Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek Kupffera do badania toksyczności nanocząstek

24K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/52989

⸱

18 sierpnia 2015

 ,  , 
1Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

W tym artykule

Podsumowanie

Makrofagi wątrobowe, zwane komórkami Kupffera, są odpowiedzialne za wychwytywanie krążących nanocząstek. Opisujemy tutaj metodę izolacji komórek Kupffera o wysokiej czystości i wydajności. Zmodyfikowany test LDH jest tutaj stosowany do pomiaru toksyczności indukowanej przez nanorurki węglowe w komórkach Kupffera.

Streszczenie

Zdecydowana większość badań nanotoksykologicznych in vitro wykorzystuje unieśmiertelnione linie komórkowe ze względu na ich praktyczność. Jednak wyniki badań toksyczności nanocząstek w unieśmiertelnionych liniach komórkowych lub komórkach pierwotnych wykazały rozbieżności, podkreślając potrzebę rozszerzenia zastosowania komórek pierwotnych do testów in vitro. Protokół ten opisuje izolację makrofagów wątroby myszy, zwanych komórkami Kupffera, i ich zastosowanie do badania toksyczności nanocząstek. Komórki Kupffera są najliczniejszą populacją makrofagów w organizmie i stanowią część układu siateczkowo-śródbłonkowego (RES), odpowiedzialnego za wychwytywanie krążących nanocząstek. Opisana tutaj metoda izolacji komórek Kupffera opiera się na 2-etapowej metodzie perfuzji, po której następuje oczyszczanie na podstawie gradientu gęstości. Metoda, oparta na trawieniu kolagenazy i wirowaniu gęstości, została zaadaptowana z oryginalnego protokołu opracowanego przez Smedsrøda i wsp. przeznaczony do izolacji komórek wątroby szczura i zapewnia wysoką wydajność (do 14 x 106 komórek na mysz) i wysoką czystość (>95%) komórek Kupffera. Ta metoda izolacji nie wymaga wyrafinowanego ani drogiego sprzętu i dlatego stanowi idealny kompromis między złożonością a wydajnością komórek. Zastosowanie cięższych myszy (35-45 g) poprawia wydajność metody izolacji, ale także znacznie ułatwia procedurę kaniulacji żyły wrotnej. Toksyczność funkcjonalizowanych nanorurek węglowych f-CNT mierzono w tym modelu za pomocą zmodyfikowanego testu LDH. Metoda ta ocenia żywotność komórek poprzez pomiar braku integralności strukturalnej błony komórkowej Kupffera po inkubacji z f-CNT. Toksyczność indukowaną przez f-CNT można mierzyć konsekwentnie za pomocą tego testu, podkreślając, że izolowane komórki Kupffera są przydatne do badania toksyczności nanocząstek. Takie modele mogą przynieść korzyści dzięki ogólnemu zrozumieniu nanotoksykologii, dzięki czemu selekcja nanocząstek do translacji klinicznej będzie bardziej efektywna.

Wprowadzenie

Dziedzina badań nad nanotoksykologią ma na celu scharakteryzowanie biologicznego efektu nanocząstek. Badania toksykologiczne oparte na badaniach in vivo pozostają najdokładniejszymi metodami. Jednak ich zastosowanie jest ograniczone przez ich koszty, nakłady pracy i czas1. Jako alternatywę zastosowano testy in vitro ze względu na ich prostotę i możliwość opracowania wysokowydajnych platform do badań in vitro 2 - rozszerzając w ten sposób liczbę badanych warunków. Większość badań nanatoksykologicznych przeprowadza się przy użyciu testów in vitro z unieśmiertelnionymi liniami komórkowymi. Istnieją jednak obawy co do ekstrapolacji wyników tych badań eksperymentalnych na skutki toksykologiczne in vivo 3. Rzeczywiście, właściwości unieśmiertelnionych linii komórkowych mogą znacząco różnić się od tkanek, z których pochodzą, np. transformacja genetyczna4, pogorszenie kluczowych cech morfologicznych5, utrata polaryzacji komórkowej6 i zmiany funkcjonalne, takie jak regulacja mediatorów stanu zapalnego7.

Komórki Kupffera są najliczniejszą populacją makrofagów w organizmie i mają bezpośredni kontakt z krwią, wyściełając ścianę sinusoid wątroby. Jako część układu siateczkowo-śródbłonkowego (RES), makrofagi te są odpowiedzialne za wychwytywanie krążących nanocząstek i dlatego stanowią bardzo odpowiedni model do badania toksyczności nanocząstek. Badania in vivo8 i in vitro9 dotyczące reakcji zapalnych związanych z komórkami Kupffera wystawionymi na działanie nanocząstek zostały opublikowane w innych miejscach. Komórki Kupffera są również zaangażowane w patogenezę chorób wątroby, takich jak alkoholowa choroba wątroby10, zwłóknienie wątroby11 lub wirusowe zapalenie wątroby12. Doniesiono, że izolowane komórki Kupffera dostarczają użytecznych informacji do opisania mechanizmów komórkowych zaangażowanych w zaburzenia pracy wątroby13,14.

Opisano kilka metod izolowania i oczyszczania komórek Kupffera. Izolacja komórek może wynikać z dysocjacji mechanicznej lub enzymatycznej15. Trawienie kolagenazy wykazuje zaletę zachowania integralności funkcjonalnej komórek Kupffera, prowadząc jednocześnie do wysokiej wydajności komórek Kupffera16. Do oddzielenia komórek Kupffera od innych populacji komórek wątroby zastosowano wiele podejść eksperymentalnych, różniących się złożonością i kosztami. Na przykład czystość komórek Kupffera można osiągnąć poprzez powinowactwo immunologiczne17, elektroforezę przepływową18, selektywną adhezję16 lub techniki odśrodkowe16, które selekcjonują komórki w zależności od ich wielkości i gęstości. Kombinacja tych metod może być wybrana w celu zwiększenia czystości populacji16. Nie ma zgody co do idealnej metody izolacji komórek Kupffera, ponieważ zależy to głównie od zastosowania i dostępnego sprzętu. Jednak w przypadku badania toksyczności nanocząstek prostota i wysoka wydajność techniki związanej z funkcjonalnym zachowaniem komórek Kupffera okazały się najbardziej odpowiednie dla tego zastosowania.

Opisana tutaj metoda izolacji komórek Kupffera opiera się na 2-etapowej metodzie perfuzji, po której następuje oczyszczanie na gradiacji gęstości. Metoda została zmodyfikowana w stosunku do oryginalnego protokołu opracowanego przez Smedsrød i wsp. 16 Przeznaczony do izolacji komórek wątroby szczura. Większość badań opisywała i opisywała izolację komórek Kupffera z wątroby szczurów. W tym artykule opisujemy metodę izolowania komórek Kupffera z wątroby myszy z wysoką wydajnością i czystością. Wykorzystanie myszy zmniejsza koszty eksperymentu i pozwala na przetwarzanie kilku wątrób w celu uzyskania dużych ilości komórek Kupffera do badania toksyczności nanocząstek.

W poniższym protokole, komórki Kupffera były inkubowane z funkcjonalizowanymi nanorurkami węglowymi (f-CNT). Unikalne właściwości fizykochemiczne CNT, tj. wysoki stosunek długości do średnicy i duża powierzchnia, sprawiły, że CNT są interesującymi kandydatami jako wektory do celów terapeutycznych i diagnostycznych. Wyrażono jednak obawy dotyczące toksyczności CNT19, a opracowanie nowych testów in vitro ma na celu pogłębienie wiedzy na temat skutków biologicznych CNT. Toksyczność w komórce Kupffera jest związana z brakiem integralności strukturalnej błony komórkowej. Mierzy się to poprzez utratę enzymu cytoplazmatycznego LDH z komórki do supernatantu. Zasada tej metody polega zatem na usunięciu uwolnionego LDH i zmierzeniu tego, co pozostało w komórkach20. Odbywa się to zamiast pomiaru uwolnionego LDH w supernatancie, ponieważ obecność CNT w supernatancie zakłóca test21.

Proponujemy użycie tej prostej i efektywnej metody izolacji komórek Kupffera do izolowania dużej liczby funkcjonalnych komórek Kupffera. Pozwala to na badanie przesiewowe toksyczności szeregu nanocząstek w odpowiednim pierwotnym modelu makrofagów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i wymogami organów regulacyjnych. Przedstawiony protokół został wykonany pod nadzorem i za zgodą brytyjskiego Home Office.

1. Perfuzja i pobieranie komórek (Rycina 1)

Schemat perfuzji wątroby przy użyciu roztworów HBSS/EGTA oraz kolagenazy w temperaturze 40°C w kąpieli wodnej; pompa perystaltyczna.
Rycina 1: Perfuzja wątroby. Po znieczuleniu myszy przewód pokarmowy jest przesunięty bocznie na lewą stronę jamy brzusznej, aby udostępnić żyłę wrotną (PV). W żyłę PV wprowadza się kaniulę, stosując niski przepływ (1-3 ml/min) roztworu EGTA/HBSS, a następnie natychmiast przecina się żyłę główną dolną (IVC), aby zapobiec nadmiernemu ciśnieniu w wątrobie. W ciągu pierwszej minuty perfuzji przepływ jest stopniowo zwiększany do 7 ml/min. Następnie perfunduje się roztworem kolagenazy z prędkością 10 ml/min aż do uzyskania pełnego trawienia tkanki.

  1. Przygotować na świeżo wszystkie odczynniki opisane w tabeli materiałów.
  2. Podgrzewać roztwór EGTA (kwas etylenglikoltetraoctowy)/HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanksa) (50 ml na mysz) oraz roztwór kolagenazy (100 ml na mysz) przez 30 min w temperaturze 40 °C.
  3. Przepłukać elastyczny przewód pompy najpierw 70% etanolem. Wlać 40 ml roztworu EGTA/HBSS do probówki wirówkowej zanurzonej w kąpieli wodnej i przepłukać elastyczny przewód pompy podgrzanym uprzednio roztworem EGTA/HBSS.
  4. Przeprowadzić anestezję terminalną przy użyciu barbituranu, aby niezawodnie wywołać utratę przytomności przed wystąpieniem depresji oddechowej i śmiercią. Wstrzyknąć fenobarbital w dawce 1 mg/kg, i.p., samicy lub samcowi myszy CD1 (35-45 g). Potwierdzić znieczulenie poprzez uciśnięcie palca u stopy.
  5. Ogolić owłosienie brzucha i wysterylizować powierzchnię brzucha za pomocą 70% roztworu etanolu.
  6. Przeciąć jamę brzuszną i odsłonić żyłę wrotną oraz żyłę główną dolną, przesuwając jelita bocznie na lewą stronę brzucha.
  7. Uruchomić pompę z prędkością 1-3 ml/min z roztworem EGTA/HBSS i przeprowadzić kaniulację żyły wrotnej za pomocą igły motylkowej 23 g (ze ściętymi skrzydełkami). Zaciisnąć odcinek żyły wrotnej zakaniulowany igłą 23 G, a następnie zablokować kleszczyki serrefine na powierzchni otwartego brzucha myszy. Wątroba powinna szybko zblednąć w ciągu pierwszych 30 sec perfuzji roztworem EGTA/HBSS.
  8. Szybko naciąć dolną część żyły głównej dolnej (vena cava), aby uniknąć nadmiernego wzrostu ciśnienia w wątrobie, a następnie stopniowo zwiększać szybkość przepływu do 7 ml/min w ciągu pierwszej minuty perfuzji. Zwierzę ginie w wyniku krwotoku wtórnego do nakłucia żyły głównej dolnej.
  9. Gdy w probówce wirówkowej pozostanie mniej niż 5 ml roztworu EGTA/HBSS, dopełnić ją roztworem kolagenazy (40-50 ml). Stopniowo zwiększać szybkość przepływu do 10 ml/min w ciągu 30 sec.
  10. Wywołać obrzęk wątroby, wywierając nacisk na żyłę główną dolną (vena cava) za pomocą pęsety w odstępach 5-10 sec. Można to robić okresowo (5-10 razy podczas trawienia). Krok ten poprawi dysocjację komórek wątroby i skróci czas perfuzji kolagenazą.
  11. Gdy w probówce wirówkowej pozostanie mniej niż 10 ml roztworu kolagenazy, wlać do niej 40-50 ml podgrzanego uprzednio roztworu kolagenazy.
  12. Po 10-15 min perfuzji i przepłukaniu około 70-80 ml roztworu kolagenazy, wywrzeć lekki nacisk pęsetą na powierzchnię wątroby. Odciśnięcie miejsca nacisku wskazuje, że komórki wątroby uległy dysocjacji.
  13. Wyjąć wątrobę z jamy brzusznej w całości i umieścić ją w probówce wirówkowej zawierającej 20-30 ml medium do izolacji komórek Kupffera. Przechowywać komórki wątroby w lodzie lub w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 hr, aby nie wpływać na żywotność komórek wątroby.
  14. W razie potrzeby powtórzyć procedurę perfuzji u kilku zwierząt, przechowując perfundowaną wątrobę w lodzie. Połączyć od jednej do trzech wątrób w celu oczyszczania i przejść do etapu 3.

2. Przygotowanie gradientu gęstości do wirowania (Rycina 2)

Schemat przygotowania gradientu roztworu SIP; probówka do wirowania; technika warstwowania cieczy.
Rycina 2: Przygotowanie gradientu gęstości. Wszystkie procedury są wykonywane w warunkach sterylnych. SIP przygotowuje się poprzez zmieszanie 15,3 ml roztworu powlekanych cząsteczek krzemionki z 1,7 ml 10 x PBS. W celu otrzymania 20 ml 25% roztworu SIP, 5 ml SIP miesza się z 15 ml PBS. W celu otrzymania 20 ml 50% roztworu SIP, 10 ml SIP miesza się z 10 ml PBS. Probówkę do wirowania zawierającą 50% roztwór SIP (20 ml) przechyla się i powoli dodaje 25% roztwór SIP (20 ml) za pomocą serologicznej pipety 25 ml.

