Izolacja komórek Kupffera do badania toksyczności nanocząstek

Summary

Makrofagi wątrobowe, zwane komórkami Kupffera, są odpowiedzialne za wychwytywanie krążących nanocząstek. Opisujemy tutaj metodę izolacji komórek Kupffera o wysokiej czystości i wydajności. Zmodyfikowany test LDH jest tutaj stosowany do pomiaru toksyczności indukowanej przez nanorurki węglowe w komórkach Kupffera.

Abstract

Zdecydowana większość badań nanotoksykologicznych in vitro wykorzystuje unieśmiertelnione linie komórkowe ze względu na ich praktyczność. Jednak wyniki badań toksyczności nanocząstek w unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych wykazały rozbieżności, podkreślając potrzebę rozszerzenia zastosowania komórek pierwotnych do testów in vitro. Protokół ten opisuje izolację makrofagów wątroby myszy, zwanych komórkami Kupffera, i ich zastosowanie do badania toksyczności nanocząstek. Komórki Kupffera są najliczniejszą populacją makrofagów w organizmie i stanowią część układu siateczkowo-śródbłonkowego (RES), odpowiedzialnego za wychwytywanie krążących nanocząstek. Opisana tutaj metoda izolacji komórek Kupffera opiera się na 2-etapowej metodzie perfuzji, po której następuje oczyszczanie na podstawie gradientu gęstości. Metoda, oparta na trawieniu kolagenazy i wirowaniu gęstości, została zaadaptowana z oryginalnego protokołu opracowanego przez Smedsrøda i wsp. przeznaczony do izolacji komórek wątroby szczura i zapewnia wysoką wydajność (do 14 x 10⁶ komórek na mysz) i wysoką czystość (>95%) komórek Kupffera. Ta metoda izolacji nie wymaga wyrafinowanego ani drogiego sprzętu i dlatego stanowi idealny kompromis między złożonością a wydajnością komórek. Zastosowanie cięższych myszy (35-45 g) poprawia wydajność metody izolacji, ale także znacznie ułatwia procedurę kaniulacji żyły wrotnej. Toksyczność funkcjonalizowanych nanorurek węglowych f-CNT mierzono w tym modelu za pomocą zmodyfikowanego testu LDH. Metoda ta ocenia żywotność komórek poprzez pomiar braku integralności strukturalnej błony komórkowej Kupffera po inkubacji z f-CNT. Toksyczność indukowaną przez f-CNT można mierzyć konsekwentnie za pomocą tego testu, podkreślając, że izolowane komórki Kupffera są przydatne do badania toksyczności nanocząstek. Takie modele mogą przynieść korzyści dzięki ogólnemu zrozumieniu nanotoksykologii, dzięki czemu selekcja nanocząstek do translacji klinicznej będzie bardziej efektywna.

Introduction

Dziedzina badań nad nanotoksykologią ma na celu scharakteryzowanie biologicznego efektu nanocząstek. Badania toksykologiczne oparte na badaniach in vivo pozostają najdokładniejszymi metodami. Jednak ich zastosowanie jest ograniczone przez ich koszty, nakłady pracy i czas¹. Jako alternatywę zastosowano testy in vitro ze względu na ich prostotę i możliwość opracowania wysokowydajnych platform do badań in vitro ² - rozszerzając w ten sposób liczbę badanych warunków. Większość badań nanatoksykologicznych przeprowadza się przy użyciu testów in vitro z unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi. Istnieją jednak obawy co do ekstrapolacji wyników tych badań eksperymentalnych na skutki toksykologiczne in vivo ³. Rzeczywiście, właściwości unieśmiertelnionych linii komórkowych mogą znacząco różnić się od tkanek, z których pochodzą, np. transformacja genetyczna⁴, pogorszenie kluczowych cech morfologicznych⁵, utrata polaryzacji komórkowej⁶ i zmiany funkcjonalne, takie jak regulacja mediatorów stanu zapalnego⁷.

Komórki Kupffera są najliczniejszą populacją makrofagów w organizmie i mają bezpośredni kontakt z krwią, wyściełając ścianę sinusoid wątroby. Jako część układu siateczkowo-śródbłonkowego (RES), makrofagi te są odpowiedzialne za wychwytywanie krążących nanocząstek i dlatego stanowią bardzo odpowiedni model do badania toksyczności nanocząstek. Badania in vivo⁸ i in vitro⁹ dotyczące reakcji zapalnych związanych z komórkami Kupffera wystawionymi na działanie nanocząstek zostały opublikowane w innych miejscach. Komórki Kupffera są również zaangażowane w patogenezę chorób wątroby, takich jak alkoholowa choroba wątroby¹⁰, zwłóknienie wątroby¹¹ lub wirusowe zapalenie wątroby¹². Doniesiono, że izolowane komórki Kupffera dostarczają użytecznych informacji do opisania mechanizmów komórkowych zaangażowanych w zaburzenia pracy wątroby^13,14.

Opisano kilka metod izolowania i oczyszczania komórek Kupffera. Izolacja komórek może wynikać z dysocjacji mechanicznej lub enzymatycznej¹⁵. Trawienie kolagenazy wykazuje zaletę zachowania integralności funkcjonalnej komórek Kupffera, prowadząc jednocześnie do wysokiej wydajności komórek Kupffera¹⁶. Do oddzielenia komórek Kupffera od innych populacji komórek wątroby zastosowano wiele podejść eksperymentalnych, różniących się złożonością i kosztami. Na przykład czystość komórek Kupffera można osiągnąć poprzez powinowactwo immunologiczne¹⁷, elektroforezę przepływową¹⁸, selektywną adhezję¹⁶ lub techniki odśrodkowe¹⁶, które selekcjonują komórki w zależności od ich wielkości i gęstości. Kombinacja tych metod może być wybrana w celu zwiększenia czystości populacji¹⁶. Nie ma zgody co do idealnej metody izolacji komórek Kupffera, ponieważ zależy to głównie od zastosowania i dostępnego sprzętu. Jednak w przypadku badania toksyczności nanocząstek prostota i wysoka wydajność techniki związanej z funkcjonalnym zachowaniem komórek Kupffera okazały się najbardziej odpowiednie dla tego zastosowania.

Opisana tutaj metoda izolacji komórek Kupffera opiera się na 2-etapowej metodzie perfuzji, po której następuje oczyszczanie na gradiacji gęstości. Metoda została zmodyfikowana w stosunku do oryginalnego protokołu opracowanego przez Smedsrød i wsp. ¹⁶ Przeznaczony do izolacji komórek wątroby szczura. Większość badań opisywała i opisywała izolację komórek Kupffera z wątroby szczurów. W tym artykule opisujemy metodę izolowania komórek Kupffera z wątroby myszy z wysoką wydajnością i czystością. Wykorzystanie myszy zmniejsza koszty eksperymentu i pozwala na przetwarzanie kilku wątrób w celu uzyskania dużych ilości komórek Kupffera do badania toksyczności nanocząstek.

W poniższym protokole, komórki Kupffera były inkubowane z funkcjonalizowanymi nanorurkami węglowymi (f-CNT). Unikalne właściwości fizykochemiczne CNT, tj. wysoki stosunek długości do średnicy i duża powierzchnia, sprawiły, że CNT są interesującymi kandydatami jako wektory do celów terapeutycznych i diagnostycznych. Wyrażono jednak obawy dotyczące toksyczności CNT¹⁹, a opracowanie nowych testów in vitro ma na celu pogłębienie wiedzy na temat skutków biologicznych CNT. Toksyczność w komórce Kupffera jest związana z brakiem integralności strukturalnej błony komórkowej. Mierzy się to poprzez utratę enzymu cytoplazmatycznego LDH z komórki do supernatantu. Zasada tej metody polega zatem na usunięciu uwolnionego LDH i zmierzeniu tego, co pozostało w komórkach²⁰. Odbywa się to zamiast pomiaru uwolnionego LDH w supernatancie, ponieważ obecność CNT w supernatancie zakłóca test²¹.

