Method Article

Zaprojektowana unaczyniona płat mięśniowa

DOI:

10.3791/52984

⸱

January 11th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, Kaplan Medical Center, 2Biomedical Engineering, Technion Israel Institute of Technology, 3Interdepartmental Program in Biotechnology, Technion Israel Institute of Technology, 4Medicine Department, Technion Israel Institute of Technology

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do tej pory, grube ubytki tkanek są zazwyczaj rekonstruowane za pomocą autologicznych płatów tkankowych lub tkanek zmodyfikowanych. W niniejszym protokole przedstawiamy nową metodę inżynierii unaczynionego płata tkankowego z autologiczną szypułką, która ma służyć jako substytut płatów autologicznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jednym z głównych czynników ograniczających grubość tkanki i jej wynikającą z tego żywotność i możliwość zastosowania in vivo, jest kontrola dopływu tlenu do mikrośrodowiska komórki, ponieważ pasywna dyfuzja jest ograniczona do bardzo cienkiej warstwy. Chociaż opisano różne materiały przywracające integralność pełnogrubych ubytków ściany brzucha, żaden materiał nie okazał się jeszcze optymalny, ze względu na niskie unaczynienie przeszczepu, odrzucenie tkanki, infekcję lub nieodpowiednie właściwości mechaniczne. Protokół ten opisuje sposób inżynierii w pełni unaczynionego płata, o grubości istotnej dla rekonstrukcji tkanki mięśniowej. Osadzone w komórkach konstrukty kwasu poli-L-mlekowego/kwasu polimlekowo-ko-glikolowego są wszczepiane wokół tętnicy udowej i żyły myszy i utrzymywane in vivo przez okres jednego lub dwóch tygodni. Unaczyniony przeszczep jest następnie przenoszony jako płat w kierunku ubytku pełnej grubości wykonanego w jamie brzusznej. Technika ta zastępuje potrzebę autologicznych sakraksacji tkanek i może umożliwić wykorzystanie unaczynionych płatów in vitro w wielu zastosowaniach chirurgicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wady ściany brzucha często powstają po ciężkim urazie, leczeniu raka, oparzeniach i usunięciu zainfekowanej siatki. Wady te często wiążą się ze znaczną utratą tkanek, co wymaga skomplikowanych zabiegów chirurgicznych i stanowi duże wyzwanie dla chirurgów zajmujących się rekonstrukcją plastyczną 1-4. Naukowcy zajmujący się inżynierią tkankową poszukujący nowych źródeł sztucznych tkanek zbadali różne materiały, źródła komórkowe i czynniki wzrostu. Wcześniej donoszono o udanych odbudowach różnych tkanek, takich jak tchawica 5,6, pęcherz moczowy 7, rogówka 8, kość 9i skóra 10, poprzez implantację tkanek inżynieryjnych. Jednak wytwarzanie grubej, unaczynionej tkanki inżynieryjnej, szczególnie w celu rekonstrukcji dużych defektów, pozostaje poważnym wyzwaniem w inżynierii tkankowej.

Jednym z głównych czynników ograniczających grubość żywotnej tkanki jest kontrola dopływu tlenu do komórek składowych. W przypadku polegania na dyfuzji, grubość konstrukcji jest ograniczona do grubości bardzo cienkiej warstwy. Maksymalna odległość między naczyniami włosowatymi dostarczającymi tlen i składniki odżywcze in vivo wynosi około 200 μm, co koreluje z granicą dyfuzji tlenu11,12. Niewystarczające unaczynienie może powodować niedokrwienie tkanek i eskalować do resorpcji tkanek lub martwicy 13.

Ponadto, idealny materiał używany do rekonstrukcji tkanek musi być biokompatybilny i nieimmunogenny. Musi być również zdolny do wspierania dalszej integracji komórek gospodarza z biomateriałem i utrzymywania integralności strukturalnej. Różne biologiczne matryce 14-16 i syntetyczne 1,17,18 były wcześniej badane do rekonstrukcji tkanek, jednak ich zastosowanie pozostaje ograniczone ze względu na brak skutecznego ukrwienia, infekcje lub niewystarczającą wytrzymałość tkanek.

