Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych

7.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52971

⸱

26 czerwca 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy metodę mikroprzepływowego osadzania wzorzystej genipiny i fibronektyny na podłożach PDMS, pozwalając na przedłużoną żywotność tkanek gęstych od komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych. Ta metoda wytwarzania tkanek jest połączona z poprzednią technologią cienkich warstw naczyń mięśniowych w celu pomiaru kurczliwości naczyń w czasie istotnym dla choroby.

Streszczenie

Przewlekła natura postępu choroby naczyniowej wymaga opracowania technik eksperymentalnych, które symulują fizjologiczne i patologiczne zachowania naczyń krwionośnych w skalach czasowych istotnych dla choroby. Wcześniej druk mikrokontaktowy był używany do wytwarzania dwuwymiarowych funkcjonalnych mimik tętnic poprzez tworzenie wzorów białka macierzy zewnątrzkomórkowej jako wskazówek dotyczących organizacji tkanek. Cienkie filmy mięśni naczyniowych wykorzystywały te mimiki do oceny funkcjonalnej kurczliwości. Jednak stosowana technika wytwarzania druku mikrokontaktowego zazwyczaj obejmuje hydrofobowe podłoża PDMS. Gdy tkanka przewraca się przez leżącą poniżej macierz zewnątrzkomórkową, nowe białka muszą przejść zmianę konformacyjną lub denaturację, aby wystawić hydrofobowe reszty aminokwasowe na hydrofobowe powierzchnie PDMS w celu przyłączenia, co powoduje zmienioną bioaktywność białka macierzy, delaminację i śmierć tkanek.

Tutaj prezentujemy technikę osadzania mikroprzepływowego do tworzenia wzorów genipiny związku sieciującego. Genipin służy jako pośrednik między tkankami wzorzystymi a substratami PDMS, umożliwiając komórkom zdeponowanie nowo zsyntetyzowanego białka macierzy zewnątrzkomórkowej na bardziej hydrofilowej powierzchni i pozostanie przyłączonym do substratów PDMS. Pokazujemy również, że białka macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane bezpośrednio na zdeponowanej genipinie, co pozwala na dyktowanie zmodyfikowanej struktury tkanki. Tkanki wytworzone tą techniką wykazują wysoką wierność zarówno w wyrównaniu strukturalnym, jak i funkcji skurczowej tkanki mięśni gładkich naczyń krwionośnych w modelu cienkowarstwowym mięśni naczyniowych. Technika ta może zostać rozszerzona o inne typy komórek i stanowi ramy dla przyszłych badań nad przewlekłą funkcjonalnością na poziomie tkanek i narządów.

Wprowadzenie

Choroby naczyniowe, takie jak skurcz naczyń mózgowych1,2, nadciśnienie3 i miażdżyca4, rozwijają się powoli, są zazwyczaj przewlekłe i wiążą się z dysfunkcyjnym wytwarzaniem siły przez komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC). Naszym celem jest zbadanie tych wolno postępujących dysfunkcji naczyniowych przy użyciu metod in vitro z dokładniejszą kontrolą warunków eksperymentalnych niż modele in vivo. Wcześniej opracowaliśmy cienkie warstwy mięśni naczyniowych (vMTF) do pomiaru funkcjonalnej kurczliwości tkanek sercowo-naczyniowych zmodyfikowanych in vitro 5, ale ta metoda została ograniczona do stosunkowo krótkoterminowych badań. W tym miejscu przedstawiamy technikę modyfikacji podłoża, która rozszerza naszą dotychczasową technikę vMTF do pomiarów długoterminowych.

Chociaż śródbłonek jest również krytyczny dla ogólnej funkcji naczyń krwionośnych, zmodyfikowane blaszki tętnicze dostarczają użytecznego systemu modelowego do oceny zmian w kurczliwości naczyń podczas postępu choroby. Aby zaprojektować funkcjonalny model tkanki choroby naczyniowej, zarówno struktura, jak i funkcja blaszki tętniczej, podstawowej jednostki kurczliwej naczynia, muszą zostać odtworzone z dużą dokładnością. Blaszki tętnicze to koncentryczne, wyrównane obwodowo arkusze kurczliwych VSMC oddzielone arkuszami elastyny6. Mikrokontaktowe drukowanie białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) na podłożach polidimetylosiloksanu (PDMS) było wcześniej wykorzystywane do dostarczania wskazówek dotyczących organizacji tkanek w celu naśladowania wyrównanej tkanki sercowo-naczyniowej5,7-10. Jednak tkanki wzorzyste za pomocą druku mikrokontaktowego mogą stracić integralność po 3-4 dniach w hodowli, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach przewlekłych. Protokół ten zapewnia rozwiązanie tego problemu poprzez zastąpienie poprzednich technik druku mikrokontaktowego nową techniką osadzania mikroprzepływowego.

