Artykuł metodologiczny

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

DOI:

10.3791/52975

⸱

4 sierpnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje receptor-ligand błonowy pośredniczą w wielu funkcjach komórkowych. Kinetyka wiązania i dalsza sygnalizacja wyzwalana przez te interakcje molekularne są prawdopodobnie zakłócone przez środowisko mechaniczne, w którym zachodzi wiązanie i sygnalizacja. Niedawne badanie wykazało, że siła mechaniczna może regulować rozpoznawanie antygenu poprzez wyzwalanie receptora komórek T (TCR) i wyzwalanie go. Było to możliwe dzięki nowej technologii, którą opracowaliśmy i nazwaliśmy fluorescencyjną sondą siły biomembranowej (fBFP), która łączy spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek z mikroskopią fluorescencyjną. Wykorzystując ultra-miękką ludzką krwinkę czerwoną jako czuły czujnik siły, szybką kamerę i techniki śledzenia obrazowania w czasie rzeczywistym, fBFP wynosi ~1 pN (10-12 N), ~3 nm i ~0,5 ms w mocy, rozdzielczość przestrzenną i czasową. Dzięki fBFP można precyzyjnie zmierzyć kinetykę wiązania pojedynczego receptor-ligand pod wpływem regulacji siły i jednocześnie obrazować wewnątrzkomórkową sygnalizację wapniową wyzwalaną wiązaniem na pojedynczej żywej komórce. Ta nowa technologia może być wykorzystana do badania innych interakcji receptor-ligand błonowy i sygnalizacji w innych komórkach podlegających regulacji mechanicznej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adhezja między komórkami i komórka-komórka do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odbywa się poprzez wiązanie między receptorami na powierzchni komórki, białkami ECM i/lub lipidami1. Wiązanie pozwala komórkom tworzyć funkcjonalne struktury1, a także rozpoznawać, komunikować się i reagować na środowisko1-3. W przeciwieństwie do rozpuszczalnych białek (np. cytokin i czynników wzrostu), które wiążą się z trójwymiarowej (3D) fazy płynnej z receptorami na powierzchni komórki, receptory adhezyjne komórek tworzą wiązania ze swoimi ligandami w wąskiej szczelinie połączeniowej, aby połączyć dwie przeciwstawne powierzchnie, które ograniczają dyfuzję molekularną w dwuwymiarowym (2D) interfejsie4-7. W przeciwieństwie do kinetyki 3D, która jest zwykle mierzona za pomocą tradycyjnych testów wiązania (np. powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub SPR), kinetyka 2D musi być określona ilościowo za pomocą specjalistycznych technik, takich jak mikroskopia sił atomowych (AFM)8-10, komora przepływowa11,12, mikropipeta13,14, pęseta optyczna15 i sonda siły biomembrany (BFP)16-21.

Cząsteczki adhezyjne są czymś więcej niż tylko fizycznym połączeniem dla spójności komórkowej, są głównym składnikiem maszynerii sygnalizacyjnej dla komórki do komunikowania się z otoczeniem. Rośnie zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób zaangażowanie ligandów w cząsteczki adhezyjne inicjuje sygnalizację wewnątrzkomórkową i w jaki sposób początkowy sygnał jest przenoszony do wnętrza komórki. Intuicyjnie rzecz biorąc, właściwości wiązania receptor-ligand mogą wpływać na sygnały, które indukuje. Jednak trudno jest przeanalizować mechanistyczne relacje między interakcją zewnątrzkomórkową a wewnątrzkomórkowymi zdarzeniami sygnalizacyjnymi przy użyciu tradycyjnego zestawu testów biochemicznych ze względu na ich wiele ograniczeń, np. słabą rozdzielczość czasową i całkowity brak rozdzielczości przestrzennej. Istniejące metody, które umożliwiają zarówno biofizyczne (kinetyka wiązania receptor-ligand 2D), jak i biochemiczne (sygnalizacja) obserwacje żywych komórek, obejmują substraty o regulowanej sztywności22, układy filarów elastomerowych23 oraz komory przepływowe/urządzenia mikroprzepływowe ze zdolnością fluorescencji24-26. Odczyty sygnalizacji i wiązania receptor-ligand muszą być jednak uzyskiwane oddzielnie (najczęściej różnymi metodami), co utrudnia analizę czasowych i przestrzennych relacji charakterystyki wiązania wiązania ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi.

Konwencjonalny BFP to ultraczuła spektroskopia sił o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej17. Wykorzystuje elastyczną krwinkę czerwoną (RBC) jako czujnik siły, umożliwiając pomiar kinetyki 2D pojedynczej cząsteczki, właściwości mechanicznych i zmian konformacyjnych14,16,19-21,27-29. BFP oparty na obrazowaniu fluorescencyjnym (fBFP) koreluje kinetykę wiązania receptor-ligand z sygnalizacją komórkową wyzwalaną wiązaniem w skali pojedynczej cząsteczki. Dzięki tej konfiguracji w komórkach T zaobserwowano aktywność sygnalizacji komórkowej in situ w kontekście powierzchniowej stymulacji mechanicznej27. fBFP jest wszechstronny i może być stosowany do badań adhezji komórek i sygnalizacji, w której pośredniczą inne cząsteczki w innych komórkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez komisję etyki badań na ludziach Georgia Institute of Technology.

