Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

Yulia Kaluzhny; Helena Kandárová; Laurence d’Argembeau-Thornton; Paul Kearney; Mitchell Klausner

doi:10.3791/52979

Artykuł metodologiczny

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

DOI:

10.3791/52979

⸱

23 sierpnia 2015

Yulia Kaluzhny¹ , Helena Kandárová² , Laurence d’Argembeau-Thornton¹ , Paul Kearney¹ , Mitchell Klausner¹

¹MatTek Corporation, ²MatTek In Vitro Life Science Laboratories

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby spełnić wymagania Siódmej Poprawki do Dyrektywy Kosmetycznej UE i prawodawstwa UE REACH, potrzebne są sprawdzone alternatywne metody wiarygodnej i dokładnej oceny toksyczności dla oczu u człowieka. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy test podrażnienia oczu (EIT), który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE), który jest oparty na normalnych komórkach ludzkich. EIT jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) oraz te, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS). Test wykorzystuje dwa oddzielne protokoły, jeden przeznaczony dla ciekłych chemikaliów i drugi, podobny protokół dla stałych artykułów testowych. Model predykcyjny EIT wykorzystuje pojedynczy okres ekspozycji (30 minut dla cieczy, 6 godzin dla ciał stałych) i granicę żywotności pojedynczej tkanki (60,0% zgodnie z testem MTT). Na podstawie wyników dla 83 substancji chemicznych (44 ciecze i 39 ciał stałych) EIT osiągnął 95,5/68,2/ i 81,8% czułości/swoistości i dokładności (SS&A) dla cieczy, 100,0/68,4/ i 84,6% SS&A dla ciał stałych oraz 97,6/68,3/ i 83,1% dla ogólnego SS&A. EIT w znacznym stopniu przyczyni się do sklasyfikowania potencjalnego działania drażniącego na oczy przez szeroką gamę ciekłych i stałych substancji chemicznych bez wykorzystania zwierząt, aby spełnić wymogi regulacyjne w zakresie badań. Metoda EpiOcular EIT została wdrożona w 2015 r. do wytycznych OECD dotyczących badań jako TG 492.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkty konsumenckie, takie jak kosmetyki, detergenty i domowe środki czyszczące, zawierają różne substancje chemiczne, które mogą spowodować poważne uszkodzenia, jeśli dotkną oczy. W związku z tym amerykańskie i unijne agencje regulacyjne wymagają testowania tych środków pod kątem działania drażniącego na oczy w celu zapewnienia bezpieczeństwa konsumentów¹. Ocena potencjału działania drażniącego na oczy mieszanin i preparatów jest również wymogiem zgodności z przepisami REACH (Registration, Evaluation, Authorization, and Restriction of Chemicals) w zakresie etykietowania składników kosmetycznych zgodnie z dyrektywą kosmetyczną UE w zakresie transportu chemikaliów oraz etykietowania pestycydów i artykułów gospodarstwa domowego². Obecnie agencje regulacyjne wymagają oceny zagrożeń dla oczu przy użyciu Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS)³. GHS opiera się głównie na teście podrażnienia oczu Draize'a, najczęściej stosowanym teście podrażnienia oczu, w którym obce substancje i mieszaniny są wprowadzane bezpośrednio do worka spojówkowego oka królika⁴. Zgodnie z klasyfikacją GHS kategoria 1 GHS (substancje na oczy) odnosi się do badanych substancji chemicznych, które powodują poważne początkowe uszkodzenie tkanek oka lub poważne uszkodzenie oka i wzroku, które nie jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po narażeniu^3,5. Kategoria 2 GHS odnosi się do badanych substancji chemicznych, które powodują znaczące zmiany w oku, które są w pełni odwracalne w ciągu 21 dni od narażenia. Badane substancje chemiczne, które nie są substancjami ani drażniącymi, określa się mianem nr kategorii GHS.

Przez ponad 40 lat, test Draize na oku królika był krytykowany za brak odtwarzalności, przecenianie ludzkich reakcji i wykorzystanie żywych zwierząt^5-8. Obawy te zachęciły do wielu propozycji udoskonalenia, ograniczenia i zastąpienia testu in vivo ⁹. Potrzeba zatwierdzonych alternatyw niewymagających wykorzystania zwierząt została dodatkowo wzmocniona przez przyjęcie siódmej poprawki do dyrektywy kosmetycznej, która zakazała wykorzystywania zwierząt w ocenie bezpieczeństwa produktów kosmetycznych (w 2005 r.) i składników (w 2009 r.⁾².

Od 1996 roku, zrekonstruowany model tkanki rogówkowej jest szeroko stosowany przez przemysł kosmetyczny do oceny potencjału drażniącego surowców, preparatów na bazie środków powierzchniowo czynnych i mieszanin złożonych, które są przeznaczone do stosowania w oku^lub w jego pobliżu. Zastosowanie modelu tkankowego RhCE pozwala na bezpośrednią miejscową aplikację badanego materiału na powierzchnię tkanki w jego natywnej, nierozcieńczonej postaci. W ten sposób preparaty nierozpuszczalne w wodzie mogą być testowane bez rozcieńczania ich rozpuszczalnikami. W odpowiedzi na wniosek EURL ECVAM (Laboratorium Referencyjne Unii Europejskiej, Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych) dotyczący szeroko stosowanej, prostej i ekonomicznej metody, opracowano Test Podrażnienia Oczu (EIT), który wykorzystuje pojedynczy czas ekspozycji i jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu od materiałów, które nie wymagają oznakowania (Rysunek 1)¹⁴. Na podstawie wyników dla 83 substancji chemicznych (44 ciecze i 39 ciał stałych), EIT osiągnął 95,5/68,2/ i 81,8% czułości/swoistości i dokładności (SS&A) dla cieczy, 100,0/68,4/ i 84,6% SS&A dla ciał stałych oraz 97,6/68,3/ i 83,1% dla ogólnego SS&A.