Genchi et al. zmodyfikowali substraty PDMS za pomocą genipiny i stwierdzili przedłużoną żywotność miocytów do jednego miesiąca w hodowli11. Tutaj stosujemy podobne podejście do rozszerzenia hodowli wzorzystych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych na PDMS. Genipina, naturalna hydrolityczna pochodna owocu gardenii, jest pożądanym kandydatem do modyfikacji substratu ze względu na jej stosunkowo niską toksyczność w porównaniu z podobnymi środkami sieciującymi i jej rosnące zastosowanie jako biomateriał w dziedzinie naprawy tkanek12,13 i modyfikacji ECM14,15. W tym protokole fibronektyna jest wykorzystywana jako wskazówka naprowadzająca na komórkę, podobnie jak w poprzednich metodach drukowania mikrokontaktowego; jednak genipin jest osadzany na substratach PDMS przed modelowaniem fibronektyny. W ten sposób, gdy komórki degradują wzorzystą matrycę, nowo zsyntetyzowany ECM z przyłączonych VSMC może wiązać się z substratem PDMS pokrytym genipiną.

Ten protokół wykorzystuje urządzenie do mikroprzepływowego dostarczania do dwuetapowego osadzania genipiny i ECM. Konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego naśladuje wzorce drukowania mikrokontaktowego stosowane w projektowanych blaszkach tętniczych we wcześniejszych badaniach16. W związku z tym spodziewamy się, że ten protokół da naśladownictwo blaszek tętniczych, które z powodzeniem rekapitulują wysoce wyrównaną strukturę in vivo i funkcję skurczową blaszek tętniczych. Oceniamy również kurczliwość tkanek, aby potwierdzić, że genipin jest odpowiednim związkiem modyfikującym substrat dla długoterminowych modeli chorób naczyniowych in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Uwaga: Celem niniejszego protokołu jest stworzenie i wykorzystanie naczyniowej cienkiej błony mięśniowej (vMTF) o strukturze przedstawionej na Rysunku 1 w celu oceny kurczliwości podczas przedłużonej hodowli komórek mięśni gładkich naczyń (VSMCs) na podłożach PDMS. Aby przedłużyć żywotność VSMC, stosujemy związek sieciujący genipinę. Podłoża dla tych vMTF zostały zaprojektowane do analizy kurczliwości tkanek zgodnie z metodą opracowaną przez Grosberga et al.8 Można również stosować inne metody vMTF5, wprowadzając niewielkie zmiany w przedstawionym protokole wytwarzania podłoża.

