Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52969

⸱

6 października 2015

 , 
1Department of Biological Sciences, University of Calgary, 2Toronto General Research Institute, University Health Network

W tym artykule

Podsumowanie

Współinfekcja człowieka jest trudna do odtworzenia in vitro. Jednak ludzkie pasożyty malarii mogą być łatwo hodowane in vitro, podobnie jak świeżo wyizolowane ludzkie komórki jednojądrzaste krwi obwodowej naturalnie zakażone wirusem HIV. Stanowi to doskonały model do badania wczesnych odpowiedzi immunologicznych na pasożyty malarii w kontekście współzakażenia wirusem HIV.

Streszczenie

Jednoczesne zakażenie malarią i wirusem HIV jest rosnącym priorytetem zdrowotnym. Jednak większość badań nad malarią lub HIV koncentruje się obecnie na każdej infekcji z osobna. Chociaż zrozumienie dynamiki choroby dla każdego z tych patogenów niezależnie jest niezbędne, ważne jest również, aby zbadać i zrozumieć interakcje między tymi patogenami.

Opracowaliśmy wszechstronny model in vitro jednoczesnego zakażenia HIV i malarii, aby badać odpowiedzi immunologiczne gospodarza na malarię w kontekście zakażenia HIV. Nasz model pozwala na badanie czynników wydzielanych w supernatantach komórkowych, powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych markerów białkowych, a także poziomów ekspresji RNA. Zastosowany projekt eksperymentalny i metody ograniczają zmienność oraz promują wiarygodność i odtwarzalność danych.

Wszystkie patogeny użyte w tym modelu są naturalnymi ludzkimi patogenami (Plasmodium falciparum i HIV-1), a wszystkie zainfekowane komórki są naturalnie zakażone i używane na świeżo. Wykorzystujemy ludzkie erytrocyty pasożytujące na P. falciparum i utrzymywane w ciągłej hodowli in vitro. Uzyskujemy świeżo wyizolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej od ochotników przewlekle zakażonych wirusem HIV. Każdy zastosowany stan ma odpowiednią kontrolę (P. falciparum spasożytowany vs. normalne erytrocyty), a każdy dawca zakażony wirusem HIV ma kontrolę niezakażoną wirusem HIV, z której komórki są pobierane tego samego dnia. Model ten zapewnia realistyczne środowisko do badania interakcji między pasożytami malarii a ludzkimi komórkami odpornościowymi w kontekście zakażenia wirusem HIV.

Wprowadzenie

Współinfekcja, infekcja z wieloma równoczesnymi infekcjami, jest normą w naturalnym środowisku. Koinfekcja może mieć duży wpływ na patologię choroby i na kliniczne postępowanie w każdej infekcji. W kontekście koinfekcji może to mieć negatywny wpływ na skuteczność szczepionek i leków, a także na testy diagnostyczne (omówione w punkcie 1). Jednak pomimo jego znaczenia, większość badań nad patogenami bierze pod uwagę tylko pojedyncze infekcje.

Tutaj opisujemy metodę, za pomocą której można badać jednocześnie malarię i zakażenie wirusem HIV in vitro. W szczególności metoda ta pozwala na badanie odpowiedzi immunologicznej specyficznej dla malarii w kontekście zakażenia wirusem HIV. Nasz protokół opisuje wszechstronny system kohodowli wykorzystujący świeżo izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) wyizolowane od dawców przewlekle zakażonych wirusem HIV oraz erytrocyty pasożytnicze P. falciparum (PfRBC) z hodowli in vitro. Wpływ terapii antyretrowirusowej HIV na te odpowiedzi można również zbadać za pomocą prospektywnie pobranych PBMC od dawców HIV(+) przed i po terapii.

Użyliśmy tego systemu do zbadania wpływu zakażenia wirusem HIV na wrodzone odpowiedzi immunologiczne specyficzne dla malarii 11,12 i byliśmy w stanie ustalić, że specyficzne dla malarii odpowiedzi IFNγ i TNF są upośledzone w komórkach NK, komórkach NKT, limfocytach T γδ od dawców HIV(+) przed i po terapii antyretrowirusowej HIV. Dodatkowo udało nam się wykorzystać ten system do określenia, że funkcje monocytowe są również upośledzone u dawców HIV(+), ale wracają do terapii antyretrowirusowej po zakażeniu HIV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół wymaga rekrutacji dawców do surowicy i krwinek czerwonych do hodowli pasożytów, a HIV(+) i niezakażonych dawców do izolacji PBMC. Instytucjonalne Komisje Rewizyjne muszą zatwierdzić wszystkie badania, a wszyscy dawcy muszą wyrazić świadomą zgodę przed pobraniem krwi.

UWAGA: Praca z próbkami ludzkiej krwi i ludzkimi pasożytami malarii wymaga środków ostrożności. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice i pracuj w szafie bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. W przypadku przypadkowego przezskórnego narażenia na malarię u ludzi należy zgłosić się do Ministerstwa Bezpieczeństwa i Higieny Pracy w celu leczenia profilaktycznego. Należy również wziąć pod uwagę dodatkowe względy bezpieczeństwa w przypadku pracy z krwią HIV(+). Załóż fartuch laboratoryjny z tyłu. Podwójna rękawica (górna rękawica powinna być lateksowa). Całą obsługę należy wykonywać w szafie bezpieczeństwa biologicznego poziomu 2. Nie używaj szkła ani ostrych przedmiotów. Nie używaj aspiratora. Umieść wszystkie zanieczyszczone przedmioty w roztworze virox lub wybielaczu na co najmniej 1 godzinę przed wyrzuceniem. Umyj wszystkie powierzchnie viroxem i promieniowaniem UV przez 1 godzinę po użyciu. Należy pamiętać, że każda instytucja będzie miała swoje własne przepisy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego, których należy przestrzegać. Zgłaszaj wszystkie przypadkowe narażenie na krew zakażoną wirusem HIV do działu zdrowia i bezpieczeństwa w celu oceny i rozważenia możliwej profilaktyki poekspozycyjnej.

Uwaga: Istnieją różne szczepy pasożytów malarii P. falciparum. Do tych eksperymentów użyto ITG, ale można użyć różnych szczepów. Doskonałe instrukcje dotyczące zamrażania i rozmrażania pasożytów Plasmodium falciparum są dostępne na stronie MR4 13.

1. Tworzenie RPMI-A dla hodowli pasożytów malarii

  1. Wykonaj RPMI-0, mieszając 950 ml ddH2O, 1 opakowanie proszku RPMI-1640, 6 g HEPES, 2 g wodorowęglanu sodu i 1,35 mg hipoksantyny.
  2. Rozmrozić inaktywowaną na gorąco surowicę ludzką od dwóch różnych dawców. Dawcy AB są najlepsi, ale każdy może być użyty, jeśli pasożyty są hodowane w czerwonych krwinkach typu O (RBC). Odwróć probówki do wymieszania. Jeśli surowica zawiera cząstki stałe lub jest gęsta, wiruj z prędkością 2,000 obr./min, a następnie przefiltruj część cieczy za pomocą jednostki filtrującej 0,45 μm.
  3. Za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm przefiltruj 180 ml RPMI-0, 20 ml ludzkiej surowicy (10 ml od każdego dawcy) i 0,5 ml 10 mg/ml gentamycyny.
    Uwaga: Surowica ludzka może zatkać filtr, więc może być wymagana więcej niż jedna jednostka filtrująca.
  4. Oznacz pożywkę butelką RPMI-A, datą i źródłem surowicy. Wstaw do lodówki, aż będzie to potrzebne. RPMI-A może stać się mętny w lodówce. Jest to normalne, ale rosnące zachmurzenie jest oznaką zanieczyszczenia.
    Uwaga: Wzrost pasożyta może się różnić w zależności od surowicy dawcy. Dobrym pomysłem jest przetestowanie wszystkich partii surowicy ludzkiej pod kątem prawidłowego wzrostu pasożytów przed użyciem.

2. Przygotowanie ludzkich czerwonych krwinek do hodowli pasożytów

Uwaga: Dawcy krwi powinni być typu O.

  1. Zebrać 7-10 ml krwi do probówek z kwasem, cytrynianem i dekstrozą (ACD). Na etykiecie należy wpisać identyfikator dawcy i datę pobrania.
  2. Przechowywać krew w temperaturze 4 oC do czasu, gdy będzie potrzebna. Użyj krwi do hodowli pasożytów w ciągu 1 miesiąca.
  3. Przetrzyj górną część rurki 70% etanolem. Ostrożnie zdjąć korek i wyrzucić. Przenieść krew do probówki o pojemności 15 ml. Wiruj przez 3 minuty przy 1,000 x g. Usuń osocze przez aspirację.
  4. Zawieś RBC z równą objętością ciepłego RPMI-0. Wirować przez 5 minut przy 1,000 x g. Usunąć kożuchową sierść przez aspirację, ponownie zamieszać w 5 ml RPMI-0 i powtórzyć pranie jeszcze 2 razy.
  5. Usunąć supernatant i dodać tyle RPMI-A, aby uzyskać mieszaninę o objętości 50% RBC.
  6. Przechowywać w temperaturze 4 oC do czasu, gdy będzie potrzebna.

3. Utrzymanie kultur pasożytów

  1. Wstępne rozgrzanie RPMI-A do 37 oC.
  2. Umieść rozmrożone pasożyty (patrz protokół MR4 dla procedury rozmrażania) w kolbie T25 z 5 ml RPMI-A i 75 μl przemytych ludzkich krwinek czerwonych, aby uzyskać hematokryt ~3%. Uwaga: Hematokryt mierzy objętość erytrocytów w porównaniu z objętością całkowitą. Aby obliczyć hematokryt, zmierz objętość upakowanych erytrocytów do całkowitej objętości pożywki plus RBC. Załóżmy, że rozmrożone pasożyty wniosą 75 μl erytrocytów. Dodając 150 μl wywaru RBC (co odpowiada dodaniu 75 μl upakowanych RBC) do kolby, otrzymujemy w sumie 150 μl RBC w 5 ml pożywki, co odpowiada hematokrytowi 3% (150 μl/5,000 μl x 100% = 3%).
  3. Gazować kolbę przez 30 sekund mieszaniną gazów pasożytniczych (1% O2 , 3 % CO2, bilans N2). Uszczelnić kolbę szeroką stroną do dołu w inkubatorze o temperaturze 37 o temperaturze 37 oC, tak aby zapewnić jak największą powierzchnię wymiany gazowej.
  4. Aby zmienić pożywkę i sprawdzić, czy nie ma parazytemii (należy to robić codziennie), ostrożnie przesuwaj kolbę, aby nie naruszyć warstwy RBC. Za pomocą sterylnej, odłączonej pipety Pasteura odciągnij pożywkę hodowlaną bez naruszania warstwy krwi.
  5. Aby sprawdzić parazytemię, należy pobrać próbkę o objętości 10 μl z warstwy krwi, umieścić ją na szkiełku podstawowym i za pomocą drugiego szkiełka podstawowego utworzyć cienką warstwę krwi. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia.
  6. Umieścić 4 ml świeżego RPMI-A w kolbie, delikatnie wymieszać, gazować przez 30 sekund i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
  7. Zabarwić szkiełko za pomocą zestawu do barwienia Hema3 zgodnie z protokołem producenta.
    1. Aby uzyskać optymalne barwienie, zanurz szkiełka w roztworze utrwalającym na 10 sekund, roztworze I na 10 sekund i roztworze II na 30 sekund. Spłucz w wodzie i pozostaw szkiełka do wyschnięcia.
  8. Oblicz parazytemię, licząc liczbę PfRBC (zabarwiony na ciemnofioletowo) w porównaniu z całkowitą liczbą RBC (zabarwiony na różowo). Policz w sumie 300 komórek, aby zapewnić dokładność.
  9. Gdy pasożyty osiągną parazytemię na poziomie 5%, rozprowadź hodowlę do kolby T75, używając 40 ml RPMI-A i 500 μl RBC.

4. Synchronizacja pasożytów

Uwaga: Dzień przed eksperymentem zsynchronizuj hodowlę pasożytów, podając alaninę. Tylko pasożyty w stadium pierścieniowym i niezakażone erytrocyty przetrwają to leczenie. Synchronizacja alaniny zapewni Ci czystą kulturę trofozoitów następnego dnia, którą można wykorzystać w eksperymentach z kokulturą. Upewnij się, że zaczynasz od kultury pasożytów, która zawiera większość pasożytów w stadium pierścieniowym.

  1. Przygotować roztwór alaniny, mieszając 8,01 g alaniny (300 mM) i 0,365 g Tris (10 mM) z 300 ml ddH2O. Doprowadzić pH do 7,4. Filtr sterylizować za pomocą jednostki filtrującej 0,2 μm.
  2. Wstępnie podgrzać roztwór alaniny do temperatury 37 oC.
  3. Odkręć kulturę pasożyta (5 min x 1 000 x g) i usuń pożywkę.
  4. Zawiesić osad w 19 objętościach roztworu alaniny (1 ml napakowanych erytrocytów na 19 ml roztworu alaniny). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Wirowanie 5 min x 1 000 x g. Aspirat supernatantu. Umyj raz w RPMI-0. Odessać supernatant i ponownie zawiesić w RPMI-A i dostosować hematokryt do ~3%. Kolba gazowa i powrót do 37 oC.
    Uwaga: W przypadku eksperymentów z kokulturą potrzebna jest minimalna parazytemia wynosząca 5% trofozoitów, przy czym 10% parazytemii jest uważane za optymalne.

5. Przygotowanie pasożytów i krwinek czerwonych do eksperymentów z kokulturą

  1. Użyj stosunku 3 PfRBC na PBMC w eksperymentach z kokulturą, aby wywołać reakcję zapalną. Aby obliczyć całkowitą PfRBC, należy określić ilościowo parazytemię, wykonując cienki rozmaz krwi, jak opisano w 3.5, i hematokryt, licząc liczbę RBC na ml hodowli pasożyta za pomocą hemocytometru.
    Liczba PfRBC = % parazytemii x całkowita liczba krwinek czerwonych/ml x ml hodowli. Na przykład: 10 ml kultury przy 10 x 106 RBC/ml i 10% parazytemii jest równe 0,1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 10 6 PfRBC.
  2. Wiruj kulturę pasożyta przez 5 minut w temperaturze 1 000 x g (RT). Odessać pożywkę i ponownie zawiesić w stężeniach 6 x 106 PfRBC na ml w RPMI-S+ (500 ml RPMI-1640 uzupełnionego L-glutaminą i HEPES, 10% inaktywowany termicznie FBS, 1,5 ml gentamycyny, 5 ml 100 mM pirogronianu sodu, 5 ml 10 mM aminokwasów endogennych MEM, 5 ml 5mM β-merkaptoetanolu).
  3. Pobrać krew kontrolną (niezakażone erytrocyty od tego samego dawcy, który jest używany do utrzymania hodowli pasożyta), obliczyć hematokryt i ponownie zawiesić w RPMI-S+ przy tej samej liczbie krwinek czerwonych na ml co hodowla pasożyta.

6. Izolacja ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC)

  1. Krew żylną należy pobrać w probówkach z heparyną sodową (zielona góra) zarówno od dawcy przewlekle zakażonego wirusem HIV(+), jak i od osoby z grupy kontrolnej HIV(-). Nie należy stosować EDTA jako antykoagulantu, ponieważ chelatujące wapń działanie EDTA wpływa na funkcję komórek. Średnio spodziewaj się od 5-10 x 106 PBMC na 10 ml krwi. W typowym eksperymencie należy pobrać 30 ml krwi od każdego dawcy. Objętość krwi będzie musiała zostać dostosowana zgodnie z wymaganiami doświadczalnymi.
  2. Tak szybko, jak to możliwe, a na pewno w ciągu godziny od pobrania krwi, usuń krew z probówek i umieść ją w plastikowej probówce o pojemności 50 ml. W szczególności monocyty zostaną aktywowane i przykleją się do szkła, dlatego ważne jest, aby w przypadku użycia szklanych probówek do pobierania krwi komórki były usuwane tak szybko, jak to możliwe.
  3. Wiruj krew o sile 1000 x g przez 15 minut i zbierz osocze (w razie potrzeby można to wykorzystać do innych badań – jeśli nie, ten krok można pominąć). Rozcieńczyć krew w równej objętości zimnego DPBS.
  4. Umieścić 15 ml RT Ficoll w probówce o pojemności 50 ml. Powoli, za pomocą sterylnej plastikowej pipety do przenoszenia, nałóż roztwór krwi/DPBS na Ficoll bez mieszania. Na każde 15 ml Ficollu można nałożyć maksymalnie 25 ml roztworu krew/DPBS.
  5. Obracaj gradienty przez 30 minut przy RT przy 600 x g. Upewnij się, że ustawienie "bez hamulca" jest włączone.
  6. Gdy komórki się obrócą, poszukaj interfejsu między dwiema fazami. To jest miejsce, w którym znajdują się PBMC. Za pomocą sterylnej plastikowej pipety transferowej pobrać PBMC z granicy faz (patrz rysunek 1). Minimalizacja zanieczyszczenia przez RBC.
  7. Zebrane komórki umieścić w probówkach o pojemności 50 ml, nie więcej niż 20 ml na probówkę. Górna probówka do 50 ml ze sterylnym zimnym DPBS.
  8. Wirować komórki przez 10 minut w temperaturze 4 oC i 300 x g.
  9. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 5 ml sterylnego zimnego DPBS i zebrać wszystkie komórki od tego samego dawcy w jednej probówce. Uzupełnij do 50 ml sterylnym DPBS i powtórz kroki prania jeszcze 2 razy.
  10. Zawieś komórki w 10 ml pożywki RPMI-S+.
  11. Usunąć podwielokrotność o objętości 20 μl i wymieszać z 20 μl błękitu trypanowego. Odpipetować 10 μl do hemocytometru i policzyć żywe komórki (komórki, które nie wchłonęły niebieskiego barwnika – wszystkie niebieskie komórki są martwe). Użyj hemocytometru, aby obliczyć liczbę komórek w roztworze w następujący sposób.
    Uwaga: Hemocytometr ma siatkę o określonych wymiarach, dzięki czemu znany jest obszar pokryty liniami.
    1. Upewnij się, że hemocytometr jest czysty. Umieść szkiełko nakrywkowe na obszarze liczenia. Załadować 10 μl roztworu komórkowego, umieszczając końcówkę pipety w jednym z dołków w kształcie litery V. Obszar pod szkiełkiem nakrywkowym wypełni się działaniem kapilarnym.
    2. Umieścić załadowany hemocytometr pod mikroskopem. Pełna siatka hemocytometru zawiera 9 kwadratów o średnicy 1 mm2 każdy. Policz wszystkie komórki w każdym dużym kwadracie. Jeśli obecnych jest zbyt wiele komórek, rozcieńczyć roztwór i ponownie przeliczyć.
    3. Oblicz stężenie komórek w następujący sposób: Całkowita liczba komórek/ml = (całkowita liczba komórek/# kwadratów) x współczynnik rozcieńczenia x 10 000 komórek/ml, np. (500 komórek/5 kwadratów) x współczynnik rozcieńczenia 20 x 10 000 komórek/ml = 20 x 10 łącznie6 komórek.
  12. Doprowadzić pożywkę do końcowego stężenia 10 x 106 na ml (pożywka RPMI-S+).

7. Kultura współzakażenia malarią/HIV

  1. Płytka 100 μl izolowanych PBMC i 400 μl pożywki RPMI-S+ na płytkę 24-dołkową (1 x 106 PBMC na studzienkę). Upewnij się, że studzienki są ustawione w trzech egzemplarzach: 3 dołki dla niezakażonych RBC, 3 dołki z PfRBC, 3 dołki z pożywką i 3 dołki z PMA/jonomycyną. Dotyczy to zarówno próbki HIV(+), jak i HIV(-).
  2. W przypadku studzienek PfRBC umieścić 3 x 106 PfRBC w każdym z dołków (500 μl kultury pasożytów przygotowanej w 5.2).
  3. W przypadku studzienek niezakażonych krwinek czerwonych należy umieścić po 500 μl niezakażonej kultury krwinek czerwonych przygotowanej w ppkt 5.3 w każdym z dołków.
  4. W przypadku dołków pośrednich należy umieścić 500 μl pożywki RPMI-S+ w każdej z pożywki.
  5. W przypadku studzienek PMA/jonomycyny należy przygotować roztwór PMA/jonomycyny (odpowiednio 2,5 pg/ml, 250 pg/ml). Umieść 500 μl tego roztworu w każdym dołku.
    Uwaga: Jako silne stymulatory wydzielania cytokin limfocytów T, PMA i jonomycyna są stosowane jako kontrola pozytywna w celu zapewnienia funkcjonowania komórek.
  6. Umieścić płytkę w temperaturze 37 oC w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 .
  7. Opcjonalnie: użyj nadmiaru komórek do analizy fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej lub przechowuj w roztworze stabilizującym RNA do przyszłej analizy ekspresji mRNA.

8. Wykrywanie odpowiedzi immunologicznych na malarię

Uwaga: Przeprowadzaj eksperymenty z kulturą przez 4 dni. W tym czasie nie jest wymagana wymiana podłoża. Optymalny punkt czasowy będzie zależał od typu interesującej komórki i zadanego pytania. Inkubacja trwająca 12-48 godzin jest optymalna dla monocytowych odpowiedzi na PfRBC, podczas gdy odpowiedzi limfocytów najlepiej obserwowano po 72-96 godzinach. Punkty czasowe będą musiały zostać zoptymalizowane na podstawie pytania eksperymentalnego. Krótsze okresy (2-4 godziny) mogą być stosowane, jeśli interesująca jest interakcja między nienaruszonymi PfRBC i PBMC.

  1. Obracaj płytkę o gramaturze 300 x g przez 3 minuty, aby ogarnąć komórki. Zbierz 700 μl supernatantu kulturowego z każdej studzienki.
  2. Wirować supernatant pod ciśnieniem 1 000 x g przez 5 minut, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia.
  3. Podwielokrotność oczyszczonego supernatantu w razie potrzeby oznaczyć i zamrozić w temperaturze poniżej -20 °C do czasu przeprowadzenia analizy wydzielanych czynników.
  4. Analizuj odpowiedzi cytokin/chemokiny za pomocą testu ELISA lub tablicy perełkowej (postępuj zgodnie z sugerowanymi przez producenta protokołami).
  5. Zbierz komórki pozostałe na płytce do roztworu stabilizującego RNA i wykorzystaj do analizy ekspresji mRNA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym 14-16.

9. Wewnątrzkomórkowa cytometria przepływowa dla specyficznych dla komórki odpowiedzi Ccytokine przy użyciu PBMC współhodowanego z P. falciparum Zakażone RBC

Uwaga: Jak wspomniano powyżej, długość kokultury będzie zależała od typu interesującej nas komórki. W przypadku zainteresowania monocytowymi odpowiedziami na PfRBC potrzebny jest krótszy okres inkubacji. Czasy będą dłuższe dla wrodzonych odpowiedzi limfocytów γδ limfocytów T, komórek NK, komórek NKT), a jeszcze dłuższe dla limfocytów T CD4 i CD8. Wymagana będzie optymalizacja.

  1. 6-8 godzin przed analizą dodać 1 μl 1,000x brefeldin A do wszystkich studzienek. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 oC. Po 6-8 godzinnej inkubacji umieść płytkę na lodzie na 15 minut.
  2. Usuń komórki z dołków za pomocą energicznego pipetowania i umieść je w oznakowanych probówkach mikrocentyfugowych. W celu usunięcia monocytów może być konieczne skrobanie.
  3. Wiruj komórki przez 5 minut w temperaturze 1,000 x g. Usuń supernatanty. Zawieś komórki w buforze cytometrii przepływowej o pojemności 500 μl (1x DPBS, 2% inaktywowany termicznie FBS, 0,02% azydek sodu).
  4. Podziel komórki tak, aby każda próbka miała: jedną probówkę do pełnego barwienia przeciwciałami (240 μl) i jedną probówkę do barwienia przeciwciałami kontrolnymi fluorescencyjnymi minus jeden (FMO) (240 μl). Zebrać niewielką ilość każdej próbki (20 μl) do kontroli za pomocą niebarwionej cytometrii przepływowej (zostanie to wykorzystane do ustawienia cytometru przepływowego).
  5. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g. Usunąć supernatanty.
  6. Inkubować komórki z niesprzężonym anty-ludzkim CD16/CD32 (5 μg/ml) w 50 μl buforze cytometrii przepływowej przez 15 minut w temperaturze 4 oC w celu zablokowania receptorów Fc.
  7. Dodać 1 ml buforu do cytometrii przepływowej do każdej probówki. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g. Usunąć supernatanty.
  8. Zawiesić komórki w 50 μl buforu cytometrii przepływowej ze wstępnie dobranym stężeniem przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do pożądanych markerów powierzchniowych komórek. Wstępnie wymieszaj wystarczającą ilość roztworu przeciwciał, aby wszystkie próbki zostały zabarwione. Inkubować komórki w temperaturze 4 oC przez 20 minut. Chronić przed światłem. Uwaga: Ilość każdego przeciwciała będzie musiała zostać zoptymalizowana. Rutynowo barwimy CD56, CD3, γδ, CD4, CD8, CD14. Miareczkowane objętości tych przeciwciał przedstawiono w Tabeli 1.
  9. Dodać 1 ml buforu do cytometrii przepływowej do każdej probówki. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g. Usunąć supernatanty.
  10. Do każdej probówki dodać 100 μl roztworu cytofix/cytoperm. Inkubować komórki przez 20 minut w temperaturze 4 oC. Chronić przed światłem.
  11. Dodać 1 ml buforu do trwałej ondulacji/płukania (dostarczanego jako 10x koncentrat – rozcieńczyć do 1x za pomocą ddH2O) do każdej probówki. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g. Usunąć supernatanty.
  12. Dodać 100 μl buforu do trwałej ondulacji/płukania do probówek do barwienia przeciwciał FMO Control i wymieszać w celu ponownego zawieszenia komórek.
  13. Dodać 100 μl buforu do trwałej ondulacji/przemywania o wstępnie dobranym stężeniu przeciwciał sprzężonych z fluoroforem do pożądanych markerów wewnątrzkomórkowych (tj. cytokin/chemokin) do pełnych probówek do barwienia przeciwciał.
    Uwaga: Ilość każdego przeciwciała będzie musiała zostać zoptymalizowana. Rutynowo barwimy przeciwciałami anty-TNF i anty-IFNγ. Miareczkowane objętości tych przeciwciał przedstawiono w Tabeli 1.
  14. Inkubować wszystkie probówki przez 30 minut w temperaturze 4 oC. Chronić przed światłem.
  15. Dodać 1 ml buforu do trwałej ondulacji/płukania do każdej probówki. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 500 x g. Usunąć supernatanty.
  16. Zawieś komórki w buforze cytometrii przepływowej o pojemności 300 μl z 1% paraformaldehydem. Odstawić na co najmniej 15 minut, aby zneutralizować wirusa HIV.
  17. Przygotować pojedyncze próbki barwione przeciwciałami za pomocą kulek kompensacyjnych, które mają być użyte do kompensacji ustawionej na cytometrze przepływowym. Rodzaj kulek kompensacyjnych będzie zależał od zastosowanych przeciwciał (tj. Ig anty-myszy, anty-szczur/chomik Ig). Koraliki wirowe. Dodaj jedną kroplę kulek na przeciwciało. Dodać równe ilości przeciwciała, jakie są używane do barwienia. Dodać 200 μl buforu do cytometrii przepływowej. Są one teraz gotowe do użycia. Nie ma potrzeby mycia koralików.
  18. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy pobrać próbki za pomocą cytometru przepływowego tak szybko, jak to możliwe, w ciągu 24 godzin. Barwniki tandemowe są podatne na dysocjację podczas przechowywania, dlatego zalecamy natychmiastowe pozyskanie, jeśli to możliwe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykresy przedstawiają poziomy produkcji IFNγ przez komórki NKT (Rysunek 2), z wykorzystaniem bramkowania CD56+CD3+γδ- w celu uzyskania populacji komórek NKT (dane nie zostały przedstawione). Komórki hodowano przez 72 hr przed barwieniem. Po zabarwieniu, za pomocą cytometru przepływowego przeanalizowano 100 000 komórek CD3+, aby uzyskać wystarczająco duże populacje komórek NK, NKT i γδ (komórki będące przedmiotem analizy). Na każdym wykresie przedstawiono minimum 5 600 komórek NKT. Produkcję TNF określono...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Nasz protokół został zoptymalizowany w celu jak najbardziej realistycznego badania koinfekcji HIV i malarii in vitro. Po pierwsze, świeże ludzkie krwinki czerwone i surowica są niezbędne do hodowli pasożytów malarii. Jest to niezbędne do uzyskania zdrowej populacji pasożytów malarii. Lizaty pasożytów nie mogą zastąpić żywych pasożytów, ponieważ produkcja cytokin jest znacznie szybsza i intensywniejsza w przypadku stosowania żywych RBC zakażonych P. falciparum (PfRBC) 17,18. Ponadto aktywacja ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

C.A.M.F. i L.S. brali udział w projektowaniu protokołu, pozyskiwaniu i analizie danych oraz redagowaniu artykułu.

Autorzy pragną podziękować Dr. Kainowi, Dr. Loutfy'emu, Dr. Wasmuthowi i Dr. Ayi za ich wkład.

C.F. był wspierany przez stypendium podoktorskie CTN/Ontario HIV Treatment Network (OHTN). L.S. jest wspierany przez OHTN Junior Investigator Development Award. Obecne prace były wspierane przez grant operacyjny Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (MOP-13721 i 115160) oraz grant CIHR New Investigator Catalyst.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
przeciwciała alaninoweSigmaA7377
(patrz inna tabela)
BD Cytofix/Cytoperm z BD GolgiPlugBD555028zawiera brefeldynę A, bufor cytofix/cytoperm i bufor do trwałej ondulacji/płukania
BD Vacutainer ACD Roztwór ABD364506
BD Vacutainer Heparyna sodowaBD17-1440-02
DPBS (bez wapnia, bez magnezu)Corning21-031-CV
Surowica bydlęcapłodu SigmaF1051inaktywacja termiczna przed użyciem
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
gentamycyna (10 mg / ml)Gibco15710-064
Hema3 Zestaw do barwieniaFisher122-911
HEPESFisherBP310-500
hipoksantynaSigmaH9636
JonomycynaSigmaI3909
MEM aminokwasy endogenne (10 mM)Gibco11140
PMASigmaP8139
RPMI-1640 proszekLife-Technologies31800-022
RPMI-1640 z L-glutaminą i HEPESThermo ScientificSH30255.01
Wodorowęglan sodu (proszek, hodowla komórkowa)SigmaS5761
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco11360
Tris (baza Trizma)SigmaT6066
TrizolAmbion15596018
Trypan Blue (0,4%)Gibco15250-061
BD CompBeadBD552843, 552845zależy od zastosowanych przeciwciał
Mieszanina gazów pasożytniczychNa specjalne zamówienie3% CO2, 1% O2, równowaga N2
Equipment
0,2 μ m jednostka
Szkiełka szklane
Kolby
Kolby
Probówki 50 ml
płytki hodowlane
odłączone Pipety
Pasteura zatkane PipetyPasteura
sterylne pipety
hemocytometr
cytometr przepływowy (3 lasery)
< silne > przeciwciała stosowane do cytometrii przepływowej< / strong>
Anti-TNFeBiosciences551487FITC (fluorofor) 2 μ l
Anty-IFNγBiolegend506507PE (fluorofor) 20 μ l
Anti-CD8Biolegend300914PE-Cy7 (fluorofor) 1 μ l
Anti-CD14Biolegend; BD Biosciences325624; 551487Biotyna (fluorofor) 0,5 μ l Streptavin PE-TR (fluorofor) 0,1 i #956; l
Anti-CD56Biolegend318322PerCP/Cy5.5 (fluorofor) 5 μ l
Anty-γ δBiolegend331212APC (fluorofor) 5 μ l
Anti-CD3Biolegend300426APC-Cy7 (fluorofor) 5 μ l
Anti-CD4Biolegend317424Pacific Blue (fluorofor) 1 μ l
filtrującaT25T75 24-dołkowe transferowe

Bibliografia

  1. Graham, A. L., Cattadori, I. M., Lloyd-Smith, J. O., Ferrari, M. J., Bjørnstad, O. N. Transmission consequences of coinfection: cytokines writ large. Trends in parasitology. 23 (6), 284-291 (2007).
  2. French, N., et al. Increasing rates of malarial fever with deteriorating immune status in HIV-1-infected Ugandan adults. AIDS (London, England). 15 (7), 899-906 (2001).
  3. Hoffman, I. F., et al. The effect of Plasmodium falciparum malaria on HIV-1 RNA blood plasma concentration. AIDS (London, England). 13 (4), 487-494 (1999).
  4. Kamya, M. R., et al. Effect of HIV-1 infection on antimalarial treatment outcomes in Uganda: a population-based study. The Journal of infectious diseases. 193 (1), 9-15 (2006).
  5. Kublin, J. G., et al. Effect of Plasmodium falciparum malaria on concentration of HIV-1-RNA in the blood of adults in rural Malawi: a prospective cohort study. Lancet. 365 (9455), 233-240 (2005).
  6. Mermin, J., et al. Effect of co-trimoxazole prophylaxis, antiretroviral therapy, and insecticide-treated bednets on the frequency of malaria in HIV-1-infected adults in Uganda: a prospective cohort study. Lancet. 367 (9518), 1256-1261 (2006).
  7. Patnaik, P., et al. Effects of HIV-1 serostatus, HIV-1 RNA concentration, and CD4 cell count on the incidence of malaria infection in a cohort of adults in rural Malawi. The Journal of infectious diseases. 192 (6), 984-991 (2005).
  8. Whitworth, J., et al. Effect of HIV-1 and increasing immunosuppression on malaria parasitaemia and clinical episodes in adults in rural Uganda: a cohort study. Lancet. 356 (9235), 1051-1056 (2000).
  9. Xiao, L., Owen, S. M., Rudolph, D. L., Lal, R. B., Lal, A. A. Plasmodium falciparum antigen-induced human immunodeficiency virus type 1 replication is mediated through induction of tumor necrosis factor-alpha. The Journal of infectious diseases. 177 (2), 437-445 (1998).
  10. Francesconi, P., et al. HIV, malaria parasites, and acute febrile episodes in Ugandan adults: a case-control study. AIDS (London, England). 15 (18), 2445-2450 (2001).
  11. Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates Tim-3 expression on innate cells: combination antiretroviral therapy results in partial restoration. Journal of acquired immune deficiency syndromes. 63 (2), 161-167 (2013).
  12. Finney, C. A. M., et al. HIV infection deregulates innate immunity to malaria despite combination antiretroviral therapy. AIDS (London, England). 27 (3), 325-335 (2013).
  13. Ljungstrom, I., et al. Methods in Malaria Research. , 4th edition, MR4/ATCC. Available from: http://www.mr4.org/Publications/MethodsinMalariaResearch.aspx (2013).
  14. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  15. Universal SYBR green quantitative PCR protocol [Internet]. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/sybr-green-qpcr.html (2014).
  16. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-DDCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  17. Hensmann, M., Kwiatkowski, D. Cellular basis of early cytokine response to Plasmodium falciparum. Infection and immunity. 69 (4), 2364-2371 (2001).
  18. Artavanis-Tsakonas, K., Riley, E. M. Innate immune response to malaria: rapid induction of IFN-gamma from human NK cells by live Plasmodium falciparum-infected erythrocytes. J Immunol. 169 (6), 2956-2963 (2002).
  19. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. The Journal of parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  20. Ludlow, L. E., et al. HIV-1 inhibits phagocytosis and inflammatory cytokine responses of human monocyte-derived macrophages to P. falciparum infected erythrocytes. PloS one. 7 (2), e32102(2012).
  21. Weinberg, A., et al. Viability and functional activity of cryopreserved mononuclear cells. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (4), 714-716 (2000).
  22. Fowke, K. R., Behnke, J., Hanson, C., Shea, K., Cosentino, L. M. Apoptosis: a method for evaluating the cryopreservation of whole blood and peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunological. 244 (1-2), 139-144 (2000).
  23. Jeurink, P. V., Vissers, Y. M., Rappard, B., Savelkoul, H. F. J. T cell responses in fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells: kinetics of cell viability, cellular subsets, proliferation, and cytokine production. Cryobiology. 57 (2), 91-103 (2008).
  24. Kvarnström, M., Jenmalm, M. C., Ekerfelt, C. Effect of cryopreservation on expression of Th1 and Th2 cytokines in blood mononuclear cells from patients with different cytokine profiles, analysed with three common assays: an overall decrease of interleukin-4. Cryobiology. 49 (2), 157-168 (2004).
  25. Venkataraman, M. Effects of cryopreservation of immune responses. XI. Heightened secretion of tumor necrosis factor-alpha by frozen human peripheral blood mononuclear cells. Cryobiology. 34 (3), 276-283 (1997).
  26. Venkataraman, M. Effects of cryopreservation on immune responses. X. Decrease in interleukin-12 production by frozen human peripheral blood mononuclear cells is mediated by the endogenously hypersecreted interleukin-10. Cryobiology. 33 (5), 581-588 (1996).
  27. Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced. Clinical and diagnostic laboratory immunology. 7 (3), 352-359 (2000).
  28. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. Journal of leukocyte biology. 56 (3), 236-240 (1994).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wsp infekcja HIV i malariimononuklearne kom rki krwi obwodowejhodowla Plasmodium falciparumanaliza cytometrycznatest produkcji cytokinwrodzona odpowied immunologicznapomiar interferonu gammaprotok poziomu biosafety 2markery powierzchniowe kom rek
Model in vitro do pomiaru odpowiedzi immunologicznej na malarię w kontekście współzakażenia wirusem HIV
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.