Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce

12K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52975

⸱

4 sierpnia 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy technikę jednoczesnego pomiaru kinetyki wiązania pojedynczego receptora-liganda o regulowanej sile oraz obrazowania w czasie rzeczywistym sygnalizacji wapniowej w pojedynczym limfocycie T.

Streszczenie

Interakcje receptor-ligand błonowy pośredniczą w wielu funkcjach komórkowych. Kinetyka wiązania i dalsza sygnalizacja wyzwalana przez te interakcje molekularne są prawdopodobnie zakłócone przez środowisko mechaniczne, w którym zachodzi wiązanie i sygnalizacja. Niedawne badanie wykazało, że siła mechaniczna może regulować rozpoznawanie antygenu poprzez wyzwalanie receptora komórek T (TCR) i wyzwalanie go. Było to możliwe dzięki nowej technologii, którą opracowaliśmy i nazwaliśmy fluorescencyjną sondą siły biomembranowej (fBFP), która łączy spektroskopię sił pojedynczych cząsteczek z mikroskopią fluorescencyjną. Wykorzystując ultra-miękką ludzką krwinkę czerwoną jako czuły czujnik siły, szybką kamerę i techniki śledzenia obrazowania w czasie rzeczywistym, fBFP wynosi ~1 pN (10-12 N), ~3 nm i ~0,5 ms w mocy, rozdzielczość przestrzenną i czasową. Dzięki fBFP można precyzyjnie zmierzyć kinetykę wiązania pojedynczego receptor-ligand pod wpływem regulacji siły i jednocześnie obrazować wewnątrzkomórkową sygnalizację wapniową wyzwalaną wiązaniem na pojedynczej żywej komórce. Ta nowa technologia może być wykorzystana do badania innych interakcji receptor-ligand błonowy i sygnalizacji w innych komórkach podlegających regulacji mechanicznej.

Wprowadzenie

Adhezja między komórkami i komórka-komórka do macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) odbywa się poprzez wiązanie między receptorami na powierzchni komórki, białkami ECM i/lub lipidami1. Wiązanie pozwala komórkom tworzyć funkcjonalne struktury1, a także rozpoznawać, komunikować się i reagować na środowisko1-3. W przeciwieństwie do rozpuszczalnych białek (np. cytokin i czynników wzrostu), które wiążą się z trójwymiarowej (3D) fazy płynnej z receptorami na powierzchni komórki, receptory adhezyjne komórek tworzą wiązania ze swoimi ligandami w wąskiej szczelinie połączeniowej, aby połączyć dwie przeciwstawne powierzchnie, które ograniczają dyfuzję molekularną w dwuwymiarowym (2D) interfejsie4-7. W przeciwieństwie do kinetyki 3D, która jest zwykle mierzona za pomocą tradycyjnych testów wiązania (np. powierzchniowego rezonansu plazmonowego lub SPR), kinetyka 2D musi być określona ilościowo za pomocą specjalistycznych technik, takich jak mikroskopia sił atomowych (AFM)8-10, komora przepływowa11,12, mikropipeta13,14, pęseta optyczna15 i sonda siły biomembrany (BFP)16-21.

Cząsteczki adhezyjne są czymś więcej niż tylko fizycznym połączeniem dla spójności komórkowej, są głównym składnikiem maszynerii sygnalizacyjnej dla komórki do komunikowania się z otoczeniem. Rośnie zainteresowanie zrozumieniem, w jaki sposób zaangażowanie ligandów w cząsteczki adhezyjne inicjuje sygnalizację wewnątrzkomórkową i w jaki sposób początkowy sygnał jest przenoszony do wnętrza komórki. Intuicyjnie rzecz biorąc, właściwości wiązania receptor-ligand mogą wpływać na sygnały, które indukuje. Jednak trudno jest przeanalizować mechanistyczne relacje między interakcją zewnątrzkomórkową a wewnątrzkomórkowymi zdarzeniami sygnalizacyjnymi przy użyciu tradycyjnego zestawu testów biochemicznych ze względu na ich wiele ograniczeń, np. słabą rozdzielczość czasową i całkowity brak rozdzielczości przestrzennej. Istniejące metody, które umożliwiają zarówno biofizyczne (kinetyka wiązania receptor-ligand 2D), jak i biochemiczne (sygnalizacja) obserwacje żywych komórek, obejmują substraty o regulowanej sztywności22, układy filarów elastomerowych23 oraz komory przepływowe/urządzenia mikroprzepływowe ze zdolnością fluorescencji24-26. Odczyty sygnalizacji i wiązania receptor-ligand muszą być jednak uzyskiwane oddzielnie (najczęściej różnymi metodami), co utrudnia analizę czasowych i przestrzennych relacji charakterystyki wiązania wiązania ze zdarzeniami sygnalizacyjnymi.

Konwencjonalny BFP to ultraczuła spektroskopia sił o wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej17. Wykorzystuje elastyczną krwinkę czerwoną (RBC) jako czujnik siły, umożliwiając pomiar kinetyki 2D pojedynczej cząsteczki, właściwości mechanicznych i zmian konformacyjnych14,16,19-21,27-29. BFP oparty na obrazowaniu fluorescencyjnym (fBFP) koreluje kinetykę wiązania receptor-ligand z sygnalizacją komórkową wyzwalaną wiązaniem w skali pojedynczej cząsteczki. Dzięki tej konfiguracji w komórkach T zaobserwowano aktywność sygnalizacji komórkowej in situ w kontekście powierzchniowej stymulacji mechanicznej27. fBFP jest wszechstronny i może być stosowany do badań adhezji komórek i sygnalizacji, w której pośredniczą inne cząsteczki w innych komórkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez komisję etyki badań z udziałem ludzi w Georgia Institute of Technology.