1. Wytwarzanie podłoża

  1. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych
    1. Umieść szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm w statywie do barwienia szkiełek. Umieść statyw w dużym zlewce lub pojemniku (np., pustym pojemniku na końcówki do pipet 100 - 1,000 µl).
    2. Dolej do pojemnika 70% etanol, aby całkowicie zanurzyć szkiełka. Poddaj je sonikacji przez co najmniej 30 min.
    3. Wyjmij statyw ze szkiełkami z roztworu etanolu. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu, wieszając statyw w sterylnej komorze do hodowli (aby zapobiec osadzaniu się cząsteczek na szkiełkach) na 1- 2 h.
      Uwaga: Szkiełka muszą być całkowicie suche przed przystąpieniem do kolejnych kroków.
  2. Izolacja paska poli(N-izopropyloakrylamidu) (PIPAAm) na szkiełku nakrywkowym
    1. Za pomocą taśmy klejącej zaklej boki oczyszczonego szkiełka nakrywkowego, pozostawiając odsłonięty pasek w centrum szkiełka (Rysunek 1A). Dostosuj szerokość tego odsłoniętego paska w zależności od zastosowania i/lub projektu mikrofluidycznego.
    2. Zaznacz krawędzie pasków taśmy na szkiełku nakrywkowym za pomocą markera laboratoryjnego w celu późniejszego odniesienia (Rysunek 1A).
    3. Wytnij wzdłuż obwodu szkiełka nakrywkowego, aby oddzielić je od podłoża (Rysunek 1A, czerwona przerywana linia).
  3. Powlekanie poli(N-izopropyloakrylamidem) (PIPAAm)
    1. Za pomocą wagi analitycznej odważ 1 g proszku PIPAAm. Nie należy używać niepolimeryzowanego N-izopropyloakrylamidu, który jest substancją rakotwórczą.
    2. Przenieś PIPAAm do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. W dygestorium dodaj 10 ml 1-butanolu, aby otrzymać 10% roztwór w/v. OSTROŻNIE: Temperatura zapłonu 1-butanolu wynosi 37 oC. Powstały roztwór przechowuj w szafce na substancje łatwopalne i unikaj podgrzewania.
    3. Pozostaw PIPAAm do rozpuszczenia na 10 min. Jeśli proszek jest nadal widoczny, mieszaj roztwór za pomocą miksera Vortex aż do całkowitego rozpuszczenia proszku.
      Uwaga: Kolejne kroki wymagają użycia powlekarki rotacyjnej (spin coater). Dla każdego szkiełka nakrywkowego:
    4. Za pomocą pęsety umieść zaklejone szkiełko nakrywkowe na uchwycie powlekarki rotacyjnej.
    5. Nanieś 150 µl roztworu PIPAAm na szkiełko nakrywkowe, nakładając krople wzdłuż odsłoniętego szkła w centrum szkiełka. Zapewnij całkowite pokrycie odsłoniętego obszaru.
    6. Wykonaj powlekanie rotacyjne PIPAAm zgodnie z następującymi parametrami:
      1. Wznoszenie przez 10 s do 3,000 rpm. Przerwa przez 5 s.
      2. Wznoszenie przez 10 s do 6,000 rpm. Przerwa przez 60 s.
      3. Wznoszenie przez 10 s do 3,000 rpm. Przerwa przez 5 s.
    7. Umieść szkiełko nakrywkowe w przykrytej szalce Petriego warstwą PIPAAm skierowaną do góry. Pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 15 min.
    8. Ostrożnie usuń taśmę klejącą ze wszystkich szkiełek nakrywkowych, pozostawiając całe szkiełko odsłonięte z cienką warstwą powłoki PIPAAm w środkowym pasku.
  4. Powlekanie PDMS
    1. Wymieszaj i odgazuj 15 g PDMS w stosunku bazy do sieciującego 10:1. Przed mieszaniem dodaj 7 - 8 kropli sonikowanych fluorescencyjnych mikrokulek o rozmiarze 0.2 µm. Przykryj naczynie z PDMS folią aluminiową, gdy nie jest używane, aby zapobiec zanieczyszczeniu PDMS kurzem i innymi cząsteczkami.
      Uwaga: Kolejne kroki wymagają użycia powlekarki rotacyjnej. Dla każdego szkiełka nakrywkowego:
    2. Za pomocą pęsety umieść szkiełko nakrywkowe powleczone PIPAAm na uchwycie powlekarki rotacyjnej.
    3. Nanieś PDMS na szkiełko nakrywkowe, pokrywając co najmniej jedną trzecią powierzchni szkiełka.
    4. Wykonaj powlekanie rotacyjne zgodnie z następującymi parametrami:
      1. Wznoszenie przez 5 s do 500 rpm. Przerwa 5 s.
      2. Wznoszenie przez 5 s do 1,000 rpm. Przerwa 5 s.
      3. Wznoszenie przez 10 s do 3,000 rpm. Przerwa 10 s.
      4. Wznoszenie przez 10 s do 4,000 rpm. Przerwa 60 s.
      5. Wznoszenie przez 10 s do 2,000 rpm. Przerwa 15 s.
      6. Wznoszenie przez 10 s do 1,000 rpm. Przerwa 10 s.
      7. Wznoszenie przez 5 s do 500 rpm. Przerwa 5 s.
    5. Umieść szkiełko nakrywkowe w przykrytej szalce Petriego warstwą PDMS skierowaną do góry. Zanotuj czas powlekania rotacyjnego szkiełka. Śledź czas przypisany do każdego szkiełka w trakcie całego eksperymentu, aby później wyznaczyć grubość podłoża PDMS.
    6. Umieść szalkę Petriego zawierającą szkiełka w piekarniku w temperaturze 90 °C na co najmniej 1.5 h, aby zapewnić prawidłowe utwardzenie PDMS. Jeśli piekarnik jest niedostępny, pozostaw szkiełka do utwardzenia przez co najmniej 48 h w temperaturze pokojowej (RT).
    7. Wyjmij szkiełka z piekarnika i przechowuj je w ciemnej szufladzie do momentu użycia.
    8. Odłóż co czwarte szkiełko do późniejszego pomiaru grubości podłoża za pomocą profilometru jako funkcji czasu powlekania rotacyjnego.