W 2007 roku, wielolaboratoryjne badanie prewalidacyjne sponsorowane przez Cosmetics Europe (dawniej Colipa) pod auspicjami EURL ECVAM oceniło znaczenie i wiarygodność EIT w celu doprowadzenia go do formalnej walidacji¹⁵. W tym badaniu przeprowadzono 298 niezależnych badań w siedmiu niezależnych laboratoriach. Wyniki badania wykazały 99,7% zgodność w przewidywaniach przy niskich współczynnikach zmienności we wszystkich uczestniczących laboratoriach¹⁵. W związku z tym w 2010 r. protokół EIT został włączony do formalnego programu walidacji EURL ECVAM. W badaniu walidacyjnym wykorzystano 104 zakodowane badane substancje chemiczne, w tym pojedyncze substancje i mieszaniny chemiczne, dla których dostępne były dane referencyjne in vivo (dane dotyczące działania drażniącego na oczy Draize'a). Opierając się na sukcesie tych prac, w 2014 r. przedłożono projekt wytycznych OECD dotyczących badań. Oczekuje się, że EIT w znacznym stopniu przyczyni się do klasyfikacji potencjału działania drażniącego na oczy szerokiej gamy materiałów zgodnie z systemem klasyfikacji i oznakowania GHS ONZ.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie tkanek RhCE do leczenia – Dzień 0

Po otrzymaniu komercyjnego zestawu ludzkiego nabłonka rogówkowego (RhCE) należy sprawdzić wszystkie elementy zestawu pod kątem integralności (szczegółowe informacje na temat zestawu znajdują się w części Elementy zestawu do oznaczania standardowego (tabela 1) oraz Sprzęt i materiały wymagane do przeprowadzenia testu EIT (Tabela 2). W dniu otrzymania należy zrównoważyć chusteczki (w 24-dołkowym pojemniku transportowym) do RT przez 15 minut.

powiedział: powiedział:

kwota	Odczynnik	Warunki	źródło	opis	Data ważności
1	Szczelna 24-dołkowa płytka z tkankami epiocznymi (OCL-200)	2-8 °C	MatTek	Zawiera 24 tkanki wkładek do hodowli komórkowych, opakowanie na agarozie	72 godz
1 butelka, Pojemność 200 ml	Test EpiOcular Assay Medium (OCL-200-ASY)	2-8 °C	MatTek	Podłoże na bazie DMEM	21 dni
1 butelka, Pojemność 100 ml	Wolny od Ca⁺⁺Mg⁺⁺ Dulbecco's-PBS (DPBS)	Rt	Sigma-Aldrich, D5652 lub odpowiednik.	Służy do płukania wkładów	1 rok
4	Płytki 6-dołkowe	Rt	sokół	Służy do utrzymywania tkanek podczas protokołu testu	nie
cyfra arabska	Płytki 12-dołkowe	Rt	sokół	Używany podczas protokołu testu	nie
cyfra arabska	Płytki 24-dołkowe	Rt	sokół	Służy do wykonywania testu MTT	nie
1 fiolka, Pojemność 0,5 ml	Octan metylu (CAS#79-20-9)	Rt	Sigma-Aldrich, Kot# 186325	Używany jako PC w teście	1 miesiąc

Tabela 1: Składniki zestawu do testów standardowych.

Sprzęt/ Materiał	Potrzebne do:
Inkubator nawilżany (37 ± 1 °C, 5 ± 1% CO_2,wilgotność 90 ± 10%)	Inkubacja tkanek przed i w trakcie testów
Okap z przepływem laminarnym	Bezpieczna praca w sterylnych warunkach
Pompa próżniowa (opcjonalnie)	Pożywka zasysająca i roztwory
Fotometr z czytnikiem płytek (do płytek 96-dołkowych)	Czytanie OD
Wytrząsarka płytkowa	Ekstrakcja formazanu
Sterylne kleszcze o krawędziach	Postępowanie z wkładkami tkankowymi
Stopery	Czas stosowania badanych materiałów i inne kroki określone w czasie w protokole
Łaźnia wodna (37 ± 1 °C)	Pożywka grzewcza i roztwór MTT
Moździerz i tłuczek	Mielenie ziarnistych ciał stałych
Pipeta wyporowa (50 μl)	Stosowanie lepkich i półstałych materiałów i zawiesin
Pipety regulowane (200 μl–2 ml)	Zastosowanie materiałów płynnych, pożywki do oznaczania i MTT
Wstępnie wysterylizowane końcówki (200 μl i 20 μl), Rainin Cat#HR-200F i HR-20F (lub odpowiedniki)	Zastosowanie materiałów płynnych, pożywki do oznaczania i MTT
Wstępnie wysterylizowane końcówki z szerokim otworem (250 μl), Rainin Cat#HR-250WS (lub odpowiednik)	Stosowanie lepkich i półstałych materiałów i zawiesin
Pojemniki na próbki 8 uncji/220 ml, Falcon Cat# 3540200 (lub odpowiednik)	Płukanie tkanek
Sterylne strzykawki jednorazowego użytku (np. strzykawka tuberkulinowa 1 ml Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG, kat. Nr 9161406V)	Dostawa ~50 mg materiałów stałych (opcjonalnie)
Ted Pella mikro szpatułka/łyżka, Ted Pella Inc., Cat# 13504 (lub równoważna, ostra łyżka lub łyżeczka kostna, np. Aesculap, No: FK 623)	Dostawa materiałów stałych ~50 mg
Sól fizjologiczna Dulbecco wolna od Ca⁺⁺ i Mg⁺⁺ (Ca⁺⁺Mg⁺⁺Free-DPBS): Sigma-Aldrich, Cat# D5652 (lub odpowiednik)	Płukanie tkanek podczas badania
Sterylna woda dejonizowana, klasa kultury tkankowej (jakość biologiczna lub równoważna)	Użyj jako NC
96-dołkowe płaskie płyty denne, Falcon (lub odpowiednik)	Do odczytu OD
Wymienne końcówki bawełniane (sterylne)	Do suszenia powierzchni tkanki (opcjonalnie)
Taśma klejąca lub Parafilm	Płytki zakrywające podczas ekstrakcji formazanu
Zestaw testowy MTT-100	Zawiera odczynnik MTT-Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromek (Sigma #M-5655) i ekstrakt izopropanolowy.

Tabela 2: Sprzęt i materiały wymagane do przeprowadzenia EIT.

