Artykuł metodologiczny

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

12.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52970

⸱

23 października 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Tufts University, 2Department of Pediatrics, University of Connecticut Health Center & Connecticut Children's Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Streszczenie

Pomimo ogromnych wysiłków zmierzających do rozszyfrowania anatomii, składu i funkcji mózgu, pozostaje on najmniej poznanym organem ludzkiego ciała. Aby lepiej zrozumieć system neuronowy, naukowcy dążą do prostej rekonstrukcji tkanki poprzez złożenie jej in vitro z podstawowych elementów budulcowych przy użyciu podejścia inżynierii tkankowej. Nasza grupa opracowała oparty na inżynierii tkankowej model 3D przypominający mózg na bazie jedwabiu i kolagenu, przypominający białą i szarą istotę kory mózgowej. Model składa się z jedwabnej porowatej gąbki, która jest wstępnie wysiana neuronami pochodzącymi z mózgu szczura, zanurzonymi w miękkiej matrycy kolagenowej. Spolaryzowany rozrost neuronów i tworzenie sieci obserwuje się z oddzielną lokalizacją aksonów i ciała komórki. Ta architektura kompartmentowa pozwala na unikalny rozwój nisz naśladujących natywną tkankę neuronalną, umożliwiając w ten sposób badania nad tworzeniem sieci neuronalnych, prowadzeniem aksonów, interakcjami komórka-komórka i komórka-macierz oraz funkcjami elektrycznymi.

Wprowadzenie

Ośrodkowy układ nerwowy (OUN) może być dotknięty różnymi zaburzeniami obejmującymi naczyniowe, strukturalne, funkcjonalne, zakaźne lub zwyrodnieniowe. Szacuje się, że 6,8 miliona ludzi umiera każdego roku w wyniku zaburzeń neurologicznych, co stanowi rosnące obciążenie społeczno-ekonomiczne na całym świecie1. Jednak tylko kilka z tych zaburzeń ma dostępne metody leczenia. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na innowacyjne strategie terapeutyczne dla pacjentów cierpiących na zaburzenia neurologiczne. Niestety, wiele terapii ukierunkowanych na OUN zawodzi podczas badań klinicznych, częściowo z powodu wykorzystania nieodpowiednich modeli badań przedklinicznych, które nie pozwalają na ocenę ostrych i przewlekłych skutków z fizjologicznie istotnymi odczytami funkcjonalnymi.

Pomimo znacznych wysiłków badawczych w ciągu ostatnich dziesięcioleci, istnieje ogromna ilość niewiadomych na temat struktury i funkcji CNS. W celu zdobycia większej wiedzy, modele zwierzęce są często wykorzystywane do modelowania stanów patologicznych, takich jak urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) lub demencja, zwłaszcza w badaniach przedklinicznych. Jednak zwierzęta znacznie różnią się od ludzi zarówno anatomią OUN, jak i funkcją, ekspresją genów i metabolizmem2-4. Z drugiej strony, hodowle 2D in vitro są powszechną metodą badania biologii komórki i są rutynowo stosowane do odkrywania leków. Jednak hodowle komórkowe 2D nie są tak złożone i fizjologiczne jak w przypadku ludzkiego mózgu5-7. Chociaż nic nie zastąpi niskich kosztów i prostoty badań 2D nad hodowlami komórkowymi ani złożoności modeli zwierzęcych, inżynieria tkankowa 3D może wygenerować ulepszone modele badawcze, aby wypełnić lukę istniejącą między podejściami 2D in vitro i in vivo. Inżynieria tkankowa 3D zapewnia bardziej fizjologicznie istotne warunki eksperymentalne osiągane przez interakcje 3D komórka-komórka i sygnały zewnątrzkomórkowe dostarczane przez rusztowania biomateriałowe. Pomimo znaczących dowodów potwierdzających wartość kultur 3D, obecnie istnieje tylko kilka trójwymiarowych modeli tkanek OUN, takich jak hodowle organoidów pochodzących z komórek macierzystych8-10, neurosferoidy11 i rozproszone kultury hydrożelowe12,13. Zaawansowane metody techniczne, w tym litografia wielowarstwowa14 i druk 3D15, zostały wykorzystane do badania tkanki płuc, wątroby i nerek. Brakuje jednak modeli 3D OUN, które pozwalają na podzielony wzrost neuronów, taki jak naśladowanie architektury korowej i biologii. Oddzielony wzrost neurytów od ciał komórek neuronalnych został wcześniej zademonstrowany w hodowlach 2D przy użyciu mikrowytwarzania16,17 umożliwiającego badanie śledzenia szlaku aksonowego, napływu wapnia, architektury i aktywności sieci. Ten pomysł zainspirował nas do opracowania spolaryzowanej tkanki nerwowej 3D, w której ciała komórkowe i drogi aksonalne znajdują się w różnych przedziałach, naśladując warstwową architekturę mózgu18. Nasze podejście opiera się na zastosowaniu unikalnej konstrukcji rusztowania jedwabnego, która mieści dużą gęstość komórek w ograniczonej objętości i umożliwia rozrost gęstej sieci aksonalnej do żelu kolagenowego. Tutaj demonstrujemy pełną procedurę składania tkanki podobnej do mózgu, w tym wytwarzanie rusztowania i hodowlę neuronów.