W tym badaniu, biokompatybilne, osadzone w komórkach rusztowanie składające się z zatwierdzonego przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) kwasu poli L-mlekowego (PLLA) / kwasu polimlekowo-ko-glikolowego (PLGA), zostało wszczepione wokół tętnic udowych i naczyń żyłowych (AV) nagiej myszy i oddzielone od otaczającej tkanki, zapewniając unaczynienie tylko z naczyń AV. Tydzień po implantacji przeszczep był żywotny, gruby i dobrze unaczyniony. Ta gruba, unaczyniona tkanka z naczyniami przedsionkowo-komorowymi została następnie przeniesiona jako uszypułowany płat do ubytku pełnej grubości w jamie brzusznej u tej samej myszy. Tydzień po przeniesieniu płat był sprawny, unaczyniony i dobrze zintegrowany z otaczającą tkanką, mając wystarczającą siłę, aby podtrzymać wnętrzności brzuszne. W ten sposób zaprojektowany gruby, unaczyniony płat tkankowy, z autologiczną szypułką, przedstawia nowatorską metodę naprawy ubytków ściany brzucha o pełnej grubości.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentów na Zwierzętach Technionu. Do tej procedury użyto atymicznych nagich myszy, aby uniknąć odrzucenia immunologicznego. W przypadku korzystania z innego rodzaju myszy, myszy powinny zostać ogolone przed zabiegiem chirurgicznym i zaleca się podanie cyklosporyny (lub innego substytutu zapobiegającego odrzuceniu).

1. Przygotowanie rusztowania i osadzanie komórek

  1. Przygotować rusztowania składające się z mieszaniny 1:1 kwasu poli-L-mlekowego (PLLA) i kwasu polimlekowo-koglikolowego (PLGA) w następujący sposób:
    1. Rozpuścić 500 mg PLLA i 500 mg PLGA w 10 ml chloroformu.
    2. Dodać 0,24 ml roztworu polimeru do 0,4 g cząstek chlorku sodu zebranych w foremkach teflonowych. Użyj soli o średnicy 212-600 μm. Pozwól, aby chloroform odparował O/N.
    3. Wypłucz sól za pomocą wody destylowanej, co prowadzi do połączonych ze sobą porowatych rusztowań 3D.
    4. Pokrój kawałki polimeru za pomocą nożyczek, a następnie namocz w 70% etanolu (v/v) przez 30 minut i umyj 3 razy w PBS przez 2 minuty przed użyciem.
  2. Przygotować trikulturę następujących komórek w pożywce dla komórek śródbłonka w stosunku 1:1 (EGM-2 uzupełniony składnikami zestawu pocisków i pożywką dla komórek mięśniowych (minimalna pożywka egzogenna (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2,5% buforem HEPES, 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny (roztwór Pen-Strep).
    1. Użyj 0,5 x 106 mioblastów C2C12, 0,9 x 106 ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) i 0,2 x 106 normalnych ludzkich fibroblastów skóry (NHDF).
  3. Wymieszać komórki w probówce do mikrowirówek i wirować przy 200 x g przez 4 minuty, odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w mieszaninie 4 μl lodowatego roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej i 4 μl pożywki komórkowej.
  4. Wyciąć kawałek rusztowania PLLA/PLGA o wymiarach 10 mm x 7 mm x 1 mm (długość x szerokość x grubość) i wysiać zawiesinę komórek na płytce 6-dołkowej, pozostawić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej do zestalenia się (30 min, 37 °C, 5% CO2) przed dodaniem 4 ml pożywki komórkowej.
  5. Inkubuj rusztowania przez dziesięć dni przed implantacją i wymieniaj podłoże co drugi dzień.

2. Przed rozpoczęciem zabiegu chirurgicznego

  1. Przygotuj i wysterylizuj (autoklaw) następujące narzędzia chirurgiczne: małe, cienkie, proste nożyczki, nożyczki sprężynowe, proste kleszczyki z cienką końcówką, ząbkowane kleszczyki i uchwyt na igły.
  2. Przygotować mieszaninę roztworu ketaminy: ksylazyny w probówce do mikrowirówki, mieszając 425 μl ketaminy i 75 μl ksylazyny w strzykawce o pojemności 1 ml.
  3. Rozcieńczyć 0,3 mg/ml buprenorfiny w jałowym roztworze soli fizjologicznej (1:20).

