Artykuł metodologiczny

Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)

42.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52979

⸱

23 sierpnia 2015

 ,  ,  ,  , 
1MatTek Corporation, 2MatTek In Vitro Life Science Laboratories

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy test podrażnienia oczu, który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE). Test jest w stanie odróżnić materiały drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od tych, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS).

Streszczenie

Aby spełnić wymagania Siódmej Poprawki do Dyrektywy Kosmetycznej UE i prawodawstwa UE REACH, potrzebne są sprawdzone alternatywne metody wiarygodnej i dokładnej oceny toksyczności dla oczu u człowieka. Aby zaspokoić tę potrzebę, opracowaliśmy test podrażnienia oczu (EIT), który wykorzystuje trójwymiarowy zrekonstruowany model tkanki ludzkiego nabłonka przypominającego rogówkę (RhCE), który jest oparty na normalnych komórkach ludzkich. EIT jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) oraz te, które nie wymagają oznakowania (kategoria bez GHS). Test wykorzystuje dwa oddzielne protokoły, jeden przeznaczony dla ciekłych chemikaliów i drugi, podobny protokół dla stałych artykułów testowych. Model predykcyjny EIT wykorzystuje pojedynczy okres ekspozycji (30 minut dla cieczy, 6 godzin dla ciał stałych) i granicę żywotności pojedynczej tkanki (60,0% zgodnie z testem MTT). Na podstawie wyników dla 83 substancji chemicznych (44 ciecze i 39 ciał stałych) EIT osiągnął 95,5/68,2/ i 81,8% czułości/swoistości i dokładności (SS&A) dla cieczy, 100,0/68,4/ i 84,6% SS&A dla ciał stałych oraz 97,6/68,3/ i 83,1% dla ogólnego SS&A. EIT w znacznym stopniu przyczyni się do sklasyfikowania potencjalnego działania drażniącego na oczy przez szeroką gamę ciekłych i stałych substancji chemicznych bez wykorzystania zwierząt, aby spełnić wymogi regulacyjne w zakresie badań. Metoda EpiOcular EIT została wdrożona w 2015 r. do wytycznych OECD dotyczących badań jako TG 492.

Wprowadzenie

Produkty konsumenckie, takie jak kosmetyki, detergenty i domowe środki czyszczące, zawierają różne substancje chemiczne, które mogą spowodować poważne uszkodzenia, jeśli dotkną oczy. W związku z tym amerykańskie i unijne agencje regulacyjne wymagają testowania tych środków pod kątem działania drażniącego na oczy w celu zapewnienia bezpieczeństwa konsumentów1. Ocena potencjału działania drażniącego na oczy mieszanin i preparatów jest również wymogiem zgodności z przepisami REACH (Registration, Evaluation, Authorization, and Restriction of Chemicals) w zakresie etykietowania składników kosmetycznych zgodnie z dyrektywą kosmetyczną UE w zakresie transportu chemikaliów oraz etykietowania pestycydów i artykułów gospodarstwa domowego2. Obecnie agencje regulacyjne wymagają oceny zagrożeń dla oczu przy użyciu Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS)3. GHS opiera się głównie na teście podrażnienia oczu Draize'a, najczęściej stosowanym teście podrażnienia oczu, w którym obce substancje i mieszaniny są wprowadzane bezpośrednio do worka spojówkowego oka królika4. Zgodnie z klasyfikacją GHS kategoria 1 GHS (substancje na oczy) odnosi się do badanych substancji chemicznych, które powodują poważne początkowe uszkodzenie tkanek oka lub poważne uszkodzenie oka i wzroku, które nie jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po narażeniu3,5. Kategoria 2 GHS odnosi się do badanych substancji chemicznych, które powodują znaczące zmiany w oku, które są w pełni odwracalne w ciągu 21 dni od narażenia. Badane substancje chemiczne, które nie są substancjami ani drażniącymi, określa się mianem nr kategorii GHS.

Przez ponad 40 lat, test Draize na oku królika był krytykowany za brak odtwarzalności, przecenianie ludzkich reakcji i wykorzystanie żywych zwierząt5-8. Obawy te zachęciły do wielu propozycji udoskonalenia, ograniczenia i zastąpienia testu in vivo 9. Potrzeba zatwierdzonych alternatyw niewymagających wykorzystania zwierząt została dodatkowo wzmocniona przez przyjęcie siódmej poprawki do dyrektywy kosmetycznej, która zakazała wykorzystywania zwierząt w ocenie bezpieczeństwa produktów kosmetycznych (w 2005 r.) i składników (w 2009 r.)2.

Od 1996 roku, zrekonstruowany model tkanki rogówkowej jest szeroko stosowany przez przemysł kosmetyczny do oceny potencjału drażniącego surowców, preparatów na bazie środków powierzchniowo czynnych i mieszanin złożonych, które są przeznaczone do stosowania w okulub w jego pobliżu. Zastosowanie modelu tkankowego RhCE pozwala na bezpośrednią miejscową aplikację badanego materiału na powierzchnię tkanki w jego natywnej, nierozcieńczonej postaci. W ten sposób preparaty nierozpuszczalne w wodzie mogą być testowane bez rozcieńczania ich rozpuszczalnikami. W odpowiedzi na wniosek EURL ECVAM (Laboratorium Referencyjne Unii Europejskiej, Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych) dotyczący szeroko stosowanej, prostej i ekonomicznej metody, opracowano Test Podrażnienia Oczu (EIT), który wykorzystuje pojedynczy czas ekspozycji i jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu od materiałów, które nie wymagają oznakowania (Rysunek 1)14. Na podstawie wyników dla 83 substancji chemicznych (44 ciecze i 39 ciał stałych), EIT osiągnął 95,5/68,2/ i 81,8% czułości/swoistości i dokładności (SS&A) dla cieczy, 100,0/68,4/ i 84,6% SS&A dla ciał stałych oraz 97,6/68,3/ i 83,1% dla ogólnego SS&A.

W 2007 roku, wielolaboratoryjne badanie prewalidacyjne sponsorowane przez Cosmetics Europe (dawniej Colipa) pod auspicjami EURL ECVAM oceniło znaczenie i wiarygodność EIT w celu doprowadzenia go do formalnej walidacji15. W tym badaniu przeprowadzono 298 niezależnych badań w siedmiu niezależnych laboratoriach. Wyniki badania wykazały 99,7% zgodność w przewidywaniach przy niskich współczynnikach zmienności we wszystkich uczestniczących laboratoriach15. W związku z tym w 2010 r. protokół EIT został włączony do formalnego programu walidacji EURL ECVAM. W badaniu walidacyjnym wykorzystano 104 zakodowane badane substancje chemiczne, w tym pojedyncze substancje i mieszaniny chemiczne, dla których dostępne były dane referencyjne in vivo (dane dotyczące działania drażniącego na oczy Draize'a). Opierając się na sukcesie tych prac, w 2014 r. przedłożono projekt wytycznych OECD dotyczących badań. Oczekuje się, że EIT w znacznym stopniu przyczyni się do klasyfikacji potencjału działania drażniącego na oczy szerokiej gamy materiałów zgodnie z systemem klasyfikacji i oznakowania GHS ONZ.

