Selektywne zubożanie mikrogleju z kultur komórek ziarnistych móżdżku przy użyciu estru metylowego L-leucyny

Podsumowanie

Mikroglej może wpływać na neurony i inne komórki glejowe w hodowli za pomocą różnych autonomicznych mechanizmów niekomórkowych. W tym miejscu przedstawiamy protokół selektywnego usuwania mikrogleju z pierwotnych kultur neuronalnych. Metoda ta może potencjalnie wyjaśnić rolę interakcji mikrogleju i neuronów, co ma implikacje dla schorzeń neurodegeneracyjnych, w których zapalenie nerwów jest cechą charakterystyczną.

Streszczenie

Mikroglej, rezydujące immunokompetentne komórki OUN, odgrywają wieloaspektową rolę w modulowaniu i kontrolowaniu funkcji neuronów, a także pośredniczą w odporności wrodzonej. Pierwotne modele hodowli komórek gryzoni znacznie poszerzyły naszą wiedzę na temat interakcji neuronalno-glejowych, ale dopiero niedawno zastosowano metody specyficznego eliminowania mikrogleju z kultur mieszanych. Jedną z takich technik – opisaną tutaj – jest zastosowanie estru metylowego L-leucyny, czynnika lizomotropowego, który jest internalizowany przez makrofagi i mikroglej, gdzie powoduje zakłócenie lizosomalne, a następnie apoptozę^13,14. Eksperymenty z użyciem estru metylowego L-leucyny mają moc identyfikacji wkładu mikrogleju w otaczające środowisko komórkowe w różnych warunkach hodowli. Korzystając z protokołu zoptymalizowanego w naszym laboratorium, opisujemy, jak wyeliminować mikroglej z hodowli komórek ziarnistych móżdżku gryzoni P5. Takie podejście pozwala ocenić względny wpływ mikrogleju na dane eksperymentalne, a także określić, czy mikroglej odgrywa rolę neuroprotekcyjną czy neurotoksyczną w modelach hodowlanych schorzeń neurologicznych, takich jak udar, choroba Alzheimera czy Parkinsona.

Wprowadzenie

Ludzki mózg składa się z około 85 miliardów neuronów i kolejnych 85 miliardów komórek nieneuronalnych, w tym komórek glejowych¹. Przez większą część ostatnich 100 lat neuronaukowcy skupiali się głównie na populacji komórek nerwowych, wierząc, że komórki glejowe są niewiele więcej niż pasywnymi komórkami podporowymi, które zapewniają strukturalne wsparcie neuronom – stąd grecka etymologia słowa "glej" przetłumaczona na angielski jako "klej". Ostatnio jednak staje się coraz bardziej oczywiste, że interakcje neuronalno-glejowe mogą być znacznie bardziej fundamentalne dla podstawowych aspektów neurobiologii, neurofizjologii oraz genezy i progresji wielu chorób neurodegeneracyjnych. Komórki ziarniste móżdżku (CGC), najliczniejsza jednorodna populacja neuronów w ludzkim mózgu, dominują w móżdżku i stanowią ponad 90% jego składników komórkowych. W związku z tym komórki te były szeroko stosowane in vitro jako system modelowy do badania rozwoju, funkcji i patologii neuronów^2-6.

Jednak kultury CGC nadal zawierają mikroglej i inne komórki glejowe w prawdopodobnie znacznych proporcjach. W rezultacie, dane CGC przypuszczalnie wykazujące bezpośrednie odpowiedzi neuronalne na różne terapie komórkowe mogą w rzeczywistości wynikać – częściowo lub całkowicie – z pośredniej wtórnej odpowiedzi sąsiedniego gleju w hodowli. Aby to ocenić, selektywnie wyeliminowaliśmy mikroglej z kultur neuronalnych CGC za pomocą estru metylowego L-leucyny (LME). LME jest środkiem lizomotropowym pierwotnie używanym do selektywnego niszczenia makrofagów⁷ i od tego czasu jest również używany do selektywnego zubożania mikrogleju z kultur glejowych nerwowych, astrocytów i mieszanych^8,9,10. LME jest internalizowany przez makrofagi i mikroglej, gdzie powoduje rozerwanie lizosomów, a następnie apoptozę^13,14. Makrofagi i mikroglej są charakterystycznie bogate w lizosomy, co powoduje, że są one szczególnie wrażliwe po ekspozycji na leczenie LME. Protokół ten zapewnia potężny, a jednocześnie prosty i łatwy sposób ustalenia udziału mikrogleju w eksperymentach z wykorzystaniem CGC i innych systemów hodowli neuronalnych/glejowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty opisane tutaj zostały przeprowadzone zgodnie z Ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) w Wielkiej Brytanii z 1986 roku.

1. Przygotowanie instrumentów, pożywek hodowlanych i potraw

1. Przygotuj dwa laboratoryjne nożyczki preparacyjne ze stali nierdzewnej i dwa kleszcze laboratoryjne ze stali nierdzewnej. Umieść wszystkie narzędzia w autoklawie i umieść w okapie hodowlanym O/N pod światłem ultrafioletowym (UV) w celu sterylizacji.
2. Przygotować 500 ml pożywki hodowlanej o minimalnej ilości niezbędnych pożywek (MEM) (10% płodowej surowicy bydlęcej [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO₃, 30 mM D-glukozy, 2 mM L-glutaminy, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 6 μg/ml ampicyliny) i wysterylizować filtrem. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez wiele miesięcy.
3. Przygotować 24-dołkowe płytki hodowlane zawierające szkiełka nakrywkowe o grubości 14 mm i grubości 1. Szkiełka nakrywkowe należy sterylizować w autoklawie i pokryć poli-d-lizyną (PDL) w stężeniu 100 mg/l, jak opisano wcześniej ³. Światło UV sterylizuje O / N.

2. Przygotowanie rozwiązań w zakresie kultur CGC

1. Przygotować "roztwór A" (100 ml) w autoklawowanym, poddanym działaniu promieni UV, sterylnym_dH2O, poddanym działaniu promieniowania UV, zawierający 250 mg glukozy, 300 mg albuminy surowicy bydlęcej [BSA], 955 mg soli fizjologicznej buforowanej fosforanami [PBS] (wolną od Ca²⁺ i Mg⁺) oraz 1 ml 3,8% MgSO₄·_7H2O.
2. Przygotować "roztwór B" (10 ml) zawierający 1 ml 5 mg/ml trypsyny rozcieńczonej w 9 ml roztworu A.
3. Przygotować "roztwór C" (10 ml) zawierający 1000 jednostek DNazy, 0,5 mg inhibitora trypsyny sojowej, 100 μl 3,8% MgSO₄·_7H2O, rozcieńczony do 10 ml roztworem A.
4. Przygotować roztwór D (20 ml) zawierający 3,2 ml roztworu C, rozcieńczony do 20 ml roztworem A.
5. Przygotować roztwór zrównoważonej soli BSA/Earle'a (EBSS) zawierający EBSS, 25 mM NaHCO₃, 3 mM MgSO₄·7H₂O i 4% BSA, pH 7,4, jak opisano wcześniej³.
6. Przygotować LME, dodając czystą LME do 5 ml pożywki hodowlanej MEM, aby uzyskać końcowe stężenie 150 mM LME, przywrócić roztwór do pH 7,4 za pomocą pH-metru laboratoryjnego i wysterylizować filtr za pomocą 28 mm filtra strzykawkowego z polieterosulfonu (PES) 0,2 μm.

3. Hodowla CGC

1. Zbierz móżdżek od 4-7 dniowych szczeniąt szczurów, jak opisano wcześniej³. Umieścić natychmiast na szalce Petriego zawierającej 5 ml roztworu A na lodzie.
2. Odlej nadmiar roztworu z móżdżku i umieść tkankę w pokrywie szalki Petriego.
3. Drobno posiekaj tkankę dobrze podpaloną żyletką w co najmniej trzech różnych kierunkach.
4. Dodać rozdrobnioną chusteczkę do roztworu B (przepłukać szalkę Petriego roztworem, aby upewnić się, że utracono ograniczoną ilość tkanki) i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 5 minut. Wstrząsać delikatnie co kilka minut.
5. Dodać roztwór D (20 ml) do probówki, aby zneutralizować trypsynę, wstrząsnąć i odwirować przy 65 x g przez 5 minut.
6. Odlewać supernatant.
7. Zawiesić ponownie w 4 ml roztworu C. Dobrze rozprowadzić (około 10 razy każda) trzema pipetami ze szkła płomienistego o zmniejszającej się średnicy, aż zawiesina stanie się możliwie najbardziej jednorodna.
8. Powoli i delikatnie dodaj kilka kropli tego homogenatu na wierzch BSA/EBSS. Jeśli zacznie zapadać się przez BSA/EBSS, rozcieraj więcej i/lub dodaj trochę więcej roztworu C. Homogenat powinien znajdować się w warstwie na wierzchu BSA/EBSS. Nie potrząsać. Wirować z prędkością 100 x g przez 5 min.
9. Usunąć supernatant i zawiesić osad (miękki) w 1 ml pożywki MEM.
10. Policz komórki za pomocą hemocytometru i płytki w ilości 800 000 komórek/szkiełko nakrywkowe w 500 μl pożywki MEM. Umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 6% CO₂ .
11. Zmień podłoże następnego dnia (24-36 godzin po przygotowaniu). Przygotować roztwór pożywki MEM zawierający 10 μM inhibitora cyklu komórkowego arabinofuranozylocytydyny (AraC).
    1. Dla każdego szkiełka nakrywkowego należy zachować 250 μl starej pożywki na świeżej płytce 24-dołkowej, odessać resztę, dodać 250 μl normalnej pożywki MEM i odessać ją w celu przepłukania komórek, a następnie dodać 250 μl starej pożywki z powrotem do komórek i uzupełnić 250 μl pożywki zawierającej AraC.
       Uwaga: Komórki mogą być używane od 6 dni in vitro (DIV).

4. Selektywne zubożanie mikrogleju (wykonywane przy 6 DIV)

1. Dodać czystą LME do 5 ml oddzielnej podwielokrotności pożywki MEM, aby uzyskać końcowe stężenie 150 mM LME.
2. Przywróć roztwór do pH 7,4 i wysterylizuj filtr za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 28 mm z sulfonu polieterowego (PES) 0,2 μm.
3. Rozcieńczyć roztwór do stężenia 50 mM (2 x LME) w pożywce MEM i umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 ^°C na 10 minut wraz z normalną pożywką MEM dla kultur kontrolnych.
4. Usunąć połowę (250 μl) pożywki MEM z kultur CGC i zachować w temperaturze 37 °C.
5. Traktować komórki pożywką MEM zawierającą 2 x LME (250 μl), tj. rozcieńczoną w stosunku 1:1, co daje stężenie studzienki 25 mM, lub wstępnie podgrzaną pożywką MEM bez LME (250 μl) dla kultur kontrolnych.
6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze z 6% CO₂ przez 1 godzinę.
7. Umyć komórki dwukrotnie w świeżej, wstępnie podgrzanej pożywce MEM w celu usunięcia pożywki zawierającej LME, a następnie zastąpić zatrzymaną pożywkę hodowlaną i równą objętość świeżej, wstępnie podgrzanej pożywki MEM do odpowiednich studzienek.
8. Umieścić kultury z powrotem w inkubatorze (nawilżonym 6% CO₂ w temperaturze 37 °C) i pozostawić na 24 godziny przed dalszym leczeniem.

Wyniki

Zdolność tej techniki do selektywnego usuwania mikrogleju z CGC i/lub kultur mieszanych opiera się na późniejszej możliwości dokładnej identyfikacji i odróżnienia mikrogleju od otaczających go komórek przez badacza. Można to osiągnąć przy użyciu markera specyficznego dla mikrogleju, takiego jak izolektyna-B4, co zilustrowano na Rysunku 1. Jak pokazano na Rysunku 2, nie odnotowano zauważalnych zmian w gęstości i morfologii astrocytów oraz neuronów w odniesieniu do każdej z głównych grup b...

Dyskusja

Najważniejszymi krokami zapewniającymi skuteczną selektywną eliminację mikrogleju z CGC i/lub kultur mieszanych są: 1) utrzymanie sterylnej i zdrowej hodowli CGC; 2) filtr sterylizujący pożywkę zawierającą LME i przywracający roztwór do pH 7,4; 3) utrzymywanie zatrzymanych mediów CGC i mediów zawierających LME w temperaturze 37 °C w celu uniknięcia szoku cieplnego; oraz 4) szybkie działanie w celu skrócenia czasu przetrzymywania komórek poza inkubatorem.

Użyliśmy 25 mM LME do zuboże...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kleszcze	Sigma-Aldrich	F4142	Zakrzywiony koniec ułatwia usuwanie móżdżku
Nożyczki do mikropreparacji	Sigma-Aldrich	S3146	Prosty, ostry czubek ułatwia preparację gryzoni P4-7
Chlorowodorek estru metylowego L-leucyny	Sigma-Aldrich	7517-19-3
Roztwór EBSS	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poli-D-lizyna	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Szkiełka nakrywkowe pokryć 1 dzień przed użyciem
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNaza	Sigma-Aldrich	D5025
Inhibitor trypsyny sojowej	Sigma-Aldrich	T6414
Mysie przeciwciało anty-ED1	Abcam	ab31630

powiedział: