Co więcej, ostatnie dowody wskazują, że Nurr1 ulega również ekspresji w innych obszarach mózgu, takich jak hipokamp i odgrywa kluczową rolę w uczeniu się i pamięci. Pozostali członkowie rodziny to czynnik wzrostu nerwów IB (Nur77 lub NR4A1) i receptor sierocy pochodzenia neuronalnego 1 (NOR1 lub NR4A3). Aby pomóc w zbadaniu dokładnych funkcjonalnych ról Nurr1 w dysfunkcjach neuronalnych związanych z dopaminergią i innymi regionami mózgu, potrzebne były przeciwciała pozbawione reaktywności krzyżowej przeciwko Nur77 i NOR1. Ponieważ białka są bardziej rozbieżne w swoich LBD niż w ich domenach wiążących DNA, immunizacja oczyszczonymi LBD powinna dać przeciwciała specyficzne dla Nurr1 z minimalnymi reaktywnościami przeciwko Nur77 i / lub NOR1. Chociaż udało się wytworzyć przeciwciała anty-Nurr1, wykazały one znaczną immunoreaktywność w stosunku do innych członków rodziny. Chromatografia powinowactwa nad unieruchomionym białkiem A, a następnie wstępna adsorpcja przeciwko unieruchomionym LBD Nur77 i NOR1 dała przeciwciała specyficzne dla Nurr1 wolne od reaktywności krzyżowej. W tym przypadku selektywnie celujemy w przeciwciała przeciwko określonemu członkowi wysoce konserwatywnej rodziny białek, immunizując zwierzęta ich najbardziej rozbieżnymi regionami, a następnie usuwając przeciwciała reagujące krzyżowo przez wstępną adsorpcję. Celem protokołu jest zwiększenie swoistości przeciwciał poliklonalnych poprzez wstępną adsorpcję przeciwko antygenom reagującym krzyżowo.

Wprowadzenie

Czynnik transkrypcyjny Nurr1 i jego homologi (Nur77 i Nor1) należą do podrodziny receptorów jądrowych 4A (NR4A)¹. Są również receptorami sierocymi, ponieważ ich endogenne ligandy nie są jeszcze zidentyfikowane. Nurr1 został po raz pierwszy sklonowany w 1992 roku i chociaż wiadomo, że ulega ekspresji w mózgu², jego zasadnicza rola w rozwoju i utrzymaniu neuronów dopaminowych w śródmózgowiu została ujawniona w badaniach na myszach z nokautem³. Ponadto jego ważna rola w utrzymaniu neuronów dopaminowych w śródmózgowiu została niedawno wykazana w badaniu z warunkowym nokautem⁴. Ze względu na te eleganckie badania pokazujące krytyczną rolę Nurr1 dla neuronów dopaminy śródmózgowia, wiele późniejszych badań w dużej mierze koncentrowało się na neuronach dopaminowych w śródmózgowiu i zaburzeniu neurodegeneracyjnym związanym z dopaminą, chorobie Parkinsona (PD)⁵.

Warto zauważyć, że Nurr1 jest wyrażany nie tylko w neuronach dopaminy śródmózgowia (mDA), ale także w różnych obszarach mózgu², co sugeruje, że może pełnić funkcjonalne role w wielu obszarach nie-DA, co jest silnie wspierane przez nowsze badania pokazujące, że Nurr1 odgrywa ważną rolę w różnych funkcjach mózgu. Na przykład wykazano, że czynności indukujące pamięć, takie jak uczenie się lub inne zadania zależne od hipokampa, powodują regulację w górę ekspresji Nurr1 w hipokampie^6,7. Ponadto, obniżenie ekspresji Nurr1 w hipokampie było wystarczające do upośledzenia pamięci długotrwałej i/lub plastyczności synaptycznej^8-11, co silnie sugeruje, że Nurr1 odgrywa różne role w wielu obszarach mózgu. Tak więc, aby lepiej zrozumieć specyficzną dla typu komórki i subkomórkową ekspresję Nurr1, pożądane jest użycie przeciwciał specyficznych dla Nurr1, które nie wykazują żadnej reaktywności krzyżowej z jego homologami Nur77 lub Nor1. W artykule opisano protokół wstępnej adsorpcji w celu wytworzenia przeciwciał specyficznych dla Nurr1 i przedstawiono dodatkowe dane pokazujące jego specyficzność.