1. Izolacja ludzkich erytrocytów (RBC), biotynilacja i regulacja osmolarności

Uwaga: Krok 1.1 powinien zostać wykonany przez wykwalifikowanego pracownika medycznego, np. pielęgniarkę, zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Recenzencką (IRB).

  1. Pobrać 8-10 µl (jedną kroplę) krwi poprzez nakłucie palca i dodać do 1 ml buforu węglanowo-wodorowęglanowego (Tabela 1 i 2). Mieszaninę delikatnie wymieszać na wortexie lub pipetą, a następnie wirować przez 1 min przy 900 x g. Odrzucić nadsącz i wypłukać jeszcze raz.
  2. W małym zlewce odważyć 3,5-4 mg łącznika Biotin-PEG3500-NHS (Tabela 1). Rozpuścić go w buforze węglanowo-wodorowęglanowym, aby uzyskać stężenie końcowe 3 mg/ml.
  3. Wymieszać 171 µl buforu węglanowo-wodorowęglanowego, 10 µl osadu RBC oraz 1049 µl roztworu łącznika Biotin-PEG3500-NHS i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. RBC wypłukać raz buforem węglanowo-wodorowęglanowym, a następnie dwukrotnie buforem N2-5% (Tabela 1 i 2).
  4. W międzyczasie butelkę z łącznikiem z poluzowaną zakrętką umieścić w szklanym eksykatore próżniowym z osuszaczem na dnie, odessać powietrze przez 5 min, a następnie napełnić eksykator argonem. Dokręcić zakrętkę i wyjąć butelkę. Uszczelnić butelkę plastikową folią parafinową (Tabela 1), umieścić w pojemniku z osuszaczem na dnie i przechowywać w -20 °C.
    Uwaga: Kroki obejmujące użycie łącznika Biotin-PEG3500-NHS, w tym punkty 1.2-1.4 (z wyjątkiem inkubacji i płukania w punkcie 1.3), należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe.
  5. Rozcieńczyć nystatynę w buforze N2-5%, aby uzyskać stężenie końcowe 40 µg/ml. Wymieszać 5 µl biotynilowanych RBC z 71,4 µl roztworu nystatyny (Tabela 1) i inkubować przez 1 h w 0 °C. Wypłukać dwukrotnie buforem N2-5% i przechowywać w buforze N2-5% + 0,5% BSA (Tabela 1) w lodówce (4 °C).

2. Silanizacja szklanych kulek

  1. Czyszczenie powierzchni kulek
    1. Odważyć 50 mg proszku z szklanych kulek i resuspender go w 500 µl wody DI.
    2. W zlewce o pojemności 50 ml zmieszać 0,5 ml 30% H2O2 (Tabela 1) z 9,5 ml wody DI, następnie dodać 2 ml stężonego NH4OH (Tabela 1) i doprowadzić roztwór do wrzenia na płycie grzejnej.
    3. Dodać szklane kulki do wrzącego roztworu i kontynuować gotowanie przez kolejne 5 min. Delikatnie mieszać roztwór co minutę.
    4. Po zagotowaniu przenieść ok. 5 ml tej gorącej zawiesiny kulek do probówki do mikrowirówki o pojemności 15 ml i uzupełnić wodą DI w temperaturze pokojowej (RT). Wirować przy 3 500 x g przez 5 min, a następnie usunąć i odrzucić nadsącz.
    5. Przenieść kolejne 5 ml gorącej zawiesiny kulek i dodać do wypłukanych kulek, uzupełnić wodą DI, dobrze wymieszać i ponownie odwirować. Powtarzać tę procedurę aż do zużycia około 50 ml wody DI, co odpowiada łącznie 4 do 5 cyklom płukania.
    6. Przenieść zawiesinę kulek do fiolki o pojemności 1 ml. Powtarzać płukanie kulek metanolem (Tabela 1) poprzez wirowanie przy 17 000 x g przez 5 min (3 razy), a na koniec resuspender kulki w 1 ml 100% metanolu.
  2.  Tiolowanie powierzchni kulek
    1. Do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodać 45,6 ml metanolu, 0,4 ml kwasu octowego (Tabela 1), 1,85 ml wody DI, 1,15 ml 3-merkaptopropylotrimetoksysilanu (MPTMS) (Tabela 1) oraz 1 ml zawiesiny kulek przygotowanej w punkcie 2.1, a następnie inkubować w RT przez 3 h.
    2. Po reakcji usunąć wszystkie substraty, płucząc raz świeżym metanolem, i resuspender kulki w 500 µl metanolu. Równomiernie podzielić tę skoncentrowaną zawiesinę szklanych kulek do zestawu 20 suchych i czystych szklanych fiolek z zakrętkami. Odparować metanol za pomocą strumienia suchego argonu, powoli obracając fiolki, aby na ściankach każdej z nich powstała cienka warstwa suchych kulek.
    3. Umieścić fiolki z kulkami w wstępnie rozgrzanej suszarce w temperaturze 120 °C na 5 min, a następnie wyjąć i szybko nałożyć luźno zakrętki. Umieścić fiolki w szklanym eksykatorze próżniowym z osuszaczem na dnie i odpompowywać powietrze pompą próżniową aż do wystygnięcia.
    4. Przepłukać opróżniony z powietrza eksykator suchym argonem, aby przywrócić w nim normalne ciśnienie atmosferyczne. Zdjąć pokrywę eksykatora i szybko mocno dokręcić zakrętki fiolek. Uszczelnić fiolki plastikową folią parafinową i przechowywać w RT w suchej, ciemnej kasetce do przechowywania.
    5. Bezpośrednio przed użyciem pobrać jedną fiolkę z suchymi kulkami i wypłukać raz buforem fosforanowym (Tabele 1 i 2), resuspender w 50 µl buforu fosforanowego i przechowywać w 4 °C. Ten skoncentrowany preparat kulek będzie w dalszych krokach określany jako „kulki MPTMS”.
      Uwaga: Przy odpowiednim przechowywaniu kulki MPTMS mogą zachować funkcjonalność do trzech miesięcy.

3. Funkcjonalizacja kulek

  1. Kowalencyjne powlekanie kulek białkami
    1. Nabrać określoną objętość (np. 2,5 µl) roztoku białka i zmieszać z równą objętością buforu węglanowo-wodorowęglanowego, aby przygotować Roztwór 1.
      Uwaga: Objętość zależy od stężenia roztoku oraz pożądanej końcowej gęstości miejsc białka na powierzchni kulek.
    2. W małym zlewce odważyć 2-3 mg łącznika MAL-PEG3500-NHS (Tabela 1) i rozpuścić go w buforze węglanowo-wodorowęglanowym do uzyskania stężenia końcowego 0,231 mg/ml.
    3. Zmieszać Roztwór 1 z równą objętością roztworu łącznika przygotowanego w punkcie 3.1.2. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min, aby otrzymać Roztwór 2.
    4. W międzyczasie umieścić butelkę z łącznikiem z poluzowaną zakrętką w szklanym deskrytorze próżniowym z osuszaczem na dnie, odessać powietrze przez 5 min, a następnie napełnić deskryptor argonem. Mocno zakręcić butelkę i wyjąć ją z urządzenia. Uszczelnić butelkę plastikową folią parafinową, umieścić w pojemniku z osuszaczem na dnie i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      Uwaga: Etapy obejmujące użycie łącznika MAL-PEG3500-NHS, w tym punkty 3.1.2-3.1.4 (z wyjątkiem inkubacji w 3.1.3), należy przeprowadzić jak najszybciej.
    5. Zmieszać 5 µl kulek MPTMS z Roztworem 2 i dodać bufor fosforanowy (Tabela 1), aby uzyskać objętość końcową 250 µl.
    6. Inkubować kulki przez noc w temperaturze pokojowej (RT), przemyć 3 razy buforem fosforanowym, ponownie zawiesić w 100 µl buforu fosforanowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie kulek powlekanych białkiem/streptawidyną (SA)
    1. Postępować zgodnie z protokołem 3.1.1-3.1.4.
    2. Zmieszać 5 µl kulek MPTMS z Roztworem 2 oraz 5 µl roztworu Streptawidyny-Maleimidu (SA-MAL) o stężeniu 4 mg/ml (Tabela 1), a następnie dodać bufor fosforanowy do uzyskania objętości końcowej 250 µl.
    3. Inkubować kulki przez noc w temperaturze pokojowej (RT), przemyć 3 razy buforem fosforanowym, a na koniec ponownie zawiesić w 100 µl buforu fosforanowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  3. Powlekanie kulek szklanych streptawidyną
    1. Zmieszać 5 µl kulek MPTMS z 5 µl roztworu SA o stężeniu 4 mg/ml i dodać 140 µl buforu fosforanowego.
    2. Inkubować kulki przez noc w temperaturze pokojowej (RT), przemyć 3 razy buforem fosforanowym, ponownie zawiesić w 50 µl buforu fosforanowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  4. Powlekanie kulek powlekanych SA białkiem biotynylowanym
    1. Zmieszać 5 µl kulek powlekanych SA z białkiem (objętość zależna od pożądanej gęstości powlekania) i dodać bufor fosforanowy, aby objętość końcowa wynosiła 100 µl.
    2. Inkubować mieszaninę przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 3 h w temperaturze pokojowej (RT), przemyć 3 razy buforem fosforanowym, ponownie zawiesić w 50 µl buforu fosforanowego i przechowywać w temperaturze 4 °C.

4. Przygotowanie komórek

Uwaga: Aby oczyścić komórki, należy postępować zgodnie ze standardowymi protokołami oczyszczania komórek odpowiadającymi typowi używanych komórek, na przykład limfocytów T27 lub określonych linii komórkowych21,29.

  1. W przypadku eksperymentów fBFP, po przygotowaniu zawiesiny komórkowej, dodać do niej Fura2-AM (Tabela 1) rozpuszczony w DMSO, aby uzyskać stężenie końcowe 2 µM, inkubować przez 30 min w temperaturze pokojowej, a następnie wypłukać raz. Tę zawiesinę komórkową z załadowanym barwnikiem fluorescencyjnym przechowywać w ciemności do momentu użycia.