Proponujemy użycie tej prostej i efektywnej metody izolacji komórek Kupffera do izolowania dużej liczby funkcjonalnych komórek Kupffera. Pozwala to na badanie przesiewowe toksyczności szeregu nanocząstek w odpowiednim pierwotnym modelu makrofagów.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Demonstrowany protokół został przeprowadzony zgodnie z wytycznymi i zatwierdzeniem brytyjskiego rozporządzenia w sprawie Ministerstwa Spraw Wewnętrznych

1. Perfuzja i zbieranie komórek (Rysunek 1)

Rycina 1: Perfuzja wątroby. Po znieczuleniu myszy przewód pokarmowy jest przesuwany bocznie na lewo od brzucha w celu udostępnienia żyły wrotnej (PV). PV jest kaniulowany przy użyciu roztworu EGTA/HBSS o powolnym natężeniu przepływu (1-3 ml/min), a żyła główna dolna (IVC) jest natychmiast pękana, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia w wątrobie. W ciągu pierwszej minuty perfuzji szybkość przepływu jest stopniowo zwiększana do 7 ml/min. Roztwór kolagenazy jest następnie perfuzjowany z prędkością 10 ml/min, aż do osiągnięcia pełnego trawienia.

1. Przygotować na świeżo wszystkie odczynniki opisane w tabeli materiałów.
2. Podgrzewać roztwór EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego)/HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanka) (50 ml na mysz) i roztwór kolagenazy (100 ml na mysz) przez 30 minut w temperaturze 40 °C.
3. Najpierw przepłucz elastyczny przewód pompy 70% etanolem. Wlać 40 ml roztworu EGTA/HBSS do probówki wirówkowej zanurzonej w łaźni wodnej i przepłukać elastyczny przewód pompy wstępnie podgrzanym roztworem EGTA/HBSS.
4. Wykonaj znieczulenie końcowe za pomocą barbituranu, aby niezawodnie spowodować utratę przytomności przed depresją oddechową i śmiercią. Wstrzyknąć fenobarbiton w dawce 1 mg/kg, i.p. samicy lub samca myszy CD1 (35-45 g). Potwierdź znieczulenie, szczypiąc palec u nogi.
5. Ogolić włosy na brzuchu i wysterylizować powierzchnię brzucha za pomocą 70% roztworu etanolu.
6. Przeciąć jamę brzuszną i odsłonić żyłę wrotną i żyłę główną dolną, przesuwając jelito na boki po lewej stronie brzucha.
7. Uruchomić pompę z prędkością 1-3 ml/min z roztworem EGTA/HBSS i kaniulować żyłę wrotną za pomocą igły motylkowej o wadze 23 g (nacięcie skrzydeł). Zacisnąć odcinek żyły wzbiorczej kaniulowany igłą 23 G, a następnie odwrócić ząbkowane kleszcze na powierzchni otwartego brzucha myszy. Wątroba powinna szybko zblednąć w ciągu pierwszych 30 sekund od perfuzji roztworu EGTA/HBSS.
8. Szybko naciąć dolną część żyły głównej dolnej, aby uniknąć nadmiernego wzrostu ciśnienia w wątrobie, a następnie stopniowo zwiększać szybkość przepływu do 7 ml/min w ciągu pierwszej minuty perfuzji. Zwierzę umiera z powodu krwawienia wtórnego do nakłucia żyły głównej.
9. Gdy w probówce wirówkowej pozostało mniej niż 5 ml roztworu EGTA/HBSS, napełnij ją roztworem kolagenazy (40-50 ml). Stopniowo zwiększaj natężenie przepływu do 10 ml/min, przez 30 sekund.
10. Spraw, aby wątroba puchła, wywierając nacisk na żyłę główną dolną za pomocą pęsety w odstępach 5-10 sekund. Można to robić okresowo (5-10 razy podczas trawienia). Ten krok poprawi dysocjację komórek wątroby i skróci czas perfuzji z kolagenazą.
11. Gdy w probówce wirówkowej pozostanie mniej niż 10 ml roztworu kolagenazy, wlej 40-50 ml wstępnie podgrzanego roztworu kolagenazy do probówki wirówkowej.
12. Po 10-15 minutach perfuzji i około 70-80 ml perfuzji roztworu kolagenazy należy lekko uciskać powierzchnię wątroby kleszczami. Odcisk ciśnienia wskazuje, że komórki wątroby są zdysocjowane.
13. Wyjmij wątrobę z jamy brzusznej jako jeden kawałek i umieść ją w probówce wirówkowej zawierającej 20-30 ml pożywki do izolacji komórek Kupffera. Komórki wątroby należy przechowywać na lodzie lub w temperaturze 4 °C przez okres maksymalnie 3 godzin, aby uniknąć wpływu na żywotność komórek wątroby.
14. W razie potrzeby powtórzyć procedurę perfuzji na kilku zwierzętach, utrzymując perfundowaną wątrobę na lodzie. Zbierz od jednej do trzech wątrób w celu oczyszczenia i przejdź do etapu 3.