Protokół

Protokół izolacji tkanki mózgowej został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Tufts i jest zgodny z Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (Institutional Animal Care and Use Committee B2011-45).

1. Przygotowanie rusztowania jedwabnego

  1. Przygotowanie roztworu jedwabiu z kokonów Bombyx mori, jak opisano wcześniej19,20.
    1. Pokrój każdy kokon na 8 równych kawałków za pomocą nożyczek. Użyj około 11 kokonów na 5 g rozdrobnionych kokonów. (Czas trwania: 15 min)
    2. Przygotować 2 l roztworu 0,02 M Na2CO3 i doprowadzić do wrzenia na płycie grzejnej. (Czas trwania: 15 min)
    3. Odważyć 5 g rozdrobnionych kokonów i gotować je w roztworze Na2CO3 przez 30 min. Mieszaj wrzący jedwab co kilka minut szpatułką. Ten etap, zwany również odgumowywaniem, oczyszcza fibroinę jedwabiu z hydrofilowych białek, serycyn. (Czas trwania: 30 min)
    4. Wykręć fibroinę ręcznie i opłucz ją w wodzie destylowanej co najmniej trzy razy, aby wypłukać pozostałą serycynę i chemikalia. (Czas trwania: 5 min)
    5. Umieść mokrą fibroinę na szalce Petriego i wysusz ekstrakt z fibroiny w okapie przepływowym O/N.
    6. Następnego dnia zważ suchą masę fibroiny i umieść ją w szklanej zlewce. (Czas trwania: 15 min)
    7. W celu rozpuszczenia fibroiny w 9,3 M roztworze LiBr należy obliczyć wymaganą objętość (w ml) LiBr, mnożąc masę suchej fibroiny przez 4. Powoli wlej roztwór LiBr na fibroinę jedwabiu i zanurz wszystkie włókna fibroiny za pomocą szpatułki. Przykryj zlewkę, aby zapobiec parowaniu, i umieść ją w temperaturze 60 °C na 4 godziny, aby włókna mogły się rozpuścić. (Czas trwania: 15 min)
    8. Za pomocą strzykawki pobrać roztwór fibroiny ze zlewki i załadować go do kaset do dializy MWCO 3,500. Wykonuj dializę z wodą destylowaną przez 48 godzin. Zmieniaj wodę co kilka godzin.
    9. Za pomocą strzykawki zebrać roztwór fibroiny z kaset do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i dwukrotnie odwirować przy 9 000 obr./min (~12 700 x g) w temperaturze 4 °C przez 20 min. Po każdym etapie wirowania wlać supernatant do świeżej probówki i wyrzucić osad. (Czas trwania: 40 min)
    10. Zmierz stężenie fibroiny, szacując suchą masę. Wlej 1 ml roztworu jedwabiu do łódki wagowej. Suszyć próbkę w suszarce w temperaturze 60 °C przez 2 godziny. Zważyć suchą fibroinę jedwabiu i obliczyć stężenie roztworu fibroiny jedwabiu, mnożąc uzyskaną masę przez 100. Oczekiwane stężenie roztworu jedwabiu wynosi 6-9% (w/v).
    11. Dostosuj stężenie jedwabiu do 6% (w/v), rozcieńczając go w wodzie destylowanej.
      Punkt zatrzymania: Płynna fibroina jedwabiu może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca w zamkniętym pojemniku.
  2. Przygotowanie porowatych rusztowań z roztworu jedwabiu.
    1. Przesiej granulowany NaCl, aby oddzielić granulki o wielkości 500-600 μm, które zostaną wykorzystane w późniejszych etapach. Granulki o wielkości poniżej 500 μm i powyżej 600 μm należy wyrzucić. (15 min)
    2. Wlać 30 ml 6% roztworu jedwabiu do formy z politetrafluoroetylenu (PTFE) (rysunek 1). Delikatnie rozsyp 60 g przesianego NaCl na jedwabiu. Postukaj w pojemnik, aby uzyskać jednolitą warstwę soli. Inkubować 48 godzin w temperaturze pokojowej w celu polimeryzacji jedwabiu.
    3. Umieścić formę PTFE zawierającą rusztowanie w piecu w temperaturze 60 °C na 1 godzinę, aby zakończyć polimeryzację i odparować pozostałą ciecz
      4. .
    4. Umieść zawartość formy PTFE w zlewce zawierającej 2 litry wody destylowanej na 48 godzin, aby wypłukać sól. Zmieniaj wodę 2-3 razy dziennie. Usuń rusztowania gąbczaste z form, gdy sól zostanie całkowicie wypłukana. Punkt zatrzymania: Gąbki można przechowywać zanurzone w wodzie o temperaturze 4 °C w zamkniętym pojemniku, aby zapobiec odwodnieniu rusztowań.
    5. Gdy będziesz gotowy, wytnij rusztowania za pomocą stempla do biopsji o średnicy 5 mm. Rusztowania należy wstępnie przyciąć tak, aby osiągnęły około 2 mm wysokości. Przebić środek rusztowania za pomocą stempla do biopsji o średnicy 2 mm (ryc. 2A). (1 godz.)
    6. Rusztowania zanurzone w wodzie należy sterylizować w autoklawie (cykl mokry, 121 °C, 20 min). Punkt zatrzymania: Gąbki można przechowywać zanurzone w wodzie o temperaturze 4 °C w zamkniętym pojemniku, aby zapobiec odwodnieniu rusztowań.
    7. Przed planowanym wysiewem komórek należy zanurzyć rusztowania w sterylnym roztworze poli-D-lizyny (PDL) o stężeniu 0,1 mg/ml. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
    8. Przemyć rusztowania 3x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w celu usunięcia niezwiązanego PDL. (Czas trwania: 30 min)