3. Budowa płata (implantacja przeszczepu)

  1. Za pomocą strzykawki insulinowej znieczulij mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy:ksylazyny (35 μl na 20 g masy ciała).
  2. Przed operacją należy wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę (końcowe stężenie 0,05-0,1 mg/kg).
  3. Umieść mysz na stoliku podgrzanym do 37 °C, aby zapewnić normalną temperaturę ciała, a następnie zabezpiecz mysz za pomocą bandaża samoprzylepnego.
  4. Za pomocą bawełnianych końcówek nałóż nawilżającą maść do oczu myszy (aby uniknąć odwodnienia).
  5. Za pomocą bawełnianych końcówek oczyść miejsce nacięcia jodem, a następnie 70% etanolem, aby stworzyć aseptyczne pole robocze.
  6. Za pomocą małych nożyczek i kleszczy wykonaj nacięcie przez skórę, od poziomu kolana do więzadła pachwinowego, równolegle do naczyń udowych, aż do odsłonięcia tętnicy udowej i naczyń żylnych (AV).
  7. Przytrzymaj skórę za pomocą retraktora, aby uzyskać lepszy dostęp do tkanki.
  8. Za pomocą nożyczek sprężynowych i kleszczy ostrożnie odizoluj tętnicę udową i naczynia żylne od otaczającej tkanki. Zacznij od poziomu więzadła pachwinowego do rozwidlenia górnych naczyń nadbrzusza. Pozostaw profunda nietkniętą, aby zachować przepływ krwi do nogi i zapobiec późniejszemu niedokrwieniu.
  9. Złożyć przeszczep (z sekcji 1) wokół odsłoniętej kości udowej AV, poniżej profunda i powyżej rozwidlenia do kości piszczelowej i proneszowej AV i połączyć jego końce za pomocą 8-0 szwy jedwabne.
  10. Aby zapewnić unaczynienie implantu przez naczynia włosowate wyrastające tylko z naczyń przedsionkowo-komorowych kości udowej, owiń przeszczep kawałkiem wysterylizowanego lateksu i zszyj szwami 6-0.
  11. Zamknij leżącą na powierzchni skórę za pomocą jedwabnych szwów 4-0.
  12. Uważnie obserwuj mysz aż do wyzdrowienia ze znieczulenia, a następnie codziennie, aż przeszczep zostanie przeniesiony jako płat. Podskórnie wstrzykiwać buprenorfinę (końcowe stężenie 0,05-0,1 mg/kg) dwa razy dziennie przez 2-3 dni.
    UWAGA: Używaj soli fizjologicznej na dowolnym etapie, aby uniknąć odwodnienia odsłoniętej tkanki.

4. Przeniesienie klapy

  1. Po jednym lub dwóch tygodniach od implantacji znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy:ksylazyny (35 μl/20 g) za pomocą strzykawki insulinowej.
  2. Przed operacją należy wstrzyknąć podskórnie buprenorfinę (końcowe stężenie 0,05-0,1 mg/kg).
  3. Umieść mysz na stoliku podgrzanym do 37 °C, aby zapewnić normalną temperaturę ciała, a następnie zabezpiecz mysz za pomocą bandaża samoprzylepnego.
  4. Za pomocą bawełnianych końcówek nałóż nawilżającą maść pod oczy myszy (aby uniknąć odwodnienia).
  5. Za pomocą bawełnianych końcówek oczyść miejsce nacięcia (od okolicy kolana do brzucha) jodem, a następnie 70% etanolem, aby stworzyć aseptyczne pole robocze.
  6. Za pomocą nożyczek i kleszczy ostrożnie otwórz szwy w skórze i za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie przez skórę równolegle do więzadła pachwinowego, kontynuując przez skórę brzuszną.
  7. Ostrożnie usuń kawałek lateksu za pomocą kleszczy i odsłoń unaczynioną klapę.
  8. Za pomocą nożyczek i kleszczy odetnij płat tkanki od otaczającej tkanki.
  9. Za pomocą kleszczy i uchwytu na igłę podwiązaj dystalny koniec kości udowej przedsionkowo-komorowej za pomocą 8-0 jedwabne szwy zapobiegające krwawieniu z AV. Następnie kauteryzuj przedsionkowo-komorowy na poziomie kolana, dystalnie do złożonej implantowanej tkanki i 8-0 szwy.
  10. Delikatnie przenieś przedsionkowo-komorową kość udową otoczoną przeszczepem w kierunku brzusznej ściany brzucha, unikając uszkodzenia tętnicy, aby określić, w jakiej odległości należy wykonać ubytek pełnej grubości.
    UWAGA: Zbyt daleko pociągnięcie tętnicy spowoduje jej uszkodzenie.
  11. Za pomocą cienkich nożyczek wykonaj nacięcie w brzusznej ścianie brzucha.
  12. Za pomocą nożyczek sprężynowych wykonaj nacięcie w mięśniu prostym brzucha. Usuń segment mięśnia prostego brzucha o wymiarach około 1 cm x 0,8 cm wraz z leżącą nad nim skórą.
  13. Przenieść przedsionkowość kości udowej, otoczoną unaczynionym przeszczepem, jako płat osiowy, do ubytku o pełnej grubości w brzusznej ścianie brzucha.
  14. Zszyj płat z otaczającą tkanką mięśniową, używając 8-0 szwy jedwabne, aby zapobiec przepuklinie.
  15. Aby uniknąć zszywania narządów wewnętrznych, podczas zszywania płata do mięśnia brzucha należy podnieść mięsień kleszczami. Pozostaw skórę brzuszną odsłoniętą, aby naśladować efekt pełnego ubytku ściany brzucha.
  16. Przykryj ranę na skórze jodowaną gazą i sterylnym bandażem, aby zapobiec zanieczyszczeniu odsłoniętego obszaru.
  17. Zszyj skórę nogi za pomocą jedwabnych szwów 4-0.
  18. Uważnie obserwować mysz aż do wyzdrowienia ze znieczulenia, a następnie codziennie, aż do odzyskania płatka. Podskórnie wstrzykiwać buprenorfinę (końcowe stężenie 0,05-0,1 mg/kg) dwa razy dziennie przez 2-3 dni.
  19. UWAGA: Używaj soli fizjologicznej na dowolnym etapie, aby uniknąć odwodnienia odsłoniętej tkanki.

5. Ultradźwiękowe oznaczanie perfuzji naczyniowej przeszczepu

UWAGA: Przed przeniesieniem, perfuzja naczyniowa przeszczepu jest mierzona po jednym i dwóch tygodniach od implantacji, za pomocą ultrasonografii.

  1. Znieczulij mysz za pomocą 2% izofluranu.
  2. Umieść mysz na ruchomym stoliku podgrzanym do 38 °C, aby zapewnić normalną temperaturę ciała, a następnie zabezpiecz mysz za pomocą samoprzylepnego bandaża.
  3. Znajdź tętnicę udową i naczynia żylne z nieliniowym przetwornikiem ustawionym w trybie B.
  4. Zbadaj drożność naczyń udowych przeszczepu za pomocą przetwornika ustawionego na tryb kolorowego Dopplera.
  5. Niecelowany środek kontrastowy należy przygotować zgodnie z zaleceniami producenta.
  6. Podłączyć cewnik do żyły ogonowej (12 cm rurka z igłą 27 G) do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej solą fizjologiczną. Zamocuj strzykawkę obok myszy na etapie ogrzewania (aby uniknąć przesuwania się strzykawki).
  7. Podłącz cewnik do żyły ogonowej myszy i zabezpiecz igłę.
  8. Wstrzyknąć trochę soli fizjologicznej, aby upewnić się, że zastrzyki są wykonywane do żyły, a także aby napełnić rurkę solą fizjologiczną (aby uniknąć pęcherzyków powietrza).
  9. Napełnić strzykawkę o pojemności 1 ml 70 μl środka kontrastowego i zastąpić strzykawkę z solą fizjologiczną strzykawką ze środkiem kontrastowym.
  10. Ustaw ultradźwięki, aby zobrazować wstrzyknięcie środka kontrastowego. We właściwościach trybu nieliniowego ustaw liczbę ramek na 1,500, a impuls zakłócający na 30% ramek.
    UWAGA: Po impulsie rozrywającym mikropęcherzyki ponownie napełniają naczynia w tempie, które zależy od natężenia przepływu mikropęcherzyków w naczyniach włosowatych i jest niezależne od szybkości wstrzykiwania mikropęcherzyków. Liczbę ramek można zmieniać w zależności od czasu napełniania 19,20.
  11. Powoli wstrzyknąć środek kontrastowy do żyły ogonowej.
  12. Rejestruj obrazy w trybie kontrastu nieliniowego systemu ultrasonograficznego o wysokiej rozdzielczości.
  13. Przeanalizuj wyniki za pomocą oprogramowania, jak opisano wcześniej 19,20.
    1. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) na obrazie uzyskanym bezpośrednio po impulsie zakłócającym w trybie kontrastu. Zwrot z inwestycji powinien określać tylko obszar wypełniony środkiem kontrastowym.
    2. Obliczyć wzmocnienie piku (PE), które jest stosunkiem średniej intensywności sygnału nieliniowego po wstrzyknięciu mikropęcherzyków do czasu po impulsie rozrywającym i jest miarą objętości perfuzji.
    3. Obliczyć natężenie przepływu, które określa się od czasu (T), który upływa do sygnału szczytowego (P).

6. Określenie stopnia unaczynienia przeszczepu

UWAGA: Stopień unaczynienia przeszczepu tkankowego określa się jeden lub dwa tygodnie po implantacji.

  1. Za pomocą strzykawki insulinowej znieczulić mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy: ksylazyny (35 μl/20 g).
  2. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć dożylnie 200 μl dekstranu sprzężonego z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC-Dextran, MW = 500 000) do żyły ogonowej.
  3. Dziesięć sekund po zakończeniu wstrzyknięcia należy poddać mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.
  4. Otwórz nogę myszy i odsłoń przeszczep.
  5. Przemyć obszar przeszczepu solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i nałożyć 10% neutralną buforowaną formalinę.
  6. Zobrazuj przeszczep w nodze myszy za pomocą mikroskopu konfokalnego.
  7. Ilościowe określenie funkcjonalnej gęstości naczyń (FVD).
    1. Wyizolować kanał zielony (wzbudzenie = 488 nm) konfokalnych obrazów mikroskopowych.
    2. Przepuść wynikowe obrazy przez filtr górnoprzepustowy, aby uwydatnić struktury o wysokim kontraście.
    3. Użyj filtra usuwającego plamy, aby usunąć szumy, które mogły zostać wzmocnione przez filtr górnoprzepustowy.
    4. Ustaw wartość progu na obrazie wynikowym; wartość progowa jest dostosowywana tak, aby cechy i struktury na oryginalnym obrazie były widoczne na obrazie binarnym.
    5. Zastosuj próg rozmiaru, tak aby w obrazie binarnym pozostały tylko grupy połączonych pikseli większe niż zdefiniowany próg rozmiaru.
    6. Nakreśl szkielet naczyń w przeszczepie, korzystając z algorytmu Zhang-Suena 21.
    7. Oblicz FVD, sumując długości linii środkowej każdego naczynia i dzieląc wynik przez obszar ROI.

7. Barwienie immunohistologiczne i histologiczne przeszczepu

  1. Barwienie immunohistologiczne
    1. Po obrazowaniu konfokalnym pobierz przeszczep za pomocą małych nożyczek i kleszczy. Wypreparuj naczynia przedsionkowo-komorowe na dwóch końcach przeszczepu i odzyskaj przeszczep.
    2. Utrwal przeszczepy w 10% neutralnej buforowanej formalinie na 30 min - 2 godziny.
    3. Umieść przeszczepy w kasetach histologicznych i przechowuj w 70% etanolu do momentu zatopienia się parafiny.
    4. Zanurzyć w parafinie przy użyciu standardowego protokołu utrwalania i zatapiania 22 i pokroić tkanki zatopione w parafinie na plastry o wielkości 5 μm za pomocą mikrotomu. Pokrój całą tkankę prostopadle do naczyń przedsionkowo-komorowych.
    5. Odparafinować skrawki zatopione w parafinie przez dwukrotne zanurzenie w 100% ksylenie na 10 minut każda.
    6. Ułóż szkiełka w plastikowym słoiku Coplin o pojemności 250 ml.
    7. Nawadniaj przez seryjne zanurzenia w malejących stężeniach etanolu (100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 50%, 30% i wodzie podwójnie destylowanej (DDW)) przez 3 minuty każde.
    8. Przygotować roztwór do demaskowania antygenu, rozcieńczając 2,35 ml roztworu do demaskowania antygenu z 250 ml DDW. Podgrzewać roztwór demaskujący antygen przez 2 minuty w kuchence mikrofalowej nastawionej na 95 °C.
    9. Włóż szkiełka do wstępnie podgrzanego roztworu demaskującego antygen i ponownie podgrzewaj przez 3 minuty w kuchence mikrofalowej nastawionej na 95 °C. Schłodzić szkiełka do 50 °C.
    10. Podgrzewaj ponownie przez 2 minuty, a następnie ostudź do RT.
    11. Inkubować szkiełka w 3,3% roztworze H2O2w metanolu przez 10 minut, w temperaturze pokojowej w celu wygaszenia aktywności endogennej peroksydazy, a następnie dwukrotnie przepłukać w PBS.
    12. Przygotuj komorę inkubacyjną: umieść mokre arkusze chłonne w pudełku histologicznym i wysusz szkiełka za pomocą delikatnych wycieraczek roboczych.
    13. Zakreślić obszar plastra na szkiełku za pomocą hydrofobowego pisaka i inkubować przez 30 minut w temperaturze suchej masy, z około 50 μl roztworu blokującego surowicę kozią (2%, przygotowanego w PBS) na plasterek.
    14. Rozcieńczyć królicze przeciwciało anty-CD31 w stosunku 1:50 w roztworze blokującym, nałożyć około 50 μl przeciwciała na plaster i inkubować O/N w temperaturze 4 °C. Przepłukać 3 razy PBS po 5 minut każdy.
    15. Rozcieńczyć biotynylowane kozie przeciwciało drugorzędowe przeciwko królikowi w stosunku 1:400 w PBS, umieścić na szkiełkach około 50 μl przeciwciała na plaster i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    16. Spłucz 3 razy PBS po 5 minut.
    17. Rozcieńczyć peroksydazę streptawidyny w stosunku 1:400 w PBS, nałożyć około 50 μl na plaster i inkubować ze szkiełkami przez 30 minut, w temperaturze pokojowej. Spłukać 3 razy PBS po 5 minut.
    18. Nałożyć około 50 μl substratu aminoetylokarbazolu (AEC) na plaster, zgodnie z instrukcjami producenta. Zanurz szkiełka w DDW, aby zatrzymać reakcję.
    19. Zabarwić jądra na niebiesko, zanurzając skrawki w około 50 μl roztworu hematoksyliny Mayera na 2 minuty. Delikatnie spłukać w wodzie, a następnie przykryć skrawki medium montażowym.
    20. Określ ilościowo barwienie CD31-dodatnie przy użyciu podejścia podwójnie ślepej próby. Barwienie CD31 wygląda jak brązowa plama. Wybierz 4-5 różnych pól w polu widzenia o powiększeniu 40x pod mikroskopem dwuokularowym. Policz liczbę lumenów CD31-dodatnich.
      1. Oblicz średnią liczbę lumenów CD31-dodatnich na rusztowanie, dzieląc całkowitą liczbę zliczonych lumenów przez liczbę pól i pole (zgodnie z danymi lornetkowymi).
        UWAGA: Objętość nałożonego odczynnika musi być wystarczająca, aby pokryć cały zarysowany plasterek.
  2. Barwienie histologiczne
    1. Utrwal przeszczepy w 10% neutralnej buforowanej formalinie.
    2. Osadzaj przeszczepy w parafinie przy użyciu standardowych procedur utrwalania i zatapiania.
    3. Usunąć parafinę z odcinków zatopionych w parafinie, zanurzając dwukrotnie w 100% ksylenie na 10 minut.
    4. Szybkie pranie dwa razy w celu nawodnienia w 100% izopropanolu.
    5. Szybkie pranie dwa razy 95% etanolu.
    6. Umyj trzy razy w wodzie z kranu.
    7. Zanurz w Hematoxylin na 10 min.
    8. Umyj trzy razy w wodzie z kranu.
    9. Immere w Eosin przez 2 min.
    10. Szybkie pranie dwukrotnie odwadniało w 95% etanolu.
    11. Szybkie pranie 100% izopropanol dwukrotnie.
    12. Szybkie pranie 100% ksylenu dwukrotnie.
    13. Przykryć klejem DPX ze szkłem nakrywkowym o grubości 1,5 mm.
    14. Obraz za pomocą mikroskopu w powiększeniu 40X.

8. Ocena właściwości mechanicznych

  1. Odzyskaj przeszczep za pomocą małych nożyczek i kleszczy.
  2. Przepłucz przeszczep w PBS.
  3. Zmierz szerokość i grubość przeszczepu i oblicz pole przekroju poprzecznego jako szerokość pomnożoną przez grubość.
  4. Użyj przyrządu testowego, aby wygenerować krzywą naprężenie-odkształcenie uwodnionych przeszczepów.
    1. Zamontuj przeszczep między uchwytami rozciągającymi systemu i zmierz ostateczną długość między dwoma uchwytami (tj. długość początkową).
    2. Zastosuj prędkość odkształcania 0,01 mm/s, aż do uszkodzenia.
    3. Zapisz wytworzoną siłę i przemieszczenie za pomocą protokołu producenta.
    4. Wygeneruj krzywą naprężenie-odkształcenie w Matlabie.
      1. Oblicz odkształcenie według przemieszczenia podzielonego przez długość początkową. Naprężenie oblicza się jako zmierzoną siłę podzieloną przez pole przekroju poprzecznego.
      2. Sztywność należy określić jako nachylenie obszaru liniowego na krzywej naprężenie-odkształcenie, a maksymalny punkt krzywej to ostateczna wytrzymałość na rozciąganie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Unaczynienie i perfuzja przeszczepu in vivo

Przeszczepy zostały wszczepione na tydzień lub dwa przed ich przeniesieniem jako płaty osiowe. Po jednym i dwóch tygodniach od implantacji dokładna obserwacja obszaru przeszczepu ujawniła żywotne i unaczynione przeszczepy tkankowe. Przeszczepy te okazały się być wysoce unaczynione, co stwierdzono na podstawie dodatniego barwienia immunologicznego CD31 (Figura 1A) i wysoce perfundowane, o czym świadczy wstrzyknięcie żyły ogon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Postępy w inżynierii tkankowej spotkały się z rosnącym zapotrzebowaniem na tkanki zastępcze do rekonstrukcji różnych typów tkanek. Różnorodność syntetycznych materiałów 1,17,18 i biologicznych 14-16 , a także metody wytwarzania zostały ocenione pod kątem ich zdolności do sprostania tym wymaganiom. Jednak pomimo postępu w opiece klinicznej i inżynierii tkankowej, odtworzenie pełnogrubych ubytków powłok brzusznych pozostaje wyzwaniem. Tkanka odpowiednia do rekonstrukcji takich masywnych ubytków musi b...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez 281501 grantowy Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych FP7, ENGVASC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
małe cienkie proste nożyczkiFine Science Tools (FST)14090-09
nożyczki sprężynoweFine Science Tools (FST)15003-08
kleszcze proste z cienką końcówkąFine Science Tools (FST)11251-20
kleszczyki ząbkowane Fine Science Tools (FST)11050-10
uchwyt na igłęFine Science Tools (FST)12500-12
Kauteryzator do małych naczyń Fine Science Tools (FST)18000-00
DuratearsAlcon5686
SedaxylanEuravetDJ03
Clorketam 1000Vetoquinol4A0726B
BuprenorfinavetmarketB15100
4-0 nici jedwabneSzwy Assut647
6-0 nici polipropylenoweNici Assut9351F
8-0 Nici jedwabneNici Assut684568
Strzykawka insulinowa (igła 6 mm)BD324911
System ultrasonograficzny o wysokiej rozdzielczości Vevo 2100VisualSonics inc.
Przetwornik nieliniowy MS250firmy VisualSonics inc.
Mikromarker niecelowany środek kontrastowyVisualSonics inc.VS-11694
cewnik do żył ogonowychVisualSonics inc.VS-11912
Oprogramowanie Vevo 2100VisualSonics inc.
dekstran sprzężony z izotiocyjanianem fluoresceinySigmaFD500S
MatlabMathworks, MA, USA
KimwipesKimtech34120
roztwór demaskujący antygenLaboratoria wektoroweH-3300
Abcam ab28364
biotynylowane kozie przeciwciało anty-królicze (wtórne)Laboratoria wektoroweBA-1000
peroksydaza streptawidynyJackson 016-030-084
Mayera do roztworu hamatoksyliny MayeraSigma-AldrichMHS-16
Technologie życia, Invitrogen 00-2007
VectamountVector laboratoriesH-5501
Przeciwciało anty-CD31 Zestaw substratów aminoetylokarbazolu (AEC)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Engelsman, A. F., van der Mei, H. C., Ploeg, R. J., Busscher, H. J. The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction. Biomaterials. 28 (14), 2314-2327 (2007).
  2. De Coppi, P., et al. Myoblast-acellular skeletal muscle matrix constructs guarantee a long-term repair of experimental full-thickness abdominal wall defects. Tissue Eng. 12 (7), 1929-1936 (2006).
  3. Shi, C., et al. Regeneration of full-thickness abdominal wall defects in rats using collagen scaffolds loaded with collagen-binding basic fibroblast growth factor. Biomaterials. 32 (3), 753-759 (2011).
  4. Yezhelyev, M. V., Deigni, O., Losken, A. Management of full-thickness abdominal wall defects following tumor resection. Ann Plast Surg. 69 (2), 186-191 (2012).
  5. Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J Thorac Cardiovasc Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
  6. Macchiarini, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9665), 2023-2030 (2008).
  7. Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
  8. Nishida, K., et al. Corneal reconstruction with tissue-engineered cell sheets composed of autologous oral mucosal epithelium. N Engl J Med. 351 (12), 1187-1196 (2004).
  9. Petite, H., et al. Tissue-engineered bone regeneration. Nat Biotechnol. 18 (9), 959-963 (2000).
  10. Banta, M. N., Kirsner, R. S. Modulating diseased skin with tissue engineering: actinic purpura treated with Apligraf. Dermatol Surg. 28 (12), 1103-1106 (2002).
  11. Vunjak-Novakovic, G., et al. Challenges in cardiac tissue engineering. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (2), 169-187 (2010).
  12. Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
  13. Lesman, A., Gepstein, L., Levenberg, S. Vascularization shaping the heart. Ann N Y Acad Sci. 1188, 46-51 (2010).