2. Przygotowanie gradientu gęstości do wirowania (Rysunek 2)

Rysunek 2: Przygotowanie gradientu gęstości. Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w sterylnych warunkach. SIP przygotowuje się przez zmieszanie 15,3 ml powlekanego roztworu cząstek krzemionki z 1,7 ml 10 x PBS. 5 ml SIP miesza się z 15 ml PBS, aby uzyskać 20 ml 25% roztworu SIP. 10 ml SIP miesza się z 10 ml PBS, aby uzyskać 20 ml 50% roztworu SIP. Probówkę wirówkową zawierającą 50% roztwór SIP (20 ml) przechyla się, a 25% roztwór SIP (20 ml) powoli dodaje się za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml.

1. Postępować zgodnie z poniższymi krokami (sekcja 2., 3 i 5.) w sterylnych warunkach i utrzymywać komórki na lodzie lub w temperaturze 4 °C. Przygotować SIP (roztwór cząstek krzemionki pokrytych izotonicznie) mieszając 15,3 ml powlekanego roztworu cząstek krzemionki z 1,7 ml 10 x PBS.
2. Aby przygotować 20 ml 25% roztworu SIP, zmieszaj 5 ml SIP z 15 ml PBS. Aby przygotować 20 ml 50% roztworu SIP, zmieszaj 10 ml SIP z 10 ml PBS.
3. Napełnić jedną probówkę wirówkową 20 ml 50% roztworu SIP. Przechylić probówkę wirówkową pod kątem zbliżonym do 90° i powoli dodawać 25% roztwór SIP (20 ml) na boczną ściankę probówki za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml, nie dotykając powierzchni warstwy 50% SIP. Dodając 25% roztwór SIP, stopniowo zmniejszaj kąt rurki. Utrzymuj gradient gęstości na lodzie do czasu użycia.

3. Oczyszczanie komórek Kupffera (Rysunek 3)

Rysunek 3: Oczyszczanie komórek Kupffera przez wirowanie w gradiacji gradientu gęstości i adhezję komórek. Wszystkie zabiegi przeprowadzane są w sterylnych warunkach. (A) Po pęknięciu kapsułki Glissona, komórki wątroby są filtrowane przez sitko o średnicy 100 μm. Zawiesinę odwirowuje się w dawce x 50 g w celu odrzucenia hepatocytów (osadów) i zebrania frakcji komórek niemiąższowych (supernatantu). Ten krok powtarza się 3 razy. Komórki niemiąższowe dodaje się do nieciągłego gradientu izotonicznego i odwirowuje przy 800 x g przez 15 minut. Komórki Kupffera zebrane z 25% poduszki SIP są dalej oczyszczane przez selekcję adhezji komórek. (B) Komórki umieszcza się na płytce 24-dołkowej i inkubuje w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 30 minut. Nieprzylegające komórki przemywa się jednorazowo 500 μl HBSS. Komórki Kupffera wykazują swoją przylegającą morfologię 4 godziny po posiewie, kiedy do komórek można dodać f-CNT. Podziałka reprezentuje 25 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Umieścić jedną perfundowaną wątrobę na szalce Petriego z 15 ml pożywki do izolacji komórek Kupffera. Rozerwij torebkę Glissona (błonę wątroby) za pomocą nożyczek i uwolnij wszystkie komórki wątroby do pożywki do izolacji komórek Kupffera. Przefiltrować roztwór przez sitko o wielkości 100 μm, które ma być zebrane w probówce wirówkowej. Powtórzyć procedurę perfuzji na dodatkowych perfundowanych wątrobach i zebrać komórki w tej samej probówce wirówkowej (15 ml od jednej myszy, do 45 ml od trzech myszy).
2. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 50 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C. Komórki miąższowe (hepatocyty) znajdują się w osadzie, a komórki niemiąższowe (w tym komórki Kupffera) znajdują się w supernatancie.
3. Zebrać supernatant do czystej probówki wirówkowej i wirować przy 50 x g przez 2 minuty każdy. Powtórz ten krok jeszcze trzy razy.
4. Wirować przy 1 350 g przez 15 minut w celu osadzenia komórek niemiąższowych. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml pożywki do izolacji komórek Kupffera.
5. Dodać niemiąższowy roztwór komórek o nieciągłym gradieniu izotonicznym 25/50%, jak opisano w ppkt 2.3. Wirować przy 850 x g przez 15 minut bez przyspieszania i hamowania.
6. Zlokalizuj wzbogaconą frakcję komórek Kupffera, która wydaje się mętna, w obrębie 25% frakcji SIP w pobliżu interfejsu 25/50% SIP (ryc. 3). Za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml odessać około 12 ml wzbogaconej frakcji komórek Kupffera. Przenieść komórki do probówki wirówkowej zawierającej 35-40 ml pożywki do izolacji komórek Kupffera. Delikatnie wymieszać i odwirować przy 1 350 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C do uzyskania komórek osadu.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5-10 ml wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych Kupffera. Policz komórki (hemocytometr) i zmierz żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
8. Umieść oczyszczone komórki niemiąższowe na 24-dołkowych płytkach o gęstości 5 x 10⁵ komórek/basenik. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ (rysunek 3). Po 30 minutach delikatnie usuń pożywkę, przemyj ją wstępnie podgrzanym roztworem soli Hanka (HBSS), a następnie zastąp ją 500 μl świeżej i wstępnie podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych Kupffer (na dołek).
9. Pozostawić komórki Kupffera na co najmniej 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przed poddaniem działaniu nanocząstek, aby umożliwić im uzyskanie przylegającej morfologii.

4. Charakterystyka

1. Czystość komórek Kupffera
   1. Przygotować świeży roztwór PBS/BSA stosowany w celu utrzymania żywotności komórek Kupffera. Przemyć komórki jednorazowo 500 μl roztworu PBS/BSA. Usunąć roztwór PBS/BSA i odłączyć komórki Kupffera w 500 μl świeżego roztworu PBS/BSA, delikatnie skrobając. Gdy komórki są platerowane na płytkach 24-dołkowych, skróć końce ostrzy skrobaka nożyczkami, aby ułatwić odłączanie. Przenieś komórki do probówek do cytometrii przepływowej.
   2. Policz komórki Kupffera za pomocą hemocytometru i odwiruj 1 x 10⁵ komórek przy 1,350 x g. Ponownie zawieś komórki Kupffera w 30 μl przeciwciała F4/80 (schludnie). Dobrze wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Niebarwione komórki (nie inkubowane z przeciwciałem) należy przechowywać na lodzie.
   3. Dodać 2 ml roztworu PBS/BSA do wybarwionych komórek, odwirować przy 1,350 g przez 5 minut i odrzucić otrzymany supernatant. Ponownie zawiesić wybarwione komórki w 200 μl PBS/BSA.
   4. Do analizy cytometrii przepływowej należy pobrać 10 000 niebarwionych komórek Kupffera zgodnie z ich rozmiarem (rozproszenie do przodu) i ziarnistością (rozproszenie boczne). Analiza fluorescencji bramkowanych komórek w kanale FL-1.
   5. Powtórzyć procedurę dla barwionych komórek Kupffera, zachowując te same ustawienia, które są używane do analizy cytometrii przepływowej niebarwionych komórek Kupffera. Wybierz i określ ilościowo fluorescencję barwionych komórek, aby ocenić czystość komórki Kupffera.
2. Aktywność fagocytarna komórek Kupffera
   1. Zastąp pożywkę kulkami fluorescencyjnymi 0,5% (v/v) w pożywce do hodowli komórkowych Kupffer i inkubuj przez 4 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .
   2. W celu usunięcia niezinternalizowanych kulek, odwirować komórki Kupffera przy 1 350 x g, wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 500 μl roztworu PBS/BSA. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy.
   3. Zeskrobać komórki Kupffera w 500 μl roztworu PBS/BSA i przenieść komórki do probówki do cytometrii przepływowej.
   4. Odwirować komórki Kupffera przy stężeniu 1 350 x g, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 200 μl roztworu PBS/BSA.
   5. Do analizy cytometrii przepływowej należy pobrać 10 000 niebarwionych komórek Kupffera zgodnie z ich rozmiarem (rozproszenie do przodu) i ziarnistością (rozproszenie boczne). Analiza fluorescencji bramkowanych komórek w kanale FL-2.

5. Inkubacja chemicznie funkcjonalizowanych nanorurek węglowych (f -CNT)

1. Przygotować dyspersję f-CNT (1 mg/ml) w wodzie metodą sonikacji przez 15 minut przed użyciem. Rurki węglowe f-CNT są przygotowywane we własnym zakresie²².
2. Przygotować 2x skoncentrowaną dyspersję f-CNT w pożywce do hodowli komórkowych Kupffera. Sonizować f-CNT rozproszone w pożywce przez 2 minuty przed przystąpieniem do kroku 5.3).
3. Dla każdej studzienki zastąp 250 μl starych pożywek 250 μl dyspersji 2x f-CNT. Studzienki niepoddane działaniu (250 μl kondycjonowanej pożywki + 250 μl świeżej pożywki do hodowli komórkowych Kupffera) oraz studzienki poddane działaniu 10% DMSO stosuje się odpowiednio jako kontrolę ujemną i dodatnią.
4. Inkubować komórki Kupffera w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 24 lub 72 godziny.

6. Ocena toksyczności f -CNT w komórkach Kupffera za pomocą testu zmodyfikowanej dehydrogenazy mleczanowej (LDH)

1. Odrzucić supernatant.
2. Dodać 200 μl (na dołek na płytkę 24-dołkową) buforu do lizy i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min-1 godz.
3. Po przeprowadzeniu intensywnego pipetowania zebrać zlizowane komórki Kupffera do probówek mikrowirówek i wirować przy 40 000 x g przez 10 minut, aby osadzać f-CNT, które zostały wchłonięte przez komórki i szczątki komórek.
4. Zebrać supernatanty (wolne od ƒ-CNT) do probówek do mikrowirówek i przechowywać w temperaturze -20 °C lub przejść do kroku 6.5).
5. Przenieść 50 μl do płytki 96-dołkowej i dodać równą objętość roztworu do mieszania substratów (zestaw LDH) do każdej studzienki. Przykryć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed dodaniem 50 μl roztworu zatrzymującego (zestaw LDH). Dodać trzy egzemplarze studzienek zerowych zawierających 50 μl buforu do lizy, 50 μl roztworu mieszaniny substratów i 50 μl roztworu zatrzymującego.
6. Odczytać absorbancję przy 490 nm w czytniku mikropłytek i użyć poniższego wzoru, aby obliczyć żywotność (%) komórek.

Results

Liczba nieoczyszczonych komórek miąższowych była stała i wahała się między 8 a 14 x 10⁶ komórek na mysz (przeprowadzono 17 izolacji). Każda izolacja myszy wystarczała do umieszczenia w niej od 16 do 28 dołków. Żywotność komórek przez barwienie błękitem trypanowym wykazała żywotność komórek ~95%. Komórki Kupffera wykazały okrągły kształt w ciągu 30 minut od inkubacji w temperaturze 37 °C, co było związane z ich niekompletną przylegającą morfologią (ryc. 4A). Po 4 godzinach inkubacji i po jej za...

Discussion

Poniższe kroki mają kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności i wysokiej żywotności komórek Kupffera. Należy stosować warunki aseptyczne, aby ograniczyć ryzyko skażenia bakteryjnego i grzybiczego. Wszystkie narzędzia należy wysterylizować przed użyciem. Odczynniki powinny być świeżo przygotowane przed przeprowadzeniem procedury izolacji.

Wybór kolagenazy dożylnej, o niskiej aktywności tryptycznej, ma kluczowe znaczenie. Różne partie od tego samego dostawcy mają różną aktywność enz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euthatal (pentobarbital sodium)	Merial
CD1 myszy	Charles River	-	Waga myszy powinna wahać się od 35 do 45 g. Zalecamy stosowanie samców myszy CD1, ponieważ ich waga szybko rośnie (np. samiec myszy CD1 w wieku 7 tygodni przekracza 35 g wagi). Zaleca się również wcześniejsze skontaktowanie się z dostawcą zwierząt w celu umówienia się na dostawę starszych zwierząt. Alternatywnie zwierzęta mogą być w domu, aby osiągnąć pożądaną wagę.
HBSS (Ca2+ oraz Mg2+ bez wodorowęglanów)	Technologie życiowe	14175-053	HBSS musi być  Ca2+ za darmo.
Glikol etylenowy Kwas tetraoctowy (EGTA) sól tetrasodowa	Sigma-Aldrich	E8145	EDTA może być również stosowany, ale EGTA ma tę zaletę, że chelatuje Ca2+ selektywnie.
FILTR HEPESOWY (1 M)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 15630-056	100 ml
Kolagenaza typu IV	Worthington	Certyfikat CSL-4	Zaleca się przetestowanie różnych partii kolagenazy lub przynajmniej wspomnienie dostawcy, że produkt musi być odpowiedni do izolacji komórek wątroby
Niski poziom glukozy DMEM	Sigma-Aldrich	D5523	500 ml
RPMI (z pirogronianem sodu i Glutamaxem)	Technologie życiowe	Numer katalogowy: 12633-012	Pojemność 500 ml
Penicylina/Steptomycyna	Technologie życiowe	15140-122	100 ml
Surowica bydlęca	Pierwsze łącze	60-00-850	500 ml
Roztwór błękitu trypanowego	Sigma-Aldrich	T8154	100 ml
Powlekany roztwór cząstek krzemionki (Percoll)	GE Healtcare	17-0891-02	Percoll® jest bardzo stabilny i może być przechowywany przez kilka lat
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Technologie życiowe	10010-023	500 ml
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami	Technologie życiowe	70011-036	500 ml
dimetylosulfotlenku	Rybacy	D/4120/PB08	500 ml
Zestaw LDH (CytoTox 96)	Promega	G1781	Chronić przed światłem
Technologie życia bez czerwieni fenolowej DMEM		31053-028	500 ml
Przeciwciało F4/80 (Alexa 488)	AbD Serotec	MCA497A488	Nie rozcieńczać, stosować w postaci czystej do cytometrii przepływowej
Koraliki fluorescencyjne	Sigma	L2778	Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany aminami, kolor fluorescencyjny. 1 ml
Nazwa firmy zajmującej się materiałami		Numer katalogowy	Komentarze/Opis
Zestaw do pobierania krwi motylkowej (rurka o długości 23 g/305 mm)	BD
Filtry strzykawkowe (0,22 μ m Niebieska obwódka)	Minisart	16534-K
Probówki wirówkowe (50 ml niebieska nakrętka)	BD Biosciences, Sokół	35 2070
Szalka Petriego (90 x 15 mm)	Thermo Fisher Naukowy	Numer BSN 101VR20
100 μ Filtr siatkowy M	BD	352360
Pompa perystaltyczna	Watsona Marlowa	SciQ 300	Przepłucz rurki przed i po każdym użyciu sterylnym PBS i 70% etanolem.
Płytki 24-dołkowe Corning		3526
Płytki 96-dołkowe	Corning	3595
Wirówka	Eppendorf	5810R
Czytnik płytek	BMG Labtech	FLUOstar Omega
Serrefine kleszcze	Hammacher GmbH	Nr art. HSE 004-35 / nr kat. 221-0051	Kleszczyki serrefine umożliwiają zaciśnięcie naczynia kaniulowanego igłą 23 G bez konieczności trzymania kleszczyków podczas zabiegu perfuzji. Adres internetowy: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)
Rurki do cytometrii przepływowej	BD Biosciences, Falcon
Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)	Elkay	000-MICR-150
Skrobak do komórek	BD Biosciences, Falcon	353086	Wytnij kończyny ostrzy nożyczkami, aby zeskrobać komórki na płytkach 24-dołkowych.
Nazwa firmy produkującej odczynniki		Numer katalogowy	Komentarze/Opis
Roztwór EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego)/HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanka)			HBSS zawierający 0,5 mM EGTA i 25 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,4. Przygotuj 50 ml na każdą wątrobę do perfuzji.
Roztwór kolagenazy			DMEM o niskiej zawartości glukozy zawierającej kolagenazę typu IV w stężeniu 100 UI/ml, 15 mM HEPES i 1% Penicllin/Streptamycyny (v / v). Dostosuj pH do 7,4. Przygotować 100 ml na każdą wątrobę do perfuzji. Po dodaniu kolagenazy zaleca się podgrzanie roztworu przez 30 minut przed użyciem. Dzięki temu aktywność kolagenazy jest optymalna.
Podłoże do izolacji komórek Kupffera			RPMI zawierające: 1% aminokwasów endogennych (v/v), 1% glutamax® (v/v) i 1% Penicllin/Streptomycyna (v/v). Przygotuj co najmniej 100 ml na 1-3 wątróbki.
Pożywka do hodowli komórkowych Kupffera			RPMI zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% aminokwasów endogennych (v/v), 1% Glutamax® (v/v) i 1% Penicllin/Streptamycyna (v/v). Przygotuj co najmniej 100 ml na 1-3 wątróbki.
SIP (roztwór cząstek krzemionki pokrytych izotonicznie)			Wymieszać 1,7 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 15,3 ml Percoll® aby uzyskać 17 ml SIP.
25% roztwór SIP			Zmieszaj 5 ml SIP z 15 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami
50% rozwiązanie SIP			Wymieszaj 10 ml SIP z 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem
Bufor			Pożywka DMEM z 0,9% roztworem
		PBS/BSA	Przygotuj świeżą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami o pH 7,4 z 1% albuminą surowicy bydlęcej.