2. Wzorcowanie mikrofluidalne w inżynierii tkankowej

  1. Wytwarzanie urządzeń mikrofluidycznych
    1. Projektowanie fotomaski mikrofluidycznej do tkanek
      1. Użyj odpowiedniego programu do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) w celu zaprojektowania wzorów mikrofluidycznych. W przypadku blaszek tętniczych składających się z ludzkich komórek mięśni gładkich naczyń tętnicy pępowinowej, zastosuj naprzemienny wzór kanałów o szerokości 10 µm i ścianek o grubości 10 µm.
      2. Jeśli to możliwe, zastosuj binarny rozgałęzianie kanałów17, choć dopuszczalne są inne projekty rozgałęzień. Zmniejszaj szerokość i długość kanałów przy każdej iteracji rozgałęziania, aż do uzyskania pożądanego odstępu wzoru tkankowego (ścianki i kanały, Rycina 1B).
      3. Zaprojektuj urządzenie tak, aby posiadało pojedynczy wlot do wprowadzania roztworu do obróbki powierzchni oraz pojedynczy wylot do aplikowania próżni.
      4. Wytwórz fotomaskę zawierającą projekt(y) mikrofluidyczne, zgodnie z wcześniejszym opisem18.
    2. Fotolitograficzne wytwarzanie wafli
      Uwaga: Fotolitografię należy przeprowadzać w odpowiednim pomieszczeniu czystym (cleanroom) lub podobnym obiekcie. Aby wykonać wafle krzemowe ze wzorami do miękkiej litografii urządzeń mikrofluidycznych do tkanek (wysokość kanału ~20 - 25 µm) przy użyciu fotolitografii:
      1. Oczyść wafel krzemowy w acetonie, metanolu i alkoholu izopropylowym przez 1 min w każdym z tych roztworów. Osusz wafel pistoletem azotowym.
      2. Wstępnie wypiecz wafel na płycie grzewczej przez 5 min w temperaturze 115 °C, aby usunąć nadmiar wilgoci.
      3. Nałóż na wafel fotorezyst SU-8 3025 metodą spin-coatingu, stosując poniższy protokół, aby uzyskać elementy o wysokości 20 - 25 µm:
        1. Przyspieszenie przez 5 s do 500 rpm. Utrzymanie przez 5 s.
        2. Przyspieszenie przez 15 s do 4 000 rpm. Utrzymanie przez 15 s.
      4. Wstępnie wypiecz wafel na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez 15 min.
      5. Załaduj fotomaskę i naświetl wafel przez 16 s, korzystając z programu kontaktu próżniowego na maskowniku stykowym.
      6. Wypiecz wafel na płycie grzewczej w temperaturze 95 °C przez 4 min.
      7. Wywołaj wafel przez 6 min w wywoływaczu. Następnie przemyj wafel dwukrotnie przez 2 s w świeżym wywoływaczu i opłucz wafel alkoholem izopropylowym.
      8. Przeprowadź silanizację wzorowanego wafla przez noc (O/N), umieszczając 2 - 3 krople tridecafluoro-trichlorosilanu w pustym naczyniu wewnątrz desykatora próżniowego. Podeprzyj wafel za pomocą szalek Petriego tak, aby odsłonięte były zarówno jego spód, jak i góra.
        OSTROŻNIE: Tridecafluoro-trichlorosilan jest cieczą łatwopalną i żrącą. Do jego stosowania niezbędne są odpowiednie środki ochrony osobistej oraz lokalny wyciąg.
    3. Wytwarzanie mikrofluidycznego urządzenia do tkanek
      1. Umieść silanizowany, wzorowany wafel stroną z elementami do góry w szalce Petriego.
      2. Wymieszaj i odgazuj 100 g PDMS w stosunku bazy do sieciującego 10:1. Wlej PDMS do naczynia, całkowicie i równomiernie pokrywając wafel.
      3. Umieść naczynie w desykatorze próżniowym, aż wszystkie pęcherzyki powietrza zostaną usunięte z nieutwardzonego PDMS, co zajmuje około 30 min. Utwardź PDMS w naczyniu w temperaturze 90 °C przez co najmniej 1,5 h. Czas i temperaturę można dostosować zgodnie z wytycznymi producenta, aby uzyskać pełne utwardzenie.
      4. Po utwardzeniu PDMS, wytnij nadmiar materiału wokół wafla za pomocą żyletki i ostrożnie wyjmij pokryty PDMS wafel z naczynia. Usuń nadmiar PDMS spod wafla i powoli oderwij PDMS od górnej powierzchni wafla.
      5. Umieść dysk PDMS stroną z elementami do góry w czystym naczyniu, a używany wafel przechowuj w ciemności.
      6. Odetnij nadmiar PDMS wokół wzorów za pomocą żyletki. Wytnij urządzenia w kształcie prostokątów (Rycina 1C), aby ułatwić ich oddzielanie od podłoży w późniejszych etapach. Precyzyjne cięcia nie są konieczne, o ile pozostanie wystarczająco dużo miejsca na wlot, wylot i obszar wzoru tkankowego (Rycina 1C).
      7. Wybij otwory wlotowe i wylotowe (Rycina 1C) za pomocą 1 mm chirurgicznego wycinaka do biopsji.
  2. Osadzanie w urządzeniu mikrofluidycznym
    Uwaga: W niniejszym protokole dostarczanie mikrofluidyczne jest wykorzystywane do osadzania wzorowanej genipiny, kluczowego czynnika sieciującego dla długoterminowych hodowli tkankowych, a także fibronektyny. Kroki poprzedzające sterylizację penicyliną/streptomycyną (2.2.3) nie muszą odbywać się w warunkach sterylnych, jednak zaleca się ograniczanie zanieczyszczeń i gromadzenia się kurzu w trakcie całego protokołu. Wszystkie kroki następujące po sterylizacji szkiełek podstawkowych penicyliną/streptomycyną (2.2.3) powinny być wykonywane z zachowaniem technik sterylnych. Uwaga: tę część protokołu należy rozpocząć na jeden dzień przed wysianiem komórek.
    1. Przygotowanie podłoża i urządzenia mikrofluidycznego
      1. Poddaj urządzenia mikrofluidyczne sonikacji w 70% etanolu przez co najmniej 30 min.
      2. Osusz sonikowane urządzenia mikrofluidyczne za pomocą sprężonego powietrza lub azotu i umieść je w szalce Petriego stroną z kanałami do góry, aby zapobiec niepotrzebnemu zużyciu elementów.
      3. Umieść do 10 szkiełek podstawkowych podłoża vMTF w czyszczarce UVO (pokrywa zdjęta, szkiełka w naczyniu, aby powierzchnia została funkcjonalizowana) na 8 min.