5. Przygotowanie mikropipet oraz komory komórkowej

  1. Przygotowanie mikropipet
    1. Za pomocą przecinaka do szkła potnij długie szklane rurki kapilarne (Tabela 1) na krótkie odcinki o długości około 3 cali. Zamocuj jeden odcinek w wyciągaczu do mikropipet (Tabela 1), kliknij przycisk „Pull”, aby maszyna podgrzała środek kapilary, a następnie rozciągnęła ją na obu końcach, tworząc dwie kapilary z ostrymi końcówkami (surowe mikropipety).
      Uwaga: Zgodnie z wytycznymi produktu, pożądana morfologia surowej pipety charakteryzuje się zwężeniem o długości 6-8 mm i końcówką o średnicy 0.1-0.5 µm.
    2. Zamocuj surową pipetę w uchwycie do pipet w kuźni do mikropipet (Tabela 1). Podgrzej szklaną kulę w kuźni do stopienia. Wprowadź końcówkę surowej pipety do wnętrza szklanej kuli. Ostudź szklaną kulę i pociągnij surową pipetę, aby przełamać ją od zewnątrz, pozostawiając jej końcówkę wewnątrz kuli. Powtarzaj tę procedurę, aż uzyskasz pożądaną średnicę otworu końcówki.
      Uwaga: Przykłady wewnętrznej średnicy końcówki mikropipety: 2.0-2.4 µm dla erytrocyta (RBC), ~1.5 µm dla kuleczki (bead), ~2-4 µm dla limfocytu T i -7 µm dla komórki hybridoma.
  2. Budowa komory komórkowej
    Uwaga: komora komórkowa jest budowana w oparciu o wykonany samodzielnie uchwyt komory, który składa się z dwóch metalowych kwadratów (miedź/aluminium) oraz uchwytu łączącego je ze sobą (Rycina 1D).
  3. Za pomocą przecinaka do szkła potnij szkiełko podstawowe o wymiarach 40 mm x 22 mm x 0.2 mm na dwa kawałki o wymiarach 40 mm x 11 mm x 0.2 mm (szkiełko 1 i 2). Przyklej szkiełko 1 za pomocą smaru do górnej strony uchwytu komory w taki sposób, aby mostkowało ono oba metalowe kwadraty, a analogicznie przyklej szkiełko 2 do dolnej strony, co utworzy komorę komórkową z równoległych szkiełek (Rycina 1D).
  4. Używając pipety, wstrzyknij 200 µl buforu eksperymentalnego pomiędzy dwa szkiełka. Upewnij się, że bufor przylega do obu szkiełek. Delikatnie obracaj i potrząsaj komorą, aby bufor dotknął obu końców komory.
  5. Ostrożnie wstrzyknij olej mineralny po obu stronach komory, flankując strefę buforu eksperymentalnego, aby odizolować bufor od otoczenia. Wstrzyknij zawiesiny kuleczek sond (na przykład kuleczek pokrytych pMHC), erytrocytów (RBC) oraz komórek docelowych (na przykład limfocytów T) odpowiednio do górnej, środkowej i dolnej części strefy buforu.

6. Eksperyment z BFP

Układ mikroskopii fluorescencyjnej z kontrolerem piezoelektrycznym do analizy DNA, obejmujący schemat.
Rysunek 1: Budowa fBFP. (A) Zdjęcie ogólne systemu sprzętowego fBFP. (B) Schemat systemu sprzętowego fBFP. (C) System dwukamerowy „DC2” (pomarańczowy), do którego zamontowano kamerę wysokiej rozdzielczości (niebieska) oraz kamerę fluorescencyjną (biała). (D) Stolik mikroskopowy przystosowany do komory eksperymentalnej i trzech systemów manipulacji mikropipetami. (E i F) Mikrofotografie ustawienia BFP w komorze eksperymentalnej. (E) Zespół mikropipet przedstawiający pipetę sondy (lewa), pipetę celu (górna prawa) oraz pipetę pomocniczą (dolna prawa). (F) Umiejscowienie kuleczki sondy. Kuleczka sondy była manipulowana za pomocą pipety pomocniczej i przytwierdzona do wierzchołka erytrocyta (RBC) w celu utworzenia sondy siły. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