W sterylnych warunkach otwórz plastikową torbę zawierającą 24-dołkową płytkę z tkankami RhCE i wyjmij sterylną gazę. Sprawdź wszystkie tkanki pod kątem pęcherzyków powietrza między żelem agarozowym a wkładką. Nie należy używać kultur z pęcherzykami powietrza pod wkładką pokrywającą >50% powierzchni wkładki, tkanek uszkodzonych lub tkanek całkowicie pokrytych płynem.
Oznacz płytki 6-dołkowe kodami badanego artykułu lub kodów kontrolnych i czasami ekspozycji. Podwielokrotność 1,0 ml pożywki do oznaczania (dostarczonej z zestawem), wstępnie podgrzanej do temperatury około 37 °C, do studzienek wstępnie znakowanych płytek 6-dołkowych.
Za pomocą sterylnych kleszczyków usuń każdą wkładkę zawierającą tkankę RhCE i umieść wkładkę w oznakowanej płytce 6-dołkowej. Na tym etapie należy usunąć pozostałą agarozę transportową, która przylega do zewnętrznych stron wkładu, delikatnie osuszając ją na sterylnej bibule filtracyjnej. Uwolnij wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod wkładkami.
Wstępnie inkubować tkanki RhCE na płytkach 6-dołkowych w standardowych warunkach hodowli (SCC, wilgotna atmosfera z 5 ± 1% CO₂ w temperaturze 37 ± 1 °C) przez 1 godzinę.
Po 1 godzinie zastąp pożywkę testową 1,0 ml świeżej pożywki testowej podgrzanej do 37 °C i inkubuj tkanki RhCE w warunkach SCC (przez noc = O/N) (16-24 godziny).

2. Leczenie wstępne – Dzień 1

Po inkubacji O/N nanieść 20 μl Ca²⁺Mg²⁺ wolnego od fosforanów soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS, pod warunkiem) za pomocą odpowiedniego urządzenia do pipetowania. Jeśli DPBS nie rozprzestrzenia się po tkankach, delikatnie postukaj w wkładkę na płytce, aby upewnić się, że DPBS zwilży całą powierzchnię tkanki.
Inkubować tkanki RhCE w SCC przez 30 ± 2 min.
Uwaga: Ten krok jest niezbędny do nawodnienia tkanek i naśladowania warunków in vivo.

3. Procedury ekspozycji materiału testowego

Zastosować każdy badany artykuł i kontrole w celu zduplikowania tkanek RhCE (n = 2). Procedura dozowania badanego artykułu jest inna dla cieczy i ciał stałych. Nanieść miejscowo 50 μl płynnych artykułów testowych za pomocą pipety. Czas ekspozycji dla cieczy wynosi 30 min. Nanieść 50 mg stałych artykułów testowych za pomocą wypoziomowanej łyżki (skalibrowanej na 50 mg chlorku sodu). Czas ekspozycji na ciała stałe wynosi 6 godz.
Uwaga: Płyny definiuje się jako substancje płynne (np. płyny, żele i kremy), które można nakładać za pomocą urządzenia pipetującego. Ciała stałe definiuje się jako substancje niepłynne (np. proszki, materiały żywiczne lub woskowe), których nie można nakładać za pomocą pipety.
1. Jeżeli stan fizyczny badanych przedmiotów nie jest łatwy do określenia, umieścić fiolki z badanym artykułem w łaźni wodnej na 15 minut (37 °C). Postępuj zgodnie z protokołem EIT dla cieczy dla tych badanych artykułów, które upłynniają się w temperaturze 37 °C.
2. Do materiałów szczególnie lepkich należy używać pipety wyporowej.
Najpierw należy dozować kontrolę ujemną i kontrole dodatnie, a następnie dozować badane przedmioty.
1. Nanieść 50 μl kontroli ujemnej (NC) i kontroli dodatniej (PC) na tkanki RhCE za pomocą standardowej pipety. NC to sterylna woda dejonizowana; PC to octan metylu (CAS # 79-20-9). Stosuj NC i PC przez 30 minut podczas testowania płynnych artykułów testowych i przez 6 godzin podczas testowania stałych artykułów testowych.

4. Ekspozycja na artykuł testowy – Dzień 1

W przypadku obróbki badanych płynnych artykułów należy postępować zgodnie z harmonogramem podanym w tabeli 3. Pozostawić 1-minutowe odstępy między aplikacjami każdego badanego przedmiotu, aby zapewnić równe narażenie dla wszystkich tkanek.
1. Po 30 ± 2 minutowej obróbce wstępnej DPBS, należy miejscowo nanieść 50 μl NC i PC, a następnie każdy płynny artykuł testowy miejscowo na tkanki RhCE za pomocą odpowiedniego urządzenia do pipetowania.
2. Nanieść 50 μl płynnego badanego przedmiotu bezpośrednio na tkankę, aby pokryć górną powierzchnię. Odetnij wąski koniec końcówki pipety, aby poszerzyć otwór na lepkie materiały. W przypadku bardzo lepkich materiałów należy nałożyć badany przedmiot na urządzenie dozujące (cylinder z płaską główką o średnicy nieco mniejszej niż wewnętrzna średnica wkładki tkankowej lub plastikowa pinezka), odwrócić urządzenie dozujące i umieścić je na tkance tak, aby badany przedmiot równomiernie stykał się z powierzchnią tkanki.
3. Jeśli badany artykuł nie rozprzestrzenia się po tkance, delikatnie postukaj w wkładkę, aby upewnić się, że rozprowadza się na całej powierzchni tkanki. Nie zaleca się mechanicznego rozprowadzania badanych przedmiotów (np. za pomocą końcówki do pipety), ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanek.
4. Inkubować tkanki w SCC przez 30 ± 2 min.
W przypadku obróbki stałych artykułów testowych – Dzień 1 należy postępować zgodnie z harmonogramem podanym w Tabeli 4. Pozostawić 2-minutowe odstępy między aplikacjami każdego badanego artykułu, aby zapewnić równe narażenie dla wszystkich tkanek.
1. Po 30 ± 2 minutowej obróbce wstępnej DPBS nanieść miejscowo 50 μl NC i PC na tkanki RhCE za pomocą odpowiedniego urządzenia do pipetowania.
2. W przypadku aplikacji stałego wyrobu do badań należy wyjąć wkładki (n = 2) z dołka i umieścić je na sterylnej powierzchni (np. pokrywie płytki wielodołkowej), aby uniknąć rozlania się badanego przedmiotu do pożywki.
3. Za pomocą wypoziomowanej łyżki nanieść miejscowo około 50 mg badanego przedmiotu na powierzchnię tkanki; upewnić się, że powierzchnia tkanki jest całkowicie pokryta badanym przedmiotem. Jeśli badany przedmiot nie rozprzestrzenia się po tkance, należy delikatnie potrząsnąć wkładką z boku na bok, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie pokryta badanym elementem. Nie zaleca się mechanicznego rozprowadzania badanych przedmiotów (np. za pomocą końcówki do pipety), ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanek.
  1. W razie potrzeby zmiel krystaliczne proszki za pomocą moździerza i tłuczka, aby zagwarantować lepszy kontakt badanego przedmiotu z tkanką.
  2. Alternatywnie, należy umieścić proszki bezpośrednio na kulturze tkankowej wewnątrz wkładki za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z odciętą głowicą. Wprowadzić proszki do strzykawki, gdy tłok jest odciągnięty, a następnie nanieść, naciskając tłok w dół.
  3. Jeśli zewnętrzna ścianka wkładu jest zanieczyszczona np. proszkami, należy zetrzeć cząstki sterylną gazą.
4. Po podaniu należy umieścić tkanki z powrotem na płytkach 6-dołkowych zawierających pożywkę hodowlaną i inkubować w SCC przez 6 godzin ± 15 minut.

