Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

Podsumowanie

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Streszczenie

Mikroiniekcja mózgu może pomóc w wyjaśnieniu molekularnych substratów złożonych zachowań, takich jak motywacja. W tym celu gryzonie mogą służyć jako odpowiednie modele, częściowo dlatego, że reakcja na bodźce istotne behawioralnie i obwody analizujące wyniki działania bodźca są zadziwiająco podobne między ludźmi a gryzoniami. W badaniu molekularnych substratów złożonych zachowań, mikroiniekcja odczynników, które modyfikują, rozszerzają lub wyciszają określone systemy, jest nieocenioną techniką. Bardzo ważne jest jednak, aby miejsce mikroiniekcji było precyzyjnie ukierunkowane, aby ułatwić interpretację wyników. Przedstawiamy metodę produkcji narzędzi chirurgicznych i igieł do mikroiniekcji, która umożliwia dokładne mikroiniekcje i nieograniczone możliwości dostosowywania przy minimalnych kosztach. Co ważne, technika ta może być z powodzeniem wykonywana u obudzonych gryzoni, jeśli jest przeprowadzana w połączeniu z innymi artykułami JoVE, które obejmowały wymagane zabiegi chirurgiczne. Ponadto istnieje wiele paradygmatów behawioralnych, które dobrze nadają się do pomiaru motywacji. Współczynnik progresywny jest powszechnie stosowaną metodą, która określa ilościowo skuteczność wzmacniacza w utrzymaniu reakcji pomimo (często wykładniczo) rosnącego zapotrzebowania na pracę. Test ten jest wrażliwy na wielkość wzmacniacza i manipulacje farmakologiczne, co pozwala na określenie skuteczności wzmocnienia i / lub motywacji. Przedstawiamy również proste podejście do programowania oprogramowania operacyjnego w celu dostosowania do harmonogramu zbrojenia o progresywnym współczynniku.

Wprowadzenie

Gryzonie i ludzie reagują w niezwykle podobny sposób na bodźce behawioralne^1-3. Sugeruje to, że gryzonie są odpowiednimi obiektami do wyjaśnienia molekularnych substratów zachowania i^{złożonych schorzeń} psychicznych4. Zrozumienie molekularnych substratów złożonych procesów behawioralnych, takich jak motywacja, często wymaga mikroiniekcji do mózgu. Przedstawiona zostanie tu zarówno technika mikroiniekcji mózgu, jak i test motywacji pierwotnej. Szczury będą wykorzystywane jako obiekty, ale procedury te można łatwo dostosować do dobrze traktowanych myszy. Niniejszy dokument obejmuje procedury wytwarzania wymaganych kaniul, obturatorów (atrap kaniul lub styletów) oraz mikroiniektorów. Przedstawiona metoda jest znacznie bardziej elastyczna i bardziej opłacalna niż narzędzia prefabrykowane. Ta elastyczność okaże się cenna przy optymalizacji warunków. Co ważne, ponieważ procedura mikroiniekcji może być wykorzystana do przetestowania niezliczonej ilości hipotez; Przedstawione tu techniki powinny mieć szerokie zastosowanie. Na przykład ligandy receptorowe mogą być mikrowstrzykiwane, aby zrozumieć neurochemię^3,5,6; Peptydy przepuszczalne dla komórek i małe cząsteczki mogą być mikrowstrzykiwane w celu zrozumienia wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych^7-10; Toksyny, blokery kanałów jonowych lub koktajle antagonistów mogą być mikrowstrzykiwane, aby zrozumieć obwody^1,11,12.

Podczas gdy przedstawiony tutaj ogólny protokół może być łatwo dostosowany przez użytkownika do jego konkretnych potrzeb, procedura ta jest szczególnie dobrze dostosowana do testów behawioralnych, ponieważ mikroiniekcja występuje u obudzonych gryzoni, które są tylko pod łagodnym ograniczeniem ręki. Nie jest wymagane znieczulenie ani specjalne ograniczenia. Jest to możliwe, ponieważ sam mózg nie odczuwa bólu. Jeśli jednak znieczulenie nie jest stosowane, mikroiniekcja musi odbywać się przez kaniule, które zostały wcześniej wszczepione stereotaktycznie. Dzieje się tak, ponieważ nocyceptory są obecne na skórze głowy, oponach ^mózgowych13, które są błonami otaczającymi mózg, oraz okostnej14, która jest błoną pokrywającą czaszkę. Należy zauważyć, że czasami pożądane jest mikroiniekcja w znieczuleniu. Jednym z przykładów jest sytuacja, w której wirus jest wstrzykiwany i można chcieć wstrzyknąć wirusa bezpośrednio za pomocą igieł ze stali nierdzewnej¹⁵ lub szklanych pipet, ponieważ może to zmniejszyć uszkodzenie tkanek i poprawić wydajność transdukcji. ^16,17 Opisane poniżej mikroiostrzykacze mogą być w tym celu modyfikowane, a sugestie, jak to zrobić, można znaleźć w Dyskusji. Ponieważ inne artykuły JoVE wykazały stereotaktyczną implantację kaniuli ^{mózgowej,18-20} procedury te nie zostaną tutaj omówione.