  14. Patton Jr, H., Berry, S., Kralovich, K. A. Use of human acellular dermal matrix in complex and contaminated abdominal wall reconstructions. The Am J of Surg. 193 (3), 360-363 (2007).
  15. Menon, N. G., et al. Revascularization of human acellular dermis in full-thickness abdominal wall reconstruction in the rabbit model. Ann Plast Surg. 50 (5), 523-527 (2003).
  16. Buinewicz, B., Rosen, B. Acellular cadaveric dermis (AlloDerm): a new alternative for abdominal hernia repair. Ann Plast Surg. 52 (2), 188-194 (2004).
  17. Bringman, S., et al. Hernia repair: the search for ideal meshes. Hernia. 14 (1), 81-87 (2010).
  18. Meintjes, J., Yan, S., Zhou, L., Zheng, S., Zheng, M. Synthetic biological and composite scaffolds for abdominal wall reconstruction. Exp rev of med dev. 8 (2), 275-288 (2011).
  19. Cheng, G., et al. Engineered blood vessel networks connect to host vasculature via wrapping-and-tapping anastomosis. Blood. 118 (17), 4740-4749 (2011).
  20. Shandalov, Y., et al. An engineered muscle flap for reconstruction of large soft tissue defects. PNAS of the USA. 111 (16), 6010-6015 (2014).
  21. Zhang, T. Y., Suen, C. Y. A fast parallel algorithm for thinning digital patterns. Commun. ACM. 27 (3), 236-239 (1984).
  22. Luna, L. G. AFIo Pathology. Manual of Histo Stain Meth ; of the Arm Forcs Inst of Path. Luna, L. G. , Blakiston Division, McGraw-Hill. (1968).
  23. Choi, J. H., et al. Adipose tissue engineering for soft tissue regeneration. Tissue engineering. Part B, Reviews. 16 (4), 413-426 (2010).
  24. Bellows, C. F., Alder, A., Helton, W. S. Abdominal wall reconstruction using biological tissue grafts: present status and future opportunities. Exp rev of med dev. 3 (5), 657-675 (2006).
  25. Caspi, O., et al. Tissue engineering of vascularized cardiac muscle from human embryonic stem cells. Circ Res. 100 (2), 263-272 (2007).
  26. Kaufman-Francis, K., Koffler, J., Weinberg, N., Dor, Y., Levenberg, S. Engineered vascular beds provide key signals to pancreatic hormone-producing cells. PloS one. 7 (7), e40741(2012).
  27. Kaully, T., Kaufman-Francis, K., Lesman, A., Levenberg, S. Vascularization--the conduit to viable engineered tissues. Tiss eng. Part B, Reviews. 15 (2), 159-169 (2009).
  28. Koffler, J., et al. Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts. PNAS of the USA. 108 (36), 14789-14794 (2011).
  29. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tisseng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  30. Levenberg, S., et al. Engineering vascularized skeletal muscle tissue. Nat Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).
  31. Bearzi, C., et al. PlGF-MMP9-engineered iPS cells supported on a PEG-fibrinogen hydrogel scaffold possess an enhanced capacity to repair damaged myocardium. Cell death & disease. 5, e1053(2014).
  32. Zhang, M., et al. SDF-1 expression by mesenchymal stem cells results in trophic support of cardiac myocytes after myocardial infarction. FASEB J : official publication of the .Fed Am Soc Exp Biol. 21 (12), 3197-3207 (2007).
  33. Dvir, T., et al. Prevascularization of cardiac patch on the omentum improves its therapeutic outcome. PNAS. 106 (35), 14990-14995 (2009).
  34. Marsano, A., et al. The effect of controlled expression of VEGF by transduced myoblasts in a cardiac patch on vascularization in a mouse model of myocardial infarction. Biomaterials. 34 (2), 393-401 (2013).
  35. Rufaihah, A. J., et al. Enhanced infarct stabilization and neovascularization mediated by VEGF-loaded PEGylated fibrinogen hydrogel in a rodent myocardial infarction model. Biomaterials. 34 (33), 8195-8202 (2013).
  36. Nillesen, S. T. M., et al. Increased angiogenesis in acellular scaffolds by combined release of FGF2 and VEGF. J of Contr Release. 116 (2), e88-e90 (2006).
  37. Sekine, H., et al. In vitro fabrication of functional three-dimensional tissues with perfusable blood vessels. Nat Commun. 4, 1399(2013).
  38. Tee, R., et al. Transplantation of engineered cardiac muscle flaps in syngeneic rats. Tiss eng. Part A. (19-20), 1992-1999 (2012).
  39. Morritt, A. N., et al. Cardiac tissue engineering in an in vivo vascularized chamber. Circulation. 115 (3), 353-360 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Vascularized Muscle FlapTissue EngineeringBiodegradable ScaffoldCell SeedingIn Vitro CultureFemoral Artery ImplantationAnastomosis With Host VesselsPedicled Flap TransferAbdominal Wall ReconstructionUltrasound Imaging

Related Articles