Protokół

1. Przygotowanie tkanek RhCE do leczenia – Dzień 0

  1. Po otrzymaniu komercyjnego zestawu ludzkiego nabłonka rogówkowego (RhCE) należy sprawdzić wszystkie elementy zestawu pod kątem integralności (szczegółowe informacje na temat zestawu znajdują się w części Elementy zestawu do oznaczania standardowego (tabela 1) oraz Sprzęt i materiały wymagane do przeprowadzenia testu EIT (Tabela 2). W dniu otrzymania należy zrównoważyć chusteczki (w 24-dołkowym pojemniku transportowym) do RT przez 15 minut.

powiedział: powiedział:
kwotaOdczynnikWarunki źródłoopisData ważności
1Szczelna 24-dołkowa płytka z tkankami epiocznymi
(OCL-200)		2-8 °CMatTekZawiera 24 tkanki wkładek do hodowli komórkowych, opakowanie na agarozie72 godz
1 butelka,
Pojemność 200 ml		Test EpiOcular Assay Medium
(OCL-200-ASY)		2-8 °CMatTekPodłoże na bazie DMEM21 dni
1 butelka,
Pojemność 100 ml		Wolny od Ca++Mg++ Dulbecco's-PBS (DPBS)RtSigma-Aldrich, D5652 lub odpowiednik.Służy do płukania wkładów1 rok
4Płytki 6-dołkoweRt sokółSłuży do utrzymywania tkanek podczas protokołu testunie
cyfra arabskaPłytki 12-dołkoweRtsokółUżywany podczas protokołu testunie
cyfra arabskaPłytki 24-dołkoweRtsokółSłuży do wykonywania testu MTTnie
1 fiolka,
Pojemność 0,5 ml		Octan metylu
(CAS#79-20-9)		RtSigma-Aldrich,
Kot# 186325		Używany jako PC w teście1 miesiąc

Tabela 1: Składniki zestawu do testów standardowych.

Sprzęt/ MateriałPotrzebne do:
Inkubator nawilżany (37 ± 1 °C, 5 ± 1% CO2, wilgotność 90 ± 10%)Inkubacja tkanek przed i w trakcie testów
Okap z przepływem laminarnymBezpieczna praca w sterylnych warunkach
Pompa próżniowa (opcjonalnie)Pożywka zasysająca i roztwory
Fotometr z czytnikiem płytek (do płytek 96-dołkowych)Czytanie OD
Wytrząsarka płytkowa Ekstrakcja formazanu
Sterylne kleszcze o krawędziachPostępowanie z wkładkami tkankowymi
StoperyCzas stosowania badanych materiałów i inne kroki określone w czasie w protokole
Łaźnia wodna (37 ± 1 °C)Pożywka grzewcza i roztwór MTT
Moździerz i tłuczekMielenie ziarnistych ciał stałych
Pipeta wyporowa (50 μl)Stosowanie lepkich i półstałych materiałów i zawiesin
Pipety regulowane (200 μl–2 ml)Zastosowanie materiałów płynnych, pożywki do oznaczania i MTT
Wstępnie wysterylizowane końcówki (200 μl i 20 μl), Rainin Cat#HR-200F i HR-20F (lub odpowiedniki)Zastosowanie materiałów płynnych, pożywki do oznaczania i MTT
Wstępnie wysterylizowane końcówki z szerokim otworem (250 μl), Rainin Cat#HR-250WS (lub odpowiednik)Stosowanie lepkich i półstałych materiałów i zawiesin
Pojemniki na próbki 8 uncji/220 ml, Falcon Cat# 3540200 (lub odpowiednik)Płukanie tkanek
Sterylne strzykawki jednorazowego użytku (np. strzykawka tuberkulinowa 1 ml Omnifix-F, B. Braun Melsungen AG, kat. Nr 9161406V)Dostawa ~50 mg materiałów stałych (opcjonalnie)
Ted Pella mikro szpatułka/łyżka, Ted Pella Inc., Cat# 13504 (lub równoważna, ostra łyżka lub łyżeczka kostna, np. Aesculap, No: FK 623)Dostawa materiałów stałych ~50 mg
Sól fizjologiczna Dulbecco wolna od Ca++ i Mg++ (Ca++Mg++Free-DPBS): Sigma-Aldrich, Cat# D5652 (lub odpowiednik)Płukanie tkanek podczas badania
Sterylna woda dejonizowana, klasa kultury tkankowej (jakość biologiczna lub równoważna)Użyj jako NC
96-dołkowe płaskie płyty denne, Falcon (lub odpowiednik)Do odczytu OD
Wymienne końcówki bawełniane (sterylne)Do suszenia powierzchni tkanki (opcjonalnie)
Taśma klejąca lub Parafilm Płytki zakrywające podczas ekstrakcji formazanu
Zestaw testowy MTT-100Zawiera odczynnik MTT-Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromek (Sigma #M-5655) i ekstrakt izopropanolowy.

Tabela 2: Sprzęt i materiały wymagane do przeprowadzenia EIT.

  1. W sterylnych warunkach otwórz plastikową torbę zawierającą 24-dołkową płytkę z tkankami RhCE i wyjmij sterylną gazę. Sprawdź wszystkie tkanki pod kątem pęcherzyków powietrza między żelem agarozowym a wkładką. Nie należy używać kultur z pęcherzykami powietrza pod wkładką pokrywającą >50% powierzchni wkładki, tkanek uszkodzonych lub tkanek całkowicie pokrytych płynem.
  2. Oznacz płytki 6-dołkowe kodami badanego artykułu lub kodów kontrolnych i czasami ekspozycji. Podwielokrotność 1,0 ml pożywki do oznaczania (dostarczonej z zestawem), wstępnie podgrzanej do temperatury około 37 °C, do studzienek wstępnie znakowanych płytek 6-dołkowych.
  3. Za pomocą sterylnych kleszczyków usuń każdą wkładkę zawierającą tkankę RhCE i umieść wkładkę w oznakowanej płytce 6-dołkowej. Na tym etapie należy usunąć pozostałą agarozę transportową, która przylega do zewnętrznych stron wkładu, delikatnie osuszając ją na sterylnej bibule filtracyjnej. Uwolnij wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod wkładkami.
  4. Wstępnie inkubować tkanki RhCE na płytkach 6-dołkowych w standardowych warunkach hodowli (SCC, wilgotna atmosfera z 5 ± 1% CO2 w temperaturze 37 ± 1 °C) przez 1 godzinę.
  5. Po 1 godzinie zastąp pożywkę testową 1,0 ml świeżej pożywki testowej podgrzanej do 37 °C i inkubuj tkanki RhCE w warunkach SCC (przez noc = O/N) (16-24 godziny).

