Oznaczanie utleniania i lipogenezy kwasów tłuszczowych w pierwotnych hepatocytach myszy

Podsumowanie

Lipogeneza de novo i utlenianie β-kwasów tłuszczowych stanowią kluczowe szlaki metaboliczne w hepatocytach, szlaki, które są zaburzone w wielu zaburzeniach metabolicznych, w tym w stłuszczeniu wątroby. Tutaj pokazujemy izolację pierwotnych hepatocytów myszy i opisujemy ilościowe oznaczanie utleniania i lipogenezy β-kwasów tłuszczowych.

Streszczenie

Metabolizm lipidów w wątrobie jest złożony. Oprócz importu i eksportu lipidów za pośrednictwem lipoprotein, hepatocyty mogą utleniać lipidy poprzez utlenianie kwasów tłuszczowych lub alternatywnie syntetyzować nowy lipid poprzez lipogenezę de novo. Suma netto tych szlaków jest podyktowana wieloma czynnikami, co w niektórych stanach chorobowych prowadzi do stłuszczenia wątroby. Nadmierne gromadzenie lipidów w wątrobie jest związane z insulinoopornością całego organizmu i chorobą niedokrwienną serca. Narzędzia do badania metabolizmu lipidów w hepatocytach są przydatne do zrozumienia roli metabolizmu lipidów w wątrobie w niektórych zaburzeniach metabolicznych.

W wątrobie hepatocyty regulują rozkład i syntezę kwasów tłuszczowych odpowiednio poprzez utlenianie β tłuszczowe i lipogenezę de novo. Kwantyfikacja metabolizmu w tych szlakach dostarcza informacji na temat postępowania z lipidami w wątrobie. W przeciwieństwie do kwantyfikacji in vitro, przy użyciu hepatocytów pierwotnych, wykonywanie pomiarów in vivo jest technicznie trudne i wymaga dużych zasobów. W związku z tym ilościowe określenie utleniania β-kwasów tłuszczowych i lipogenezy de novo w hodowanych hepatocytach myszy zapewnia prostą metodę oceny postępowania z lipidami w hepatocytach.

Tutaj opisujemy metodę izolacji pierwotnych mysich hepatocytów i demonstrujemy ilościowe oznaczanie utleniania β-kwasów tłuszczowych i lipogenezy de novo, używając radioznakowanych substratów.

Wprowadzenie

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby jest jedną z głównych przyczyn chorób wątroby w kulturach zachodnich^1,2. Akumulacja lipidów w wątrobie jest związana ze śmiercią komórki, zwłóknieniem i niewydolnością wątroby poprzez nieznane jeszcze mechanizmy^3-6. W stłuszczeniowej chorobie wątroby utlenianie β kwasów tłuszczowych za pośrednictwem hepatocytów i lipogeneza de novo są ważnymi determinantami akumulacji lipidów netto^7,8. W tym artykule skupimy się zatem na izolacji hepatocytów, a następnie na ilościowym określeniu utleniania β-kwasów tłuszczowych i lipogenezie de novo.

Liczne metodologie zostały opracowane do badania metabolizmu lipidów w hepatocytach. Chociaż możliwe jest zmierzenie metabolizmu tłuszczu in vivo przy użyciu stabilnych izotopów^9,10, metody te są kosztowne i wymagają dużej liczby zwierząt. Ponadto możliwość zbadania wpływu egzogennych substancji chemicznych jest ograniczona ze względu na charakter eksperymentów in vivo. W przeciwieństwie do tego, izolacja pierwotnych hepatocytów z wątroby myszy zapewnia przystępną cenowo drogę do realizacji¹¹. Co więcej, badanie hepatocytów w hodowli pozwala badaczom badać wpływ różnych substancji chemicznych na przetwarzanie lipidów przy jednoczesnym obejściu trudności związanych z eksperymentami in vivo. Wreszcie, izolowane hepatocyty unikają wszelkich zakłóceń wynikających z różnych genetyk, ponieważ pochodzą z wątroby jednego zwierzęcia.

Tutaj izolujemy i hodujemy hepatocyty, a następnie mierzymy utlenianie β-kwasów tłuszczowych i lipogenezę de novo, używając radioznakowanego palmitynianu. Protokół opisany poniżej jest prosty, skuteczny i powtarzalny.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach powinny być przeprowadzane zgodnie z lokalnymi i federalnymi przepisami oraz za zgodą instytucjonalnej IACUC i administracji bezpieczeństwa radiacyjnego.