Prezentujemy te procedury mikroiniekcji razem z testem, który określa ilościowo motywację. Obecnie stosowanych jest kilka modeli umotywowanych zachowań u gryzoni, takich jak boks pasa startowego i skalowanie bariery. W tym miejscu opisujemy, jak używać harmonogramu wzmocnienia opartego na progresywnym współczynniku instrumentalnym do ilościowego określenia motywacji, w której reakcja instrumentalna jest utrzymywana przez wzmacniacz. Reakcja na współczynnik progresywny reaguje na wielkość wzmocnienia. ^21,22 W związku z tym test ten jest rutynowo stosowany jako wskaźnik zastępczy dla motywacji i/lub wzmacniania skuteczności. ^21,23-30 Ponieważ kilka doskonałych recenzji szczegółowo omówiło ten ^temat,21,24 skupimy się głównie na kwestiach praktycznych.

Protokół

Procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Virginia Commonwealth University i są zgodne z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie narzędzi przed operacją i mikroiniekcją

1. Przygotuj się do przygotowania materiału:
   1. Zaopatrz się w rurkę kaniuli 26 G, drut zasłonowy 33 G, rurkę igłową do mikroiniekcji 33 G, plastikową rurkę do mikroiniekcji (PE20 lub odpowiednik), dwie hemostatyki proste o średniej gramaturze, taśmę laboratoryjną, linijkę, marker permanentny, 70% etanol (v/v), fiolki do przechowywania (np. 20 ml scyntylacji szklanej), super klej, małe łódeczki do ważenia i narzędzie obrotowe wyposażone w nieobciążającą tarczę tnącą.
      Uwaga: Pomocne jest przymocowanie narzędzia obrotowego do pudełka z końcówkami do pipet za pomocą pasków lub taśmy, ponieważ podnosi ono narzędzie. Noszenie okularów ochronnych jest ważne, aby uniknąć obrażeń podczas korzystania z narzędzia obrotowego.
   2. Przymocuj kawałek taśmy laboratoryjnej lub autoklawu do stołu.
2. Przygotowanie kaniuli:
   Uwaga: Do wstrzyknięcia obustronnego wymagane są co najmniej dwie kaniule na szczura. Jedna dodatkowa kaniula zostanie użyta w późniejszym etapie.
   1. Zaopatrz się w odcinek rurki kaniuli o wystarczającej długości, aby uniknąć zginania podczas procesu znakowania i cięcia.
   2. Narysuj linię odniesienia 15 mm na taśmie z kroku 1.1.2 za pomocą pisaka z cienką końcówką. Będzie to służyć jako wskazówka do oznaczania sekwencyjnych odcinków 15 mm na rurze za pomocą ostrego markera permanentnego.
   3. Przyłóż rurkę kaniuli w zaznaczonych punktach do wolno obracającej się tarczy odcinającej narzędzia obrotowego, aby naciąć rurkę. Obróć kaniulę o 180° i naciąć przeciwną stronę rurki. Nie przecinaj całkowicie rurki, ponieważ może to prowadzić do niedrożności.
   4. Ostro zegnij rurkę, aby podzielić ją na odcinki ~15 mm.
   5. Trzymaj każdy odcięty koniec kaniuli prostopadle do odciętego dysku między kciukiem a palcem wskazującym. Obróć rurkę kaniuli, dotykając końcówką dużej przedniej powierzchni tarczy odcinającej (tj. Nie krawędzi). Spowoduje to wygenerowanie stępionej końcówki. Uwaga: Nie zginaj kaniuli, ponieważ może to spowodować wstrzyknięcie poza miejscem.
   6. Rozwierc oba końce kaniuli za pomocą igły ze skosem 26 G (brązowa piasta), aby upewnić się, że wszystkie zadziory zostały usunięte i że kaniula jest drożna.