2. Izolacja neuronów kory mózgowej szczura

  1. Wypreparuj korę mózgową od 18. dnia embrionalnego (E18) szczurów Sprague-Dawley, jak wcześniej opisali Pacifici i Peruzzi27, po uzyskaniu zatwierdzonego protokołu zwierzęcego. (2 godz.)
  2. Inkubować 10 kory mózgowej w 5 ml 0,25% trypsyny z 0,3% DNazą I (z trzustki bydlęcej) przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
  3. Dezaktywuj trypsynę, dodając równą objętość 1 mg/ml białka sojowego.
  4. Rozcierać korę mózgową za pomocą 10 ml pipety Pasteura, pipetując w górę i w dół 20 razy, aż do wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki. Zachowaj delikatność i unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. (Czas trwania: 10 min)
  5. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 127 x g przez 5 min.
  6. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki hodowlanej (pożywka neuropodstawna, 1x suplement B27, 1x Glutamax, 1% penicylina/streptomycyna). Policz komórki. Oczekiwane stężenie komórek wynosi około 2x107/ml. (20 min)

3. Zbuduj zgromadzenie i kulturę

  1. Siew rusztowań z komórkami.
    1. Przenieś sterylne rusztowania i wszystkie wymagane przybory do wnętrza okapu do hodowli komórkowych. Za pomocą sterylnych kleszczy umieść rusztowania na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej, przydzielając jedno rusztowanie na studzienkę. (Czas trwania: 10 min)
    2. Zanurz rusztowania w pożywce do hodowli komórkowych, aby je zrównoważyć przed wysiewem komórek. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. (10 min)
    3. Odessać nadmiar pożywki z rusztowań.
    4. Zastosować 100 μl zawiesiny komórek/rusztowania. (Czas trwania: 10 min)
    5. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C O/N, aby umożliwić przyłączenie komórek do rusztowania.
    6. Następnego ranka odessać nieprzyłączone komórki i zastosować 200 μl/studzienkę świeżej pożywki hodowlanej. (Czas trwania: 10 min)
  2. Rusztowanie zatopione matrycą kolagenową. (2 godz.)
    1. Umieść 10x PBS, wodę, 1 N NaOH i kolagen z ogona szczura I na lodzie. Przygotuj roztwór roboczy kolagenu zgodnie z instrukcjami producenta. Trzymaj na lodzie, aż konstrukty z nasion komórek będą gotowe (do 1 godziny).
    2. Usunąć z inkubatora jedwabne konstrukty nasienne komórkami i odessać nadmiar pożywki.
    3. Za pomocą sterylnych kleszczy przenieś rusztowania do pustych studzienek na płytce studzienki i zanurz każde rusztowanie w 100 μl roztworu kolagenu o stężeniu 3 mg/ml. Umieść płytkę do hodowli tkankowej z powrotem w inkubatorze na 30 minut, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.
    4. Zastosować 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża do hodowli komórkowych. Hoduj konstrukty przez tydzień, zmieniając pożywkę każdego dnia, wymieniając tylko połowę objętości pożywki.