1. Izolacja ludzkich krwinek czerwonych, biotynylacja i regulacja osmolarności

Uwaga: Krok 1.1 powinien być wykonany przez przeszkolonego lekarza, takiego jak pielęgniarka, z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.

  1. Uzyskać 8-10 μl (jedną kroplę) krwi z nakłucia palca i dodać do 1 ml buforu węglanowego/wodorowęglanowego (tabela 1 i 2). Delikatnie zmieszać lub odpipetować mieszaninę i odwirować przez 1 minutę przy 900 x g. Odrzucić supernatant i umyć jeszcze raz.
  2. W małej zlewce odważyć 3,5-4 mg łącznika Biotyna-PEG3500-NHS (Tabela 1). Rozpuścić go w buforze węglanowym/wodorowęglanowym do uzyskania końcowego stężenia 3 mg/ml.
  3. Zmieszać 171 μl buforu węglanowego/wodorowęglanowego, 10 μl pakietu RBC i 1049 μl roztworu łącznika Biotin-PEG3500-NHS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. Przemyć RBC raz buforem węglanowym/wodorowęglanowym, a następnie dwukrotnie buforem N2-5% (Tabela 1 i 2).
  4. W międzyczasie umieścić butelkę z łącznikiem z poluzowaną nakrętką w szklanym eksykatorze próżniowym wypełnionym osuszaczami na dnie i odkurzać przez 5 minut, a następnie napełnić eksykator argonem. Dokręć nakrętkę i wyjmij butelkę. Zamknąć butelkę plastikową folią parafinową (Tabela 1), umieścić ją w pojemniku wypełnionym środkami osuszającymi na dnie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    Uwaga: Kroki, które obejmują użycie łącznika Biotin-PEG3500-NHS, w tym 1,2-1,4 (z wyjątkiem inkubacji i płukania w 1,3), muszą być wykonane tak szybko, jak to możliwe.
  5. Rozcieńczyć nystatynę do buforu N2-5%, aby uzyskać końcowe stężenie 40 μg/ml. Zmieszać 5 μl biotynylowanych erytrocytów z 71,4 μl roztworu nystatyny (Tabela 1) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 0 °C. Przemyć dwukrotnie buforem N2-5% i przechowywać z buforem N2-5% + 0,5% BSA (tabela 1) w lodówce (4 °C).

2. Silanizacja szklanych koralików

  1. Czyszczenie powierzchni ściegu
    1. Odważyć 50 mg szklanych kulek w proszku i ponownie zawiesić je w 500 μl wody demineralizowanej.
    2. Zmieszać 0,5 ml 30% H2O2 (Tabela 1) z 9,5 ml wody demineralizowanej w zlewce o pojemności 50 ml, następnie dodać 2 ml stężonego NH4OH (Tabela 1) i doprowadzić ten roztwór do bojlera na płycie grzejnej.
    3. Dodaj szklane kulki do wrzącego roztworu i gotuj przez kolejne 5 minut. Delikatnie mieszaj roztwór co minutę.
    4. Po ugotowaniu przenieś ~5 ml tej gorącej zawiesiny kulek do 15 ml probówki do mikrowirówki i uzupełnij wodą RT DI. Wirować przy sile 3 500 x g przez 5 minut, usunąć i wyrzucić supernatant.
    5. Przenieś kolejne 5 ml zawiesiny gorących kulek i dodaj do umytych kulek, uzupełnij większą ilością wody DI, dobrze wymieszaj i ponownie odwiruj. Powtarzaj tę procedurę, aż zużyje się około 50 ml wody DI, co w sumie będzie 4 do 5 razy więcej niż mycie.
    6. Przenieść zawiesinę z granulek do fiolki o pojemności 1 ml. Powtórzyć mycie kulek metanolem (Tabela 1) przez odwirowanie przy 17 000 x g przez 5 minut przez 3 razy, a na koniec ponownie zawiesić kulki w 1 ml 100% metanolu.
  2. Tiolacja powierzchni kulki
    1. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 45,6 ml metanolu, 0,4 ml kwasu octowego (tabela 1), 1,85 ml wody demineralizowanej, 1,15 ml 3-merkaptopropylotrymiestoksysilanu (MPTMS) (tabela 1) i 1 ml zawiesiny kulek przygotowanej w 2.1, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 godziny.
    2. Po reakcji usuń wszystkie reagenty, przemywając raz świeżym metanolem i ponownie zawieś kulki w 500 μl metanolu. Tę skoncentrowaną zawiesinę z kulkami szklanymi równomiernie podzielić na zestaw 20 suchych i czystych szklanych fiolek z zakrętkami. Odparować metanol za pomocą strumienia suchego argonu i powoli obracać fiolki, tak aby na bokach każdej fiolki pozostała cienka warstwa suchych kulek.
    3. Umieścić fiolki z kulkami w piecu suszącym nagrzanym do 120 °C na 5 minut, a następnie wyjąć i szybko luźno nałożyć nakrętkę(i). Umieścić fiolki w szklanym eksykatorze próżniowym wypełnionym środkami osuszającymi na dnie i odkurzyć eksykator za pomocą pompy próżniowej do momentu ostygnięcia.
    4. Przedmuchnąć odkurzony eksykator suchym argonem, aby doprowadzić eksykator do normalnego ciśnienia atmosferycznego. Zdjąć pokrywę eksykatora i szybko ponownie dokręcić nakrętkę (nakrętki) fiolki. Szczelnie zamknąć fiolki folią parafinową z tworzywa sztucznego i przechowywać je w temperaturze pokojowej w suchym, ciemnym pudełku.
    5. Po natychmiastowym użyciu pobrać jedną fiolkę suchych kulek i przemyć ją raz buforem fosforanowym (tabele 1 i 2), zawiesić ponownie w 50 μl buforu fosforanowego i przechowywać w temperaturze 4 °C. Ten skoncentrowany preparat perełek będzie określany jako "kulki MPTMS" w następujących krokach.
      Uwaga: Przy odpowiednim przechowywaniu koraliki MPTMS mogą pozostać sprawne przez okres do trzech miesięcy.

3. Funkcjonalizacja koralików

  1. Kowalencyjne powlekanie białek na koralikach
    1. Pobrać pewną objętość (np. 2,5 μl) białka wyjściowego i wymieszać z równą objętością buforu węglanowego/wodorowęglanowego, aby uzyskać roztwór 1,
      Uwaga: Objętość zależy od stężenia materiału i pożądanej końcowej gęstości białka na powierzchni kulek.
    2. W małej zlewce odważyć 2-3 mg łącznika MAL-PEG3500-NHS (Tabela 1) i rozpuścić go w buforze węglanowo-wodorowęglanowym do uzyskania końcowego stężenia 0,231 mg/ml.
    3. Zmieszać roztwór 1 z równą objętością roztworu łącznika przygotowanego w ppkt 3.1.2. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby uzyskać roztwór 2.
    4. W międzyczasie umieścić butelkę z łącznikiem z poluzowaną nakrętką w szklanym eksykatorze próżniowym wypełnionym osuszaczami na dnie i odkurzać przez 5 minut, a następnie napełnić eksykator argonem. Dokręć nakrętkę i wyjmij butelkę. Zamknij butelkę plastikową folią parafinową, umieść ją w pojemniku wypełnionym środkami osuszającymi na dnie i przechowuj w temperaturze -20 °C.
      Uwaga: Kroki, które obejmują użycie łącznika MAL-PEG3500-NHS, w tym 3.1.2-3.1.4 (z wyjątkiem inkubacji w 3.1.3), muszą być wykonane tak szybko, jak to możliwe.
    5. Zmieszać 5 μl kulek MPTMS z roztworem 2 i dodać bufor fosforanowy (Tabela 1), aby uzyskać końcową objętość 250 μl.
    6. Inkubować kulki przez noc w temperaturze pokojowej, przemyć 3 razy buforem fosforanowym i ponownie zawiesić w 100 μl buforu fosforanowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie kulek pokrytych białkiem/streptawidyną (SA)
    1. Postępuj zgodnie z protokołem 3.1.1-3.1.4.
    2. Zmieszać 5 μl kulek MPTMS z roztworem 2 i 5 μl roztworu 4 mg/ml streptawidyno-maleimidu (SA-MAL) (Tabela 1), a następnie dodać bufor fosforanowy, aby uzyskać końcową objętość 250 μl.
    3. Kulki inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, przemyć 3 razy buforem fosforanowym, a na koniec ponownie zawiesić w 100 μl buforu fosforanowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Powlekanie streptawidyny na szklanych kulkach
    1. Zmieszać 5 μl kulek MPTMS z 5 μl roztworu SA o sile 4 mg/ml i dodać 140 μl buforu fosforanowego.
    2. Bulwiastek inkubować przez noc w temperaturze pokojowej, przemyć 3 razy buforem fosforanowym i ponownie zawiesić w 50 μl buforu fosforanowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Powlekanie kulek powlekanych SA biotynylowanym białkiem
    1. Wymieszać 5 μl kulek pokrytych SA z białkiem (objętość zależy od pożądanej gęstości powłoki) i dodać bufor fosforanowy, aby uzyskać końcową objętość 100 μl.
    2. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, przemyć 3 razy buforem fosforanowym i ponownie zawiesić w buforze fosforanowym o pojemności 50 μl i przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Przygotowanie komórek

Uwaga: Aby oczyścić komórki, postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami oczyszczania komórek odpowiadającymi typowi używanych komórek, na przykład limfocyty T27 lub niektóre linie komórkowe21,29.