1. Przygotowanie

1. Na kilka dni przed testem rozmrozić 500 ml butelkę pożywki do trawienia wątroby (LDM) i ponownie zamrozić ~35 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie to potrzebne.
2. Na dzień przed testem wstępnie wysterylizuj czyste narzędzia preparacyjne w autoklawie.
3. W dniu testu należy potraktować kolagenem niezbędną ilość 24-dołkowych płytek hodowlanych.
   1. Wymieszaj 1 część 3 mg/ml kolagenu z ogona szczura z 50 częściami PBS. Dodać około 500 μl do każdego dołka na 24-dołkowej płytce i inkubować przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Usuń kolagen i pozostaw płytkę do wyschnięcia na powietrzu w kapturze. Powtórz co najmniej jeden dodatkowy raz.
      Uwaga: Powlekanie kolagenem można wykonać z tygodniowym wyprzedzeniem, a płytki przechowywane w temperaturze 4 °C są szczelnie zamknięte w folii plastikowej.
4. Przygotować LDM do oznaczenia: rozmrozić LDM i ogrzać do 37 °C, a następnie dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 N KOH. Przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 42 °C z recyrkulacją.
5. Podgrzać 25 ml pożywki do perfuzji wątrobowej do temperatury 42 °C w recyrkulacyjnej łaźni wodnej.
6. Przygotować 90% krzemionkę koloidalną pokrytą roztworem poliwinylopirolidonu: Dodać 1 ml 10x DPBS do 9 ml krzemionki koloidalnej pokrytej poliwinylopirolidonem. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 0,1 N HCl. Filtruj sterylnym filtrem strzykawkowym 0,2 μm. Sklep w RT.
7. Ciepłe podłoże galwaniczne do 37 °C.

2. Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy

1. Ustaw pompę perystaltyczną, rurki i stół rozwarstwiający: Wysterylizuj rurki, przepłukując je 5 ml 70% etanolu w wodzie destylowanej, a następnie 10 ml sterylnej wody. Umieść rurkę w pożywce do perfuzji wątroby i uruchom pompę, aby wypełnić całą długość rurki.
2. Złóż w ofierze mysz metodą zatwierdzoną przez instytucję.
3. Rozwiń jamę brzuszną: Spryskaj obficie brzuch myszy 70% etanolem. Używając nożyczek z końcami, wykonaj nacięcie w linii środkowej przez skórę właściwą na długości brzucha i odbij na boki. Wykonaj podobne nacięcie w otrzewnej, aby odsłonić wnętrzności.
   1. Za pomocą narzędzia delikatnie przemieszcz jelita, aby odsłonić układ naczyniowy jamy brzusznej Zlokalizuj żyłę główną dolną brzucha (IVC) i umieść szew pod naczyniem krwionośnym, dystalnie do żyły nerkowej
4. Dystalnie do szwu, umieść igłę i cewnik w IVC, przesuwając go poza poziom szwu. Trzymając igłę nadal na miejscu, zawiąż szew wokół cewnika, aby utrzymać go na miejscu. Ostrożnie wyjąć igłę. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, krew przepływa przez cewnik.
5. Za pomocą pipety wypełnij pozostały obszar cewnika środkiem perfuzyjnym, upewniając się, że nie ma powietrza. Z dużą ostrożnością przymocuj rurkę do cewnika.
6. Wypreparuj jamę płuca: delikatnie odbij górne płaty wątroby, aby odsłonić przeponę. Ostrożnie przebij przeponę nożyczkami z ostrą końcówką, a następnie wykonaj boczne nacięcie, aby odsłonić jamę opłucnej, uważając, aby uniknąć pęcherzyka żółciowego i naczyń opłucnej. Umieść zacisk buldoga wokół żyły głównej piersiowej dolnej tuż proksymalnie do żyły wątrobowej.
7. Przeciąć żyłę wrotną i włączyć pompę z prędkością 3 - 4 ml/min. Perfuzję wątroby za pomocą pożywki do perfuzji wątroby przez 5 minut, używając około 20 ml pożywki perfuzyjnej.
   Uwaga: Wątroba powinna natychmiast zmienić kolor z czerwonego na szary/brązowy. Jeśli części wątroby pozostają czerwone, prawdopodobnie oznacza to słabą perfuzję, a prawdopodobieństwo udanej izolacji jest znacznie zmniejszone. Podczas perfuzji należy uważać, aby pożywka nie wypłynęła i aby żadne pęcherzyki nie dostały się do rurki.
8. Po 5 minutowej inkubacji zatrzymać pompę i przenieść rurkę do pożywki do pożywki do trawienia wątroby. Ponownie uruchomić pompę i wysysać płuczki przez kolejne 10 - 15 minut (aż do wyczerpania pożywki).
9. Pod koniec perfuzji zatrzymaj pompę. Wątroba powinna mieć różowawy odcień i wyglądać na nieco powiększoną. Wytnij wątrobę przez staranne wypreparowanie. Usuń woreczek żółciowy i przenieś wątrobę do 10 cm naczynia do hodowli tkankowych.
10. W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodać 10 ml pożywki galwanicznej (Tabela 1) do wątroby. Delikatnie zeskrob wątrobę za pomocą kleszczy lub skalpela, aby usunąć hepatocyty. Przefiltrować zawiesinę za pomocą sitka o wielkości 100 μm i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Umyj płytkę dodatkowymi 10 ml pożywki galwanicznej i rozlej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
11. Granulować komórki przez odwirowywanie przez 5 minut w temperaturze 350 x g, 4 °C.
12. Odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w 10 ml podłoża galwanicznego i dodać 10 ml 90% krzemionki koloidalnej pokrytej poliwinylopirolidonem. Delikatnie wymieszać i odwirować jak w kroku 2.11. Po odwirowaniu warstwa martwych komórek będzie unosić się na wierzchu mieszaniny, podczas gdy żywe komórki będą opadać na dno.
13. Odessać martwe komórki i pożywkę. Przemyć 2 razy 20 ml podłoża galwanicznego, odwirować jak w ppkt 2.11.
14. Zawiesić komórki w 10 ml podłoża galwanicznego. Policz komórki za pomocą hemocytometru i umieść 9 x 10⁴ komórek/basenik w 24-dołkowych szalkach hodowlanych poddanych działaniu kolagenu. Inkubować w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Każda płytka może być używana do testu utleniania kwasów tłuszczowych LUB testu lipogenezy.
15. Opcjonalnie należy zmienić studzienki na pożywkę konserwacyjną (tabela 1) i hodować w temperaturze 37 °C. Komórki można hodować przez 2-3 dni bez wpływu na wyniki testu.

3. Test utleniania kwasów tłuszczowych

Ostrzeżenie: Użycie radioaktywności może być niebezpieczne. Wszelkie zakupy, przechowywanie, obchodzenie się i usuwanie materiałów radioaktywnych powinny odbywać się zgodnie z przepisami i wytycznymi instytucjonalnymi, stanowymi i federalnymi.

1. 16 - 20 godzin przed testem umyj komórki 2 razy ciepłym PBS. Zmienić komórki na bezsurowicową pożywkę głodową surowicy (Tabela 1) z 20 nM glukagonem i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Ponieważ płodowa surowica bydlęca zawiera nieznane stężenie hormonów metabolicznych (np. insuliny, glukagonu), surowica głodza komórki, aby usunąć wszelkie zakłócające skutki, jakie może to mieć na test. Komórki są żywotne w pożywce głodowej surowicy przez >24 godziny. Leczenie glukagonem stosuje się w celu stymulacji utleniania kwasów tłuszczowych w hepatocytach.
2. Rano w dniu testu przygotować pożywkę do wstępnej inkubacji: Zawiesić odpowiednią ilość palmitynianu sodu w ultraczystej wodzie, aby uzyskać roztwór o stężeniu 100 mM i podgrzewać do temperatury 70 °C przez 10 minut. W międzyczasie przygotuj wymaganą ilość (0,5 ml na dołek na płytkę 24-dołkową) DMEM z 25 mM HEPES, 1% BSA frakcji V i 20 nM glukagonu. Podgrzać do 37 °C.
   1. Po rozpuszczeniu dodać palmitynian do końcowego stężenia 250 μM do podłoża. Zmienić hepatocyty na pożywkę do inkubacji wstępnej i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Zachowaj trochę pożywki do wstępnej inkubacji w temperaturze 37 °C do późniejszego wykorzystania.
3. Podczas inkubacji wysuszyć odpowiednią ilość ¹⁴C-palmitynianu (0,5 μCi/studzienkę) przez odparowanie pod gazowym azotem.
   1. Na przykład, aby zmierzyć 24 próbki na 24-dołkowej płytce, przenieś 120 μl 0,1 μCi/ml¹⁴ C-palmitynianu do probówki o pojemności 1,5 ml. Powoli odparować rozpuszczalnik etanolowy, wdmuchując gazowy azot nad roztwór z odległości 3-5 cm w dygestorium. Rozpuszczalnik powinien odparować w ciągu około 30 - 40 minut, pozostawiając suchy ¹⁴C-palmitynian na dnie probówki.
4. Na około 15 minut przed zakończeniem inkubacji ponownie zawiesić ¹⁴C-palmitynianu w 0,1 N NaOH (12,5 μl/μCi). Inkubować w temperaturze 70 °C przez 10 minut. Dodać trzy objętości ciepłej pożywki do wstępnej inkubacji i mieszać, pipetując w górę i w dół.
5. Do każdej studzienki należy dodać 25 μl rozcieńczonego ¹⁴C-palmitynianu. Wymieszać, delikatnie kołysząc płytką i inkubować w temperaturze 37 °C przez 90 minut. To jest płytka testowa.
6. Podczas inkubacji przygotuj płytkę z bibuły filtracyjnej (rysunek 1).
   1. Zdejmij pokrywkę ze sterylnej płytki 24-dołkowej. Umieść jeden kawałek bibuły filtracyjnej o wymiarach 2 cm x 2 cm na dnie każdej ze studzienek. Na płytkę nałożymy kawałek parafilmu o wymiarach 4" x 7".
   2. Używając dużego prostokątnego przedmiotu, takiego jak pudełko z końcówką do mikropipet, przetrzyj parafilm o dołki, aby przebić parafilm w otworach studzienek i stworzyć uszczelnienie na pozostałej części płytki. Usuń perforowane kręgi parafilmu pokrywające teraz studzienki. Płytka powinna być teraz szczelnie pokryta parafilmem we wszystkich obszarach z wyjątkiem otworów studzienek.
7. 10 minut przed końcem inkubacji dodać 200 μl 3 N NaOH do każdego dołka płytki z bibuły filtracyjnej, upewniając się, że bibuła filtracyjna wchłonęła całą ciecz.
   1. Opcjonalnie przed zamrożeniem przenieś pożywkę na świeżą płytkę 24-dołkową. Po jednokrotnym umyciu PBS poddać lizie pozostałe komórki w 0,1 N HCl i obliczyć zawartość białka za pomocą testu BCA.
8. Pod koniec inkubacji zamrozić szalkę testową w ciekłym azocie. Uważaj, aby upewnić się, że każda studzienka jest całkowicie zamrożona przed kontynuowaniem.
9. Dodać 100 μl 70% kwasu nadchlorowego do każdego dołka płytki testowej. Natychmiast przykryj płytką z bibuły filtracyjnej. Umieść płytki na wytrząsarce orbitalnej i kołysz prędkością orbitalną 80 obr./min przy RT przez 2 godziny.
10. Po inkubacji próbki należy przetworzyć:
    1. Aby zmierzyć frakcję CO₂ , przenieś kwadraty bibuły filtracyjnej do 4 ml płynnego płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej i zmierz sygnał ¹⁴C.
    2. Aby zmierzyć materiał rozpuszczalny w kwasach, przenieś 400 μl pożywki do probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml. Wirować z maksymalną prędkością przez 10 min. Dodać 100 μl otrzymanego supernatantu do 500 μl chloroformu-metanolu (v/v) w proporcji 2:1 i krótko odwirować.
       1. Dodaj 250 μl wody do mieszaniny i ponownie zwiruj. Odwirować próbki przez 10 minut przy 3 000 x g. Przenieść 200 μl górnej fazy do 4 ml płynnego płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej i zmierzyć sygnał ¹⁴C.

4. Test lipogenezy

1. Wieczorem przed rozpoczęciem testu przemyj komórki 2 razy ciepłym PBS. Zmień hepatocyty na pożywkę głodową surowicy z insuliną 100 nM. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.
   Uwaga: Ponieważ płodowa surowica bydlęca zawiera nieznane stężenie hormonów metabolicznych (np. insuliny, glukagonu), surowica głodza komórki, aby usunąć wszelkie zakłócające skutki, jakie może to mieć na test. Komórki są żywotne w pożywce głodowej surowicy przez >24 godziny. Insulina jest stosowana w tym teście w celu stymulacji lipogenezy.
2. Wykonaj pożywkę do lipogenezy: pożywkę do głodzenia surowicy ze 100 nM insuliny, 10 μM zimnego octanu i 0,5 μCi ³H-octanu na studzienkę. Zmień komórki na pożywkę lipogenezę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Należy uwzględnić wszelkie związki będące przedmiotem zainteresowania, które mają być badane.
3. Po okresie inkubacji przemyć komórki 2 razy PBS. Lizować komórki przez zeskrobanie 120 μl 0,1 N HCl. Zarezerwować 10 μl do oznaczania białka (ocenić za pomocą testu BCA) i przenieść 100 μl do 1,5 ml probówki do mikrofuge.
4. Ekstrahować lipidy przez dodanie 500 μl chloroformu metanolu w proporcji 2:1 (v/v). Krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 250 μl wody, wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 5 minut. Odwirować próbki przez 10 minut przy 3 000 x g, RT. Ostrożnie przenieść dolną fazę do 4 ml płynnego płynu scyntylacyjnego w fiolce scyntylacyjnej i zmierzyć ^{aktywność 3}H.

Wyniki

Izolacja hepatocytów zazwyczaj pozwala na uzyskanie łącznie 1 - 3 x 10⁷ komórek. Po inkubacji przez noc komórki będą miały kształt sześciokątny, a wiele z nich będzie dwojądrowych (Rycina 2). Zdrowe komórki nie powinny wykazywać granulacji ani pęcherzyków, które świadczą o śmierci komórki.

Zasadniczo test utleniania kwasów tłuszczowych przeprowadza się w trzech lub czterech powtórzeniach dla każdego badanego związku. Liczby dla próbek CO₂ stanowią około j...

Dyskusja

Czas od złożenia ofiary do perfuzji powinien być krótszy niż 3 minuty, aby uzyskać idealną perfuzję i trawienie kolagenazy w wątrobie. Po rozpoczęciu perfuzji za pomocą pożywki perfuzyjnej wątroba powinna natychmiast zmienić wygląd z czerwonego na blady. Po około 10 minutach inkubacji z LDM wątroba będzie obrzęknięta i zaróżowiona. W przypadku, gdy perfuzja jest niewystarczająca, wątroba może nie wykazywać tych zmian, co zazwyczaj skutkuje niższą wydajnością hepatocytów.

Po etapach mycia, wyiz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Liver Perfusion Medium	Life Technologies	17701038
Liver Digest Medium	Life Technologies	17703034	Aliquot i przechowywać w temperaturze -20 & deg; C
PBS	Corning	21-040-CV
10X DPBS	Corning	46-013-CM
DMEM	Corning	10-017-CV
FBS	Life Technologies	26140079
Technologie Collagen	Life	A1048301
Krzemionka koloidalna pokryta poliwinylopirolidonem	GE Life Sciences	17-0891-01
Pirogronian sodu	Cellgro	25-000-CI
Penicylina / Streptomycyna	Cellgro	30-001-CI
	Insulina Sigma	I0516-5ML
Deksametazon	Sigma	D2915-100MG
Albumina (BSA), Frakcja V	MP Biomedicals	103703
24-dołkowe naczynie hodowlane	Corning Falcon	353047
Rurki Tygon S3	Cole Parmer	06460-34
Męski Leur Lock do 200 łączników kolczastych	Cole Parmer	45518-00
Cewnik 24 G x 3/4" SurFlo		SROX2419CA
szew Perma-Hand	Ethicon	683G
Sitko do komórek	Corning Falcon	08-771-2
IsoTemp 3013HD Kąpiel recyrkulacyjna	Fisher	13-874-3
Pompa perystaltyczna MasterFlex C/L MasterFlex		HV-77122-24
Mikrozacisk	Roboz	RS-7438	Wstępna sterylizacja w autoklawie
5" Proste, tępo-nożyczki operacyjne	Roboz	RS-6810	Wstępna sterylizacja w autoklawie
Ostrze 24 mm Proste, ostro zakończone nożyczki do mikropreparacji	Roboz	RS-5912	Wstępna sterylizacja w autoklawie
Kleszcze do mikropreparacji 4 "0,8 mm Roboz		RS-5130	Wstępna sterylizacja w autoklawie
4" 0,8 mm Końcówka z pełną krzywą Kleszcze do mikropreparacji	Roboz	RS-5137	Wstępna sterylizacja w autoklawie
Strzykawka 60 ml	Becton Dickinson	309653
50 ml	Test białka Corning Falcon	352070
BCA	Thermo Scientific	23225
Komora
Inkubator
Serologiczny pipety
1,000, 200, 20 μ l Pipeta i końcówki