4. Analiza mikroskopowa

  1. Barwienie żywe/martwe (1 godz.)
    1. Przygotować roztwór podstawowy jodku propydyny (PI) 1 mg/ml (1,5 mM) w wodzie destylowanej.
    2. Przygotować roztwór podstawowy dioctanu fluoresceiny (FDA) 2 mg/ml w acetonie.
    3. Przygotować roztwór roboczy zawierający 10 μM PI i 0,15 μM FDA rozcieńczony w PBS. Podgrzej roztwór do temperatury 37 °C w łaźni wodnej.
    4. Umyj komórki wstępnie podgrzanym PBS, aby usunąć esterazy surowicy. Zassać PBS.
    5. Nałóż wstępnie podgrzany roztwór roboczy na komórki na 2 minuty i przemyj go PBS.
    6. Użyj mikroskopu epifluorescencyjnego do zobrazowania komórek (PI ex λ=490 nm, em λ=570 nm; FDA ex λ=490 nm, em λ=514 nm). Plama utrzymuje się stabilnie przez 40 minut. Długotrwałe barwienie może powodować niespecyficzne barwienie wynikające z wychwytu PI przez komórki i kolokalizacji PI/FDA w komórkach.
  2. Barwienie immunologiczne
    1. W pożądanym punkcie czasowym hodowli utrwalić komórki za pomocą 4% paraformaldehydu (PFA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ze względu na toksyczność oparów PFA, etap utrwalania należy wykonać w dygestoriach chemicznych.
    2. Myj rusztowania za pomocą 3x PBS. Punkt zatrzymania: Konstrukcje utrwalone PFA mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C przez kilka dni przed przystąpieniem do dalszych kroków.
    3. Inkubować rusztowania w 0,2% Tritonie, 0,25% albuminie surowicy bydlęcej (BSA) w PBS zawierającej pierwszorzędowe przeciwciało O/N w temperaturze 4 °C.
    4. Następnego dnia wyrzucić roztwór barwiący i przemyć rusztowania 3 x 30 minut PBS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała pierwszorzędowego.
    5. Próbki inkubować z przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w 0,2% Tritonie, 0,25% BSA w PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć roztwór barwiący i umyć rusztowania 3 x 30 minut PBS w celu usunięcia niezwiązanego przeciwciała drugorzędowego.
    7. Zobrazuj rusztowania za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 20X, pobierając 100 μm przekrojów z próbki w odstępie 1 μm. Aby zobrazować cienkie neuryty, rozdzielczość obrazu powinna wynosić co najmniej 1,024 x 1,024 pikseli.
  3. Izolacja RNA, DNA i białek
    Uwaga: Izolacja RNA, DNA i białka odbywa się przy użyciu komercyjnego zestawu AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Za pomocą sterylnych kleszczyków przenieś rusztowania z płytki hodowlanej do sterylnej probówki o pojemności 2 ml. Umieść jedno rusztowanie na rurę.
    2. Dodać 200 μl buforu RLT do każdej probówki.
    3. Zarąb konstrukcję, rozdrabniając ją sterylnymi mikronożyczkami.
    4. Aby homogenizować rozerwaną tkankę, przenieś zawartość probówki do kolumny wirowej. Wirować przez 2 minuty z pełną prędkością w mikrowirówce. Lizat jest homogenizowany, gdy przechodzi przez kolumnę wirową.
    5. Zbierz przepływ i natychmiast użyj go do wyizolowania RNA, DNA i białka zgodnie z protokołem producenta.
    6. Określ ilościowo wydajność kwasów nukleinowych dowolną inną kompatybilną metodą (np. NanoDrop).
    7. Określ ilościowo wydajność białka za pomocą testu białka BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierz wynik testu za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali 562 nm.
      Uwaga: Oczekiwana wydajność kwasów nukleinowych i białka na konstrukt w stosunku do gęstości komórek pokazano na rysunku 4.