  1. W przypadku doświadczeń fBFP, po przygotowaniu zawiesiny komórek, dodać Fura2-AM (Tabela 1) rozpuszczony w DMSO do zawiesiny komórek, aby osiągnąć końcowe stężenie 2 μM, inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć raz. Tę fluorescencyjnie naładowaną zawiesinę komórkową należy przechowywać w ciemności do momentu użycia.

5. Przygotowanie do mikropipet i komory komórkowej

  1. Przygotowanie mikropipet
    1. Pokrój długie szklane rurki kapilarne (Tabela 1) za pomocą noża do szkła na krótkie kawałki o długości około 3 cali. Zamontuj jedną sztukę na ściągaczu do mikropipet (Tabela 1), kliknij przycisk "Pull", aby środek kapilary został podgrzany przez maszynę, a kapilara została pociągnięta na dwóch końcach, aby utworzyć dwie kapilary z ostrymi końcówkami (surowe mikropipety).
      Uwaga: Postępując zgodnie z wytycznymi dotyczącymi produktu, pożądana morfologia surowej pipety ma stożek 6-8 mm i końcówkę 0,1-0,5 μm.
    2. Zamontuj surową pipetę na uchwycie pipet w kuźni mikropipet (Tabela 1). Podgrzej, aby stopić szklaną kulę na kuźni. Włóż końcówkę surowej pipety do szklanej kuli. Ostudź szklaną kulę i pociągnij surową pipetę, aby rozbić ją od zewnątrz i pozostaw jej końcówkę wewnątrz kuli. Powtarzaj tę procedurę, aż do uzyskania pożądanego otworu końcówki.
      Uwaga: Przykładowa średnica wewnętrzna końcówki mikropipety: 2,0-2,4 μm dla RBC, ~1,5 μm dla kulki, ~2-4 μm dla komórki T i -7 μm dla komórki hybrydoma.
  2. Budowa komory komórkowej
    Uwaga: komora ogniwa zbudowana jest w oparciu o domowej roboty uchwyt komory, który składa się z dwóch kawałków metalowych kwadratów (miedź/aluminium) oraz uchwytu, który je ze sobą łączy (rysunek 1D).
  3. Szkiełko nakrywkowe o wymiarach 40 mm x 22 mm x 0,2 mm pokroić nożem do szkła na dwa kawałki o wymiarach 40 mm x 11 mm x 0,2 mm (szkiełko nakrywkowe 1 i 2). Przyklej szkiełko nakrywkowe 1 za pomocą smaru do górnej strony uchwytu komory w taki sposób, aby łączyło się z dwoma metalowymi kwadratami, i podobnie przyklej szkiełko nakrywkowe 2 do dolnej strony, co utworzy równoległą komorę komórkową szkiełka nakrywkowego (rysunek 1D).
  4. Za pomocą pipety wstrzyknąć 200 μl eksperymentalnego buforu pomiędzy dwa szkiełka nakrywkowe. Upewnij się, że bufor jest przymocowany do obu szkiełek nakrywkowych. Delikatnie obróć i potrząśnij komorą, aby bufor dotknął obu końców komory.
  5. Ostrożnie wstrzyknąć olej mineralny po obu stronach komory, otaczając eksperymentalną strefę buforową, uszczelniając w ten sposób bufor od otwartego powietrza. Wstrzyknąć zawiesiny kulek sondy (na przykład kulek pokrytych pMHC), erytrocytów i celów (na przykład limfocytów T) odpowiednio w górnym, środkowym i dolnym obszarze strefy buforowej.

6. Eksperyment BFP

figure-protocol-1
Rysunek 1: montaż fBFP. (A) Ogólny obraz systemu sprzętowego fBFP. (B) Schematyczny rysunek systemu sprzętowego fBFP. (C) Dwukrzywkowy system "DC2" (pomarańczowy) na którym zamontowana była szybka kamera (niebieska) oraz kamera fluorescencyjna (biała). (D) Stolik mikroskopowy, który adaptuje komorę doświadczalną i trzy systemy manipulacji mikropipetami. (E i F) Mikrofotografie ustawienia BFP w komorze doświadczalnej. (E) Zespół mikropipet przedstawiający pipetę z sondą (po lewej), pipetę docelową (u góry po prawej) i pipetę pomocniczą (u dołu po prawej). (F) Umieszczenie koralika sondy. Koralik sondy był manipulowany za pomocą pipety pomocniczej i przymocowany do wierzchołka RBC w celu utworzenia sondy siły. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Włącz mikroskop (Tabela 1) i źródło światła. Umieść komorę na głównym stoliku mikroskopu (Rysunek 1A, D).
  2. Zainstaluj wszystkie trzy mikropipety BFP (Rysunek 1D. Po lewej: sonda, aby chwycić RBC, po prawej: cel, aby złapać komórkę lub koralik, u dołu po prawej: pomocnik, aby złapać koralik).
    1. Za pomocą mikroiniektora (Tabela 1) napełnić mikropipetę buforem doświadczalnym. Zdejmij uchwyt na pipety (Tabela 1) i przytrzymaj go w niższym miejscu, aby woda mogła kapać z końcówki. Szybko włóż mikropipetę do końcówki uchwytu i upewnij się, że podczas wkładania mikropipety nie dostały się do niej pęcherzyki powietrza. Dokręć uchwytu.
    2. Zamontuj każdy uchwyt pipety na odpowiednim mikromanipulatorze. Popchnij mikropipetę w kierunku komory tak, aby jej końcówki weszły w obszar buforowy komory. Wyreguluj położenie mikropipety i znajdź je w polu mikroskopu view.
  3. Poruszaj się po etapie uchwytu komory, aby znaleźć kolonie trzech pierwiastków (erytrocytów, celów i koralików sondy) jeden po drugim. Wyreguluj położenie odpowiedniej mikropipety, obracając pokrętła manipulatorów tak, aby końcówka mikropipety zbliżyła się do jednej komórki/kulki. Zassać komórkę/kulkę, regulując ciśnienie wewnątrz odpowiedniej mikropipety. Wszystkie trzy mikropipety będą rejestrować odpowiadające im elementy.
  4. Poruszaj się po stoliku z uchwytem komory, aby znaleźć otwartą przestrzeń z dala od kolonii wstrzykniętych elementów, w których zostanie przeprowadzony eksperyment. Przełącz tryb wizualny mikroskopu, aby zobrazować obraz w programie komputerowym na ekranie komputera. Przenieś wszystkie trzy elementy na końcówkach do pipet w pole widzenia programu.
  5. Dopasuj koralik sondy i RBC i ostrożnie manewruj koralikiem sondy do wierzchołka RBC, krótko uderz koralikiem w RBC i delikatnie schuj. Wyreguluj ciśnienie mikropipety pomocniczej, aby delikatnie zdmuchnąć kulkę, tak aby pozostała przyklejona do wierzchołka RBC (Rysunek 1F). Odsuń mikropipetę pomocniczą i wyrównaj tarczę oraz koralik sondy (Rysunek 2A).

figure-protocol-2
Rysunek 2: Schemat BFP i jego cykl testowy. (A) Mikrografika wideo przedstawiająca sondę siły (po lewej) i docelową komórkę T (po prawej) zassane przez odpowiednie pipety. Stacjonarna sonda siły składa się ze spuchniętego RBC i dołączonej kulki zawierającej ligand. Limfocyt T z łożyskiem receptora (cel) jest zamontowany na piezotłumaczu ustawionym przeciwnie do sondy. Zwrot z inwestycji jest zaznaczony na zielono. Tracker krawędzi jest oznaczony niebieską linią. Wkładka przedstawia parę liganda (pMHC, strona koralika) i receptora (TCR, strona limfocytów T) na dwóch przeciwległych powierzchniach w obszarze oznaczonym kolorem pomarańczowym. (B) Profil intensywności krawędzi ściegu w (A). Obszar ROI w kierunku x jest wykreślany jako oś x (w liczbie pikseli), a natężenie światła (w wartości skali szarości) jest uśredniane przez grupowanie 30 pikseli wzdłuż kierunku y. (C) Ugięcie RBC oraz położenie stopki i celu (komórki T) w cyklu badania siły zaciskowej. Pionowe i poziome linie przerywane wskazują odpowiednio pozycję wierzchołka RBC przy zerowej sile i przebieg czasu. Śledzenie krawędzi linii deformacji RBC jest pokazane na niebiesko w każdym panelu. Te same, jeszcze mniej etapów przyjmuje się w teście częstotliwości adhezji (w którym brakuje etapów "zacisku" i "dysocjacji") oraz w teście fluktuacji termicznej (w którym brakuje kroku "dysocjacji").

  1. W programie, w oknie pola widzenia, użyj narzędzi w programie, aby zmierzyć odpowiednie promienie mikropipety sondy (Rp), RBC (R0), okrągłą powierzchnię styku między RBC a koralikiem sondy (Rc), co pozwala na oszacowanie stałej sprężystości RBC (k) za pomocą następującego równania17,30,
    figure-protocol-3

    gdzie Δp jest ciśnieniem zasysania na końcówce pipety sondy.

    Uwaga: Z prawa Hooke'a wynika, że siłę wiązania, F, można określić ilościowo za pomocą iloczynu stałej sprężystości i przemieszczenia ściegu sondy (d), tj. F = d (rysunek 2C).
  2. Wprowadź do programu żądaną stałą sprężystości RBC (patrz rozdział 6.6 protokołu. Stała sprężystości jest zwykle ustawiana na 0,25 lub 0,3 pN/nm dla testu siły cęgowej i testu częstotliwości adhezji oraz 0,1 pN/nm dla testu fluktuacji termicznej), co zwróci wymagane ciśnienie zasysania w jednostce centymetra wody. Dostosuj wysokość zbiornika na wodę, który łączy się z pipetą sondy, aż do osiągnięcia wymaganego ciśnienia zasysania.
  3. Narysuj poziomą linię w poprzek wierzchołka RBC, która da krzywą w sąsiednim oknie wskazującą jasność (wartość skali szarości) każdego piksela wzdłuż tej linii. Przeciągnij linię progową tak, aby znajdowała się mniej więcej na połowie głębokości krzywej (Rysunek 2A, B).
    Uwaga: Minimalny punkt na krzywej jasności poniżej linii progowej wskazuje położenie granicy ściegu, dlatego dozwolone jest tylko jedno lokalne minimum. Jeśli obecnie występują dwa lub więcej lokalnych minimów, oznacza to, że obraz nie jest optymalny (prawdopodobnie z powodu nieostrości obrazu lub złego wyrównania między koralikiem sondy a RBC).
  4. Wybierz żądany tryb eksperymentu: test fluktuacji termicznej, test częstotliwości adhezji lub test siły zaciskowej. Ustaw parametry zgodnie z potrzebami (np. siła uderzenia = 15 pN, szybkość obciążenia = 1 000 pN/s, czas kontaktu = 1 sekunda, siła zacisku = 20 pN (dla testu siły zaciskowej) itp.).
    1. Kliknij przycisk "Start", co pozwala programowi przesunąć pipetę docelową i wprowadzić i wyłączyć cel z sondy (szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji Reprezentatywne wyniki). Zbieranie danych będzie odbywać się równolegle, co rejestruje położenie koralika sondy w czasie rzeczywistym. Zatrzymaj program, klikając przycisk "Zatrzymaj eksperyment", w którym to czasie wyskoczy okno umożliwiające zapisanie pozyskanych danych.

7. Eksperyment z fluorescencyjną BFP (fBFP)

  1. Aby skorzystać z funkcji fluorescencji systemu BFP, należy włączyć źródło światła wzbudzenia (Tabela 1) oraz kamerę fluorescencyjną (Tabela 1), które są sterowane przez osobny program (Tabela 1). W programie wybierz parametry obrazowania fluorescencyjnego, w tym wzmocnienie, ekspozycję, kanały wzbudzenia (w tym przypadku światło 340 nm i 380 nm) itp. Postępuj zgodnie ze wszystkimi przygotowaniami w protokole eksperymentu BFP, w tym z ustawieniem sondy i tarczy, co pozwoli na wizualizację obrazu fluorescencyjnego na żywo komórki docelowej wzbudzonego światłem wzbudzonym światłem wzbudzającym 340 nm lub 380 nm.
  2. Użyj narzędzia do dzielenia na sekcje, aby z grubsza przeciąć obszar, w którym komórka pozostanie przez cały okres nagrywania.
    Uwaga: Ze względu na zastosowanie cyklu podejście-kontakt-wycofanie, komórka będzie wielokrotnie poruszać się do przodu i do tyłu, dzięki czemu przecięty obszar jest znacznie większy niż sama komórka.
  3. Kliknij "Nagraj", aby światło o długości fali 340 nm i 380 nm na przemian wzbudzało wewnątrzkomórkowy barwnik fluorescencyjny (Fura2), a para odpowiednich obrazów fluorescencyjnych będzie rejestrowana naprzemiennie mniej więcej raz na sekundę. Jednocześnie kliknij "Start" w programie, aby rozpocząć eksperyment BFP do analizy interakcji molekularnej i eksperyment obrazowania fluorescencyjnego w celu monitorowania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej. System wytworzy plik surowych danych dla wiązania receptor-ligand (patrz rysunek 6A poniżej) oraz serię obrazów fluorescencyjnych w .tiff formacie dla sygnałów wapniowych.

8. Analiza danych

  1. Analiza danych BFP
    1. Analiza danych do oznaczania częstości adhezji
      1. Sekwencyjnie sprawdzaj sygnał "siła w funkcji czasu" każdego cyklu i po prostu rejestruj, które cykle zawierają zdarzenie adhezji, a które nie, a następnie sumuj, aby uzyskać średnią częstotliwość adhezji.
      2. Zbierz siłę zerwania każdego zdarzenia adhezji, która jest szczytową wartością liniowo narastającej siły przed zerwaniem wiązania. Po zebraniu wystarczającej ilości sił zrywających w zakresie szybkości narastania, wyprowadź rozkład siły zrywania przy każdej szybkości narastania, z której wyprowadza się zależną od siły szybkość dysocjacji receptor-ligand za pomocą dynamicznej analizy spektroskopii sił18,31.
    2. Analiza danych do testu fluktuacji termicznej
      1. Sekwencyjnie sprawdzaj sygnał fazy zaciskania każdego cyklu, który prawdopodobnie zawiera wiele zdarzeń asocjacji i dysocjacji wiązań. Wykorzystać poziom fluktuacji termicznej fazy zaciskania (średnie odchylenie standardowe interwału ślizgu wynoszącego 70 kolejnych punktów czasowych położenia ściegu) w sygnale "siła w funkcji czasu" jako wskazówkę do rozróżnienia zdarzeń asocjacji wiązania i dysocjacji, ponieważ tworzenie się wiązania odpowiada spadkowi fluktuacji termicznej.
      2. Wyznacz przedział od momentu dysocjacji wiązania (kiedy fluktuacja termiczna powraca do normalnego poziomu) do momentu powstania następnego wiązania jako czas oczekiwania, a czas trwania wiązania od jego asocjacji do dysocjacji należy określić jako czas życia wiązania, które są zbierane podczas inspekcji danych. Oblicz średni czas oczekiwania i średni czas życia obligacji, które odpowiednio odzwierciedlają odwrotność stopy on-rate i off-rate przy zerowej sile16,30.
    3. Analiza danych do testu siły zaciskowej
      1. Zapisz parametry wszystkich zdarzeń w okresie życia, w tym średni czas życia siły i wiązania, wraz z numerem sekwencji, a także czas rozpoczęcia i czas zakończenia, co pozwoli narysować skumulowaną krzywą czasu życia (na przykład rysunek 6C, żółta krzywa).
      2. Zbierz wystarczającą liczbę wydarzeń życiowych przy użyciu różnych sił. Pogrupuj je w różne przedziały siły, co da średnią żywotność w każdym przedziale siły i razem da krzywą "średniego czasu życia w funkcji siły" (rysunek 4).
  2. Analiza danych obrazowania fluorescencji wapnia
    1. Dostosuj próg intensywności, aż obrazy fluorescencyjne pokażą wyraźny kontur komórki zarówno w kanałach 340 nm, jak i 380 nm bez szumu tła (Rysunek 5A, B). Następnie przejrzyj wewnątrzkomórkowy sygnał Ca2 + klatka po klatce z pseudokolorem wskazującym poziom intensywności (Figura 6B), który jest uzyskiwany na podstawie stosunku intensywności 340 nm / 380 nm, aby wygenerować krzywą "znormalizowanej intensywności Ca2 + w funkcji czasu" (Figura 6C). Użyj pseudokolorowych obrazów fluorescencyjnych, aby stworzyć film, który wyświetla poziom fluorescencji sekunda po sekundzie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika BFP została zapoczątkowana przez laboratorium Evansa w 1995 roku 17. To narzędzie picoforce było szeroko stosowane do pomiaru oddziaływań białek unieruchomionych na powierzchniach, tak aby analizować dwuwymiarową kinetykę cząsteczek adhezyjnych oddziałujących z ich ligandami16,19,20,30, mierzyć elastyczność molekularną21,29 i określać zmiany konformacyjne białek21. W przypadku fBFP dodaje się dodatkowy zestaw urządzeń związanych z epifluorescencją wraz z odpowiednim sy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udany eksperyment z fBFP wiąże się z kilkoma krytycznymi kwestiami. Po pierwsze, aby obliczenia siły były wiarygodne, mikropipeta, RBC i koralik sondy powinny być ustawione jak najbliżej współosiowego. Występ RBC wewnątrz pipety powinien mieć około jednej średnicy pipety sondy, tak aby tarcie między RBC a pipetą było znikome. Dla typowego ludzkiego krwinki czerwonej optymalna średnica pipety wynosi 2,0-2,4 μm, co zapewnia najlepsze dopasowanie do równania 117,30. Po drugie, aby zapewnić, że pomiary w teście si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania związane z tym artykułem i rozwojem technologii fBFP w laboratorium Zhu były wspierane przez granty NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 i TW008753. Dziękujemy Evanowi Evansowi za wynalezienie tego inspirującego narzędzia eksperymentalnego oraz członkom laboratorium Evansa, Andrew Leungowi, Kojiemu Kinoshicie, Wesleyowi Wongowi i Kenowi Halvorsenowi, za pomoc w budowie BFP. Dziękujemy również innym członkom laboratorium Zhu, Fang Kongowi, Chenghao Ge i Kaitao Li, za ich pomoc w rozwoju oprzyrządowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednozasadowy monohydrat fosforanu sodu (NaH2PO4 • H2O)Sigma-AldrichS9638Preparat buforu fosforanowego
Anhy. Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907Preparat buforowy fosforanowy
Węglan sodu (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Węglan/wodorowęglan preparat buforowy
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653N2-5% preparat buforowy
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541N2-5% preparat buforowy
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655N2-5% preparat buforowy
SacharozaSigma-AldrichS0389Przygotowanie buforu N2-5%
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Funkcjonalizacja kulek
Biotyna-PEG3500-NHSJenKemA5026-1Biotynylacja RBC
NystatynaSigma-AldrichN6261Regulacja osmolarności RBC
Wodorotlenek amonu (NH4OH)Sigma-AldrichA-6899Koralik szklany silanizacja
MetanolBDH67-56-1Silanizacja kulek szklanych
30% Nadtlenek wodoru (H2O2)J. T. BarkerJan-86Silanizacja kulek szklanych
Kwas octowy (lodowaty)Sigma-AldrichARK2183Silanizacja kulek szklanych
3-merkaptopropylotrimetoksysilan (MPTMS)Uct Specialties, llc4420-74-0Funkcjonalizacja kulek szklanych Koraliki
ze szkła borokrzemianowegoDistrilab Particle Technology9002Funkcjonalizacja kulek szklanych
Streptawidyna− MaleimideSigma-AldrichS9415Funkcjonalizacja kulek szklanych
BSASigma-AldrichA0336Ligand funkcjonalizujący
Fura2-AMLife TechnologiesF-1201Wewnątrzkomórkowe ładowanie barwnikiem fluorescencji wapnia
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Wewnątrzkomórkowe ładowanie barwnika fluorescencji wapnia
Koraliki Quantibrite PEBD Biosciences340495Kwantyfikacja gęstości
Cytometr przepływowyBD BiosciencesBD LSR IIKwantyfikacja gęstości
Rurka kapilarna 0,7-1,0 mm x 30 caliKimble Chase46485-1Produkcja mikropipet
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipetInstrument sutterP-97Produkcja mikropipet
Mikrosiła do pipetNarishigeMF-900Produkcja mikropipet
Olej mineralnyFisher ScientificBP2629-1Zespół komory
Szklana osłona mikroskopuFisher Scientific12-544-GZespół komory
MikrowtryskiwaczWorld Precision InstrumentsMF34G-5Zespół komory
1 ml strzykawkaBD Zespół 309602 komory
Uchwyt na mikropipetyNarishigeHI-7Montaż komory
Domowe części mechaniczne i adaptery zaprojektowane w domu przy użyciu obróbki CNC. Instrument biofizycznyWszystkie części są dostosowywane zgodnie z projektami CAD.System BFP
Mikroskop (odwrócony TiE)System NikonMEA53100BFP
Obiektyw CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)System NikonMRH00401BFP
Aparat, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, monoGraftek Imaging02-2020CSystem BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADCGraftek Imaging02-2185ABFP system
Ręczna submikronowa głowica pomiarowa z pilotem o wysokiej rozdzielczościKarl SussPH400BFP
Stół antywibracyjny (5' x 3')System TMC77049089BFP
Ręczny etap translacyjny 3DNewport462-XYZ-M
Oprogramowanie CAD 3D SolidWorksSOLIDWORKS Corp.Wersja 2012 SP5System BFP
OprogramowanieLabVIEW National InstrumentsWersja 2009System BFP, program BFP
Stolik translacyjny 3D piezoelektrycznyPhysik InstrumenteM-105.3PSystem BFP
Liniowy akumulator piezoelektrycznyPhysik InstrumenteP-753.1CDSystem
BFP OprogramowanieWersja 1.4system fBFP, fluorescencja program do obrazowania
Dual Cam (DC-2)Fotometria77054724system fBFP
Filtr emisyjny Dual Cam (T565LPXR)Fotometria77054725system fBFP
Kamera fluorescencyjnaHamamatsuORCA-R2 C10600-10BSystem fBFP
Folia parafinowa z tworzywa sztucznego (Parafilm)Bemis Company, IncUszczelnienie butelkiPM996
Węglan/ Bufor wodorowęglanowy (pH 8,5)8,4 g/l węglan sodu (Na2CO3), 10,6 g/l wodorowęglan sodu (NaHCO3
Bufor fosforanowy (pH 6,5-6,8)27,6 g/l NaFosforan jednozasadowy (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosforan dwuzasadowy (Na2HPO4)
N2-5% bufor (pH 7,2)20,77 g/L chlorek potasu (KCl), 2,38 g/L chlorek sodu (NaCl), 0,13 g/l jednozasadowy fosforan potasu (KH2PO4), 0,71 g/l anhy. fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4), 9,70 g/l sacharozy
System Micromanager )

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
  2. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  3. Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
  4. Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86(2012).
  5. Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
  6. Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
  7. Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005(2012).
  8. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
  9. Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
  10. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
  11. Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
  12. Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
  13. Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
  14. Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
  15. Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
  16. Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
  17. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
  18. Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
  19. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
  20. Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
  21. Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
  22. Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
  23. Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
  24. Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
  25. Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
  26. Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157(2012).
  27. Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
  28. Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
  29. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886(2014).
  30. Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
  31. Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
  32. Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorescence Biomembrane Force ProbeReceptor ligand KineticsIntracellular Calcium SignalingSingle Cell AnalysisForce SpectroscopyFluorescence MicroscopyRed Blood Cell Force SensorT cell Receptor BindingMechanical Force RegulationMicro Pipette Manipulation

Powiązane artykuły