Method Article

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

DOI:

10.3791/52975

⸱

August 4th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Interakcje receptor-ligand błonowy pośredniczą w wielu funkcjach komórkowych. Kinetyka wiązania i dalsza sygnalizacja wyzwalana przez te interakcje molekularne są prawdopodobnie zakłócone przez środowisko mechaniczne, w którym zachodzi wiązanie i sygnalizacja. Niedawne badanie wykazało, że siła mechaniczna może regulować rozpoznawanie antygenu poprzez wyzwalanie receptora komórek T (TCR) i wyzwalanie go. Było to możliwe dzięki nowej technologii, którą opracowaliśmy i nazwaliśmy fluorescencyjną sondą siły biomembranowej (fBFP), która łączy spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek z mikroskopią fluorescencyjną. Wykorzystując ultra-miękką ludzką krwinkę czerwoną jako czuły czujnik siły, szybką kamerę i techniki śledzenia obrazowania w czasie rzeczywistym, fBFP wynosi ~1 pN (10-12 N), ~3 nm i ~0,5 ms w mocy, rozdzielczość przestrzenną i czasową. Dzięki fBFP można precyzyjnie zmierzyć kinetykę wiązania pojedynczego receptor-ligand pod wpływem regulacji siły i jednocześnie obrazować wewnątrzkomórkową sygnalizację wapniową wyzwalaną wiązaniem na pojedynczej żywej komórce. Ta nowa technologia może być wykorzystana do badania innych interakcji receptor-ligand błonowy i sygnalizacji w innych komórkach podlegających regulacji mechanicznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adhezja między komórkami i komórka-komórka do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odbywa się poprzez wiązanie między receptorami na powierzchni komórki, białkami ECM i/lub lipidami1. Wiązanie pozwala komórkom tworzyć funkcjonalne struktury1, a także rozpoznawać, komunikować się i reagować na środowisko1-3. W przeciwieństwie do rozpuszczalnych białek (np. cytokin i czynników wzrostu), które wiążą się z trójwymiarowej (3D) fazy płynnej z receptorami na powierzchni komórki, receptory adhezyjne komórek tworzą wiązania ze swoimi ligandami w wąskiej szczelinie połączeniowej, aby połączyć dwie przeciwstawne powierzchnie, które ogranicz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez komisję etyki badań na ludziach Georgia Institute of Technology.

1. Izolacja ludzkich krwinek czerwonych, biotynylacja i regulacja osmolarności

Uwaga: Krok 1.1 powinien być wykonany przez przeszkolonego lekarza, takiego jak pielęgniarka, z zatwierdzonym protokołem Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.

  1. Uzyskać 8-10 μl (jedną kroplę) krwi z nakłucia palca i dodać do 1 ml buforu węglanowego/wodorowęglanowego (tabela 1 i 2). Delikatnie zmieszać lub odpipetować mieszaninę i odwirować przez 1 minutę przy 900 x....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Technika BFP została zapoczątkowana przez laboratorium Evansa w 1995 roku 17. To narzędzie picoforce było szeroko stosowane do pomiaru oddziaływań białek unieruchomionych na powierzchniach, tak aby analizować dwuwymiarową kinetykę cząsteczek adhezyjnych oddziałujących z ich ligandami16,19,20,30, mierzyć elastyczność molekularną21,29 i określać zmiany konformacyjne białek21. W przypadku fBFP dodaje się dodatkowy zestaw urządzeń związanych z epifluorescencją wraz z odpowiednim sy.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Udany eksperyment z fBFP wiąże się z kilkoma krytycznymi kwestiami. Po pierwsze, aby obliczenia siły były wiarygodne, mikropipeta, RBC i koralik sondy powinny być ustawione jak najbliżej współosiowego. Występ RBC wewnątrz pipety powinien mieć około jednej średnicy pipety sondy, tak aby tarcie między RBC a pipetą było znikome. Dla typowego ludzkiego krwinki czerwonej optymalna średnica pipety wynosi 2,0-2,4 μm, co zapewnia najlepsze dopasowanie do równania 117,30. Po drugie, aby zapewnić, że pomiary w teście si.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania związane z tym artykułem i rozwojem technologii fBFP w laboratorium Zhu były wspierane przez granty NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 i TW008753. Dziękujemy Evanowi Evansowi za wynalezienie tego inspirującego narzędzia eksperymentalnego oraz członkom laboratorium Evansa, Andrew Leungowi, Kojiemu Kinoshicie, Wesleyowi Wongowi i Kenowi Halvorsenowi, za pomoc w budowie BFP. Dziękujemy również innym członkom laboratorium Zhu, Fang Kongowi, Chenghao Ge i Kaitao Li, za ich pomoc w rozwoju oprzyrządowania.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Jednozasadowy monohydrat fosforanu sodu (NaH2PO4 • H2O)Sigma-AldrichS9638Preparat buforu fosforanowego
Anhy. Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907Preparat buforowy fosforanowy
Węglan sodu (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Węglan/wodorowęglan preparat buforowy
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653N2-5% preparat buforowy
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541N2-5% preparat buforowy
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655N2-5% preparat buforowy
SacharozaSigma-AldrichS0389Przygotowanie buforu N2-5%
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Funkcjonalizacja kulek
Biotyna-PEG3500-NHSJenKemA5026-1Biotynylacja RBC
NystatynaSigma-AldrichN6261Regulacja osmolarności RBC
Wodorotlenek amonu (NH4OH)Sigma-AldrichA-6899Koralik szklany silanizacja
MetanolBDH67-56-1Silanizacja kulek szklanych
30% Nadtlenek wodoru (H2O2)J. T. BarkerJan-86Silanizacja kulek szklanych
Kwas octowy (lodowaty)Sigma-AldrichARK2183Silanizacja kulek szklanych
3-merkaptopropylotrimetoksysilan (MPTMS)Uct Specialties, llc4420-74-0Funkcjonalizacja kulek szklanych Koraliki
ze szkła borokrzemianowegoDistrilab Particle Technology9002Funkcjonalizacja kulek szklanych
Streptawidyna− MaleimideSigma-AldrichS9415Funkcjonalizacja kulek szklanych
BSASigma-AldrichA0336Ligand funkcjonalizujący
Fura2-AMLife TechnologiesF-1201Wewnątrzkomórkowe ładowanie barwnikiem fluorescencji wapnia
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Wewnątrzkomórkowe ładowanie barwnika fluorescencji wapnia
Koraliki Quantibrite PEBD Biosciences340495Kwantyfikacja gęstości
Cytometr przepływowyBD BiosciencesBD LSR IIKwantyfikacja gęstości
Rurka kapilarna 0,7-1,0 mm x 30 caliKimble Chase46485-1Produkcja mikropipet
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipetInstrument sutterP-97Produkcja mikropipet
Mikrosiła do pipetNarishigeMF-900Produkcja mikropipet
Olej mineralnyFisher ScientificBP2629-1Zespół komory
Szklana osłona mikroskopuFisher Scientific12-544-GZespół komory
MikrowtryskiwaczWorld Precision InstrumentsMF34G-5Zespół komory
1 ml strzykawkaBD Zespół 309602 komory
Uchwyt na mikropipetyNarishigeHI-7Montaż komory
Domowe części mechaniczne i adaptery zaprojektowane w domu przy użyciu obróbki CNC. Instrument biofizycznyWszystkie części są dostosowywane zgodnie z projektami CAD.System BFP
Mikroskop (odwrócony TiE)System NikonMEA53100BFP
Obiektyw CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)System NikonMRH00401BFP
Aparat, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, monoGraftek Imaging02-2020CSystem BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADCGraftek Imaging02-2185ABFP system
Ręczna submikronowa głowica pomiarowa z pilotem o wysokiej rozdzielczościKarl SussPH400BFP
Stół antywibracyjny (5' x 3')System TMC77049089BFP
Ręczny etap translacyjny 3DNewport462-XYZ-M
Oprogramowanie CAD 3D SolidWorksSOLIDWORKS Corp.Wersja 2012 SP5System BFP
OprogramowanieLabVIEW National InstrumentsWersja 2009System BFP, program BFP
Stolik translacyjny 3D piezoelektrycznyPhysik InstrumenteM-105.3PSystem BFP
Liniowy akumulator piezoelektrycznyPhysik InstrumenteP-753.1CDSystem
BFP OprogramowanieWersja 1.4system fBFP, fluorescencja program do obrazowania
Dual Cam (DC-2)Fotometria77054724system fBFP
Filtr emisyjny Dual Cam (T565LPXR)Fotometria77054725system fBFP
Kamera fluorescencyjnaHamamatsuORCA-R2 C10600-10BSystem fBFP
Folia parafinowa z tworzywa sztucznego (Parafilm)Bemis Company, IncUszczelnienie butelkiPM996
Węglan/ Bufor wodorowęglanowy (pH 8,5)8,4 g/l węglan sodu (Na2CO3), 10,6 g/l wodorowęglan sodu (NaHCO3
Bufor fosforanowy (pH 6,5-6,8)27,6 g/l NaFosforan jednozasadowy (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosforan dwuzasadowy (Na2HPO4)
N2-5% bufor (pH 7,2)20,77 g/L chlorek potasu (KCl), 2,38 g/L chlorek sodu (NaCl), 0,13 g/l jednozasadowy fosforan potasu (KH2PO4), 0,71 g/l anhy. fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4), 9,70 g/l sacharozy
System Micromanager )

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
  2. Davis, M. M., Bjorkman, P. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Biomembrane Force ProbeReceptor ligand KineticsIntracellular Calcium SignalingSingle Cell AnalysisForce SpectroscopyFluorescence MicroscopyRed Blood Cell Force SensorT cell Receptor BindingMechanical Force RegulationMicro Pipette Manipulation

Related Articles