Protokół

Uwaga: Skład wszystkich rozwiązań wymienionych poniżej można znaleźć w Tabeli Materiałów/Sprzętu.

1. Oczyszczanie przeciwciał w kolumnie białka A

1. Przed rozpoczęciem zabiegu należy zrównoważyć kolumnę wirową białka A i wszystkie wymagane do temperatury pokojowej przez 15 minut.
2. Rozcieńczyć surowicę immunologiczną w stosunku 1:1 buforem wiążącym białko A IgG. (zalecane 5 ml surowicy).
3. Delikatnie postukaj w kolumnę wirującą z białkiem A na blacie stołu, aby usunąć żywicę, która może utknąć w nasadce. Zdejmij górną nasadkę i delikatnie oderwij dolne zamknięcie. Umieścić kolumnę w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml i odczekać, aż roztwór do przechowywania spłynie.
4. Dodać 5 ml buforu wiążącego białko A IgG i odczekać, aż roztwór odpłynie.
5. Nanieść rozcieńczoną surowicę immunologiczną na kolumnę i zebrać przepływ. Aby uzyskać najlepsze wyniki, dodaj objętość próbki, która zawiera stężenie przeciwciał mniejsze niż 80% zdolności kolumny do wiązania przeciwciał
.
6. Przepłukać kolumnę 15 ml buforu wiążącego białko A IgG lub do momentu, gdy absorbancja przy 280 nm spadnie poniżej 0,1.
7. Dodać 100 μl buforu neutralizującego do pięciu oznakowanych probówek zbiorczych.
8. Dodać 5 ml buforu elucyjnego IgG do kolumny z białkiem A i zebrać 1 ml frakcji w każdej z probówek zawierających 100 μl buforu neutralizującego.
9. Zmierzyć absorbancję każdej frakcji przy 280 nm i frakcjach pulowych o absorbancji większej niż 0,5. Trzymaj zebrane frakcje na lodzie, aż będą gotowe do dializy.
10. Zregenerować kolumnę, dodając 8 ml buforu elucyjnego IgG i pozwolić, aby roztwór przepłynął przez kolumnę.
11. Przepłukać kolumnę roztworem wiążącym białko A IgG, aż pH eluentu powróci do 7,4.
12. Przechowywać kolumnę, dodając 5 ml roztworu do przechowywania (0,02% azydku sodu w PBS). Gdy w kolumnie pozostanie około 3 ml, zakryj dno i zabezpiecz górną nakrętkę. Przechowywać kolumnę w temperaturze 4 °C.
13. Określ potrzebną długość rurki do dializy zgodnie z instrukcjami producenta. Używając rurki o płaskiej średnicy 16 mm, użyj 5,47 cm długości rurki na ml roztworu, który ma być dializowany. Przeciąć rurkę i płukać PBS pH 7,4 przez 15 do 30 minut.
14. Złożyć i zapiąć jeden koniec rurki do dializy, przenieść zebrane frakcje zawierające IgG do rurki dializacyjnej o pH 7,4 i zamknąć drugi koniec.
15. Dializować w temperaturze pokojowej w stosunku do 200 objętości PBS o pH 7,4 przez 2 godziny.
16. Zmienić bufor dializacyjny (świeży PBS pH 7,4) i dializować przez kolejne 2 godziny w temperaturze pokojowej.
17. Zmienić bufor do dializy (świeży PBS o pH 7,4) i dializować przez noc w temperaturze 4 °C.
18. Przechowywać dializowany roztwór przeciwciała w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie on gotowy do przejścia do dalszych etapów oczyszczania.
19. Ocenić stężenie przeciwciał, wykorzystując ich absorbancję przy 280 nm i molowy współczynnik absorpcji przeciwciał przy 280 nm wynoszący 210 000 ^{M-1 cm-112}.

2. Sprzężenie białek LBD z żywicą sprzęgającą AminoLink

1. Przygotuj dwie kolumny, jedną dla Nor1, a drugą dla Nur77. Postępuj zgodnie z tym samym protokołem dla obu białek.
2. Rozmrozić białko, które ma być sprzężone z żywicą na lodzie. Oznaczyć stężenie białka za pomocą jego molowego współczynnika ekstynkcji i jego absorbancji przy 280 nm¹².
   1. Alternatywnie można zastosować test oznaczania białka, taki jak test kwasu bicinchoninowego¹³. Jeśli białko jest rozpuszczone w buforze zawierającym aminy, dializuj lub wymieniaj bufor z buforem sprzęgającym. Jeśli białko znajduje się w odpowiednim buforze (bez wolnych amin), rozcieńcz je 4-krotnie w buforze sprzęgającym.
3. Użyj 2 ml żywicy na 2 mg białka. Wszystkie poniższe kroki dotyczą 2 ml żywicy w kolumnie o pojemności 10 ml. Na 1 ml żywicy (2 ml zawiesiny w proporcji 1:1) można połączyć do 10 mg białka
.
4. Przygotować kolumnę o pojemności 10 ml, popychając frytę na dno i przepuszczając przez nią PBS o pH 7,4. Zakryć dno kolumny i dodać 2 ml buforu sprzęgającego.
5. Dodać żądaną objętość gnojowicy (4 ml w celu uzyskania 2 ml żywicy) do kolumny, zdjąć dolną nasadkę i pozwolić kolumnie spłynąć. Przepłukać kolumnę łącznie 6 ml (3 objętości złoża żywicy) buforu sprzęgającego i pozostawić kolumnę do opróżnienia. Po opróżnieniu bufora sprzęgającego załóż dolną zaślepkę.
6. Dodać 2-4 ml białka zawieszonego w buforze sprzęgającym do kolumny (zachować podwielokrotność roztworu białkowego w celu oceny skuteczności sprzęgania przez porównanie stężenia białka w eluacie w kroku 2.11 przy użyciu absorbancji przy 280 nm lub testu bicynchoninowego). Zakręć i wymieszaj od końca do końca, aby uzyskać jednorodny roztwór.
7. Zważyć pustą probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,8 ml i przenieść do dygestorium. Ostrożnie przenieść NaCNBH₃ (około 0,05 g) do wstępnie zważonej probówki. Zamknąć probówkę i zważyć probówkę zawierającą NaCNBH₃. Nie otwieraj rurki na zewnątrz maski.
8. W oparciu o masę NaCNBH₃ przeniesionego do probówki, należy przygotować 5 M roztwór, dodając 1 M NaOH. Masa cząsteczkowa NaCNBH₃ wynosi 62.84 g, dlatego 0.05 g jest równe (0.05/62.84 = 7.96 x ^10-4 mole) 7.96 x ^10-4 mole. Aby przygotować 5 M roztwór, dodać (7,96 x ^10-4 /5) 159 μl 1 M NaOH.
9. Zmierz całkowitą objętość reakcji, biorąc pod uwagę objętość żywicy. Dodać 10 μl 5 M NaCNBH₃ na ml reakcji.
   1. Na przykład: dla objętości reakcyjnej 4 ml dodać 40 μl 5 M NaCNBH₃. Na 1 ml żywicy i 3 ml dodanego białka całkowita objętość wynosi 4 ml.
10. Zakryj kolumnę i mieszaj koniec po końcu. Zabezpieczyć kolumnę na rotatorze rurowym i pozostawić reakcję na noc w temperaturze 4 °C.
11. Rano przynieś kolumnę do okapu chemicznego i ostrożnie zdejmij nasadkę, ponieważ mógł powstać trochę gazu. Opróżnić kolumnę do czystej probówki i zachować eluat do pomiaru stężenia białka przy użyciu metody^{absorbancji 280 nm 12} lub testu kwasu bicinchoninowego i porównać go z wyjściowym stężeniem białka w kroku 2.6.
12. Umyć żywicę 4 ml buforu sprzęgającego i pozwolić kolumnie spłynąć.

3. Blokowanie pozostałych stron

1. Przemyć żywicę 4 ml buforu hartującego. Opróżnij i załóż dolną nakrętkę. Dodać 2 ml buforu hartowniczego i zawiesić żywicę.
2. Ocenić całkowitą objętość reakcji, mierząc objętość żywicy i objętość buforu hartującego, a następnie dodać 10 μl 5 M NaCNBH₃ na ml objętości reakcyjnej.
3. Mieszaj delikatnie w temperaturze pokojowej przez 30 minut od końca. Po 30 minutach umieścić kolumnę w dygestorium. Ostrożnie zdejmij górną część, a następnie zdejmij dolną nasadkę i pozwól, aby kolumna spłynęła do rurki odpływowej.
4. Przemyć kolumnę 5 objętościami żywicy roztworu do mycia. Monitorować płukanie pod kątem obecności resztek białek, mierząc absorbancję eluatu przy 280 nm. Niesprzężone białka są wypłukiwane przez wysokie stężenie soli.
5. Przemyć żywicę 6 ml odgazowanego PBS o pH 7,4 zawierającego 0,02% azydku sodu. Utrzymywać kolumnę w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będzie potrzebna.

4. Oczyszczanie przeciwciał specyficznych dla Nurr1

1. Przepłukać sprzężoną kolumnę Nur77 LBD 10 ml PBS o pH 7,4 i pozwolić kolumnie spłynąć. Zakryj dno kolumny i umieść opróżnioną kolumnę sprzężoną z Nur77 LBD w nowej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
2. Dodać 5 ml oczyszczonych przeciwciał anty-Nurr1 z białka A, zakryć kolumnę i umieścić na rotatorze w temperaturze 4 °C na 1 godzinę. Zdjąć górną i dolną nakrętkę i zebrać przepływ. Odstawić na lód, aż będzie gotowy do dodania do kolumny sprzężonej Nor1 LBD.
3. Przepłukać kolumnę sprzężoną z Nor1 LBD 10 ml PBS o pH 7,4 i pozwolić kolumnie spłynąć. Zakryj dno kolumny i umieść sprzężoną kolumnę Nor1 LBD w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
4. Dodać przepływ z kolumny sprzężonej Nur77 LBD, zakryć kolumnę i umieścić na rotatorze w temperaturze 4 °C na 1 godzinę. Zdejmij górną i dolną zaślepkę i zbierz przepływ.
5. Zmierzyć stężenie przeciwciał, mierząc absorbancję przy 280 nm.

5. Analiza oczyszczonego przeciwciała anty-Nurr1 oparta na teście ELISA

1. Dodać 100 μl białka (2,5 μg/ml) do dołków płytki 96-dołkowej. W przypadku badania 3 różnych białek, dodać 100 μl białka 1 do studzienek A1 do H4, 100 μl białka 2 do studzienek A5 do H8 i 100 μl białka 3 do dołków A9 do H12. Przykryć płytkę i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Przemyć powlekane studzienki dwukrotnie 300 μl na studzienkę o pH PBS 7,4 i dodać 300 μl buforu blokującego ELISA do wszystkich studzienek pokrytych antygenem i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
3. Podczas gdy płytka się blokuje, należy przygotować pożądane początkowe rozcieńczenie oczyszczonego przeciwciała anty-Nurr1 (w zakresie od 10 do 100 μg/ml) w buforze blokującym ELISA.
4. Po 2 godzinach blokowania zastąp bufor blokowy ELISA 100 μl świeżego bufora blokowego ELISA do wszystkich studzienek.
5. Dodać 100 μl rozcieńczonego, oczyszczonego przeciwciała anty-Nurr1 do wszystkich studzienek w rzędzie A. Seryjnie rozcieńczyć przeciwciała, przenosząc 100 μl roztworu z rzędu A do studzienek w rzędzie B, a następnie przenieść 100 μl roztworu z rzędu B do rzędu C, kontynuując w dół do rzędu G. Po wymieszaniu roztworów w studzienkach w rzędzie G wyrzucić dodatkowe 100 μl. Studzienki w rzędzie H otrzymują tylko początkowe 100 μl buforu blokującego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
6. Umyj płytkę trzy (3) razy 300 μl na studzienkę 0,05% Tween 20 w PBS pH 7,4 i osusz płytkę, aby usunąć nadmiar buforu do mycia.
7. Dodać 100 μl sprzężonej z peroksydazą chrzanową (HRP) koziej anty-króliczej IgG rozcieńczonej w buforze blokowym ELISA (rozcieńczenie 1:8 000; typowy zakres wynosi od 1:5 000 do 1:25 000). Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
8. Umyć płytkę trzy (3) razy, jak opisano w ppkt 5.6. Przepłucz wszystkie studzienki, napełniając je 300 μl wody dejonizowanej. Zetrzyj nadmiar wody, odwracając płytkę na papier absorpcyjny.
9. Dodać 100 μl 3, 3', 5, 5' tetrametylobenzydyny (ogrzanej do temperatury pokojowej) do wszystkich studzienek i inkubować 15 do 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej.
10. Zatrzymać reakcję przez dodanie 50 μl 2 N H₂SO₄.
11. Odczyt absorbancji przy 450 nm, odejmowanie tła przy 650 nm.