2. Leczenie wstępne – Dzień 1

  1. Po inkubacji O/N nanieść 20 μl Ca2+ Mg2+ wolnego od fosforanów soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS, pod warunkiem) za pomocą odpowiedniego urządzenia do pipetowania. Jeśli DPBS nie rozprzestrzenia się po tkankach, delikatnie postukaj w wkładkę na płytce, aby upewnić się, że DPBS zwilży całą powierzchnię tkanki.
  2. Inkubować tkanki RhCE w SCC przez 30 ± 2 min.
    Uwaga: Ten krok jest niezbędny do nawodnienia tkanek i naśladowania warunków in vivo.

3. Procedury ekspozycji materiału testowego

  1. Zastosować każdy badany artykuł i kontrole w celu zduplikowania tkanek RhCE (n = 2). Procedura dozowania badanego artykułu jest inna dla cieczy i ciał stałych. Nanieść miejscowo 50 μl płynnych artykułów testowych za pomocą pipety. Czas ekspozycji dla cieczy wynosi 30 min. Nanieść 50 mg stałych artykułów testowych za pomocą wypoziomowanej łyżki (skalibrowanej na 50 mg chlorku sodu). Czas ekspozycji na ciała stałe wynosi 6 godz.
    Uwaga: Płyny definiuje się jako substancje płynne (np. płyny, żele i kremy), które można nakładać za pomocą urządzenia pipetującego. Ciała stałe definiuje się jako substancje niepłynne (np. proszki, materiały żywiczne lub woskowe), których nie można nakładać za pomocą pipety.
    1. Jeżeli stan fizyczny badanych przedmiotów nie jest łatwy do określenia, umieścić fiolki z badanym artykułem w łaźni wodnej na 15 minut (37 °C). Postępuj zgodnie z protokołem EIT dla cieczy dla tych badanych artykułów, które upłynniają się w temperaturze 37 °C.
    2. Do materiałów szczególnie lepkich należy używać pipety wyporowej.
  2. Najpierw należy dozować kontrolę ujemną i kontrole dodatnie, a następnie dozować badane przedmioty.
    1. Nanieść 50 μl kontroli ujemnej (NC) i kontroli dodatniej (PC) na tkanki RhCE za pomocą standardowej pipety. NC to sterylna woda dejonizowana; PC to octan metylu (CAS # 79-20-9). Stosuj NC i PC przez 30 minut podczas testowania płynnych artykułów testowych i przez 6 godzin podczas testowania stałych artykułów testowych.

4. Ekspozycja na artykuł testowy – Dzień 1

  1. W przypadku obróbki badanych płynnych artykułów należy postępować zgodnie z harmonogramem podanym w tabeli 3. Pozostawić 1-minutowe odstępy między aplikacjami każdego badanego przedmiotu, aby zapewnić równe narażenie dla wszystkich tkanek.
    1. Po 30 ± 2 minutowej obróbce wstępnej DPBS, należy miejscowo nanieść 50 μl NC i PC, a następnie każdy płynny artykuł testowy miejscowo na tkanki RhCE za pomocą odpowiedniego urządzenia do pipetowania.
    2. Nanieść 50 μl płynnego badanego przedmiotu bezpośrednio na tkankę, aby pokryć górną powierzchnię. Odetnij wąski koniec końcówki pipety, aby poszerzyć otwór na lepkie materiały. W przypadku bardzo lepkich materiałów należy nałożyć badany przedmiot na urządzenie dozujące (cylinder z płaską główką o średnicy nieco mniejszej niż wewnętrzna średnica wkładki tkankowej lub plastikowa pinezka), odwrócić urządzenie dozujące i umieścić je na tkance tak, aby badany przedmiot równomiernie stykał się z powierzchnią tkanki.
    3. Jeśli badany artykuł nie rozprzestrzenia się po tkance, delikatnie postukaj w wkładkę, aby upewnić się, że rozprowadza się na całej powierzchni tkanki. Nie zaleca się mechanicznego rozprowadzania badanych przedmiotów (np. za pomocą końcówki do pipety), ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanek.
    4. Inkubować tkanki w SCC przez 30 ± 2 min.
  2. W przypadku obróbki stałych artykułów testowych – Dzień 1 należy postępować zgodnie z harmonogramem podanym w Tabeli 4. Pozostawić 2-minutowe odstępy między aplikacjami każdego badanego artykułu, aby zapewnić równe narażenie dla wszystkich tkanek.
    1. Po 30 ± 2 minutowej obróbce wstępnej DPBS nanieść miejscowo 50 μl NC i PC na tkanki RhCE za pomocą odpowiedniego urządzenia do pipetowania.
    2. W przypadku aplikacji stałego wyrobu do badań należy wyjąć wkładki (n = 2) z dołka i umieścić je na sterylnej powierzchni (np. pokrywie płytki wielodołkowej), aby uniknąć rozlania się badanego przedmiotu do pożywki.
    3. Za pomocą wypoziomowanej łyżki nanieść miejscowo około 50 mg badanego przedmiotu na powierzchnię tkanki; upewnić się, że powierzchnia tkanki jest całkowicie pokryta badanym przedmiotem. Jeśli badany przedmiot nie rozprzestrzenia się po tkance, należy delikatnie potrząsnąć wkładką z boku na bok, aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie pokryta badanym elementem. Nie zaleca się mechanicznego rozprowadzania badanych przedmiotów (np. za pomocą końcówki do pipety), ponieważ może to spowodować uszkodzenie tkanek.
      1. W razie potrzeby zmiel krystaliczne proszki za pomocą moździerza i tłuczka, aby zagwarantować lepszy kontakt badanego przedmiotu z tkanką.
      2. Alternatywnie, należy umieścić proszki bezpośrednio na kulturze tkankowej wewnątrz wkładki za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z odciętą głowicą. Wprowadzić proszki do strzykawki, gdy tłok jest odciągnięty, a następnie nanieść, naciskając tłok w dół.
      3. Jeśli zewnętrzna ścianka wkładu jest zanieczyszczona np. proszkami, należy zetrzeć cząstki sterylną gazą.
    4. Po podaniu należy umieścić tkanki z powrotem na płytkach 6-dołkowych zawierających pożywkę hodowlaną i inkubować w SCC przez 6 godzin ± 15 minut.