  1. Kolejne kroki (sekcje 2., 3. i 5.) należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, utrzymując komórki w lodzie lub w temperaturze 4 °C. Przygotować SIP (roztwór izotonicznych powlekanych cząsteczek krzemionki), mieszając 15,3 ml roztworu powlekanych cząsteczek krzemionki z 1,7 ml 10 x PBS.
  2. Aby przygotować 20 ml 25% roztworu SIP, należy zmieszać 5 ml SIP z 15 ml PBS. Aby przygotować 20 ml 50% roztworu SIP, należy zmieszać 10 ml SIP z 10 ml PBS.
  3. Napełnić probówkę do wirowania 20 ml 50% roztworu SIP. Przechylić probówkę pod kątem bliskim 90° i powoli dodać 25% roztwór SIP (20 ml) na ściankę boczną probówki za pomocą pipety serologicznej 25 ml, nie dotykając powierzchni warstwy 50% SIP. Podczas dodawania 25% roztworu SIP należy stopniowo zmniejszać kąt nachylenia probówki. Gradient gęstości przechowywać w lodzie do czasu użycia.

3. Oczyszczanie komórek Kupffera (Rycina 3)

Metody sekwencyjnej wirowania i adhezji komórek w izolacji komórek Kupffera; filtrowanie komórek wątroby.
Rysunek 3: Oczyszczanie komórek Kupffera poprzez wirowanie w gradiencie gęstości i adhezję komórkową. Wszystkie procedury są wykonywane w warunkach sterylnych. (A) Po przerwaniu torebki Glissona komórki wątroby są filtrowane przez sito 100 µm. Zawiesinę wiruje się przy x 50 g, aby odrzucić hepatocyty (osad) i zebrać frakcję komórek nieparenchymalnych (nadosad). Krok ten powtarza się 3 razy. Komórki nieparenchymalne nanosi się na nieciągły gradient izotoniczny i wiruje przy 800 x g przez 15 min. Komórki Kupffera zebrane z poduszki 25% SIP są następnie oczyszczane poprzez selekcję adhezyjną. (B) Komórki wysiewa się na płytkę 24-dołkową i inkubuje w 37 °C i 5% CO2 przez 30 min. Komórki nieadherentne przemywa się raz 500 µl HBSS. Komórki Kupffera wykazują morfologię adherentną 4 hr po wysianiu, kiedy do komórek można dodać f-CNTs. Pasek skali reprezentuje 25 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Umieścić jedną perfundowaną wątrobę w szalce Petriego z 15 ml Medium do Izolacji Komórek Kupffera. Przerwać torebkę Glissona (błonę wątroby) za pomocą nożyczek i uwolnić wszystkie komórki wątroby do medium do izolacji komórek Kupffera. Przefiltrować roztwór przez sitko komórkowe 100 µm do probówki wirówkowej. Powtórzyć procedurę perfuzji na dodatkowych perfundowanych wątrobach i połączyć komórki w tej samej probówce wirówkowej (15 ml od jednej myszy, do 45 ml od trzech myszy).
  2. Wirować zawiesinę komórkową przy 50 x g przez 2 min w temperaturze 4 °C. Komórki miąższowe (hepatocyty) znajdą się w osadzie, a komórki niemiąższowe (w tym komórki Kupffera) w nadsączu.
  3. Zebrać nadsącz do czystej probówki wirówkowej i wirować przy 50 x g przez 2 min. Powtórzyć ten krok jeszcze trzy razy.
  4. Wirować przy 1 350 x g przez 15 min w celu osadzenia komórek niemiąższowych. Odlać nadsącz i resuspender osad w 10 ml Medium do Izolacji Komórek Kupffera.
  5. Nanieść roztwór komórek niemiąższowych na nieciągły gradient izotoniczny 25/50% zgodnie z opisem w sekcji 2.3. Wirować przy 850 x g przez 15 min bez przyspieszania i hamowania.
  6. Zlokalizować wzbogaconą frakcję komórek Kupffera, która pojawia się jako zmętnienie w obrębie frakcji 25% SIP, blisko granicy między 25% a 50% SIP (Rysunek 3). Za pomocą pipety serologicznej 10 ml odessać około 12 ml wzbogaconej frakcji komórek Kupffera. Przenieść komórki do probówki wirówkowej zawierającej 35-40 ml Medium do Izolacji Komórek Kupffera. Delikatnie wymieszać i wirować przy 1 350 x g przez 15 min w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
  7. Odlać nadsącz i resuspender komórki w 5-10 ml podgrzanego Medium do Hodowli Komórek Kupffera. Policzyć komórki (komora licznikowa) i zmierzyć ich żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
  8. Wysiać oczyszczone komórki niemiąższowe na płytki 24-dołkowe z gęstością 5 x 105 komórek/dołek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 (Rysunek 3). Po 30 min delikatnie usunąć medium, przepłukać raz podgrzanym Zrównoważonym Roztworem Solnym Hanksa (HBSS), a następnie zastąpić go 500 µl świeżego i podgrzanego Medium do Hodowli Komórek Kupffera (na dołek).
  9. Pozostawić komórki Kupffera przez co najmniej 4 h w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przed traktowaniem nanocząsteczkami, aby pozwolić im na uzyskanie morfologii adherentnej.

4. Charakterystyka

  1. Czystość komórek Kupffera
    1. Przygotować świeży roztwór PBS/BSA stosowany do utrzymania żywotności komórek Kupffera. Przemyć komórki raz 500 µl roztworu PBS/BSA. Usunąć roztwór PBS/BSA i odkleić komórki Kupffera w 500 µl świeżego roztworu PBS/BSA, delikatnie zeskrobując je. W przypadku wysiewania komórek na płytki 24-dołkowe, należy skrócić końce ostrzy skrobaka nożyczkami, aby ułatwić proces odklejania. Przenieść komórki do probówek do cytometrii przepływowej.
    2. Policzyć komórki Kupffera za pomocą hemocytometru i odwirować 1 x 105 komórek przy 1,350 x g. Resuspendować komórki Kupffera w 30 µl przeciwciała F4/80 (czystego). Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 min. Niebarwione komórki (nieinkubowane z przeciwciałem) przechowywać na lodzie.
    3. Do zabarwionych komórek dodać 2 ml roztworu PBS/BSA, odwirować przy 1,350 g przez 5 min i odrzucić otrzymany nadosad. Resuspendować zabarwione komórki w 200 µl PBS/BSA.
    4. W analizie cytometrii przepływowej wyznaczyć bramkę (gate) dla 10 000 niebarwionych komórek Kupffera zgodnie z ich rozmiarem (rozproszenie przednie, FSC) i ziarnistością (rozproszenie boczne, SSC). Analizować fluorescencję wybranych komórek w kanale FL-1.
    5. Powtórzyć procedurę dla zabarwionych komórek Kupffera, zachowując te same ustawienia, które zostały zastosowane podczas analizy cytometrii przepływowej niebarwionych komórek Kupffera. Wybrać i określić ilość fluorescencji zabarwionych komórek, aby ocenić czystość populacji komórek Kupffera.
  2. Aktywność fagocytarna komórek Kupffera
    1. Wymienić medium na pożywkę do hodowli komórek Kupffera zawierającą 0,5% (v/v) fluorescencyjnych kuleczek i inkubować przez 4 hr w 37 °C i 5% CO2.
    2. Aby usunąć kuleczki, które nie zostały zinternalizowane, odwirować komórki Kupffera przy 1,350 x g, odrzucić nadosad i resuspendować komórki w 500 µl roztworu PBS/BSA. Powtórzyć ten krok jeszcze 2 razy.
    3. Zeskrobać komórki Kupffera w 500 µl roztworu PBS/BSA i przenieść komórki do probówki do cytometrii przepływowej.
    4. Odwirować komórki Kupffera przy 1,350 x g, odrzucić nadosad i resuspendować komórki w 200 µl roztworu PBS/BSA.
    5. W analizie cytometrii przepływowej wyznaczyć bramkę dla 10 000 niebarwionych komórek Kupffera zgodnie z ich rozmiarem (rozproszenie przednie) i ziarnistością (rozproszenie boczne). Analizować fluorescencję wybranych komórek w kanale FL-2.

5. Inkubacja chemicznie funkcjonalizowanych nanorurek węglowych (f -CNTs)

  1. Przygotować dyspersję z f-CNTs (1 mg/ml) w wodzie poprzez sonikację przez 15 min przed użyciem. f-CNTs są przygotowywane wewnętrznie22.
  2. Przygotować stężenie 2x f-nanorurki węglowe suspensja w pożywce do hodowli komórek Kupffera. Sonicuj f-CNT dyspergować w medium przez 2 min przed przejściem do kroku 5.3).
  3. W każdym dołku należy wymienić 250 µl starych mediów z 250 µl 2x f-dyspersja CNT. Dołki niepoddane działaniu (250 µl pożywki warunkującej + 250 µl świeżej pożywki do hodowli komórek Kupffera) oraz studzienki traktowane 10% DMSO służą odpowiednio jako kontrola negatywna i pozytywna.
  4. Inkubować komórki Kupffera w 37 °C oraz 5% CO22 przez 24 lub 72 h.

6. Ocena toksyczności f-CNT w komórkach Kupffera przy użyciu zmodyfikowanego testu dehydrogenazy mleczanowej (LDH)

  1. Odrzuć nadsącz.
  2. Dodaj 200 µl (na dołek płytki 24-dołkowej) buforu do lizy i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 min-1 h.
  3. Po intensywnym pipetowaniu zbierz zlizowane komórki Kupffera do probówek do mikrocentryfugi i wiruj przy 40 000 x g przez 10 min, aby utworzyć osad z f-CNTs pochłoniętych przez komórki oraz z debris komórkowego.
  4. Zbierz nadsącze (wolne od ƒ-CNT) do probówek do mikrocentryfugi i przechowuj w temperaturze -20 °C lub przejdź do kroku 6.5).
  5. Przenieś 50 µl do płytki 96-dołkowej i dodaj do każdego dołka równą objętość roztworu mieszaniny substratu (zestaw LDH). Przykryj płytkę i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 min przed dodaniem 50 µl roztworu stopującego (zestaw LDH). Przygotuj triplikaty dołków kontrolnych (blank), zawierających 50 µl buforu do lizy, 50 µl roztworu mieszaniny substratu i 50 µl roztworu stopującego.
  6. Odczytaj absorbancję przy 490 nm w czytniku mikropłytek i użyj następującego wzoru do obliczenia (%) żywotności komórek.

Wzór na żywotność komórek, %=(A490 traktowane-blank)/(A490 nietraktowane-blank)×100, równanie do analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Liczba nieoczyszczonych komórek miąższowych była stała i mieściła się w zakresie od 8 do 14 x 106 komórek na mysz (wykonano 17 izolacji). Każda izolacja z jednej myszy była wystarczająca do wysiania od 16 do 28 dołków. Żywotność komórek określona za pomocą barwienia błękitem trypanowym wyniosła ~95%. Komórki Kupffera w ciągu 30 min inkubacji w 37 °C przybrały okrągły kształt, co wiązało się z ich niepełną morfologią adherentną (Rycina 4A). Po 4 h inkubacji i później komórki uległy rozpostarciu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Poniższe kroki mają kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej wydajności i wysokiej żywotności komórek Kupffera. Należy stosować warunki aseptyczne, aby ograniczyć ryzyko skażenia bakteryjnego i grzybiczego. Wszystkie narzędzia należy wysterylizować przed użyciem. Odczynniki powinny być świeżo przygotowane przed przeprowadzeniem procedury izolacji.

Wybór kolagenazy dożylnej, o niskiej aktywności tryptycznej, ma kluczowe znaczenie. Różne partie od tego samego dostawcy mają różną aktywność enz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez program EU FP7-ITN Marie-Curie Network RADDEL. MB i KAJ pragną podziękować Joe Varguese i Rui Serra Maia za ich pomoc i sugestie dotyczące optymalizacji izolacji komórek Kupffera.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Euthatal (pentobarbital sodium)Merial
CD1 myszyCharles River   -Waga myszy powinna wahać się od 35 do 45 g. Zalecamy stosowanie samców myszy CD1, ponieważ ich waga szybko rośnie (np. samiec myszy CD1 w wieku 7 tygodni przekracza 35 g wagi). Zaleca się również wcześniejsze skontaktowanie się z dostawcą zwierząt w celu umówienia się na dostawę starszych zwierząt. Alternatywnie zwierzęta mogą być w domu, aby osiągnąć pożądaną wagę.
HBSS (Ca2+ oraz Mg2+ bez wodorowęglanów)   Technologie życiowe   14175-053HBSS musi być  Ca2+ za darmo. 
Glikol etylenowy Kwas tetraoctowy (EGTA) sól tetrasodowa Sigma-Aldrich   E8145   EDTA może być również stosowany, ale EGTA ma tę zaletę, że chelatuje Ca2+ selektywnie. 
FILTR HEPESOWY (1 M) Technologie życiowe   Numer katalogowy: 15630-056 100 ml 
Kolagenaza typu IV Worthington Certyfikat CSL-4 Zaleca się przetestowanie różnych partii kolagenazy lub przynajmniej wspomnienie dostawcy, że produkt musi być odpowiedni do izolacji komórek wątroby 
  Niski poziom glukozy DMEM Sigma-Aldrich   D5523 500 ml 
RPMI (z pirogronianem sodu i Glutamaxem) Technologie życiowe   Numer katalogowy: 12633-012 Pojemność 500 ml
Penicylina/Steptomycyna Technologie życiowe   15140-122100 ml
Surowica bydlęca Pierwsze łącze   60-00-850 500 ml 
Roztwór błękitu trypanowego Sigma-Aldrich T8154 100 ml 
Powlekany roztwór cząstek krzemionki (Percoll)GE Healtcare   17-0891-02 Percoll® jest bardzo stabilny i może być przechowywany przez kilka lat 
1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami   Technologie życiowe   10010-023500 ml 
10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami   Technologie życiowe   70011-036500 ml
dimetylosulfotlenku Rybacy D/4120/PB08 500 ml 
Zestaw LDH (CytoTox 96) Promega G1781 Chronić przed światłem 
Technologie życia bez czerwieni fenolowej DMEM   31053-028 500 ml 
Przeciwciało F4/80 (Alexa 488)AbD SerotecMCA497A488Nie rozcieńczać, stosować w postaci czystej do cytometrii przepływowej
Koraliki fluorescencyjneSigmaL2778Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany aminami, kolor fluorescencyjny. 1 ml
Nazwa firmy zajmującej się materiałami Numer katalogowy Komentarze/Opis 
Zestaw do pobierania krwi motylkowej (rurka o długości 23 g/305 mm)   BD 
Filtry strzykawkowe (0,22 μ m Niebieska obwódka) Minisart 16534-K 
Probówki wirówkowe (50 ml niebieska nakrętka) BD Biosciences, Sokół 35 2070 
Szalka Petriego (90 x 15 mm) Thermo Fisher Naukowy   Numer BSN 101VR20 
100 μ Filtr siatkowy M   BD   352360
Pompa perystaltyczna Watsona Marlowa SciQ 300   Przepłucz rurki przed i po każdym użyciu sterylnym PBS i 70% etanolem.
Płytki 24-dołkowe Corning   3526
Płytki 96-dołkowe Corning   3595
Wirówka Eppendorf5810R
Czytnik płytekBMG LabtechFLUOstar Omega
Serrefine kleszczeHammacher GmbH Nr art. HSE 004-35 / nr kat. 221-0051Kleszczyki serrefine umożliwiają zaciśnięcie naczynia kaniulowanego igłą 23 G bez konieczności trzymania kleszczyków podczas zabiegu perfuzji. Adres internetowy: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html) 
Rurki do cytometrii przepływowejBD Biosciences, Falcon 
Probówki do mikrowirówek (1,5 ml)Elkay  000-MICR-150
Skrobak do komórekBD Biosciences, Falcon353086Wytnij kończyny ostrzy nożyczkami, aby zeskrobać komórki na płytkach 24-dołkowych.
Nazwa firmy produkującej odczynniki Numer katalogowy Komentarze/Opis 
  Roztwór EGTA (kwas tetraoctowy glikolu etylenowego)/HBSS (zrównoważony roztwór soli Hanka) HBSS zawierający 0,5 mM EGTA i 25 mM HEPES. Dostosuj pH do 7,4. Przygotuj 50 ml na każdą wątrobę do perfuzji.  
Roztwór kolagenazy DMEM o niskiej zawartości glukozy zawierającej kolagenazę typu IV w stężeniu 100 UI/ml, 15 mM HEPES i 1% Penicllin/Streptamycyny (v / v). Dostosuj pH do 7,4. Przygotować 100 ml na każdą wątrobę do perfuzji. Po dodaniu kolagenazy zaleca się podgrzanie roztworu przez 30 minut przed użyciem. Dzięki temu aktywność kolagenazy jest optymalna. 
Podłoże do izolacji komórek Kupffera RPMI zawierające: 1% aminokwasów endogennych (v/v), 1% glutamax® (v/v) i 1% Penicllin/Streptomycyna (v/v). Przygotuj co najmniej 100 ml na 1-3 wątróbki.  
Pożywka do hodowli komórkowych Kupffera RPMI zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej, 1% aminokwasów endogennych (v/v), 1% Glutamax® (v/v) i 1% Penicllin/Streptamycyna (v/v). Przygotuj co najmniej 100 ml na 1-3 wątróbki.  
SIP (roztwór cząstek krzemionki pokrytych izotonicznie)Wymieszać 1,7 ml 10x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem z 15,3 ml Percoll® aby uzyskać 17 ml SIP.
25% roztwór SIP Zmieszaj 5 ml SIP z 15 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami   
50% rozwiązanie SIP Wymieszaj 10 ml SIP z 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 
BuforPożywka DMEM z 0,9% roztworem
PBS/BSAPrzygotuj świeżą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami o pH 7,4 z 1% albuminą surowicy bydlęcej. 
367288352052 do lizy Triton X-100

Bibliografia

  1. Hoffmann, D., et al. Performance of novel kidney biomarkers in preclinical toxicity studies. Toxicol Sci. 116 (1), 8-22 (2010).
  2. Nel, A., et al. Nanomaterial Toxicity Testing in the 21st Century: Use of a Predictive Toxicological Approach and High-Throughput Screening. Accounts of Chemical Research. 46 (3), 607-621 (2013).
  3. Bregoli, L., et al. Toxicity of antimony trioxide nanoparticles on human hematopoietic progenitor cells and comparison to cell lines. Toxicology. 262 (2), 121-129 (2009).
  4. Yamasaki, K., et al. Genomic Aberrations and Cellular Heterogeneity in SV40-Immortalized Human Corneal Epithelial Cells. Investigative Ophthalmology, & Visual Science. 50 (2), 604-613 (2009).
  5. Motoyoshi, Y., et al. Megalin contributes to the early injury of proximal tubule cells during nonselective proteinuria. Kidney International. 74 (10), 1262-1269 (1038).
  6. Prozialeck, W. C., Edwards, J. R., Lamar, P. C., Smith, C. S. Epithelial barrier characteristics and expression of cell adhesion molecules in proximal tubule-derived cell lines commonly used for in vitro toxicity studies. Toxicology in Vitro. 20 (6), 942-953 (2006).
  7. Chamberlain, L. M., Godek, M. L., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Phenotypic non-equivalence of murine (monocyte-) macrophage cells in biomaterial and inflammatory models. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 858-871 (2009).
  8. Kermanizadeh, A., et al. The role of Kupffer cells in the hepatic response to silver nanoparticles. Nanotoxicology. , (2013).
  9. Fischer, H. C., Hauck, T. S., Gomez-Aristizabal, A., Chan, W. C. W. Exploring Primary Liver Macrophages for Studying Quantum Dot Interactions with Biological Systems. Advanced Materials. 22 (23), 2520-2524 (2010).
  10. Wan, J. H., et al. M2 Kupffer Cells Promote M1 Kupffer Cell Apoptosis: A Protective Mechanism Against Alcoholic and Nonalcoholic Fatty Liver Disease. Hepatology. 59 (1), 130-142 (2014).
  11. Matsuoka, M., Tsukamoto, H. Stimulation of hepatic lipocyte collagen production by Kupffer cell-derived transforming growth factor β: Implication for a pathogenetic role in alcoholic liver fibrogenesis. Hepatology. 11 (4), 599-605 (1990).
  12. Polakos, N. K., et al. Kupffer Cell-Dependent Hepatitis Occurs during Influenza Infection. The American Journal of Pathology. 168 (4), 1169-1178 (2006).
  13. Tanner, A., Keyhani, A., Reiner, R., Holdstock, G., Wright, R. Proteolytic enzymes released by liver macrophages may promote hepatic injury in a rat model of hepatic damage. Gastroenterology. 80 (4), 647-654 (1981).
  14. Knittel, T., et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and their inhibitors in parenchymal and non-parenchymal cells of rat liver: regulation by TNF-α and TGF-β1. Journal of Hepatology. 30 (1), 48-60 (1999).
  15. Branster, M. V., Morton, R. K. Isolation of Intact Liver Cells. Nature. 180 (4597), 1283-1284 (1038).
  16. Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
  17. Morin, O., Patry, P., Lafleur, L. Heterogeneity of endothelial cells of adult rat liver as resolved by sedimentation velocity and flow cytometry. J Cell Physiol. 119 (3), 327-334 (1984).
  18. Miller, S. B., et al. Purification of cells from livers of carcinogen-treated rats by free-flow electrophoresis. Cancer Res. 43 (9), 4176-4179 (1983).
  19. Firme, C. P., Bandaru, P. R. Toxicity issues in the application of carbon nanotubes to biological systems. Nanomedicine. 6 (2), 245-256 (2010).
  20. Ali-Boucetta, H., Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Cytotoxic assessment of carbon nanotube interaction with cell cultures. Methods in Molecular Biology. 726, 299-312 (2011).
  21. Wang, G., et al. Understanding and correcting for carbon nanotube interferences with a commercial LDH cytotoxicity assay. Toxicology. 299 (2-3), 99-111 (2012).
  22. Wang, J. T. -W., et al. Magnetically Decorated Multiwalled Carbon Nanotubes as Dual MRI and SPECT Contrast Agents. Advanced Functional Materials. 24 (13), 1880-1894 (2014).
  23. Li, P. Z., Li, J. Z., Li, M., Gong, J. P., He, K. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells. Immunol Lett. 158 (1-2), 52-56 (2014).
  24. Froh, M., Konno, A., Thurman, R. G. Isolation of liver Kupffer cells. Curr Protoc Toxicol. Chapter 14, Unit14 14(2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

makrofagi wątrobowe myszytrawienie kolagenaząwirowanie w gradiencie gęstościanaliza cytometrycznafunkcjonalizowane nanorurki węglowezmodyfikowany test LDHkomórki nieparenchymalnekaniulacja żyły wrotnej
Izolacja komórek Kupffera do badania toksyczności nanocząstek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.