Wyniki

Porównanie przeciwciał specyficznych dla Nurr1 oczyszczonych na kolumnie z Proteiną A z przeciwciałami anty-Nurr1 oczyszczonymi Proteiną A, a następnie przepuszczonymi przez kolumny z LBD Nur77 i LBD Nor1, przedstawiono na Rysunku 1. Jak widać, przeciwciało Nurr1 oczyszczone Proteiną A wykazało silne wiązanie z LBD Nurr1. Wykazało ono jednak również znaczące wiązanie z LBD Nur77 oraz LBD Nor1. Po dodatkowym oczyszczaniu przeciwciał Nurr1 oczyszczonych Proteiną A przeciwko LBD Nur77 i LBD Nor1, końcowe pr...

Dyskusja

Sukces tego protokołu zależy od dostępności czystych białek do scharakteryzowania przeciwciał podniesionych przeciwko określonemu członkowi rodziny białek będących przedmiotem zainteresowania. Nie ma potrzeby oczyszczania przeciwciał za pomocą białka A/G, dopóki nie zostanie wyraźnie ustalone, że istnieją znaczące reaktywności krzyżowe za pomocą testu ELISA i Western blot.

Jak stwierdzono w tekście, ważne jest, aby unikać zawieszania białka (białek), które mają być usieciowane w kolumnie w buf...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Oczyszczona domena wiążąca ligand z Nurr1, Nor 1 i Nur77			Roztwór do przechowywania kolumn
Żywica sprzęgająca AminoLink i zestaw	Thermo Scientific	44890
Kolumna wirowa białka	A Thermo Scientific	89978
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco		Corning 21-031-CV
96 well Płyty z płaskim dnem, wysoki kołnierz, 330 μ l	Thermo Scientific	3455
10% Normalna surowica kozia	KPL	50-675-69
Rozcieńczalnik do mleka / Koncentrat blokujący	KPL	50-82-01
Bufor elucyjny IgG	Thermo Scientific	21004
Zestaw do oznaczania białek Micro BCA	Thermo Scientific	23235
Anty-królicza IgG (H+L) sprzężona z peroksydazą chrzanowa kozia Thermo	Scientific	31460
Żywica Ni-NTA	Thermo Scientific	88221
3, 3', 5, 5' Tetramethylbenzydine	Thermo Scientific	34028
2N H2SO4	Macron Fine Chemicals	H381 05
Bufor wiążący białko A IgG	Thermo Scientific	21001
Bufor elucyjny IgG	Thermo Scientific	21004
Roztwór do przechowywania			kolumn Bufor fosforanowy Sól fizjologiczna zawierająca 0,02% azydek sodu
Spectra/Por 7 wstępnie obrobione rurki dializacyjne	Spectrum Labs	132128
10 ml Kolumny jednorazowe	Thermo Scientific	29924
Bufor			0,1 M fosforan sodu, 0,05% NaN3, pH 7,0
Bufor			1M Tris. HCI, 0,05% NaN3, pH 7,4
Roztwór			1M NaCl, 0,05% NaN3
ELISA Bufor			1% Normalna surowica końska (NHS), 1% Normalna surowica kozia (NGS) w 1X Rozcieńczalnik do mleka KPL
Roztwór			PBS pH 7,4 zawierający 0,02% azydku sodu
Mikropipety: 10 μ l; 20 μ l; 200 μ l; 1000 μ l

sprzęgający AminoLink hartujący myjący blokujący do przechowywania