5. Płukanie

Przygotować zestaw trzech czystych zlewek (o pojemności 150 ml) na badany artykuł i napełnić każdą z nich 100 ml DPBS. Dla każdego badanego artykułu użyj innego zestawu trzech zlewek.
Po upływie 30 ± 2 minut ekspozycji w przypadku materiałów płynnych lub 6 godzin ± 15 minut w przypadku materiałów stałych, należy wyjąć i wyrzucić urządzenie dozujące, jeśli było używane.
Wyjąć wkładki zawierające tkankę RhCE z pożywki, chwytając za górną krawędź plastikowego "kołnierza" cienkimi kleszkami. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby ułatwić przenoszenie i dekantację. Opłucz chusteczki po dwie na raz, przytrzymując zduplikowane wkładki razem za kołnierze za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić tkanek kleszczami.
Zdekantować badane przedmioty lub kontrole z powierzchni tkanki na czysty materiał chłonny (ręcznik papierowy, gaza itp.)
Zanurzyć wkładki w pierwszej zlewce DPBS, obracać okrężnymi ruchami w DPBS przez około 2 sekundy, podnieść wkładki tak, aby były w większości wypełnione DPBS i zdekantować płyn z powrotem do zlewki. Powtórz ten proces trzy razy w pierwszej zlewce.
Opłucz wkładki w drugiej i trzeciej zlewce DPBS trzy razy każda w ten sam sposób.
Zdekantować pozostałą ciecz we wkładzie na materiał chłonny. Obrócić wkładkę pod kątem około 45° (otwartym końcem do dołu) i przyłożyć górną wargę do materiału chłonnego.
Uwaga: Jeżeli nie jest możliwe usunięcie całego widocznego materiału do badań, nie należy wykonywać dalszego płukania, aby uniknąć uszkodzenia tkanek w wyniku nadmiernego obchodzenia się z nim.

6. Po kąpieli

Po wypłukaniu natychmiast zanurzyć tkanki w 5 ml pożywki do oznaczania uprzednio podgrzanej do temperatury cieplnej we wstępnie znakowanej płytce 12-dołkowej.
Inkubować tkanki przez 12 ± 2 minuty w przypadku materiałów płynnych lub 25 ± 2 minuty w przypadku materiałów stałych zanurzonych w temperaturze pokojowej, aby ułatwić usunięcie wszelkich pozostałości badanego przedmiotu.

7. Po inkubacji

Pod koniec okresu zanurzenia po namaczaniu zdekantować pożywkę testową z tkanek i osuszyć wkładki na materiale chłonnym.
Przenieść wkładki do wstępnie oznakowanej płytki 6-dołkowej zawierającej 1 ml ciepłego podłoża do oznaczania.
1. Inkubować tkanki przez 120 ± 15 minut w SCC dla płynnych materiałów testowych.
2. Inkubować tkanki przez 18 ± 0,25 godziny w SCC dla stałych materiałów testowych.

8. Test żywotności MTT – Dzień 1 (Protokół dla płynów) i Dzień 2 (Protokół dla ciał stałych)

Test MTT należy przeprowadzić po inkubacji trwającej odpowiednio 120 ± 15 minut dla cieczy i 18 ± 0,25 godziny dla ciał stałych.
Przygotować 1,0 mg/ml roztworu MTT i podwielokrotność 0,3 ml roztworu do każdego dołka na wstępnie znakowanej płytce 24-dołkowej.
1. Użyj komercyjnego zestawu MTT (Tabela 5):
2. Na 2 godziny przed użyciem rozmrozić koncentrat MTT w temperaturze pokojowej (RT). Połączyć 2 ml koncentratu MTT i 8 ml rozcieńczalnika MTT, aby uzyskać 1,0 mg/ml roztworu MTT.
3. Roztwór MTT należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Nie należy przechowywać roztworu MTT dłużej niż 1 dzień.
Pod koniec postinkubacji wyjąć każdą wkładkę z płytki 6-dołkowej i delikatnie osuszyć materiał chłonny.
Umieścić wkładki w 24-dołkowej płytce zawierającej 0,3 ml roztworu MTT. Uwolnij wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod wkładkami. Inkubować płytkę przez 180 ± 10 minut w SCC.
Ekstrakcja MTT
1. Po 180 ± 10 minutach inkubacji w roztworze MTT wyjąć każdą wkładkę z płytki 24-dołkowej i osuszyć dno wkładu na materiale chłonnym.
2. W przypadku niebarwiących cieczy testowych (ekstrakcja zanurzeniowa): Przenieść wkładki do wstępnie oznakowanej 24-dołkowej płytki zawierającej 2,0 ml roztworu ekstrahentu (izopropanolu) tak, aby zanurzyła wkładkę.
3. W przypadku ciał stałych i ciekłych barwników (ekstrakcja bez zanurzenia w celu uniknięcia zanieczyszczenia roztworu ekstrahentu): Przenieść wkładki do wstępnie znakowanej płytki 6-dołkowej zawierającej 1,0 ml roztworu ekstrahentu (izopropanolu) tak, aby nie zanurzała wkładki.
  Uwaga: Przeprowadzić tę samą ekstrakcję bez zanurzenia dla odpowiednich kontroli ujemnych i dodatnich.
Uszczelnić płyty (np. za pomocą parafilmu między pokrywą płyty a górną krawędzią studzienek lub za pomocą standardowego uszczelniacza do płyt). Umieść płytki na orbitalnej wytrząsarce płytowej i potrząsaj przez 2 do 3 godzin w temperaturze pokojowej, aby wyjąć MTT.
1. Alternatywnie, przeprowadzić ekstrakcję O/N w temperaturze 2-8 °C w ciemności bez wstrząsania.
W przypadku niebarwnych cieczy testowych (ekstrakcja zanurzona): Pod koniec okresu ekstrakcji zdekantować ciecz z każdej wkładki z powrotem do studzienki i wyrzucić wkładki z tkankami RhCE.
1. Wymieszać roztwór ekstraktu i przenieść dwie podwielokrotności o objętości 200 μl do odpowiednich studzienek wstępnie znakowanej płytki 96-dołkowej zgodnie z konfiguracją płytki (rysunek 2).
W przypadku ciał stałych i płynnych barwników (ekstrakcja bez zanurzenia): Pod koniec okresu ekstrakcji wyrzuć tkanki (uważaj, aby nie przekłuć tkanek).
1. Dodać 1,0 ml roztworu ekstrahowanego do każdego dołka 24-dołkowej płytki zawierającej roztwór wyekstrahowany z tkanek. Wymieszać roztwór ekstrahentu i przenieść dwie podwielokrotności o objętości 200 μl do odpowiednich dołków wstępnie znakowanej płytki 96-dołkowej zgodnie z konfiguracją płytki (rysunek 2).
Oznaczyć gęstość optyczną (OD) ekstrahowanych próbek na pojedynczej długości fali w zakresie od 550 do 590 nm (powinna być spójna w laboratorium) na czytniku płytek lub spektrofotometrze.
1. W przypadku mętnych roztworów ekstraktów spowodowanych przez nierozpuszczalne ciała stałe, należy odwirować roztwory przed pomiarem średnicy zewnętrznej (schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C, aby uniknąć parowania). W przypadku gdy płukanie nie usunie badanego przedmiotu (TA), a TA zakłóca redukcję MTT, należy zastosować dodatkowe kontrole. Zapoznaj się ze szczegółową procedurą SOP, aby skorygować redukcję MTT¹⁶.
2. W przypadku wykazania, że TA ma lub rozwija barwę, która może wchodzić w interakcje z pomiarem MTT, należy przeprowadzić dodatkowe badanie w celu określenia ilości koloru związanego z tkankami, a następnie ekstrahowanego z nich. Zapoznaj się ze szczegółową procedurą SOP, aby skorygować kolorowe artykuły testowe¹⁶.

9. Obliczenia dla testu żywotności tkanek (Tabela 6 i Rysunek 3)

Obliczenia ogólne
1. Obliczyć średnią wartość OD ślepej próby studzienki kontrolnej (OD Blk) dla każdego doświadczenia.
2. Odejmij OD Blk od każdej wartości OD tego samego eksperymentu (dane skorygowane Blk).
3. Obliczyć średnią wartość dwóch podwielokrotności dla każdej tkanki (= skorygowana średnica zewnętrzna).
Obliczyć procentową żywotność każdej z dwóch powtórzonych tkanek dla każdej próby kontrolnej i badanego artykułu w stosunku do średniej kontroli ujemnej (100 % kontroli).
Żywotność (%) = [skorygowane tkanki poddane działaniu OD / skorygowana kontrola ujemna OD] x 100%
Obliczyć różnicę żywotności (różnicę żywotności między dwiema tkankami replikowanymi).
Obliczyć średnią żywotność badanego artykułu (żywotność TA) i sklasyfikować badany artykuł zgodnie z modelem predykcyjnym.

10. Model predykcyjny (Rysunek 3)

Jeżeli żywotność tkanek poddanych działaniu TA wynosi >60,0 w stosunku do żywotności tkanek poddanych działaniu NC, należy oznaczyć badany artykuł jako niedrażniący (NI) (nr kategorii GHS).
Jeżeli żywotność tkanek poddanych działaniu TA wynosi ≤ 60,0 w stosunku do żywotności tkanek poddanych działaniu NC, należy oznaczyć badany artykuł jako drażniący (I) (kategorie GHS 1 i 2).
Uwaga: Wyniki testu EIT uznaje się za kwalifikowane, jeżeli:
- EIT NC OD >0,8 i <2,5;
- żywotność tkanek EIT PC (%, w stosunku do NC) wynosi ≤50,0%;
- różnica między dwiema powtórzonymi tkankami (NC, PC i badany artykuł) wynosi <20,0%.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne wyniki EIT przeprowadzone na 10 artykułach testowych (TA) oraz kontrolach negatywnych i pozytywnych przedstawiono w Tabeli 6 i Rysunku 3. Średnia OD = 1,31 dla NC odpowiada 100% żywotności tkanek, dlatego PC (średnia OD = 0,41) miała względną żywotność tkanek wynoszącą 31,2%. Gdy protokół EIT przeprowadzono w 15 ważnych niezależnych eksperymentach w 7 laboratoriach przy użyciu protokołu ekspozycji na ciecz oraz w 8 niezależnych ważnych eksperymentach w 4 laboratoriach, przy użyciu protokołu ekspozycji na ciała stałe, średnia żywotność tkanek dla PC przy użyciu protokołu ciekłego wynosiła 36,4 ±4,0% i 32,3±6,4% dla protokołu ciał stałych. We wszystkich przypadkach wyniki kontroli dodatniej były niższe od wartości odcięcia wynoszącej 60,0%¹⁵.

Jak pokazano na >rysunku 3, TA1, TA2, TA4, TA7 i TA8 miały żywotność tkanek >60,0% i dlatego zostały sklasyfikowane jako "NI". TA3, TA5, TA6, TA9 i TA10 miały żywotność tkanek ≤60,0% i dlatego zostały sklasyfikowane jako "I". Różnica w żywotności tkanek między zduplikowanymi tkankami wynosiła <20,0% dla wszystkich TAs z wyjątkiem TA2. W związku z tym wyniki dla wszystkich badanych artykułów, z wyjątkiem TA2, uznano za "kwalifikowane", ponieważ spełniały wszystkie kryteria akceptacji EIT (sekcja 10.2). Ze względu na dużą zmienność między zduplikowanymi tkankami dla TA2 w początkowym eksperymencie, konieczne było przeprowadzenie drugiego eksperymentu w celu uzyskania kwalifikowanych wyników EIT.

Opisana tutaj metoda testowa EIT, wykorzystująca model tkankowy RhCE, została wykorzystana do oceny podrażnienia oczu w kilku wielolaboratoryjnych badaniach walidacyjnych, w tym formalnej walidacji przez EURL ECVAM/Cosmetics Europe^15,17-19. We wszystkich badaniach wykazano, że EIT jest odtwarzalny i był w stanie prawidłowo zidentyfikować substancje chemiczne (zarówno substancje, jak i mieszaniny) niewymagające klasyfikacji i oznakowania pod kątem działania drażniącego na oczy lub poważnego uszkodzenia oczu zgodnie z GHS ONZ^15,17-19. Metoda badawcza EIT spełniła kryteria akceptacji Grupy ds. Zarządzania Walidacją (VMG) w odniesieniu do działania drażniącego na oczy pod względem czułości, swoistości i ogólnej dokładności, a obecnie oczekuje na formalne wdrożenie jako częściowy zamiennik testu Draize'a na króliku in vivo ¹⁹.

figure-results-1
Rysunek 1: Zarys protokołu EIT dla ciekłych i stałych artykułów testowych. Stosowane skróty: AM, podłoże do oznaczania; SCC, standardowe warunki hodowli; PBS, sól fizjologiczna buforowana fosforanami firmy Dulbecco; RT, temperatura pokojowa.

figure-results-2
Rycina 2: Znormalizowana konfiguracja 96-dołkowej płytki do testu żywotności tkanek MTT. Dwie podwielokrotności o objętości 200 μl przenosi się do odpowiednich dołków wstępnie znakowanej płytki 96-dołkowej. Stosowane skróty: NC, kontrola ujemna; PC, kontrola pozytywna; TA1-TA20, artykuły testowe 1-20; Ślepy, ekstrahowany roztwór. Konfiguracja płytki 96- MTT jest używana z arkuszem kalkulacyjnym Excel przeznaczonym do obliczania żywotności tkanek RhCE i wyników EIT.

figure-results-3
Rysunek 3: Wyniki EIT uzyskane dla 10 badanych artykułów, kontroli NC i PC przy użyciu modelu tkankowego RhCE. Wykres jest generowany z arkusza kalkulacyjnego Excel przeznaczonego do prezentacji wyników EIT. Badane substancje chemiczne, które zmniejszyły żywotność tkanek ≤ 60,0 % w stosunku do NC, klasyfikuje się jako substancje drażniące ("I", TA3, TA5, TA6, TA9 i TA10), a badane substancje chemiczne, które miały żywotność tkanek >60,0 %, klasyfikuje się jako substancje niedrażniące ("NI", TA1, TA2, TA4, TA7 i TA8).

Czas rozpoczęcia kroków roboczych protokołu EIT (jeden dzień pracy dla jednego operatora)

Każda linia odpowiada jednej parze tkanek

Kolejność kroków:	1	cyfra arabska	3	4	5	6	7
Cieczy:	Pbs	TA Narażenie	Po Moczyć	Po Inkub.	MTT Reakcja	MTT Wydobywanie	miara
	Czas trwania: 30 min	Czas trwania: 30 min	Czas trwania: 12 min	Czas trwania: 120 min	Czas trwania: 180 min	Czas trwania: 120 min	OD
Nc	godz. 9:00	Godzina 9:30	godz. 10:00	10:12	12:12	15:12	po
komputer osobisty	Godzina 9:01	Godzina 9:31	Godzina 10:01	Godzina 10:13	12:13	15:13	godz. 17:30
TA-1	Godzina 9:02	9:32	Godzina 10:02	10:14	godz. 12:14	15:14
TA-2	Godzina 9:03	9:33	godz. 10:03	godz. 10:15	godz. 12:15	godz. 15:15
TA-3	Godzina 9:04	Godzina 9:34	Godzina 10:04	Godzina 10:16	12:16	15:16
TA-4	Godzina 9:05	Godzina 9:35	godz. 10:05	Środa, godz. 10:17	godz. 12:17	godz. 15:17
TA-5	Godzina 9:06	Godzina 9:36	Godzina 10:06	Godzina 10:18	godz. 12:18	Środa, godz. 15:18
TA-6	Godzina 9:07	Godzina 9:37	Godzina 10:07	Godzina 10:19	12:19	godz. 15:19
TA-7	Godzina 9:08	Godzina 9:38	10:08	godz. 10:20	godz. 12:20	godz. 15:20
TA-8	Godzina 9:09	Godzina 9:39	Godzina 10:09	Godzina 10:21	godz. 12:21	godz. 15:21
TA-9	Godzina 9:10	Godzina 9:40	Godzina 10:10	Godzina 10:22	godz. 12:22	Środa, godz. 15:22
TA-10	9:11	Godzina 9:41	Godzina 10:11	Godzina 10:23	godz. 12:23	Godzina 15:23

Tabela 3: Przykładowy harmonogram testów płynnych artykułów. Etapy protokołu, w tym wstępne zwilżanie tkanek DPBS, stosowanie artykułów testowych (TA), płukanie i namaczanie, okres po inkubacji, test MTT, ekstrakcja MTT i pomiar MTT OD są przedstawione w kolumnach. Czasy dla zduplikowanych tkanek są zorganizowane w wierszach. Cały test testujący 10 TA i kontrole można zakończyć w ciągu jednego dnia.

Czas rozpoczęcia kroków protokołu EIT (2 dni pracy dla jednego operatora)

Każda linia odpowiada jednej parze tkanek

Dzień 1					Dzień 2 (następny dzień)

Kolejność kroków:	1	cyfra arabska	3	4	5	6	7
Brył:	Pbs	TA Narażenie	Po Moczyć	Po Inkubacja	MTT Reakcja	MTT Wydobywanie	miara
	Czas trwania: 30 min	godz. 6	Czas trwania: 26 min	18 godz	Czas trwania: 180 min	Czas trwania: 120 min	OD
Nc	godz. 9:00	Godzina 9:30	godz. 15:30	godz. 15:56	Godzina 9:56	godz. 12:56	po
komputer osobisty	Godzina 9:02	9:32	Godzina 15:32	Środa, godz. 15:58	Godzina 9:58	Godzina 12:58	godz. 15:30
TA-1	Godzina 9:04	Godzina 9:34	godz. 15:34	godz. 16:00	godz. 10:00	godz. 13:00
TA-2	Godzina 9:06	Godzina 9:36	godz. 15:36	godz. 16:02	Godzina 10:02	godz. 13:02
TA-3	Godzina 9:08	Godzina 9:38	godz. 15:38	godz. 16:04	Godzina 10:04	godz. 13:04
TA-4	Godzina 9:10	Godzina 9:40	godz. 15:40	godz. 16:06	Godzina 10:06	Godzina 13:06
TA-5	9:12	9:42	Godzina 15:42	Godzina 16:08	10:08	godz. 13:08
TA-6	9:14	Godzina 9:44	15:44	godz. 16:10	Godzina 10:10	godz. 13:10
TA-7	9:16	Godzina 9:46	15:46	Środa, godz. 16:12	10:12	13:12
TA-8	9:18	Godzina 9:48	godz. 15:48	Środa, godz. 16:14	10:14	godz. 13:14
TA-9	Godzina 9:20	godz. 9:50	godz. 15:50	Środa, godz. 16:16	Godzina 10:16	godz. 13:16
TA-10	Godzina 9:22	9:52	15:52	godz. 16:18	Godzina 10:18	godz. 13:18

Tabela 4: Przykładowy harmonogram testowania stałych artykułów testowych. Etapy protokołu, w tym wstępne zwilżanie tkanek DPBS, nakładanie artykułów testowych, płukanie i namaczanie, okres po inkubacji, test MTT, ekstrakcja MTT i pomiar MTT OD są przedstawione w kolumnach. Czasy dla zduplikowanych tkanek są zorganizowane w wierszach. Cały test testujący 10 TA i kontrole jest wykonywany przez okres dwóch dni.

powiedział: powiedział:

kwota	Odczynnik	Warunki przechowywania	źródło	opis	Data ważności
1 fiolka, Pojemność 2 ml	Koncentrat MTT (MTT-100-CON)	Ochrona przed światłem (-20ºC)	MatTek	Mrożony koncentrat MTT	2 miesiące
1 fiolka, Pojemność 8 ml	Rozcieńczalnik MTT	2-8ºC	MatTek	Do rozcieńczania koncentratu MTT przed użyciem w teście MTT	2 miesiące
1 butelka, Pojemność 60 ml	Izopropanol (CAS #67-63-0)	Rt	Sigma-Aldrich	Roztwór ekstrakcyjny	nie

Tabela 5: Składniki zestawu testowego MTT-100.

TGL TGL pkt. pkt. TGL TGL TGL TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. punktu pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: TGL pkt. TGL pkt. TGL pkt. jezdnego jezdnego jezdnego jezdnego jezdnego pkt. powiedział: TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. szt. pkt. szt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: TGL jezdnego TGL jezdnego TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. TGL pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.

Nr kodu	tkanka	Surowe dane		Puste poprawione dane		średnia z OD	% żywotności
	n	Aliq. 1	Aliq. 2	Aliq. 1	Aliq. 2	średnia z OD	% żywotności
Nc	1	1,316	1,352	1,316	1,352	1,334	101,6
	cyfra arabska	1,277	1,309	1,277	1,309	1,293	Nr 98,4
komputer osobisty	1	0,379	0,397	0,379	0,397	0,388	29,6
	cyfra arabska	0,419	0,442	0,419	0,442	0,431	32,8
TA1	1	1,213	1,244	1,213	1,244	1,229	93,5
	cyfra arabska	1,355	1,355	1,355	1,355	1,355	103,2
TA2	1	1,210	1,122	1,210	1,122	1,166	88,7
	cyfra arabska	0,828	0,837	0,828	0,837	0,833	63,4
TA3	1	0,167	0,168	0,167	0,168	0,167	Pytanie 12,7
	cyfra arabska	0,138	0,136	0,138	0,136	0,137	Rozdział 10.4
TA4	1	1,137	1,160	1,137	1,160	1,149	87,4
	cyfra arabska	1,262	1,191	1,262	1,191	1,227	93,4
TA5	1	0,610	0,621	0,610	0,621	0,616	46,9
	cyfra arabska	0,480	0,484	0,480	0,484	0,482	36,7
TA6	1	0,502	0,513	0,502	0,513	0,508	38,7
	cyfra arabska	0,396	0,407	0,396	0,407	0,402	30,6
TA7	1	1,048	1,050	1,048	1,050	1,049	79,9
	cyfra arabska	1,149	1,150	1,149	1,150	1,150	87,5
TA8	1	1,032	1,034	1,032	1,034	1,033	78,7
	cyfra arabska	0,941	0,935	0,941	0,935	0,938	71,4
TA9	1	0,022	0,022	0,022	0,022	0,022	Pytanie 1.7
	cyfra arabska	0,144	0,149	0,144	0,149	0,147	Rozdział 11.2
TA10	1	0,150	0,150	0,150	0,150	0,150	Pytanie 11,4
	cyfra arabska	0,254	0,255	0,254	0,255	0,255	Rozdział 19,4

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: TGL pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. pkt.

	znaczyć	Dif.	średnia z	Dif.	Dyf./2	Klasyfikacja
	OD	OD	Rentowność [%]	rentowności
Nc	1,314	0,041	100,0	3.12	1,56	Ni	wykwalifikowany
komputer osobisty	0,410	0,043	Dnia 31,2	Pytanie 3,23	1,62	ja	wykwalifikowany
TA1	1,292	0,127	98,3	Godzina 9,63	Z godziny 4,81	Ni	wykwalifikowany
TA2	0,999	0,333	76,1	Godzina 25.36	Godzina 12.68	Ni	D>20
TA3	0,152	0,030	Rozdział 11,6	Godzina 2,32	Pytanie 1,16	ja	wykwalifikowany
TA4	1,188	0,078	Nr 90,4	Klasa 5,94	Wynik 2,97	Ni	wykwalifikowany
TA5	0,549	0,134	41,8	Dnia 10,16	Godzina 5,08	ja	wykwalifikowany
TA6	0,455	0,106	Nr 34,6	8.07	Rozdział 4.03	ja	wykwalifikowany
TA7	1.100	0,101	83,7	Godzina 7,65	Rejon 3,82	Ni	wykwalifikowany
TA8	0,986	0,095	75,0	7,23	Pytanie 3,62	Ni	wykwalifikowany
TA9	0,085	0,125	6,4	Godzina 9,48	Z godziny 4,74	ja	wykwalifikowany
TA10	0,203	0,105	Rozdział 15,4	7,95	3,98	ja	wykwalifikowany

Tabela 6: Wyniki EIT uzyskane dla 10 artykułów testowych, kontroli NC i PC. Tabele są tworzone w arkuszu kalkulacyjnym Excel przeznaczonym do obliczania żywotności tkanek i wyników EIT. Badane substancje chemiczne, które zmniejszyły żywotność tkanek ≤ 60,0 % w stosunku do NC, klasyfikuje się jako substancje drażniące ("I", TA3, TA5, TA6, TA9 i TA10), a badane substancje chemiczne, które miały żywotność tkanek >60,0 %, klasyfikuje się jako substancje niedrażniące ("NI", TA1, TA2, TA4, TA7 i TA8).

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy Test Podrażnienia Oczu (Ryc. 1), który został opracowany dla modelu tkanki EpiOcular . EIT jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od materiałów, które nie wymagają oznakowania (kategoria nr GHS) o wysokim stopniu czułości i swoistości^17. EIT w przedstawionej formie nie dyskryminuje substancji chemicznych kategorii 1 GHS od substancji chemicznych kategorii 2. EIT został zatwierdzony pod kątem klasyfikacji i oznakowania potencjału drażniącego na oczy szerokiej gamy substancji chemicznych, w tym składników kosmetycznych i farmaceutycznych. W połączeniu z innymi badaniami in vitro EIT będzie służył jako zamiennik badania in vivo działania drażniącego na oczy królika.