5. Płukanie

  1. Przygotować zestaw trzech czystych zlewek (o pojemności 150 ml) na badany artykuł i napełnić każdą z nich 100 ml DPBS. Dla każdego badanego artykułu użyj innego zestawu trzech zlewek.
  2. Po upływie 30 ± 2 minut ekspozycji w przypadku materiałów płynnych lub 6 godzin ± 15 minut w przypadku materiałów stałych, należy wyjąć i wyrzucić urządzenie dozujące, jeśli było używane.
  3. Wyjąć wkładki zawierające tkankę RhCE z pożywki, chwytając za górną krawędź plastikowego "kołnierza" cienkimi kleszkami. Użyj zakrzywionych kleszczy, aby ułatwić przenoszenie i dekantację. Opłucz chusteczki po dwie na raz, przytrzymując zduplikowane wkładki razem za kołnierze za pomocą kleszczy. Uważaj, aby nie uszkodzić tkanek kleszczami.
  4. Zdekantować badane przedmioty lub kontrole z powierzchni tkanki na czysty materiał chłonny (ręcznik papierowy, gaza itp.)
  5. Zanurzyć wkładki w pierwszej zlewce DPBS, obracać okrężnymi ruchami w DPBS przez około 2 sekundy, podnieść wkładki tak, aby były w większości wypełnione DPBS i zdekantować płyn z powrotem do zlewki. Powtórz ten proces trzy razy w pierwszej zlewce.
  6. Opłucz wkładki w drugiej i trzeciej zlewce DPBS trzy razy każda w ten sam sposób.
  7. Zdekantować pozostałą ciecz we wkładzie na materiał chłonny. Obrócić wkładkę pod kątem około 45° (otwartym końcem do dołu) i przyłożyć górną wargę do materiału chłonnego.
    Uwaga: Jeżeli nie jest możliwe usunięcie całego widocznego materiału do badań, nie należy wykonywać dalszego płukania, aby uniknąć uszkodzenia tkanek w wyniku nadmiernego obchodzenia się z nim.

6. Po kąpieli

  1. Po wypłukaniu natychmiast zanurzyć tkanki w 5 ml pożywki do oznaczania uprzednio podgrzanej do temperatury cieplnej we wstępnie znakowanej płytce 12-dołkowej.
  2. Inkubować tkanki przez 12 ± 2 minuty w przypadku materiałów płynnych lub 25 ± 2 minuty w przypadku materiałów stałych zanurzonych w temperaturze pokojowej, aby ułatwić usunięcie wszelkich pozostałości badanego przedmiotu.

7. Po inkubacji

  1. Pod koniec okresu zanurzenia po namaczaniu zdekantować pożywkę testową z tkanek i osuszyć wkładki na materiale chłonnym.
  2. Przenieść wkładki do wstępnie oznakowanej płytki 6-dołkowej zawierającej 1 ml ciepłego podłoża do oznaczania.
    1. Inkubować tkanki przez 120 ± 15 minut w SCC dla płynnych materiałów testowych.
    2. Inkubować tkanki przez 18 ± 0,25 godziny w SCC dla stałych materiałów testowych.

8. Test żywotności MTT – Dzień 1 (Protokół dla płynów) i Dzień 2 (Protokół dla ciał stałych)

  1. Test MTT należy przeprowadzić po inkubacji trwającej odpowiednio 120 ± 15 minut dla cieczy i 18 ± 0,25 godziny dla ciał stałych.
  2. Przygotować 1,0 mg/ml roztworu MTT i podwielokrotność 0,3 ml roztworu do każdego dołka na wstępnie znakowanej płytce 24-dołkowej.
    1. Użyj komercyjnego zestawu MTT (Tabela 5):
    2. Na 2 godziny przed użyciem rozmrozić koncentrat MTT w temperaturze pokojowej (RT). Połączyć 2 ml koncentratu MTT i 8 ml rozcieńczalnika MTT, aby uzyskać 1,0 mg/ml roztworu MTT.
    3. Roztwór MTT należy przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Nie należy przechowywać roztworu MTT dłużej niż 1 dzień.
  3. Pod koniec postinkubacji wyjąć każdą wkładkę z płytki 6-dołkowej i delikatnie osuszyć materiał chłonny.
  4. Umieścić wkładki w 24-dołkowej płytce zawierającej 0,3 ml roztworu MTT. Uwolnij wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione pod wkładkami. Inkubować płytkę przez 180 ± 10 minut w SCC.
  5. Ekstrakcja MTT
    1. Po 180 ± 10 minutach inkubacji w roztworze MTT wyjąć każdą wkładkę z płytki 24-dołkowej i osuszyć dno wkładu na materiale chłonnym.
    2. W przypadku niebarwiących cieczy testowych (ekstrakcja zanurzeniowa): Przenieść wkładki do wstępnie oznakowanej 24-dołkowej płytki zawierającej 2,0 ml roztworu ekstrahentu (izopropanolu) tak, aby zanurzyła wkładkę.
    3. W przypadku ciał stałych i ciekłych barwników (ekstrakcja bez zanurzenia w celu uniknięcia zanieczyszczenia roztworu ekstrahentu): Przenieść wkładki do wstępnie znakowanej płytki 6-dołkowej zawierającej 1,0 ml roztworu ekstrahentu (izopropanolu) tak, aby nie zanurzała wkładki.
      Uwaga: Przeprowadzić tę samą ekstrakcję bez zanurzenia dla odpowiednich kontroli ujemnych i dodatnich.
  6. Uszczelnić płyty (np. za pomocą parafilmu między pokrywą płyty a górną krawędzią studzienek lub za pomocą standardowego uszczelniacza do płyt). Umieść płytki na orbitalnej wytrząsarce płytowej i potrząsaj przez 2 do 3 godzin w temperaturze pokojowej, aby wyjąć MTT.
    1. Alternatywnie, przeprowadzić ekstrakcję O/N w temperaturze 2-8 °C w ciemności bez wstrząsania.
  7. W przypadku niebarwnych cieczy testowych (ekstrakcja zanurzona): Pod koniec okresu ekstrakcji zdekantować ciecz z każdej wkładki z powrotem do studzienki i wyrzucić wkładki z tkankami RhCE.
    1. Wymieszać roztwór ekstraktu i przenieść dwie podwielokrotności o objętości 200 μl do odpowiednich studzienek wstępnie znakowanej płytki 96-dołkowej zgodnie z konfiguracją płytki (rysunek 2).
  8. W przypadku ciał stałych i płynnych barwników (ekstrakcja bez zanurzenia): Pod koniec okresu ekstrakcji wyrzuć tkanki (uważaj, aby nie przekłuć tkanek).
    1. Dodać 1,0 ml roztworu ekstrahowanego do każdego dołka 24-dołkowej płytki zawierającej roztwór wyekstrahowany z tkanek. Wymieszać roztwór ekstrahentu i przenieść dwie podwielokrotności o objętości 200 μl do odpowiednich dołków wstępnie znakowanej płytki 96-dołkowej zgodnie z konfiguracją płytki (rysunek 2).
  9. Oznaczyć gęstość optyczną (OD) ekstrahowanych próbek na pojedynczej długości fali w zakresie od 550 do 590 nm (powinna być spójna w laboratorium) na czytniku płytek lub spektrofotometrze.
    1. W przypadku mętnych roztworów ekstraktów spowodowanych przez nierozpuszczalne ciała stałe, należy odwirować roztwory przed pomiarem średnicy zewnętrznej (schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C, aby uniknąć parowania). W przypadku gdy płukanie nie usunie badanego przedmiotu (TA), a TA zakłóca redukcję MTT, należy zastosować dodatkowe kontrole. Zapoznaj się ze szczegółową procedurą SOP, aby skorygować redukcję MTT16.
    2. W przypadku wykazania, że TA ma lub rozwija barwę, która może wchodzić w interakcje z pomiarem MTT, należy przeprowadzić dodatkowe badanie w celu określenia ilości koloru związanego z tkankami, a następnie ekstrahowanego z nich. Zapoznaj się ze szczegółową procedurą SOP, aby skorygować kolorowe artykuły testowe16.

9. Obliczenia dla testu żywotności tkanek (Tabela 6 i Rysunek 3)

  1. Obliczenia ogólne
    1. Obliczyć średnią wartość OD ślepej próby studzienki kontrolnej (OD Blk) dla każdego doświadczenia.
    2. Odejmij OD Blk od każdej wartości OD tego samego eksperymentu (dane skorygowane Blk).
    3. Obliczyć średnią wartość dwóch podwielokrotności dla każdej tkanki (= skorygowana średnica zewnętrzna).
  2. Obliczyć procentową żywotność każdej z dwóch powtórzonych tkanek dla każdej próby kontrolnej i badanego artykułu w stosunku do średniej kontroli ujemnej (100 % kontroli).
    Żywotność (%) = [skorygowane tkanki poddane działaniu OD / skorygowana kontrola ujemna OD] x 100%
  3. Obliczyć różnicę żywotności (różnicę żywotności między dwiema tkankami replikowanymi).
  4. Obliczyć średnią żywotność badanego artykułu (żywotność TA) i sklasyfikować badany artykuł zgodnie z modelem predykcyjnym.

10. Model predykcyjny (Rysunek 3)

  1. Jeżeli żywotność tkanek poddanych działaniu TA wynosi >60,0 w stosunku do żywotności tkanek poddanych działaniu NC, należy oznaczyć badany artykuł jako niedrażniący (NI) (nr kategorii GHS).
  2. Jeżeli żywotność tkanek poddanych działaniu TA wynosi ≤ 60,0 w stosunku do żywotności tkanek poddanych działaniu NC, należy oznaczyć badany artykuł jako drażniący (I) (kategorie GHS 1 i 2).
    Uwaga: Wyniki testu EIT uznaje się za kwalifikowane, jeżeli:
    • EIT NC OD >0,8 i <2,5;
    • żywotność tkanek EIT PC (%, w stosunku do NC) wynosi ≤50,0%;
    • różnica między dwiema powtórzonymi tkankami (NC, PC i badany artykuł) wynosi <20,0%.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki EIT przeprowadzonego z użyciem 10 próbek testowych (TA) oraz kontroli negatywnej i pozytywnej przedstawiono w Tabeli 6 i na Rycini 3. Średnia wartość OD = 1,31 dla NC odpowiada 100% żywotności tkanki, zatem PC (średnia OD = 0,41) wykazała względną żywotność tkanki na poziomie 31,2%. Gdy protokół EIT wykonano w 15 prawidłowych niezależnych eksperymentach w 7 laboratoriach z zastosowaniem protokołu ekspozycji w fazie ciekłej oraz w 8 niezależnych prawidłowych eksperymentach w 4 laboratoriach z zastosowaniem protokołu ekspozycji w fazie stałej, średnia żywotność tkanki dla PC przy użyciu protokołu dla cieczy wyniosła 36,4 ±4,0%, a dla protokołu dla ciał stałych 32,3±6,4%. We wszystkich przypadkach wyniki kontroli pozytywnej znajdowały się poniżej wartości odcięcia wynoszącej 60,0%15.

Jak pokazano na Rysunku 3, próbki TA1, TA2, TA4, TA7 i TA8 wykazały żywotność tkanki >60,0%, w związku z czym zaklasyfikowano je jako „NI”. Próbki TA3, TA5, TA6, TA9 i TA10 wykazały żywotność tkanki ≤60,0%, zatem zaklasyfikowano je jako „I”. Różnica w żywotności tkanki pomiędzy powtórzeniami wynosiła <20,0% dla wszystkich TA z wyjątkiem TA2. W związku z tym wyniki dla wszystkich badanych artykułów, z wyjątkiem TA2, uznano za „kwalifikowane”, ponieważ spełniały one wszystkie kryteria akceptacji EIT (Sekcja 10.2). Ze względu na wysoką zmienność pomiędzy powtórzeniami tkanek dla TA2 w pierwszym eksperymencie, konieczne było przeprowadzenie drugiego eksperymentu w celu uzyskania kwalifikowanych wyników EIT.

Opisana w niniejszym dokumencie metoda testowa EIT z wykorzystaniem modelu tkankowego RhCE została użyta do oceny podrażnienia oczu w kilku wielolaboratoryjnych badaniach walidacyjnych, w tym w formalnej walidacji przeprowadzonej przez EURL ECVAM/Cosmetics Europe15,17-19. We wszystkich badaniach wykazano, że test EIT jest powtarzalny i pozwala na prawidłową identyfikację substancji chemicznych (zarówno pojedynczych substancji, jak i mieszanin), które zgodnie z UN GHS nie wymagają klasyfikacji i oznakowania jako substancje powodujące podrażnienie oczu lub poważne uszkodzenie oczu15,17-19. Metoda testowa EIT spełniła kryteria akceptacji Grupy Zarządzania Walidacją (VMG) dla podrażnienia oczu w zakresie czułości, swoistości i ogólnej dokładności i obecnie oczekuje na formalne wdrożenie jako częściowy zamiennik testu Draize na królikach in vivo19.

Schemat testu MTT; etapy preinkubacji, traktowania PBS, ekspozycji, moczenia po ekspozycji oraz pomiaru.
Rycina 1: Schemat protokołu EIT dla płynnych i stałych artykułów testowych. Stosowane skróty: AM, medium do testu; SCC, standardowe warunki hodowli; PBS, bufor fosforanowy Dulbecco; RT, temperatura pokojowa.

Schemat płytki 96-dołkowej dla analizy tkanek, przedstawiający rozkład próbek i kontrole do analizy danych.
Rycina 2: Znormalizowana konfiguracja płytki 96-dołkowej dla testu żywotności tkanek MTT. Dwie alikwoty po 200 µl przenosi się do odpowiednich dołków wcześniej oznakowanej płytki 96-dołkowej. Stosowane skróty: NC – kontrola negatywna; PC – kontrola pozytywna; TA1-TA20 – badane substancje 1-20; Blank – roztwór ekstrahujący. Konfiguracja płytki 96- MTT jest wykorzystywana z arkuszem Excel zaprojektowanym do obliczania żywotności tkanek RhCE oraz wyników EIT.

Wykres słupkowy porównujący zestawy danych NC, PC, TA1-TA10 z słupkami błędów i zaznaczoną linią progu.
Rycina 3: Wyniki EIT uzyskane dla 10 substancji testowych oraz kontroli NC i PC z wykorzystaniem modelu tkankowego RhCE. Wykres został wygenerowany z arkusza Excel zaprojektowanego do prezentacji wyników EIT. Substancje testowe, które obniżyły żywotność tkanki do ≤ 60,0% w stosunku do NC, zostały zaklasyfikowane jako substancje drażniące („I”, TA3, TA5, TA6, TA9 i TA10), natomiast substancje testowe, w których żywotność tkanki wyniosła >60,0%, zostały zaklasyfikowane jako niedrażniące („NI”, TA1, TA2, TA4, TA7 i TA8).

Czas rozpoczęcia etapów pracy protokołu EIT (praca jednego operatora w ciągu jednego dnia)
Każdy wiersz odpowiada jednej parze tkanek
Kolejność etapów:1234567
Płyny:PBSTA
Ekspozycja		Namaczanie
po ekspoz.		Inkubacja
po ekspoz.		Reakcja
MTT		Ekstrakcja
MTT		Pomiar
30 min30 min12 min120 min180 min120 minOD
NC9:009:3010:0010:1212:1215:12po 
PC9:019:3110:0110:1312:1315:1317:30
TA-19:029:3210:0210:1412:1415:14
TA-29:039:3310:0310:1512:1515:15
TA-39:049:3410:0410:1612:1615:16
TA-49:059:3510:0510:1712:1715:17
TA-59:069:3610:0610:1812:1815:18
TA-69:079:3710:0710:1912:1915:19
TA-79:089:3810:0810:2012:2015:20
TA-89:099:3910:0910:2112:2115:21
TA-99:109:4010:1010:2212:2215:22
TA-109:119:4110:1110:2312:2315:23

Tabela 3: Przykładowy harmonogram czasowy testowania ciekłych artykułów testowych. Kroki protokołu, w tym wstępne namaczanie tkanek w DPBS, aplikacja artykułów testowych (TAs), płukanie i moczenie po aplikacji, okres poinkubacyjny, test MTT, ekstrakcja MTT oraz pomiar gęstości optycznej (OD) MTT, są przedstawione w kolumnach. Czasy dla tkanek powtórzonych są zorganizowane w wierszach. Cały test obejmujący 10 TA oraz kontroli może zostać zakończony w jeden dzień.

Godziny rozpoczęcia etapów protokołu EIT (2 dni pracy jednego operatora)
Każdy wiersz odpowiada jednej parze tkanek
Dzień 1Dzień 2 (następny dzień)
Kolejność etapów:1234567
Etapy:PBSEkspozycja
TA		Moczenie
po ekspozycji		Inkubacja
po ekspozycji		Reakcja
MTT		Ekstrakcja
MTT		Pomiar
30 min6 hr26 min18 hr180 min120 minOD
NC9:009:3015:3015:569:5612:56po
PC9:029:3215:3215:589:5812:5815:30
TA-19:049:3415:3416:0010:0013:00
TA-29:069:3615:3616:0210:0213:02
TA-39:089:3815:3816:0410:0413:04
TA-49:109:4015:4016:0610:0613:06
TA-59:129:4215:4216:0810:0813:08
TA-69:149:4415:4416:1010:1013:10
TA-79:169:4615:4616:1210:1213:12
TA-89:189:4815:4816:1410:1413:14
TA-99:209:5015:5016:1610:1613:16
TA-109:229:5215:5216:1810:1813:18

Tabela 4: Przykładowy harmonogram czasowy badania stałych artykułów testowych. Kroki protokołu, w tym wstępne zwilżenie tkanek DPBS, aplikację artykułów testowych, płukanie i moczenie, okres poinkubacyjny, test MTT, ekstrakcję MTT oraz pomiar gęstości optycznej (OD) MTT, przedstawiono w kolumnach. Czasy dla tkanek dubletowych zorganizowano w wierszach. Cały test obejmujący 10 TA oraz kontrole przeprowadzany jest w ciągu dwóch dni.

IlośćOdczynnikWarunki przechowywaniaŹródłoOpisData ważności
1 fiolka,
 2 ml 		MTT Concentrate (MTT-100-CON)Chronić przed światłem (-20ºC)MatTekZamrożony koncentrat MTT2 miesiące
1 fiolka,
8 ml 		MTT diluent2-8ºCMatTekDo rozcieńczania koncentratu MTT przed użyciem w teście MTT2 miesiące
1 butelka,
 60 ml		Isopropanol
(CAS #67-63-0)		RTSigma-AldrichRoztwór ekstrakcyjnyNA

Tabela 5: Komponenty zestawu do testu MTT-100.

Kod N°Tkanka      Surowe danePoprawione dane dla próby ślepejśrednia wartość OD% żywotności
nAlikwot 1Alikwot 2Alikwot 1Aliq. 2
NC11.3161.3521.3161.3521.334101.6
21.2771.3091.2771.3091.29398.4
PC10.3790.3970.3790.3970.38829.6
20.4190.4420.4190.4420.43132.8
TA111.2131.2441.2131.2441.22993.5
21.3551.3551.3551.3551.355103.2
TA211.2101.1221.2101.1221.16688.7
20.8280.8370.8280.8370.83363.4
TA310.1670.1680.1670.1680.16712.7
20.1380.1360.1380.1360.13710.4
TA411.1371.1601.1371.1601.14987.4
21.2621.1911.2621.1911.22793.4
TA510.6100.6210.6100.6210.61646.9
20.4800.4840.4800.4840.48236.7
TA610.5020.5130.5020.5130.50838.7
20.3960.4070.3960.4070.40230.6
TA711.0481.0501.0481.0501.04979.9
21.1491.1501.1491.1501.15087.5
TA811.0321.0341.0321.0341.03378.7
20.9410.9350.9410.9350.93871.4
TA910.0220.0220.0220.0220.0221.7
20.1440.1490.1440.1490.14711.2
TA1010.1500.1500.1500.1500.15011.4
20.2540.2550.2540.2550.25519.4
średniaRóżnicowanieśrednia zRóżnicowanieRóżnicowanie/2Klasyfikacja
OD (gęstości optycznej)gęstości optycznej (OD)żywotność [%]żywotności
NC1.3140.041100.03.121.56NIwykwalifikowany
PC0.4100.04331.23.231.62Ikwalifikowany
TA11.2920.12798.39.634.81NIwykwalifikowany
TA20.9990.33376.125.3612.68NID>20
TA30.1520.03011.62.321.16Iwykwalifikowany
TA41.1880.07890.45.942.97NIwykwalifikowany
TA50.5490.13441.810.165.08Iwykwalifikowany
TA60.4550.10634.68.074.03Iwykwalifikowany
TA71.1000.10183.77.653.82NIwykwalifikowany
TA80.9860.09575.07.233.62NIkwalifikowany
TA90.0850.1256.49.484.74Iwykwalifikowany
TA100.2030.10515.47.953.98Iwykwalifikowany

Tabela 6: Wyniki EIT uzyskane dla 10 artykułów testowych oraz kontroli NC i PC. Tabele zostały wygenerowane za pomocą arkusza kalkulacyjnego Excel zaprojektowanego do obliczania żywotności tkanek i wyników EIT. Substancje chemiczne, które obniżyły żywotność tkanki do ≤ 60,0% w stosunku do NC, zostały sklasyfikowane jako drażniące („I”, TA3, TA5, TA6, TA9 i TA10), natomiast substancje chemiczne, w których żywotność tkanki wyniosła >60,0%, zostały sklasyfikowane jako niedrażniące („NI”, TA1, TA2, TA4, TA7 i TA8).

Dyskusja

Przedstawiliśmy Test Podrażnienia Oczu (Ryc. 1), który został opracowany dla modelu tkanki EpiOcular . EIT jest w stanie oddzielić substancje drażniące i dla oczu (kategorie 1 i 2 GHS łącznie) od materiałów, które nie wymagają oznakowania (kategoria nr GHS) o wysokim stopniu czułości i swoistości17. EIT w przedstawionej formie nie dyskryminuje substancji chemicznych kategorii 1 GHS od substancji chemicznych kategorii 2. EIT został zatwierdzony pod kątem klasyfikacji i oznakowania potencjału drażniącego na oczy szerokiej gamy substancji chemicznych, w tym składników kosmetycznych i farmaceutycznych. W połączeniu z innymi badaniami in vitro EIT będzie służył jako zamiennik badania in vivo działania drażniącego na oczy królika.

EIT stosuje dwa podobne, ale odrębne protokoły dla materiałów płynnych i stałych, które różnią się długością ekspozycji i okresami inkubacji po ekspozycji (rys. 1). Punktem końcowym stosowanym w EIT jest żywotność tkanek, określona za pomocą testu MTT, który był wcześniej stosowany w zwalidowanych modelach ludzkich tkanek nabłonkowych20,21. Do wykonania tego testu nie jest potrzebny żaden specjalny sprzęt poza standardowym sprzętem do hodowli komórek. Ze względu na wysoki poziom odtwarzalności tkanka-tkanka stosuje się n = 2 tkanki zamiast zwykle zalecanego n = 3. Możliwość wykorzystania n= 2 tkanek jest krytycznym aspektem protokołu, ponieważ pozwala doświadczonemu operatorowi na jednoczesne przetwarzanie dwóch tkanek, minimalizując w ten sposób zmienność testu, która może powstać z powodu różnego obchodzenia się z poszczególnymi tkankami14. Ponadto, stosując n = 2 tkanki na badany artykuł, można ocenić podrażnienie 10 badanych substancji o tym samym stanie fizycznym (ciekłym lub stałym), wraz z kontrolami pozytywnymi i ujemnymi, przy użyciu jednego zestawu (24 tkanki).

Innymi kluczowymi punktami, które zapewniają wiarygodną klasyfikację materiałów, są specyfikacje substancji służącej do kontroli dodatniej (żywotność tkanek ≤50,0%), odtwarzalność między zduplikowanymi tkankami (różnica <20,0%) oraz odczyty OD w ramach kontroli ujemnej (>0,8 i <2,5).

Podczas przeprowadzania testu EIT ważne jest przestrzeganie zatwierdzonego protokołu oraz sugerowanych schematów dawkowania i płukania (tabele 3 i 4), ponieważ odchylenie od protokołu lub zmiany w okresach inkubacji mogą skutkować zmianą wyniku. Podobnie, odchylenia od 3-godzinnego czasu inkubacji MTT spowodują różne odczyty MTT i mogą wpłynąć na wynik testu.

Czasami badana substancja chemiczna może mieć właściwości optyczne lub inne, które mogą zakłócać test żywotności tkanek MTT lub powodować zmniejszenie MTT. Na przykład badana substancja chemiczna może bezpośrednio redukować MTT do niebiesko-fioletowego produktu reakcji lub może być barwną substancją, która pochłania światło w tym samym zakresie co formazan MTT (~570 nm). Te badane substancje chemiczne będą jednak stanowić problem tylko wtedy, gdy w czasie przeprowadzania testu MTT wystarczająca ilość materiału jest nadal obecna w tkance (lub jest przez nią wchłaniana). Aby uniknąć tych zakłóceń, do protokołu EIT włączono obszerne procedury płukania. Jeśli płukanie nie usunie TA, a TA zakłóca redukcję MTT, należy zastosować dodatkowe kontrole w celu wykrycia i skorygowania tego. Krótko mówiąc, jeżeli podejrzewa się bezpośrednie zmniejszenie MTT badanej substancji chemicznej, 50 μl (lub 50 mg w przypadku ciał stałych) danej substancji chemicznej inkubuje się przez 3 godziny z roboczym roztworem MTT w SCC (NC, 50 μl sterylnej wody dejonizowanej, należy uruchomić jednocześnie). Jeśli roztwór MTT zmieni kolor na niebiesko-fioletowy, zakłada się, że badany artykuł zmniejszył MTT. W takim przypadku należy przeprowadzić kontrolę funkcjonalną z wykorzystaniem zamrożonych tkanek kontrolnych, aby ocenić, czy badany materiał wiąże się z tkanką i prowadzi do fałszywego sygnału redukcji MTT. W przypadku znacznego zmniejszenia MTT w kontroli tkanek zabitych narażonych na działanie TA (w stosunku do ilości w tkance żywotnej niepoddanej działaniu substancji czynnej), średnia żywotność badanego elementu musi zostać skorygowana poprzez odjęcie średniej żywotności zabitej grupy kontrolnej.

EIT popełnia błędy po stronie bezpieczeństwa, o czym świadczy niska liczba fałszywie ujemnych klasyfikacji14,15,18. Co ważne, żadna z substancji chemicznych kategorii 1 GHS, które działają żrąco na oczy i stanowią najpoważniejsze zagrożenie dla oczu, nie została sklasyfikowana jako niedrażniąca w tym teście14,15,18,19. Wreszcie, jedną z głównych zalet metody badania in vitro RhCE jest możliwość badania czystych materiałów ciekłych i stałych (co nie jest możliwe w przypadku dwuwymiarowych, zanurzonych kultur komórkowych).

EIT w znacznym stopniu przyczyni się do określenia potencjału drażniącego na oczy szerokiej gamy materiałów zgodnie z systemem klasyfikacji i oznakowania GHS ONZ. Zastąpienie zwierząt w celu określenia toksyczności ocznej jest celem badań toksykologicznych od wielu lat. W 2014 r. metoda badawcza EIT przeszła formalne badanie walidacyjne wspierane przez EURL ECVAM, a w 2015 r. metoda badawcza EIT została wdrożona do wytycznych OECD dotyczących badań jako OECD TG 492.

Oświadczenia

Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez MatTek Corporation. Autorzy są pracownikami firmy MatTek Corporation.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Johnowi Harbellowi za jego wsparcie naukowe i czas poświęcony projektowi EIT. Autorzy pragną również podziękować firmom Beiersdorf AG (Niemcy), IIVS (USA), Mary Kay Inc. (USA), Avon Products Inc. (USA), Procter & Gamble/Cosmital (Szwajcaria), Laboratoire Pierre Fabre (Francja), Harlan Laboratories (Wielka Brytania) i LVMH Parfume (Francja) za udział w wieloośrodkowych międzynarodowych badaniach prewalidacyjnych i walidacyjnych testu podrażnienia oczu15.

Bibliografia

  1. National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). Request for Ocular Irritancy Test Data From Human, Rabbit, and In Vitro Studies Using Standardized Testing Methods. Federal Register. 72 (109), 31582-31583 (2007).
  2. Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ. L396 (49), European Commission. 1-849 (2006).
  3. Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). , Fifth revised edition, United Nations. New York and Geneva. (2013).
  4. Draize, J. H., Woodard, G., Calvery, H. O. Methods for the Study of Irritation and Toxicity of Substances Applied Topically to the Skin and Mucous Membranes. J Pharmacol Exp Ther November. 82, 377-390 (1944).
  5. Adriaens, E. Retrospective analysis of the Draize test for serious eye damage/eye irritation: importance of understanding the in vivo endpoints under UN GHS/EU CLP for the development and evaluation of in vitro test methods. Arch tox. 88, 701-723 (2014).
  6. Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann, H. The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol in Vitro. 9, 871-929 (1995).
  7. Curren, R. D., Harbell, J. W. Ocular safety: a silent (in vitro) success story. Altern Lab Anim. 30, Suppl 2. 69-74 (2002).
  8. Wilhelmus, K. R. The Draize Eye Test. Survey of Ophthalmology. 45, 493-515 (2001).
  9. Curren, R. D., Harbell, J. W. In vitro alternatives for ocular irritation. Environ health persp. 106, 485-492 (1998).
  10. McCain, N. E., Binetti, R. R., Gettings, S. D., Jones, B. C. Assessment of ocular irritation ranges of market-leading cosmetic and personal-care products using an in vitro tissue equivalent. Toxicologist. 66, 243(2002).
  11. Niranjan, P., Dang, A. H., January, B. G., Gomez, C., Harbell, J. W. Use of the EpiOcular assay for preclinical qualification of formulas for human clinical studies. Toxicologist. 96, 249(2007).
  12. Yin, X. J. Prediction of ocular irritation potential of surfactants-based formulations at different concentrations using the EpiOcular model. Toxicologist. 108, 378(2009).
  13. Harbell, J., Curren, R. In vitro methods for the prediction of ocular and dermal toxicity. Handbook of Toxicology. , 2nd Edition, Informa Healthcare. (2001).
  14. Kaluzhny, Y. Development of the EpiOcular(TM) eye irritation test for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals in response to the requirements of the EU cosmetics directive and REACH legislation. Altern Lab Anim. 39, 339-364 (2011).
  15. Pfannenbecker, U. Cosmetics Europe Multi-Laboratory Pre-Validation of the EpiOcular Reconstituted Human Tissue Test Method for the Prediction of Eye Irritation. Toxicol in vitro. , (2013).
  16. MatTek Corporation. EpiOcular™ Eye Irritation Test (OCL-200-EIT) for the prediction of acute ocular irritation of chemicals for use with Reconstructed Human EpiOcular Model (OCL-200-EIT). Protocol#MK-24-007-0055. , MatTek Corporation. (2014).
  17. Kaluzhny, Y. EpiOcular Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification and Labeling of Eye Irritating Chemicals: Protocol Optimization for Solid Materials and Extended Shipment Times. Altern Lab Anim. 43 (2), 101-127 (2015).
  18. Kolle, S. N., Kandarova, H., Wareing, B., van Ravenzwaay, B., Landsiedel, R. In-house validation of the EpiOcular(TM) eye irritation test and its combination with the bovine corneal opacity and permeability test for the assessment of ocular irritation. Altern Lab Anim. 39, 365-387 (2011).
  19. Reconstructed Human Cornea-like Epithelium (RhCE) Test Method for Identifying Chemicals Not Requiring Classification and Labelling for Eye Irritation or Serious Eye Damage. Draft proposal for a new test guideline.. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. , (2014).
  20. Evaluating the ocular irritation potential of 54 test articles using the EpiOcular Human tissue Construct Model. Toxicol. In Vitro. Blazka, M. E., Harbell, J. 42nd Annual Meeting of the Soc. of Toxicology, Salt Lake City, UT, , (2003).
  21. Kandarova, H. The EpiDerm Test Protocol for the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. Altern Lab Anim. 33, 351-367 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test żywotności MTTocena toksyczności ocznejidentyfikacja zagrożeń chemicznychtesty in vitroprotokół nawadniania tkanekekspozycja ciało stałe-cieczpunkt odcięcia żywotności tkanki
Test działania drażniącego na oczy (EIT) w celu identyfikacji zagrożeń związanych z substancjami chemicznymi drażniącymi oczy przy użyciu zrekonstruowanego modelu tkanki nabłonka ludzkiego przypominającego rogówkę (RhCE)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.