  1.  Włączyć mikroskop (Tabela 1) i źródło światła. Umieścić komorę na głównym stole mikroskopu (Rysunek 1A, D).
  2. Zainstalować wszystkie trzy mikropipety BFP (Rysunek 1D. Lewa: sonda, do przechwytywania erytrocytów (RBC); prawa: cel, do przechwytywania komórki lub kuleczki; dolna prawa: pomocnicza, do przechwytywania kuleczki).
    1. Używając mikro-injektora (Tabela 1), napełnić mikropipetę od tyłu buforem eksperymentalnym. Zdjąć uchwyt pipety (Tabela 1) i trzymać go niżej, aby umożliwić ściekanie wody z końcówki. Szybko wsunąć mikropipetę do końcówki uchwytu, upewniając się, że podczas wkładania do mikropipety nie dostał się pęcherzyk powietrza. Dokręcić śrubę uchwytu.
    2. Zamontować każdy uchwyt pipety na odpowiadającym mu mikromanipulatorze. Przesunąć mikropipety w stronę komory tak, aby ich końcówki znalazły się w obszarze buforu w komorze. Dostosować pozycję mikropipet i zlokalizować je w polu widzenia mikroskopu.
  3. Przesuwać stół z uchwytem komory, aby po kolei odnaleźć skupiska trzech elementów (erytrocytów, celów i kuleczek sondy). Dostosować pozycję odpowiedniej mikropipety, obracając pokrętła manipulatorów, tak aby końcówka mikropipety zbliżyła się do pojedynczej komórki/kuleczki. Zasysać komórkę/kuleczkę, regulując ciśnienie wewnątrz odpowiedniej mikropipety. Wszystkie trzy mikropipety przechwycą swoje odpowiadające elementy.
  4. Przesuwać stół z uchwytem komory, aby znaleźć wolną przestrzeń z dala od skupisk wprowadzonych elementów, w której zostanie przeprowadzony eksperyment. Przełączyć tryb wizualizacji mikroskopu, aby wyświetlić obraz w programie komputerowym na ekranie. Przesunąć wszystkie trzy elementy znajdujące się na końcówkach pipet do pola widzenia programu.
  5. Wyrównać kuleczkę sondy i erytrocyt, a następnie ostrożnie zmanewrować kuleczkę sondy do wierzchołka erytrocytu, krótko docisnąć kuleczkę do erytrocytu i delikatnie wycofać. Dostosować ciśnienie w pomocniczej mikropipetcie, aby delikatnie zdmuchnąć kuleczkę, tak aby pozostała przyklejona do wierzchołka erytrocytu (Rysunek 1F). Odsunąć pomocniczą mikropipetę i wyrównać cel oraz kuleczkę sondy (Rysunek 2A).

Schemat ustawienia mikropipety dla interakcji RBC z limfocytem T z analizą śledzenia krawędzi i wykresami intensywności.
Rysunek 2: Schemat BFP i jego cykl testowy. (A) Wideomikrograf przedstawiający sondę siłową (po lewej) oraz docelny limfocyt T (po prawej) zasysane przez odpowiednie pipety. Stacjonarna sonda siłowa składa się z obrzękniętego RBC i przytwierdzonego do niego koralika z ligandem. Limfocyt T z receptorami (cel) jest zamontowany na piezotranslatorze wyrównanym naprzeciwko sondy. ROI zaznaczono kolorem zielonym. Śledzenie krawędzi zaznaczono niebieską linią. Wstawka przedstawia parę ligand (pMHC, strona koralika) i receptor (TCR, strona limfocytu T) na dwóch przeciwległych powierzchniach w obszarze zaznaczonym na pomarańczowo. (B) Profil intensywności krawędzi koralika z (A). Region ROI w kierunku x naniesiono na oś x (w liczbie pikseli), a intensywność światła (w wartości skali szarości) uśredniono poprzez grupowanie 30 pikseli w kierunku y. (C) Odchylenie RBC oraz pozycja koralika i celu (limfocytu T) w cyklu testowym pomiaru clamp siłowy. Pionowe i poziome linie przerywane wskazują odpowiednio pozycję zerowej siły wierzchołka RBC oraz przebieg czasowy. Liniowy tracker krawędzi deformacji RBC pokazano na niebiesko w każdym panelu. Podobne, lecz mniej rozbudowane etapy stosuje się w pomiarze częstotliwości adhezji (w którym brakuje etapów „clamp” i „dysocjacja”) oraz w pomiarze fluktuacji termicznych (w którym brakuje etapu „dysocjacja”).

  1. W programie, w oknie pola widzenia, należy użyć dostępnych narzędzi do pomiaru odpowiednich promieni mikropipety sondy (Rp), erytrocytów (RBC) (R0) oraz kołowego obszaru kontaktu między erytrocytem a koralikiem sondy (Rc), co pozwala na oszacowanie stałej sprężystości erytrocytów (k) za pomocą następującego równania17,30,
    Równanie przepuszczalności dla mediów porowatych; wzór κ=πRpΔp/(1-Rp/R0)ln[4R0²/(RpRc)].

    gdzie Δp to ciśnienie aspiracyjne na końcówce pipety sondy.

    Uwaga: Z prawa Hooke'a wynika, że siłę wiązania, F, można określić jako iloczyn stałej sprężystości i przesunięcia koralika sondy (d), t.j., F = d (Rysunek 2C).
  2. Wprowadź do programu żądaną stałą sprężystości erytrocytów (należy odnieść się do sekcji 6.6 Protokołu. Stałą sprężystości zazwyczaj ustawia się na 0,25 lub 0,3 pN/nm dla testu zacisku siłowego i testu częstotliwości adhezji oraz na 0,1 pN/nm dla testu fluktuacji termicznych), co pozwoli na obliczenie wymaganego ciśnienia aspiracyjnego w jednostkach centymetrów słupa wody. Reguluj wysokość zbiornika z wodą połączonego z pipetą sondy, aż do osiągnięcia wymaganego ciśnienia aspiracyjnego.
  3. Poprowadź linię poziomą przez wierzchołek erytrocytów, co wygeneruje w sąsiednim oknie krzywą obrazującą jasność (wartość w skali szarości) każdego piksela wzdłuż tej linii. Przesuń linię progu tak, aby znajdowała się mniej więcej w połowie głębokości krzywej (Rysunek 2A, B).
    Uwaga: Najniższy punkt na krzywej jasności poniżej linii progu wskazuje pozycję granicy koralika, zatem dopuszczalne jest tylko jedno minimum lokalne. Obecność dwóch lub więcej minimów lokalnych wskazuje, że obraz nie jest optymalny (prawdopodobnie z powodu braku ostrości obrazu lub złego wyrównania koralika sondy względem erytrocytów).
  4. Wybierz żądany tryb eksperymentu: test fluktuacji termicznych, test częstotliwości adhezji lub test zacisku siłowego. Ustaw parametry zgodnie z potrzebami (np., siła uderzenia = 15 pN, szybkość obciążania = 1 000 pN/s, czas kontaktu = 1 s, siła zacisku = 20 pN (dla testu zacisku siłowego) itd.).
    1. Kliknij „Start”, co pozwoli programowi przesunąć pipetę docelową i wprowadzić cel w kontakt z sondą oraz wyprowadzić go z niego (szczegóły w sekcji Reprezentatywne wyniki). Gromadzenie danych będzie odbywać się równolegle, rejestrując pozycję koralika sondy w czasie rzeczywistym. Zatrzymaj program, klikając przycisk „Stop experiment”, po czym pojawi się okno umożliwiające zapisanie pozyskanych danych.

7. Eksperyment z fluorescencyjnym BFP (fBFP)

  1. Aby korzystać z funkcji fluorescencji systemu BFP, należy włączyć źródło światła wzbudzenia (Tabela 1) oraz kamerę fluorescencyjną (Tabela 1), którymi steruje oddzielny program (Tabela 1). W programie należy wybrać parametry obrazowania fluorescencyjnego, w tym wzmocnienie (gain), czas ekspozycji, kanały wzbudzenia (w tym przypadku światło 340 nm i 380 nm) itd. Należy przeprowadzić wszystkie przygotowania zgodnie z protokołem eksperymentu BFP, w tym wyrównanie sondy i celu, co umożliwi wizualizację obrazu fluorescencyjnego żywej komórki celu wzbudzonej światłem 340 nm lub 380 nm.
  2. Użyj narzędzia do sekcjonowania, aby wstępnie wyznaczyć obszar, w którym komórka będzie znajdować się przez cały okres rejestracji.
    Uwaga: Ze względu na zastosowanie cyklu zbliżania-kontaktu-wycofania, komórka będzie powtarzalnie poruszać się do przodu i do tyłu, dlatego wyznaczony obszar jest znacznie większy niż sama komórka.
  3. Kliknij „Record”, aby umożliwić naprzemienne wzbudzanie wewnątrzkomórkowego barwnika fluorescencyjnego (Fura2) światłem 340 nm i 380 nm; para odpowiadających im obrazów fluorescencyjnych będzie rejestrowana naprzemiennie około raz na sekundę. Jednocześnie kliknij „Start” w programie, aby rozpocząć eksperyment BFP w celu analizy oddziaływań molekularnych oraz eksperyment obrazowania fluorescencyjnego do monitorowania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej. System wygeneruje plik z surowymi danymi dla wiązania receptor-ligand (patrz Rysunek 6A poniżej) oraz serię obrazów fluorescencyjnych w formacie .tiff dla sygnałów wapniowych.

8. Analiza danych

  1. Analiza danych BFP
    1. Analiza danych dla testu częstotliwości adhezji
      1. Kolejno sprawdzaj sygnał „siła vs. czas” dla każdego cyklu i zapisuj, które cykle zawierają zdarzenie adhezji, a które nie, a następnie podsumuj wyniki, aby uzyskać średnią częstotliwość adhezji.
      2. Zbierz wartości siły zerwania dla każdego zdarzenia adhezji, która jest wartością szczytową liniowo zwiększanej siły przed zerwaniem wiązania. Po zebraniu odpowiedniej liczby sił zerwania dla zakresu szybkości rampowania, wyznacz rozkład siły zerwania dla każdej szybkości rampowania, z którego za pomocą analizy dynamicznej spektroskopii sił wyznacza się zależną od siły stałą szybkości dysocjacji (off-rate) receptor-ligand18,31.
    2. Analiza danych dla testu fluktuacji termicznych
      1. Kolejno sprawdzaj sygnał fazy zaciskania (clamping phase) każdego cyklu, który prawdopodobnie zawiera wiele zdarzeń asocjacji i dysocjacji wiązań. Wykorzystaj poziom fluktuacji termicznych w fazie zaciskania (średnie odchylenie standardowe z przesuwnego interwału 70 kolejnych punktów czasowych pozycji kuleczki) w sygnale „siła vs. czas” jako wskazówkę do rozróżnienia zdarzeń asocjacji i dysocjacji wiązań, ponieważ utworzenie wiązania odpowiada spadkowi fluktuacji termicznych.
      2. Oznacz interwał od momentu dysocjacji wiązania (gdy fluktuacje termiczne wracają do poziomu normalnego) do momentu kolejnego utworzenia wiązania jako czas oczekiwania, a czas trwania wiązania od jego asocjacji do dysocjacji jako czas życia wiązania; obie te wartości należy zebrać podczas inspekcji danych. Oblicz średni czas oczekiwania oraz średni czas życia wiązania, które odzwierciedlają odpowiednio odwrotność stałej szybkości asocjacji (on-rate) oraz odwrotność stałej szybkości dysocjacji (off-rate) przy zerowej sile16,30.
    3. Analiza danych dla testu zacisku siłowego (force clamp)
      1. Zapisz parametry wszystkich zdarzeń określających czas życia, w tym średnią siłę i czas życia wiązania wraz z numerem sekwencyjnym, a także czasem rozpoczęcia i zakończenia, co pozwoli na wykreślenie kumulatywnej krzywej czasu życia (np. Rycina 6C, krzywa żółta).
      2. Zbierz odpowiednią liczbę zdarzeń czasu życia dla zakresu sił. Pogrupuj je w różne przedziały siły, co pozwoli wyznaczyć średni czas życia w każdym przedziale, a w całości da krzywą „średni czas życia vs. siła” (Rycina 4).
  2. Analiza danych obrazowania fluorescencji wapnia
    1. Dostosuj próg intensywności, aż obrazy fluorescencyjne pokażą wyraźny kontur komórki w kanałach 340 nm i 380 nm bez szumów tła (Rycina 5A, B). Następnie analizuj klatka po klatce wewnątrzkomórkowy sygnał Ca2+ przy użyciu pseudokolorów wskazujących poziom intensywności (Rycina 6B), wyznaczanego na podstawie stosunku intensywności 340 nm/380 nm, aby wygenerować krzywą „znormowana intensywność Ca2+ vs. czas” (Rycina 6C). Wykorzystaj pseudokolorowe obrazy fluorescencyjne do stworzenia filmu prezentującego poziom fluorescencji sekunda po sekundzie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Technika BFP została opracowana przez laboratorium Evansa w 1995 roku 17. To narzędzie do pomiaru sił pikoniutonowych było szeroko stosowane do pomiaru oddziaływań białek unieruchomionych na powierzchniach, w celu analizy dwuwymiarowej kinetyki cząsteczek adhezyjnych oddziałujących z ich ligandami16,19,20,30, pomiaru elastyczności molekularnej21,29 oraz określania zmian konformacyjnych białek21. W przypadku fBFP dodaje się dodatkowy zestaw urządzeń do epi-fluorescencji z odpowi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Udany eksperyment z fBFP wiąże się z kilkoma krytycznymi kwestiami. Po pierwsze, aby obliczenia siły były wiarygodne, mikropipeta, RBC i koralik sondy powinny być ustawione jak najbliżej współosiowego. Występ RBC wewnątrz pipety powinien mieć około jednej średnicy pipety sondy, tak aby tarcie między RBC a pipetą było znikome. Dla typowego ludzkiego krwinki czerwonej optymalna średnica pipety wynosi 2,0-2,4 μm, co zapewnia najlepsze dopasowanie do równania 117,30. Po drugie, aby zapewnić, że pomiary w teście si...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Badania związane z tym artykułem i rozwojem technologii fBFP w laboratorium Zhu były wspierane przez granty NIH AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 i TW008753. Dziękujemy Evanowi Evansowi za wynalezienie tego inspirującego narzędzia eksperymentalnego oraz członkom laboratorium Evansa, Andrew Leungowi, Kojiemu Kinoshicie, Wesleyowi Wongowi i Kenowi Halvorsenowi, za pomoc w budowie BFP. Dziękujemy również innym członkom laboratorium Zhu, Fang Kongowi, Chenghao Ge i Kaitao Li, za ich pomoc w rozwoju oprzyrządowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Jednozasadowy monohydrat fosforanu sodu (NaH2PO4 • H2O)Sigma-AldrichS9638Preparat buforu fosforanowego
Anhy. Fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907Preparat buforowy fosforanowy
Węglan sodu (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Preparat buforowy węglanowy/wodorowęglanowy
Wodorowęglan sodu (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Węglan/wodorowęglan preparat buforowy
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichS7653N2-5% preparat buforowy
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichP9541N2-5% preparat buforowy
Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)Sigma-AldrichP5655N2-5% preparat buforowy
SacharozaSigma-AldrichS0389Przygotowanie buforu N2-5%
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Funkcjonalizacja kulek
Biotyna-PEG3500-NHSJenKemA5026-1Biotynylacja RBC
NystatynaSigma-AldrichN6261Regulacja osmolarności RBC
Wodorotlenek amonu (NH4OH)Sigma-AldrichA-6899Koralik szklany silanizacja
MetanolBDH67-56-1Silanizacja kulek szklanych
30% Nadtlenek wodoru (H2O2)J. T. BarkerJan-86Silanizacja kulek szklanych
Kwas octowy (lodowaty)Sigma-AldrichARK2183Silanizacja kulek szklanych
3-merkaptopropylotrimetoksysilan (MPTMS)Uct Specialties, llc4420-74-0Funkcjonalizacja kulek szklanych Koraliki
ze szkła borokrzemianowegoDistrilab Particle Technology9002Funkcjonalizacja kulek szklanych
Streptawidyna− MaleimideSigma-AldrichS9415Funkcjonalizacja kulek szklanych
BSASigma-AldrichA0336Ligand funkcjonalizujący
Fura2-AMLife TechnologiesF-1201Wewnątrzkomórkowe ładowanie barwnikiem fluorescencji wapnia
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650Wewnątrzkomórkowe ładowanie barwnika fluorescencji wapnia
Koraliki Quantibrite PEBD Biosciences340495Kwantyfikacja gęstości
Cytometr przepływowyBD BiosciencesBD LSR IIKwantyfikacja gęstości
Rurka kapilarna 0,7-1,0 mm x 30 caliKimble Chase46485-1Produkcja mikropipet
Flaming/Brown Ściągacz do mikropipetInstrument sutterP-97Produkcja mikropipet
Mikrosiła do pipetNarishigeMF-900Produkcja mikropipet
Olej mineralnyFisher ScientificBP2629-1Zespół komory
Szklana osłona mikroskopuFisher Scientific12-544-GZespół komory
MikrowtryskiwaczWorld Precision InstrumentsMF34G-5Zespół komory
1 ml strzykawkaBD Zespół 309602 komory
Uchwyt na mikropipetyNarishigeHI-7Montaż komory
Domowe części mechaniczne i adaptery zaprojektowane w domu przy użyciu obróbki CNC. Instrument biofizycznyWszystkie części są dostosowywane zgodnie z projektami CAD.System BFP
Mikroskop (odwrócony TiE)System NikonMEA53100BFP
Obiektyw CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)System NikonMRH00401BFP
Aparat, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, monoGraftek Imaging02-2020CSystem BFP
Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADCGraftek Imaging02-2185ABFP system
Ręczna submikronowa głowica pomiarowa z pilotem o wysokiej rozdzielczościKarl SussPH400BFP
Stół antywibracyjny (5' x 3')System TMC77049089BFP
Ręczny etap translacyjny 3DNewport462-XYZ-M
Oprogramowanie CAD 3D SolidWorksSOLIDWORKS Corp.Wersja 2012 SP5System BFP
OprogramowanieLabVIEW National InstrumentsWersja 2009System BFP, program BFP
Stolik translacyjny 3D piezoelektrycznyPhysik InstrumenteM-105.3PSystem BFP
Liniowy akumulator piezoelektrycznyPhysik InstrumenteP-753.1CDSystem
BFP OprogramowanieWersja 1.4system fBFP, fluorescencja program do obrazowania
Dual Cam (DC-2)Fotometria77054724system fBFP
Filtr emisyjny Dual Cam (T565LPXR)Fotometria77054725system fBFP
Kamera fluorescencyjnaHamamatsuORCA-R2 C10600-10BSystem fBFP
Folia parafinowa z tworzywa sztucznego (Parafilm)Bemis Company, IncUszczelnienie butelkiPM996
Węglan/ Bufor wodorowęglanowy (pH 8,5)8,4 g/l węglan sodu (Na2CO3), 10,6 g/l wodorowęglan sodu (NaHCO3
Bufor fosforanowy (pH 6,5-6,8)27,6 g/l NaFosforan jednozasadowy (NaH2PO4 • H2O), 28,4 g/L Anhy. NaFosforan dwuzasadowy (Na2HPO4)
N2-5% bufor (pH 7,2)20,77 g/L chlorek potasu (KCl), 2,38 g/L chlorek sodu (NaCl), 0,13 g/l jednozasadowy fosforan potasu (KH2PO4), 0,71 g/l anhy. fosforan sodu dwuzasadowy (Na2HPO4), 9,70 g/l sacharozy
System Micromanager )

Bibliografia

  1. Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
  2. Davis, M. M., Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature. 334, 395-402 (1988).
  3. Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. Mechanical control of stem cell differentiation. Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).
  4. Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters. Frontiers in immunology. 3, 86(2012).
  5. Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network. Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).
  6. Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. T cell antigen recognition at the cell membrane. Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).
  7. Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions. Physical biology. 9, 045005(2012).
  8. Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).
  9. Marshall, B. T., et al. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423, 190-193 (2003).
  10. Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand. The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).
  11. Yago, T., et al. Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear. The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).
  12. Yago, T., et al. Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF. The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).
  13. Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette. Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).
  14. Huang, J., et al. The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness. Nature. 464, 932-936 (2010).
  15. Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).
  16. Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations. Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).
  17. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).
  18. Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).
  19. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib. Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).
  20. Chen, W., Lou, J., Zhu, C. Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds. The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).
  21. Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells. The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).
  22. Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. Mechanosensing in T lymphocyte activation. Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).
  23. Bashour, K. T., et al. CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).
  24. Nesbitt, W. S., et al. Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow. The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).
  25. Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor. Blood. 100, 2793-2800 (2002).
  26. Lefort, C. T., Ley, K. Neutrophil arrest by LFA-1 activation. Frontiers in immunology. 3, 157(2012).
  27. Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling. Cell. 157, 357-368 (2014).
  28. Lou, J., et al. Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge. The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).
  29. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature communications. 5, 4886(2014).
  30. Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods. Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).
  31. Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. Force history dependence of receptor-ligand dissociation. Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).
  32. Xiang, X., et al. Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin. PloS one. 6, e27946(2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wewnątrzkomórkowe przesyłanie sygnałów wapniowychanaliza pojedynczych komórekspektroskopia siłmikroskopia fluorescencyjnaczujnik siły z erytrocytówwiązanie receptorów limfocytów Tregulacja siły mechanicznejmanipulacja mikropipetą
Sonda siły biomembrany fluorescencyjnej: jednoczesna kwantyfikacja kinetyki receptor-ligand i sygnalizacji wewnątrzkomórkowej indukowanej wiązaniem na pojedynczej komórce
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.