EIT stosuje dwa podobne, ale odrębne protokoły dla materiałów płynnych i stałych, które różnią się długością ekspozycji i okresami inkubacji po ekspozycji (rys. 1). Punktem końcowym stosowanym w EIT jest żywotność tkanek, określona za pomocą testu MTT, który był wcześniej stosowany w zwalidowanych modelach ludzkich tkanek nabłonkowych^20,21. Do wykonania tego testu nie jest potrzebny żaden specjalny sprzęt poza standardowym sprzętem do hodowli komórek. Ze względu na wysoki poziom odtwarzalności tkanka-tkanka stosuje się n = 2 tkanki zamiast zwykle zalecanego n = 3. Możliwość wykorzystania n= 2 tkanek jest krytycznym aspektem protokołu, ponieważ pozwala doświadczonemu operatorowi na jednoczesne przetwarzanie dwóch tkanek, minimalizując w ten sposób zmienność testu, która może powstać z powodu różnego obchodzenia się z poszczególnymi tkankami¹⁴. Ponadto, stosując n = 2 tkanki na badany artykuł, można ocenić podrażnienie 10 badanych substancji o tym samym stanie fizycznym (ciekłym lub stałym), wraz z kontrolami pozytywnymi i ujemnymi, przy użyciu jednego zestawu (24 tkanki).

Innymi kluczowymi punktami, które zapewniają wiarygodną klasyfikację materiałów, są specyfikacje substancji służącej do kontroli dodatniej (żywotność tkanek ≤50,0%), odtwarzalność między zduplikowanymi tkankami (różnica <20,0%) oraz odczyty OD w ramach kontroli ujemnej (>0,8 i <2,5).

Podczas przeprowadzania testu EIT ważne jest przestrzeganie zatwierdzonego protokołu oraz sugerowanych schematów dawkowania i płukania (tabele 3 i 4), ponieważ odchylenie od protokołu lub zmiany w okresach inkubacji mogą skutkować zmianą wyniku. Podobnie, odchylenia od 3-godzinnego czasu inkubacji MTT spowodują różne odczyty MTT i mogą wpłynąć na wynik testu.

Czasami badana substancja chemiczna może mieć właściwości optyczne lub inne, które mogą zakłócać test żywotności tkanek MTT lub powodować zmniejszenie MTT. Na przykład badana substancja chemiczna może bezpośrednio redukować MTT do niebiesko-fioletowego produktu reakcji lub może być barwną substancją, która pochłania światło w tym samym zakresie co formazan MTT (~570 nm). Te badane substancje chemiczne będą jednak stanowić problem tylko wtedy, gdy w czasie przeprowadzania testu MTT wystarczająca ilość materiału jest nadal obecna w tkance (lub jest przez nią wchłaniana). Aby uniknąć tych zakłóceń, do protokołu EIT włączono obszerne procedury płukania. Jeśli płukanie nie usunie TA, a TA zakłóca redukcję MTT, należy zastosować dodatkowe kontrole w celu wykrycia i skorygowania tego. Krótko mówiąc, jeżeli podejrzewa się bezpośrednie zmniejszenie MTT badanej substancji chemicznej, 50 μl (lub 50 mg w przypadku ciał stałych) danej substancji chemicznej inkubuje się przez 3 godziny z roboczym roztworem MTT w SCC (NC, 50 μl sterylnej wody dejonizowanej, należy uruchomić jednocześnie). Jeśli roztwór MTT zmieni kolor na niebiesko-fioletowy, zakłada się, że badany artykuł zmniejszył MTT. W takim przypadku należy przeprowadzić kontrolę funkcjonalną z wykorzystaniem zamrożonych tkanek kontrolnych, aby ocenić, czy badany materiał wiąże się z tkanką i prowadzi do fałszywego sygnału redukcji MTT. W przypadku znacznego zmniejszenia MTT w kontroli tkanek zabitych narażonych na działanie TA (w stosunku do ilości w tkance żywotnej niepoddanej działaniu substancji czynnej), średnia żywotność badanego elementu musi zostać skorygowana poprzez odjęcie średniej żywotności zabitej grupy kontrolnej.

EIT popełnia błędy po stronie bezpieczeństwa, o czym świadczy niska liczba fałszywie ujemnych klasyfikacji^14,15,18. Co ważne, żadna z substancji chemicznych kategorii 1 GHS, które działają żrąco na oczy i stanowią najpoważniejsze zagrożenie dla oczu, nie została sklasyfikowana jako niedrażniąca w tym teście^14,15,18,19. Wreszcie, jedną z głównych zalet metody badania in vitro RhCE jest możliwość badania czystych materiałów ciekłych i stałych (co nie jest możliwe w przypadku dwuwymiarowych, zanurzonych kultur komórkowych).

EIT w znacznym stopniu przyczyni się do określenia potencjału drażniącego na oczy szerokiej gamy materiałów zgodnie z systemem klasyfikacji i oznakowania GHS ONZ. Zastąpienie zwierząt w celu określenia toksyczności ocznej jest celem badań toksykologicznych od wielu lat. W 2014 r. metoda badawcza EIT przeszła formalne badanie walidacyjne wspierane przez EURL ECVAM, a w 2015 r. metoda badawcza EIT została wdrożona do wytycznych OECD dotyczących badań jako OECD TG 492.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez MatTek Corporation. Autorzy są pracownikami firmy MatTek Corporation.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Johnowi Harbellowi za jego wsparcie naukowe i czas poświęcony projektowi EIT. Autorzy pragną również podziękować firmom Beiersdorf AG (Niemcy), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble/Cosmital (Szwajcaria), Laboratoire Pierre Fabre (Francja), Harlan Laboratories (Wielka Brytania) i LVMH Parfume (Francja) za udział w wieloośrodkowych międzynarodowych badaniach prewalidacyjnych i walidacyjnych testu podrażnienia oczu¹⁵.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).
Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).
Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243(2002).
Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249(2007).
Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378(2009).
Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. , (2013).
MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).
Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).
Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).
Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).
Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test ywotno ci MTT ocena toksyczno ci ocznej identyfikacja zagro e chemicznych testy in vitro protok nawadniania tkanek ekspozycja cia o sta e ciecz punkt odci cia ywotno ci tkanki

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły