Ten artykuł demonstruje zabiegi chirurgiczne refluksu żołądkowo-przełykowego u myszy. Modele te są przydatnymi narzędziami do badań nad mechanizmami i leczeniem choroby refluksowej przełyku, a potencjalnie również choroby Barretta i raka przełyku.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Modele chirurgiczne refluksu gastroezofagoidalnego z użyciem myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zgłoszono wiele zabiegów chirurgicznych, które wywołują refluks gastroezofagealny u zwierząt. Niniejszy artykuł opisuje trzy modele chirurgiczne z użyciem myszy mające na celu wywołanie refluksu treści żołądkowej, treści dwunastnicy lub mieszanej treści. Zabiegi chirurgiczne i ogólne zasady zostały szczegółowo opisane. Badacz z doświadczeniem chirurgicznym powinien być w stanie opanować tę technikę po krótkim okresie ćwiczeń. Po zabiegu większość myszy może przeżyć i rozwinąć refluksowe zapalenie przełyku podobne do tego u ludzi. Należy jednak zauważyć, że różnice histologiczne między przełykiem myszym a ludzkim są uwarunkowaną cechą tych modeli chirurgicznych. Jeśli są stosowane w badaniach nad przełykiem Barretta i rakiem gruczołowym, te zabiegi mogą wymagać skojarzenia z modyfikacjami genetycznymi.
Wprowadzenie
Choroba refluksowa przełyku (GERD) to przewlekłe zaburzenie spowodowane przedłużającym się narażeniem końcowego odcinka przełyku na zawartość żołądka lub żołądkowo-jelitową1. Przedłużające się narażenie na te szkodliwe refluksaty osłabia wrodzone mechanizmy obronne w nabłonku przełyku i prowadzi do zapalenia przełyku2. Przełyk Barretta powstaje w warunkach przewlekłego refluksu i jest zmianą przedrakową z podwyższonym ryzykiem raka przełyku3,4. Pomimo klinicznego znaczenia, mechanizmy GERD, przełyka Barretta i raka nie zostały dobrze poznane.
Modele zwierzęce są niezbędne do badań nad etiologią, patofizjologią, mechanizmami molekularnymi, zapobieganiem i leczeniem chorób człowieka. Do tej pory stworzono różne modele zwierzęce GERD, przełyka Barretta i raka z użyciem modelowych zwierząt5,6. Przełyk mysi jest wyściełany warstwowanym nabłonkiem łuszczącym się, który jest histologicznie podobny do nabłonka przełyku człowieka. Chociaż przełyk mysi różni się od przełyku człowieka pod względem keratynizacji i braku gruczołów podstawnych, mysz jest nadal atrakcyjnym modelem zwierzęcym ze względu na stosunkowo niski koszt utrzymania i potencjał skomplikowanych modyfikacji genetycznych. Dwa podejścia są powszechnie stosowane do modelowania GERD, przełyka Barretta i raka w myszy: chirurgia refluksowa i modyfikacje genetyczne. Chirurgia refluksowa jest najlepszym sposobem na wywołanie refluksu, a modyfikacje genetyczne naśladują zmiany molekularne5,7. Chirurgia refluksowa może być połączona z modyfikacjami genetycznymi w celu lepszego zrozumienia mechanizmów choroby8.
Wiele procedur chirurgicznych zostało opisane przez nas i innych6,9: (1) refluks żołądkowy: zwężenie piloroscy, zwężenie piloroscy z zwężeniem żołądka przedniego, kardioplastika Wendela i anastomozja przełykowo-żołądkowa; (2) refluks mieszany: anastomozja przełykowo-żołądkowo-dwunastniczo-jelitowa, przełykowo-dwunastniczowa (lub przełykowo-jelitowa); (3) refluks dwunastnicy: anastomozja przełykowo-żołądkowo-dwunastniczo-jelitowa plus resekcja żołądka; (4) refluks składników chemicznych: refluks żółciowy, refluks trzustkowy, perfuzyjne unaczynienie przełyku; i (5) przeszczepienie przełyku5. Ostatnio opisano mikrochirurgiczny model myszy, który wytwarza refluks jelitowy poprzez anastomozję przełykowo-jelitową z zastosowaniem magnesów10. Te modele chirurgiczne mają zalety w stosunku do in vitro kultur komórkowych lub modeli kultur organowych. In vitro, komórki przełyku nie tolerują medium o wysokiej kwasowości lub wysokich stężeniach kwasów żółciowych. Niekoniugowane kwasy żółciowe, które są powszechnie stosowane do wywoływania zmian w komórkach nabłonka przełyku in vitro, zwykle nie są obecne w refluksacie dwunastniczym in vivo. Dlatego wnioski wyciągnięte z takich badań in vitro należy traktować ostrożnie.
Chirurgia na przełyku mysim pozostaje wyzwaniem technicznym ze względu na jego małą wielkość. Niska współczynnik przeżycia pooperacyjnego nie pozwala na eksperymenty, które wymagają pewnej wielkości próby, aby osiągnąć statystycznie solidne wnioski. W przeszłości z powodzeniem opracowywaliśmy i charakteryzowaliśmy chirurgiczne modele refluksu żołądkowego, refluksu mieszanego i refluksu dwunastnicy z użyciem myszy w eksperymentach długookresowych9,11,12. Świadczyliśmy również konsultacje kilku innym grupom w zakresie chirurgii mysich. W dalszej części opisujemy trzy procedury chirurgiczne u myszy w celu pomocy społeczności w utworzeniu tych modeli w ich laboratoriach.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania.
1. Przygotowanie myszy
- Do operacji używaj myszy o wadze ponad ~20 g lub starszych niż ~6 tygodni.
- Przed operacją, daj myszom pokarm laboratoryjny i wodę ad libitum i utrzymuj w cyklu 12:12 godzinnym światło-ciemność.
- Ogol strefę operacyjną maszynką do włosów. Zwierzęta znieczulaj przez podanie dootrzewnowe 80 mg/kg ketaminy i 12 mg/kg ksylazyny. Ta dawka przyśpi myszy w ciągu kilku minut i zapewnia wystarczające znieczulenie na kolejne zabiegi chirurgiczne.
- Potwierdź prawidłowe znieczulenie na podstawie braku odruchu rogówkowego i cofnięcia kończyn, gdy zaciśniesz poduszeczkę łapy. Na oczy nałóż smar okulistyczny, aby zapobiec wysychaniu.
- Wysterylizuj skórę roztworem betadyny.
2. Model refluksu żołądkowego (Rysunek 1B)
- Wykonaj górny środkowy nacięcie o długości ~2 cm, zaczynając od mostka i kierując się w stronę odbytu.
- Otwórz jamę brzuszną przez środkową linię. Usuń mostek, aby poprawić widoczność za pomocą pary nożyczek.
- Oddziel i przetnij tkanki łączne między wątrobą a żołądkiem. Zawiąż i przetnij pęczek naczyń między śledzioną a fundusem, aby całkowicie uwolnić fundus.
- Lekko obróć fundus w lewo i eksponuj lewą stronę przełyku w polu. Wykonaj 5 mm podłużne nacięcie na mięśniu wzdłuż dystalnego przełyku za pomocą pary ostrych nożyczek, aby odsłonić nabłonek.
- Odciąć nabłonek wzdłuż tego samego kierunku (nacięcie 1, Rysunek 1B). Zrób trzy nacięcia na przedżołądku (nacięcia 2, 3 i 4, Rysunek 1B), aby odciąć większość przedżołądka za pomocą ostrych nożyczek operacyjnych. Jeśli żołądek nie jest pusty, ostrożnie usuń zawartość żołądka.
- Przełóż szyję 8-0 prolenu (z igłą o stożkowatym końcu) przez Punkt a (na przełyku) i Punkt a’ (na przedżołądku) z dokładnym dopasowaniem błony śluzowej do błony śluzowej. Podobnie przełóż szwy przez Punkt b i Punkt b’ oraz inne pary punktów. Równomiernie rozstaw te szwy w odległości 3-4 mm od siebie.
- Wypłucz jamę brzuszną fizjologicznym roztworem soli, aby usunąć krew i zawartość żołądka. Zamknij ścianę brzucha za pomocą szwów jedwabnych, a skórę za pomocą klipek metalowych.
3. Model mieszanego refluksu (Rysunek 1C)
- Postępuj zgodnie z krokami 2.1 do 2.4, aby eksponować przełyk.
- Delikatnie oddziel grzbietową stronę przełyku od naczyń krwionośnych za przełykiem. Włóż małe bawełniane zakończenie między przełykiem a naczynami krwionośnymi.
Uwaga: Bawełna może być częściowo usunięta z końcówki, aby zmniejszyć jej rozmiar. To bawełniane zakończenie służy dwóm celom, unoszeniu przełyku i ochronie naczyń krwionośnych. - Wykonaj dwa 5 mm podłużne nacięcia na przełyku i dystalnym końcu dwunastnicy przylegającym do żołądka za pomocą ostrych nożyczek operacyjnych. W przypadku nacięcia na dwunastnicy, unikaj naczyń krwionośnych i umieść je na przeciw-mezenteriacznej granicy.
- Połącz nacięcia z dokładnym dopasowaniem błony śluzowej do błony śluzowej za pomocą przerywanych szwów Prolene 8-0. Zazwyczaj umieść 3-4 szwy po stronie grzbietowej i 2-3 szwy po przedniej stronie.
- Wyjmij bawełniane zakończenie. Wypłucz jamę brzuszną fizjologicznym roztworem soli i zamknij ścianę brzucha i skórę.
4. Model refluksu dwunastnicy (Rysunek 1D)
- Postępuj zgodnie z krokami 3.1 do 3.4, aby wygenerować mieszany refluks.
- Delikatnie unieważniaj żołądek, aby odsłonić jego tylną stronę. Płat wątroby może być uchwycony przez tkanki łączne między wątrobą a tylną stroną żołądka. Delikatnie przetnij tkanki łączne, odpowiednio ochroń wątrobę i odsłonij naczynia krwionośne po grzbietowej stronie przełyku.
- Zawiąż i przetnij naczynia krwionośne. Zawiąż i przetnij przełyk na przełyku.
Zawiąż dwunastnicę na żołądku. Zawiąż i przetnij mezenteriał. - Wyjmij cały żołądek.
- Wypłucz jamę brzuszną fizjologicznym roztworem soli. Zamknij ścianę brzucha i skórę.
5. Leczenie pooperacyjne
- Po operacji utrzymuj temperaturę ciała za pomocą podgrzewanej podkładki. Dopiero po odzyskaniu położenia na brz
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Większość myszy (>95%) przetrwa operację. W okresie pooperacyjnym, głównymi przyczynami śmierci są przedawkowanie leków znieczulających, krwotoki i nieznane przyczyny.
Cztery tygodnie po operacji, >90% myszy z refluksem żołądkowym lub mieszanym refluksem i >80% myszy z refluksem dwunastnicy może przeżyć. W tym okresie myszy umierają głównie z powodu zwężenia przełyku i niemożności jedzenia. Te myszy wykazują oznaki ciężkiego stresu (zachowanie się na czworaka, brak aktywności, wymioty, wklęsłe...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ustanowiono różne modele chirurgiczne w celu naśladowania refluksu żołądkowego, dwunastniczego i mieszanego u gryzoni. Te trzy opisane tu procedury są odpowiednie dla długoterminowych eksperymentów z rozsądnymi wskaźnikami przeżywalności pooperacyjnej. Badacz z doświadczeniem chirurgicznym powinien być w stanie opanować tę technikę po krótkim okresie ćwiczeń.
Krwawienie może wynikać z dootrzewnowego wstrzyknięcia środków znieczulających przed operacją, rozerwania wątroby podczas oddzielania tk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Jeden z autorów (XC) otrzymał dofinansowanie, które zostało przekazane przez Takeda Pharmaceutical Company Ltd, które wspiera badania podstawowe związane z chorobą refluksową przełyku. Żaden z reagentów lub instrumentów użytych w tym artykule nie jest produkowany przez tę firmę.
Podziękowania
Dzięki wsparciu grantów badawczych Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (NR 81400590), Narodowych Instytutów Zdrowia (U54 CA156735) oraz Takeda Pharmaceutical Company Ltd. (MA-NC-D-156).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Dumont #1 Forceps Dumostar Tip | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Clip Applying Forceps 5.5" | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Bonn Scissors 3.5" Straight 15 mm Sharp/Sharp Tungsten Carbide Blades | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Operating Scissors 5.5" Straight Sharp/Sharp SureCut | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| 4-0 Silk Black Braid 100 Yard Spool | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Surgeon's Needle 1/2 Circle Cutting Edge Size 12 (25 mm Chord Length) Pack 12 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Halsey Needle Holder 5" Smooth | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Micro Needle Holder 5.125" Curved Lock.6 mm | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clip Applier | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| Reflex 9 mm Wound Clips Box Of 100 | Roboz Surgical Instrument Co. (Gaithersburg, MD) | ||
| PRONOVA Poly (hexafluoropropylene-VDF) Suture 8-0 | Ethicon US, LLC | ||
| Ringer's solution | Henry Schein, Inc. | ||
| ketamine | Henry Schein, Inc. | ||
| xylazine | Henry Schein, Inc. |
Bibliografia
- Kandulski, A., Malfertheiner, P. Gastroesophageal reflux disease--from reflux episodes to mucosal inflammation. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (1), 15-22 (2012).
- Orlando, R. C. The integrity of the esophageal mucosa. Balance between offensive and defensive mechanisms. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 24 (6), 873-882 (2010).
- Stairs, D. B., Kong, J., Lynch, J. P. Cdx genes, inflammation, and the pathogenesis of intestinal metaplasia. Prog Mol Biol Transl Sci. 96, 231-270 (2010).
- Spechler, S. J., Fitzgerald, R. C., Prasad, G. A., History Wang, K. K. molecular mechanisms, and endoscopic treatment of Barrett's esophagus. Gastroenterology. 138 (3), 854-869 (2010).
- Fang, Y., et al. Cellular origins and molecular mechanisms of Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Ann N Y Acad Sci. 1300, 187-199 (2013).
- Garman, K. S., Orlando, R. C., Chen, X. Review: Experimental models for Barrett's esophagus and esophageal adenocarcinoma. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (11), G1231-G1243 (2012).
- Baruah, A., et al. Translational research on Barrett's esophagus. Ann N Y Acad Sci. 1325, 170-186 (2014).
- Lechpammer, M., et al. Flavopiridol reduces malignant transformation of the esophageal mucosa in p27 knockout mice. Oncogene. 24 (10), 1683-1688 (2005).
- Hao, J., Liu, B., Yang, C. S., Chen, X. Gastroesophageal reflux leads to esophageal cancer in a surgical model with mice. BMC Gastroenterol. 9, 59(2009).
- Mari, L., et al. A pSMAD/CDX2 complex is essential for the intestinalization of epithelial metaplasia. Cell Rep. 7 (4), 1197-1210 (2014).
- Fang, Y., et al. Gastroesophageal reflux activates the NF-kappaB pathway and impairs esophageal barrier function in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (1), G58-G65 (2013).
- Chen, H., et al. Nrf2 deficiency impairs the barrier function of mouse oesophageal epithelium. Gut. 63 (5), 711-719 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