Wyniki

Lite gąbki jedwabne, docięte do kształtu pierścienia, stanowią unikalny i prosty sposób na uzyskanie przedzielonej architektury przypominającej tkankę nerwową (Ryc. 2A). Wysoce porowata struktura rusztowania o wielkości porów około 500 µm zapewnia wyjątkowo dużą powierzchnię właściwą, co umożliwia zasiew i wzrost wysokiej gęstości komórek w małej objętości (2x107/ml) (Ryc. 2B). Ponadto wysoka porowatość rusztowania pozwala na nieograniczoną dyfuzję składników odżywczych i produktów przemiany materii, co skutkuje lepszą żywotnością gęstych kultur komórkowych w dłuższych przedziałach czasowych. Po zasiewaniu neurony szybko i równomiernie przywierają do powierzchni porów rusztowania.

Po zakończeniu przylegania komórek i ich ekwilibracji na podłożu jedwabnym, rusztowanie gąbczaste wypełnia się miękką macierzą kolagenową, aby zapewnić środowisko 3D do tworzenia sieci aksonalnej (Rycina 3). W przypadku braku macierzy kolagenowej kompartymentacja aksonów i ciał komórkowych nie jest możliwa, ponieważ neurony tworzą wypustki jedynie na powierzchni porów, co prowadzi do powstania sieci mieszanych, podobnych do tych występujących na powierzchniach 2D (Rycina 3B). W przeciwieństwie do tego, żel kolagenowy tworzy siatkę wspierającą rozległy wzrost aksonów w 3D, podczas gdy ciała komórek neuronalnych pozostają przytwierdzone do jedwabnego rusztowania (Rycina 3C). Taki wzorzec wzrostu prowadzi do kompartymentacji ciał komórkowych i powstania czystych sieci aksonalnych (Rycina 3D), co przypomina strukturę istoty szarej i białej kory mózgowej.

Poza mikroskopią, konstrukty można oceniać za pomocą szeregu innych metod18, w zależności od pytania badawczego postawionego w eksperymencie. Na przykład izolację DNA, RNA i białek z konstruktów można łatwo przeprowadzić przy użyciu komercyjnych zestawów (Rysunek 4). Wydajność kwasów nukleinowych i białek z jednego konstruktu zależy od liczby komórek początkowo zasianych na rusztowaniach jedwabnych. Im więcej zasianych komórek, tym wyższa wydajność DNA, RNA i białek.

Schemat wymiarów ceramicznejy miseczki: średnica 10 cm, wysokość 2 cm, układ badania materiału.
Rycina 1. Forma z PTFE użyta do przygotowania rusztowania z gąbki jedwabnej. Wymiary: średnica 10 cm, wysokość 2 cm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia struktury rusztowania polimerowego, obraz w skali szarości i fluorescencyjny; widoczne szczegóły powiększenia.
Rycina 2. Model tkanki przypominającej mózg 3D. (A) Porowate rusztowanie z gąbki jedwabnej. (B) Barwienie żywe/martwe neuronów w 1. dniu po wysianiu na rusztowaniu jedwabnym przed zatopieniem w kolagenie (kolor zielony – komórki żywe, kolor czerwony – komórki martwe). Panele po prawej stronie przedstawiają powiększenie obszarów ujętych w czerwone ramki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia: Struktura hydrożelu i sieć włóknista, fluorescencja, analiza integracji komórkowej.
Rysunek 3. Kompartymentowany wzrost neuronów w 3D modelu tkanki przypominającej mózg. (A) Kompartymenty rusztowania: czerwony – kompartyment ciał komórkowych, niebieski – kompartyment aksonalny. (B) Wzorzec wzrostu neuronów w 1. dniu po wysiewie, przed zatopieniem w kolagenie. (C). Wzrost neuronów w 7. dniu po wysiewie w kompartymencie ciał komórkowych. (D) Wzrost neuronów w 7. dniu po wysiewie w kompartymencie aksonalnym. Zielony — βIIITubulin. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy ilościowe kwasów nukleinowych i białek; RNA, DNA w stosunku do gęstości komórek na rusztowaniach, n=5.
Rysunek 4. Przewidywana wydajność (A) RNA i DNA oraz (B) białka na konstrukt w zależności od liczby komórek zasianych na rusztowanie (±SD, n=5). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy wytyczne dotyczące montażu podzielonego na przedziały modelu tkanki 3D przypominającego mózg. Model charakteryzuje się gęstą spolaryzowaną kulturą neuronów, w wyniku której powstają dwa morfologicznie różne przedziały: jeden zawierający gęsto upakowane ciała komórkowe, drugi zawierający czyste sieci aksonalne. Ogólnie rzecz biorąc, architektura rusztowania i wzorzec wzrostu naśladują tkankę korową mózgu, w tym sześć warstw laminarnych i szlaki istoty białej21.

Model tkanki jedwabnej na bazie białka w kształcie pączka pozwala na modyfikację i dostrajanie właściwości mechanicznych, wszechstronnych form strukturalnych, wypełniaczy hydrożelowych i składników komórkowych. W ten sposób ten model tkankowy stanowi platformę bazową dla szerokiego zakresu badań. Jedwab jest korzystnym kandydatem na platformy biomateriałowe ze względu na jego biokompatybilność, przetwarzanie na bazie wody oraz solidne właściwości mechaniczne i degradacyjne22. Jedwabna matryca służy również jako stabilna kotwica zmniejszająca skurcz żelu kolagenowego w czasie w hodowli. Właściwości takie jak koncentracja jedwabiu i porowatość rusztowania użyte w tym modelu zostały wcześniej dostosowane w celu osiągnięcia optymalnego wzrostu komórek i właściwości mechanicznych, co skutkuje elastycznością tkanek przypominającą mózg18,23,24. Sugerujemy utrzymanie tych parametrów na stałym poziomie, aby zapewnić pomyślny wynik i powtarzalność eksperymentów.

Utworzenie sieci neuronalnej 3D osiągnięto poprzez połączenie dwóch rodzajów biomateriałów o różnych właściwościach mechanicznych: sztywnego rusztowania zapewniającego zakotwiczenie neuronów i bardziej miękkiej matrycy żelowej, która umożliwia penetrację aksonów i łączność w 3D. Selektywne preferencje materiałowe rusztowania jedwabnego i miękkiego hydrożelu stanowią podstawową zasadę oddzielania neuronów od połączeń aksonalnych. Ze względu na obojętny charakter jedwabnego rusztowania, do przyczepienia neuronów wymagana jest funkcjonalizacja poli-D-lizyną. Można jednak zastosować inne czynniki sprzyjające adhezji komórek, takie jak RGD25 lub fibronektyna26. Aby osiągnąć tworzenie sieci 3D, rusztowanie jedwabne musi zostać wypełnione hydrożelem w odpowiednim czasie, gdy tylko neurony zostaną przymocowane do rusztowania. Podobnie, wypełniacz macierzy kolagenowej może zostać zastąpiony innymi hydrożelami, co pozwala na badanie wpływu środowisk zewnątrzkomórkowych 3D na tworzenie sieci aksonalnej, aby służyć jako platforma do oceny nowych hydrożeli pod względem kompatybilności neuronalnej. Dodatkowo, oprócz neuronów korowych szczurów, można wykorzystać inne źródła neuronów, takie jak neurony hipokampa lub neurony pochodzące z indukowanych komórek pluripotencjalnych (iPSc). Co więcej, model tkankowy może być wykorzystany do badania interakcji heterokomórkowych poprzez włączenie komórek glejowych wraz z neuronami oraz do budowy bardziej złożonej tkanki przypominającej mózg.

Jak pokazano wcześniej, nasz model może być wykorzystany do oceny funkcjonalności neuronów w mikrośrodowisku 3D za pomocą różnych testów, takich jak żywotność komórek, ekspresja genów, LC-MS / MS i elektrofizjologia, wykazując w ten sposób fizjologiczne znaczenie modelu18. Inne metody, które są często wykorzystywane do oceny konstruktów 3D inżynierii tkankowej, takie jak barwienie immunologiczne i mikroskopia8,9,11 , mogą być również stosowane do oceny rozmieszczenia komórek i zakresu tworzenia sieci aksonalnej. Należy jednak zauważyć, że ze względu na dużą gęstość matrycy kolagenowej, penetracja przeciwciał i głębokość obrazowania jest ograniczona do kilkuset mikrometrów. Co więcej, na stosunek sygnału do szumu może mieć wpływ niespecyficzna fluorescencja tła. Można to przezwyciężyć poprzez zastosowanie lipofilowych znaczników komórkowych i genetycznie wyrażanych białek fluorescencyjnych, które zmniejszają potrzebę barwienia immunologicznego11. Alternatywnie, obrazowanie można wykonać za pomocą mikroskopii 2-fotonowej zamiast zwykłej techniki jednofotonowej, co może zmniejszyć utratę sygnału, fotowybielanie i może zostać rozszerzone do kilkuset mikrometrów głębokości.

Podsumowując, tkanka przypominająca mózg na bazie jedwabiu i kolagenu stanowi solidną platformę do badania sieci neuronalnych w 3D i stanowi punkt wyjścia do opracowania bardziej zaawansowanych modeli zaburzeń neurologicznych w przyszłości. Niezależnie od trybu oceny, względna prostota tego modelu tkanki wspiera jego użyteczność, sukces i odtwarzalność.

Oświadczenia

Publikacja tego artykułu wideo jest sponsorowana przez Corning.

Podziękowania

Dziękujemy laboratorium dr Stephena Mossa za dostarczenie embrionalnych tkanek mózgu szczura. M.D.T. zaprojektował oryginalny protokół. Praca ta została sfinansowana przez National Institutes of Health P41 Tissue Engineering Resource Center Grant EB002520. K.C. otrzymał stypendium podoktorskie od Niemieckiej Fundacji Badawczej (DFG) (CH 1400/2-1).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Na2CO3Sigma-Aldrich223530
LiBrSigma-Aldrich213225
MWCO 3500 kasety dializacyjne Thermo Fisher66110
Płyta grzewczaFisher ScientificWirówka izotempowa
5804 RSito Eppendorf
Fisher Scientific Nr270, nr 35, nr 30
Formawykonana we własnym zakresie (Rysunek 1) Średnica 10 cm, wysokość 2 cm
NaClSigma-Aldrich71382
Poncz do biopsji 5  mmŚwiatowy instrument precyzyjny501909
Dziurkacz do biopsji 2  mmWorld Precision Instrument501908
poli-D-lizynaSigma-AldrichP6407-5MGstężenie końcowe 10  μ g / ml, rozpuszczone w wodzie
PBSSigma-AldrichD1283-500ML
TrypsynaSigma-AldrichT4049-500ML
DNaseRoche10104159001stężenie końcowe 0,3%
Białko sojoweSigma-AldrichT6522-100MGstężenie końcowe 1  mg/ml
Pożywka neuropodstawowaGibco21103049rozgrzej do 37  ° C przed użyciem
B27 suplement 50xGibco17504-044
GlutamaxGibco35050-061
Penicilin StreptomycynaCorning30-002-CI
Kolagen I, ogon szczura, 100  mgCorning354236stężenie końcowe 3  mg / ml
NaOHSigma-AldrichS2770
jodek propidynySigma-AldrichP4170-10MGtoksyczny
dioctan fluoresceinySigma-AldrichF7378-5G
Olympus MVX10Olympus
ParaformaldehydSigma-AldrichP6148toksyczny, stężenie końcowe 4%
Bydlęcy Albumina surowicySigma-AldrichA7906-10G
anty-β IIITubulina przeciwciało Sigma-AldrichT2200królik 1:500
Sondy molekularneAlexa-546A11010kozia surowica 1:250
Sigma-AldrichG9023-5ML
Mikroskop konfokalny Leica SP2Leica20X
QIAshredderQiagen79654
AllPrep DNA/RNA/białko Mini zestawQiagen80004
Alkohol etylowy, czystySigma-AldrichE7023 
2-merkaptoetanolSigma-Aldrich63689
NanoDrop 2000c/2000 Spektrofotometr UV-VisTest
23225
Czytnik płytek Spectramax M2UrządzeniaAbsorbancja 562 nm
Mikronożyczki, ekonomiczne, Vannas-typeTedPella1346
PTFE anty-królik Obiektyw białkowy BCA Thermo Scientific molekularne

Bibliografia

  1. Dua, T., Janca, A., Kale, R., Montero, F., Muscetta, A., Peden, M. Chapter 1, Public health principles and neurological disorders. Neurological Disorders. , World Health Organization. Geneva. (2005).
  2. Ohtsuki, S., Hirayama, M., Ito, S., Uchida, Y., Tachikawa, M., Teresaki, T. Quantitative targeted proteomics for understanding the blood-brain barrier: towards pharmacoproteomics. Expert. Rev. Proteomic. 11 (3), 303-313 (2014).
  3. Hyder, F., Rothman, D. L., Bennett, M. R. Cortical energy demands of signaling and nonsignaling components in brain are conserved across mammalian species and activity levels. Proc Natl Acad Sci USA. 110 (9), 3549-3554 (2013).
  4. Wesseling, H., et al. A combined metabonomic and proteomic approach identifies frontal cortex changes in a chronic phencyclidine rat model in relation to human schizophrenia brain pathology. Neuropsychopharmacology. 38 (12), 2532-2544 (2013).
  5. Fawcett, J. W., Housden, E., Smith-Thomas, L., Meyer, R. L. The growth of axons in three-dimensional astrocyte cultures. Dev Biol. 135 (2), 449-458 (1989).
  6. Cullen, D. K., Simon, C. M., LaPlaca, M. C. Strain rate-dependent induction of reactive astrogliosis and cell death in three-dimensional neuronal-astrocytic co-cultures. Brain Res. 1158, 103-115 (2007).
  7. East, E., de Oliveira, D. B., Golding, J. P., Phillips, J. B. Alignment of astrocytes increases neuronal growth in three-dimensional collagen gels and is maintained following plastic compression to form a spinal cord repair conduit. Tissue Eng. Part A. 16 (10), 3173-3184 (2010).
  8. Dubois-Dauphin, M. L., Toni, N., Julien, S. D., Charvet, I., Sundstrom, L. E., Stoppini, L. The long-term survival of in vitro engineered nervous tissue derived from the specific neural differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (27), 7032-7042 (2010).
  9. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  10. Hogberg, H. T., et al. Toward a 3D model of human brain development for studying gene/environment interactions. Stem Cell Res Ther. 4, Suppl 1. S4(2013).
  11. Kato-Negishi, M., Morimoto, Y., Onoe, H., Takeuchi, S. Millimeter-sized neural building blocks for 3D heterogeneous neural network assembly. Adv Healthc Mater. 2 (12), 1564-1570 (2013).
  12. Watanabe, K., Nakamura, M., Okano, H., Toyama, Y. Establishment of three-dimensional culture of neural stem/progenitor cells in collagen type-1 gel. Restor Neurol Neurosci. 25 (2), 109-117 (2007).
  13. Aurand, E. R., Wagner, J. L., Shandas, R., Bjugstad, K. B. Hydrogel formulation determines cell fate of fetal and adult neural progenitor cells. Stem Cell Res. 12 (1), 11-23 (2014).
  14. Gurkan, U. A., et al. et al..Simple precision creation of digitally specified, spatially heterogeneous, engineered tissue architectures. Adv Mater. 25 (8), 1192-1198 (2013).
  15. Mironov, V., Boland, T., Trusk, T., Forgacs, G., Markwald, R. R. Organ printing: computer-aided jet-based 3D tissue engineering. Trends Biotechnol. 21 (4), 157-161 (2003).
  16. Taylor, A. M., Blurton-Jones, M., Rhee, S. W., Cribbs, D. H., Cotman, C. W., Jeon, N. L. A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport. Nature. 2 (8), 599-605 (2005).
  17. Tang-Schomer, M. D., Davies, P., Graziano, D., Thurber, A. E., Kaplan, D. L. Neural circuits with long-distance axon tracts for determining functional connectivity. J Neurosci Methods. 222, 82-90 (2014).
  18. Tang-Schomer, M. D., et al. Bioengineered functional brain-like cortical tissue. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (38), 13811-13816 (2014).
  19. Rockwood, D. N., Preda, R. C., Yücel, T., Wang, X., Lovett, M. L., Kaplan, D. L. Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin. Nat Protoc. 6, 1612-1631 (2011).
  20. Lawrence, B. D., Pan, Z., Weber, M. D., Kaplan, D. L., Rosenblatt, M. I. Silk film culture system for in vitro analysis and biomaterial design. J. Vis. Exp. (62), e3646(2012).
  21. Maddah, M., Grimson, W. E., Warfield, S. K., Wells, W. M. A unified framework for clustering and quantitative analysis of white matter fiber tracts. Med Image Anal. 12 (2), 191-202 (2008).
  22. Vepari, C., Kaplan, D. L. Silk as a biomaterial. Prog Polym Sci. 32 (8-9), 8-9 (2007).
  23. Yao, D., et al. Salt-leached silk scaffolds with tunable mechanical properties. Biomacromolecules. 13 (11), 3723-3729 (2012).
  24. Kim, U. J., Park, J., Kim, H. J., Wada, M., Kaplan, D. L. Three-dimensional aqueous-derived biomaterial scaffolds from silk fibroin. Biomaterials. 26 (15), 2775-2785 (2005).
  25. Gil, E. S., Mandal, B. B., Park, S. H., Marchant, J. K., Omentetto, F. G., Kaplan, D. L. Helicoidal multi-lamellar features of RGD-functionalized silk biomaterials for corneal tissue engineering. Biomaterials. 31 (34), 8953-8963 (2010).
  26. Hopkins, A. M., et al. Silk hydrogels as soft substrates for neural tissue engineering. Adv Funct Mater. 23 (41), 5140-5149 (2013).
  27. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: A quick protocol. Vis. Exp. (63), e3965(2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

tr jwymiarowa tkanka przypominaj ca m zgrusztowanie jedwabno kolagenowehodowla kom rek neuronalnychmikroskopia konfokalnabarwienie immunofluorescencyjneneurony korowe szczurawzrost aksonalnylokalizacja cia kom rkowychin ynieria tkankowatworzenie sieci neuronalnych
Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.