      4. Wyjmij szkiełka potraktowane UVO i układaj urządzenia mikrofluidyczne stroną z elementami do dołu na każdym szkiełku, jedno po drugim (orientacja powinna być podobna do tej na Rycynie 1C). Mocno dociśnij urządzenia, aby zapewnić szczelne przyleganie do pokrytych PDMS szkiełek.
    2. Osadzanie genipiny i fibronektyny
      1. Przygotuj roztwór genipiny o stężeniu 5 mg/ml, dodając 1 ml sterylnej ddH2O do pojemnika z 5 mg liofilizowanej genipiny. Wymieszaj roztwór za pomocą miksera vortex. Odstaw w temperaturze pokojowej (RT) na co najmniej 30 min.
        Uwaga: Proszek jest trudny do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej, dlatego często konieczne jest wielokrotne mieszanie przez co najmniej minutę.
      2. Szybko nanieś kroplę 70% etanolu na wlot każdego urządzenia w celu jego przygotowania (priming). Uwaga: etanol powinien wniknąć do wnętrza urządzeń.
      3. Po 5 - 10 min ostrożnie odessij nadmiar etanolu z wlotu, natychmiast zastępując go 1X solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS) w wlocie. Od tego momentu należy dopilnować, aby wlot nie wyschł całkowicie, by uniknąć wprowadzenia powietrza do urządzenia.
      4. Umieść końcówkę aspiratora próżniowego na wylocie każdego urządzenia. Przeciągnij 1X PBS przez urządzenia, aby wypłukać etanol. Pozostaw niewielką ilość 1X PBS we wlocie. Uwaga: jeśli wlot wydaje się prawie suchy, dodaj więcej 1X PBS.
      5. Odessij nadmiar 1X PBS tak, aby przed aplikacją roztworu genipiny we wlocie pozostała tylko niewielka ilość.
      6. Nanieś 60 μl roztworu genipiny 5 mg/ml do każdego wlotu (Rycina 1D). Przeciągnij roztwór genipiny przez urządzenia, umieszczając końcówkę aspiratora próżniowego na wylocie (Rycina 1D). Należy uważać, aby nie przeciągnąć całego roztworu, pozostawiając niewielką jego ilość we wlocie.
      7. Nanieś krople (o wielkości około monety) 1X PBS zarówno na wlot, jak i wylot, aby utrzymać zwilżenie podczas inkubacji. Przenieś naczynie z urządzeniami do nawilżanej cieplarki lub inkubatora (środowisko sterylne nie jest wymagane) ustawionego na 37 °C i inkubuj przez 4 h. Naczynie nie musi być przykryte.
      8. Podczas inkubacji resuspenduj fibronektynę do stężenia 50 μg/ml w sterylnej ddH2O na lodzie przez co najmniej 30 min przed aplikacją do urządzenia mikrofluidycznego.
      9. Po inkubacji z genipiną odessij cały pozostały 1X PBS z wylotów urządzeń. Kontynuuj stosowanie aspiratora próżniowego na każdym wylocie, wyciągając pozostały 1X PBS z wlotu.
      10. Nanieś 100 μl roztworu fibronektyny 50 μg/ml do każdego wlotu, dodając go do minimalnej ilości pozostałego 1X PBS we wlocie (Rycina 1D).
      11. Przeciągnij roztwór fibronektyny przez urządzenia za pomocą końcówki aspiratora próżniowego na wylocie (Rycina 1D). Należy uważać, aby nie przeciągnąć całego roztworu. Uwaga: kropla fibronektyny będzie wyglądać inaczej niż 1X PBS i genipina ze względu na różnice w napięciu powierzchniowym.
      12. Przenieś niezakryte naczynie z urządzeniami do cieplarki lub inkubatora ustawionego na 37 °C i inkubuj przez 24 h. Uwaga: etap z fibronektyną nie wymaga zwilżania wlotu i wylotu za pomocą 1X PBS. Pozostała pula fibronektyny we wlocie wyschnie. Jest to zjawisko oczekiwane.
    3. Sterylizacja i przygotowanie do wysiania komórek
      1. Przygotuj roztwór penicyliny/streptomycyny do sterylizacji wzorowanych szkiełek vMTF. Dodaj 5 ml penicyliny/streptomycyny (10 000 jednostek/ml; 10 000 μg/ml) do 500 ml sterylnego 1X PBS.
      2. Umieść naczynie z urządzeniami w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.
      3. Ostrożnie oddziel urządzenia od szkiełek, powoli odklejając urządzenie w jednym z rogów, jednocześnie lekko trzymając szkiełko w drugiej ręce. Uwaga: ten krok wymaga wprawy, aby zminimalizować uszkodzenia szkiełek podczas usuwania. Alternatywnie można użyć strzykawki do wstrzyknięcia 1X PBS do wlotu i/lub wylotu, aby ułatwić oddzielenie urządzenia.
      4. Umieść szkiełka w sterylnych płytkach sześciodołkowych. Dodaj co najmniej 5 ml roztworu penicyliny/streptomycyny do każdego dołka. Umieść płytki w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C na co najmniej 30 min.
      5. Po sterylizacji odessij roztwór penicyliny/streptomycyny i wysiej na szkiełka hodowane ludzkie komórki mięśni gładkich naczyń tętnicy pępowinowej19 (Rycina 1D). Stężenie wysiewu dla VSMC wynosi ~80 000 komórek na cm2. Aby zmniejszyć liczbę komórek potrzebnych dla każdej próbki, użyj reduktora w celu zmniejszenia powierzchni wysiewu. Przykładem reduktora jest odcięta góra probówki stożkowej 15 ml przymocowana do szkiełka za pomocą sterylnego smaru próżniowego przed wysiewem.
      6. Inkubuj wysiane szkiełka w sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2, pozwalając wysianym komórkom przytwierdzić się i utworzyć wyrównane mimiki blaszek tętniczych przez noc (O/N) (Rycina 2A-B).
    4. Długoterminowa hodowla tkankowa vMTF
      1. Jeden dzień po wysianiu usuń pożywkę komórkową i reduktory. Przepłucz tkanki 1X PBS. Dodaj 4 ml beztłuszczowej pożywki komórkowej, aby wywołać fenotyp kurczliwy w VSMC20.
      2. Powtarzaj płukanie 1X PBS i dodawanie świeżej beztłuszczowej pożywki co drugi dzień, zgodnie z potrzebami dla hodowli długoterminowej.

Schemat mikrofluidycznego systemu dostarczania do wysiewu komórek; obejmuje układ urządzenia, kanały przepływowe i próżnię.
Rycina 1. Mikrofluidyczne urządzenie do dostarczania białek. (A) Zaklejone taśmą szkiełko podstawowe do powlekania PIPAAm. Czerwone przerywane koło: linia cięcia w celu uwolnienia szkiełka. (B) Reprezentatywny rysunek AutoCAD wzoru maski mikrofluidycznej do tkanek. Wstawka: Szczegół binarnych rozgałęzień do naprzemiennego wzoru tkankowego 10 µm x 10 µm. (C) Umieszczenie urządzenia mikrofluidycznego na podłożu ze szkiełka podstawowego z zaznaczonym wlotem i wylotem. (D) Schemat mikrofluidycznego wzorowania i dostarczania białek. Od lewej do prawej: obraz z scanning electron microscope kanałów mikrofluidycznych (pasek skali: 50 µm); szczegółowy schemat metody osadzania białek; fibonektyna barwiona immunohistochemicznie (pasek skali: 50 µm); wysiew komórek z użyciem komórek mięśni gładkich naczyń. (E) Schemat wytworzonej tkanki. 1a wstawka: szczegół warstwowej konstrukcji. 2a wstawka: szczegół modyfikacji genipiną podłoża PDMS po osadzaniu mikrofluidycznym. © IOP Publishing. Reprodukowano i/lub zmodyfikowano za zgodą. Wszelkie prawa zastrzeżone.19 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Analiza funkcji tkanek z wykorzystaniem testu kurczliwości vMTF

Uwaga: Przedstawiony tutaj test kurczliwości MTF został opracowany na podstawie techniki opisanej przez Grosberga et al.8

  1. Eksperyment kurczliwości vMTF
    1. Umieścić próbkę tkanki w szalce 100 mm. Dodać sterylny 1X roztwór Tyrode’a o pH 7,4 podgrzany do 37 °C, aby pokryć próbkę.
    2. Za pomocą żyletki wykonać kilka równoległych cięć prostopadłych do krawędzi PIPAAm. Wykonać cięcia w taki sposób, aby uzyskać szersze sekcje tkanki, które będą stanowić vMTF (o szerokości ~2 mm), naprzemiennie z cienkimi paskami (Rysunek 3A, cięcia boczne). Aby uzyskać czyste cięcia, należy przyłożyć żyletkę do próbki i zdecydowanie przeciągnąć ją w bok.
    3. Obrócić szalkę o 90° i wykonać dwa proste, równoległe cięcia w środku tkanki, równolegle do paska PIPAAm (Rysunek 3A, cięcia końcowe). Usunąć i zutylizować luźny pasek tkanki między tymi cięciami oraz cienkie paski pomiędzy vMTF (wycięte w poprzednim kroku), aby zapobiec kontaktowi sąsiadujących filmów.
    4. Pozostawić próbkę w RT przez 10 min lub do czasu całkowitego rozpuszczenia PIPAAm. Uwaga: Jeśli PIPAAm pozostanie w kolejnych krokach, próbkę można zwrócić do szalki do cięcia w celu rozpuszczenia pozostałości PIPAAm. W razie potrzeby delikatne zeskrobanie dolnej strony vMTF może pomóc w usunięciu PIPAAm.
    5. Nanieść małą kropkę smaru próżniowego do czystej szalki Petriego 35 mm. Dodać 5 ml świeżego, sterylnego 1X roztworu Tyrode’a w temperaturze 37 °C. Przenieść szkiełko podstawowe z wyciętymi filmami z szalki 100 mm do szalki 35 mm i docisnąć do smaru próżniowego, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka.
    6. Umieścić szalkę na platformie z kontrolą temperatury na stoliku stereomikroskopu.
    7. Rejestrować obrazy time-lapse w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym w wybranych odstępach czasu (np. 30 s) przez cały czas trwania testu z lekiem.
    8. Traktować seryjnie vMTF 50 nM endoteliną-1 przez 20 min (indukcja skurczu) oraz 100 µM HA-1077 przez 30 min (relaksacja tkanki). Dodawać stężone roztwory każdego leku do szalki eksperymentalnej zawierającej 5 ml sterylnego 1X roztworu Tyrode’a w określonych punktach czasowych, aby uzyskać pożądaną koncentrację leku w objętości 5 ml. Dodawać leki w przerwach między akwizycjami obrazów time-lapse, aby uniknąć uchwycenia pipety na obrazach.
  2. Analiza kurczliwości vMTF
    1. Używając szkiełek podstawowych odłożonych w punkcie 1.4.8, zmierzyć grubość podłoża PDMS za pomocą profilometru21. Stworzyć krzywą zależności grubości od czasu wirowania dla każdego zestawu szkiełek. Użyć tej krzywej do oszacowania grubości vMTF dla każdego szkiełka użytego w eksperymencie kurczliwości.
    2. Zmierzyć długości projekcji vMTF dla każdego punktu czasowego podczas eksperymentu i obliczyć powiązane promienie krzywizny (Rysunek 3B) przy użyciu wcześniej opisanych metod8.
    3. Obliczyć naprężenie vMTF w każdym punkcie czasowym, stosując wcześniejsze metody vMTF5.
      Uwaga: Użyć szacowanej grubości vMTF obliczonej w punkcie 3.2.1. Zmierzyć grubość VSMC za pomocą obrazowania konfokalnego, jak opisano wcześniej9. Moduł Younga PDMS uzyskać z kart charakterystyki firmy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Głównym celem niniejszej pracy było przedłużenie żywotności mikrostrukturalnych VSMCs na hydrofobowych podłożach z PDMS. Osiągnięto to poprzez zastosowanie mikrofluidycznego systemu dostarczania w celu osadzenia wzorowanej genipiny i fibronektyny na PDMS (Rycina 1). Osadzanie białek ECM przy użyciu dostarczania mikrofluidycznego pozwoliło na wierny transfer wzoru kanałów z obszarami czystego PDMS pomiędzy liniami genipiny i fibronektyny (Rycina 1D). Przytwierdzone komórki (Rycina...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół, który opiera się na wcześniej opracowanej technologii vMTF, umożliwiając wydłużenie czasu eksperymentu, bardziej typowego dla szlaków przewlekłych chorób naczyniowych1,23,24. Aby to osiągnąć, opracowaliśmy mikrowzór genipiny, który, jak wykazano wcześniej, zapewnia długoterminową funkcjonalizację substratów PDMS11, wykorzystując technikę osadzania mikroprzepływowego w celu uzyskania zmodyfikowanych blaszek tętniczych o ulepszonej żywotności tkanki naczyniowej do...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy za wsparcie finansowe od American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) oraz University of Minnesota Doctoral Dissertation Fellowship (ESH). Doceniamy również zasoby mikrofabrykacji Minnesota Nano Center (MNC) oraz zasoby przetwarzania obrazu University Imaging Center (UIC), oba na University of Minnesota. Część tych prac została przeprowadzona w Characterization Facility, University of Minnesota, który otrzymuje częściowe wsparcie od NSF w ramach programu MRS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Stojak do barwienia szkiełek nakrywkowychMikroskopia elektronowa Scienceswww.emsdiasum.com/72239-04
Szkło pokrywowe mikroskopu - 25 mmFisher Scientific, Inc.www.fishersci.com12-545-102
Poli(N-izopropylokrylakamid) (PIPAAm)Polysciences, Inc.www.polysciences.com/#21458
1-butanolSigma-Aldrichwww.sigmaaldrich.com360465
SpincoaterSpecialty Coating Systems, Inc.www.scscoatings.com
Polidimetylosiloksan (PDMS)Kleje Ellsworth (Dow Corning)www.ellsworth.com184 ZESTAW SIL ELAST 0,5 KG
Mikrogranulki fluorescencyjnePolysciences, Inc.www.polysciences.com/17151
Wafle krzemoweWafer World, Inc.www.waferworld.com2398
Fotorezystor MicroChem Corp.www.microchem.com
Nakładka do masek kontaktowychSuss MicroTecwww.suss.com
DeweloperMicroChem Corp.www.microchem.com
Tridecafluro-trichlorosilanUCT Specialties, Inc.www.unitedchem.comT2492
Stempel do biopsji chirurgicznejIntegra LifeSciences Corp.www.miltex.com33-31AA-P/25
GenipinCayman Chemicalwww.caymanchem.com10010622
1X sól fizjologiczna buforowana fosforanemMediatech, Inc.www.cellgro.com21-031-CV
FibronectinCorning, Inc.www.corning.com356008
Penicylina/streptomycynaLife Technologies, Inc.www.lifetechnologies.com15140-122
Komórki mięśni gładkich tętnicy pępowinkowejLonzawww.lonza.comCC-2579
Składniki roztworu Tyrode'aSigma-Aldrichwww.sigmaaldrich.comróżne
Mikroskop stereoskopowyZeisswww.zeiss.com4350020000000000
Platforma z kontrolowaną temperaturąWarner Instrumentswww.warneronline.com641659; 640352; 641922
Endothelin-1Sigma-Aldrichwww.sigmaaldrich.comE7764-50UG
HA-1077Sigma-Aldrichwww.sigmaaldrich.comH139-10MG

Bibliografia

  1. Humphrey, J. D., Baek, S., Niklason, L. E. Biochemomechanics of cerebral vasospasm and its resolution: I. A new hypothesis and theoretical framework. Ann. Biomed. Eng. 35, 1485-1497 (2007).
  2. Hald, E. S., Alford, P. W. Smooth muscle phenotype switching in blast traumatic brain injury-induced cerebral vasospasm. Transl. Stroke Res. 5, 385-393 (2014).
  3. Olivetti, G., Anversa, P., Melissari, M., Loud, A. V. Morphometry of medial hypertrophy in the rat thoracic aorta. Lab. Invest. 42, 559-565 (1980).
  4. , Atherosclerosis. Nature. 407, 233-241 (2000).
  5. Alford, P. W., Feinberg, A. W., Sheehy, S. P., Parker, K. K. Biohybrid thin films for measuring contractility in engineered cardiovascular muscle. Biomaterials. 31, 3613-3621 (2010).
  6. Rhodin, J. A. G. Architecture of the vessel wall. Physiol. Rev. ed, B. erne,R. ., , American Physiology Society. (1979).
  7. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial-mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 19943-19948 (2011).
  8. Grosberg, A., Alford, P. W., McCain, M. L., Parker, K. K. Ensembles of engineered cardiac tissues for physiological and pharmacological study: heart on a chip. 11, 4165-4173 (2011).
  9. Alford, P. W., Nesmith, A. P., Seywerd, J. N., Grosberg, A., Parker, K. K. Vascular smooth muscle contractility depends on cell shape. Integr. Biol. (Camb). 3, 1063-1070 (2011).
  10. Win, Z., et al. Smooth muscle architecture within cell-dense vascular tissues influences functional contractility). Integr. Biol. (Camb). , (2014).
  11. Genchi, G. G., et al. Bio/non-bio interfaces: a straightforward method for obtaining long term PDMS/muscle cell biohybrid constructs). Colloid Surface B. 105, 144-151 (2013).
  12. Fessel, G., Cadby, J., Wunderli, S., van Weeren, R., Snedeker, J. G. Dose- and time-dependent effects of genipin crosslinking on cell viability and tissue mechanics - Toward clinical application for tendon repair. Acta Biomater. , (2013).
  13. Lima, E. G., et al. Genipin enhances the mechanical properties of tissue-engineered cartilage and protects against inflammatory degradation when used as a medium supplement. J. Biomed. Mater. Res. A. 91, 692-700 (2009).
  14. Madhavan, K., Belchenko, D., Tan, W. Roles of genipin crosslinking and biomolecule conditioning in collagen-based biopolymer: Potential for vascular media regeneration. J. Biomed. Mater. Res. A. , (2011).
  15. Satyam, A., Subramanian, G. S., Raghunath, M., Pandit, A., Zeugolis, D. I. In vitro evaluation of Ficoll-enriched and genipin-stabilised collagen scaffolds. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2012).
  16. Alford, P. W., et al. Blast-induced phenotypic switching in cerebral vasospasm. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 12705-12710 (2011).
  17. Song, H., Tice, J. D., Ismagilov, R. F. A microfluidic system for controlling reaction networks in time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 42, 768-772 (2003).
  18. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3, 335-373 (2001).
  19. Hald, E. S., Steucke, K. E., Reeves, J. A., Win, Z., Alford, P. W. Long-term vascular contractility assay using genipin-modified muscular thin films. Biofabrication. 6, 045005(2014).
  20. Han, M., Wen, J. K., Zheng, B., Cheng, Y., Zhang, C. Serum deprivation results in redifferentiation of human umbilical vascular smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C50-C58 (2006).
  21. Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
  22. Volfson, D., Cookson, S., Hasty, J., Tsimring, L. S. Biomechanical ordering of dense cell populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 15346-15351 (2008).
  23. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
  24. Kayembe, K. N., Sasahara, M., Hazama, F. Cerebral aneurysms and variations in the circle of Willis. Stroke. 15, 846-850 (1984).
  25. McCain, M. L., Agarwal, A., Nesmith, H. W., Nesmith, A. P., Parker, K. K. Micromolded gelatin hydrogels for extended culture of engineered cardiac tissues. Biomaterials. 35, 5462-5471 (2014).
  26. Weir, B., Grace, M., Hansen, J., Rothberg, C. Time course of vasospasm in man. 48, 173-178 (1978).
  27. McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).
  28. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  29. Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips. Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).
  30. Meer, A. D., van den Berg, A. Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse. Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

osadzanie mikrofluidycznewzorowanie genipinpod o a PDMSbia ko macierzy zewn trzkom rkowejtest kurczliwo cisamoorganizacja tkankid ugoterminowa hodowlakurczliwo mi ni g adkichmodel skurczu naczy m zgowych
Technika mikroprzepływowego osadzania genipiny do rozszerzonej hodowli cienkich warstw mięśniowych naczyń krwionośnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.