   7. Przełóż próbkę drutu zasłonowego przyciętego do ~35 mm przez przeciętą kaniulę, aby sprawdzić, czy nie ma żadnych wewnętrznych przeszkód.
   8. Podnieś każdą kaniulę indywidualnie za pomocą niezaciśniętych hemostatów i zmierz każdą ukończoną kaniulę linijką, aby upewnić się, że ma dokładnie 14 mm długości.
3. Przygotowanie obturatorów:
   1. Zacisnąć jedną kaniulę w przybliżeniu w połowie długości za pomocą prostych hemostatów o średniej wadze. Połóż zamknięty hemostat na ławce. Kaniula powinna być prostopadła do ławki.
      Uwaga: Ta kaniula nie powinna być używana w chirurgii po przytrzymaniu przez zablokowane hemostatyki, ponieważ prawdopodobnie jest wygięta.
   2. Włóż jeden koniec drutu zasłonowego do kaniuli, aż dotrze do stołu. Odbij drut w kaniuli, aby upewnić się, że zadzior nie uniemożliwia mu dotarcia do stołu; tj. dotarcie do dna kaniuli. Odpowiednia długość zasłony zapobiegnie zatykaniu się i dodatkowemu bliznowaceniu tkanek.
   3. Zegnij drut, ściskając palcami, aż do uzyskania kąta ~30°, zachowując kontakt między zasłoną a ławką. Upewnij się, że kąt zgięcia jest taki, że leży równo z nasadką głowy, a nadmiar jest skierowany do przodu, co utrudnia szczurowi usunięcie.
   4. Usuń drut z kaniul i odetnij nadmiar części w odległości ~2,5 mm od zagięcia za pomocą małych szczypiec do cięcia bocznego (przecinaków do drutu).
      Uwaga: Do wstrzyknięcia dwustronnego wymagane będą co najmniej dwa obturatory na szczura, ponieważ każda wszczepiona kaniula wymaga obturatora. Stworzenie dodatkowego zgięcia ~35° w połowie zasłony również pomoże w zapobieganiu usunięciu przez zwierzę. Przechowywać zarówno kaniule, jak i obturatory w oddzielnych fiolkach (np. 20 ml szklanego scyntylacji) zawierających 70% etanolu (v/v) do czasu użycia, ale co najmniej O/N.
4. Przygotowanie i testowanie mikrowtryskiwaczy:
   1. Zaopatrzyć się w kawałek rurki igłowej mikroiniektora o długości ~1 m.
   2. Trzymaj jeden koniec rurki mikroiniektora prostopadle z zablokowanymi prostymi hemostatami.
   3. Przekręć hemostat, utrzymując napięcie na rurce, aby zwinąć ją ciasno wokół hemostatu przynajmniej jeden raz.
   4. Odmierz 32 mm od przeciwległego, luźnego końca rurki mikroiniektora i uchwyć ten punkt prostopadle za pomocą drugiego prostego, średniej wagi hemostatu i zablokuj je. Chwyć rurkę mikroiniektora hemostatykami po stronie oznaczenia 32 mm najbliżej luźnego końca, a nie po stronie najbliższej hemostatu ze zwijanym drutem.
   5. Zegnij rurkę w przód iw tył, utrzymując napięcie rurki, aż pęknie.
      Uwaga: Pojedyncze, ostre zgięcie w górę i w dół spowoduje pęknięcie, które jest pożądane, aby zapewnić, że mikroiniekcja nastąpi w pożądanym obszarze mózgu.
   6. Sprawdź rurki mikrowtryskiwaczy, aby upewnić się, że oba końce są proste, a średnica wewnętrzna nie jest drożna.
   7. Zaopatrz się w rurkę kaniuli, która zostanie użyta do produkcji kołnierza mikroiniektora.
   8. Zmierz i oznacz sekwencyjne odcinki rurki kaniuli o średnicy 5 mm za pomocą markera permanentnego i linii odniesienia 5 mm narysowanej na taśmie (krok 1.1.2).
      Uwaga: Każdy mikrowtryskiwacz wymaga jednego kołnierza. Obroże to po prostu krótkie kaniule przyklejone do drutu mikroiniektora.
   9. Przyłóż rurkę kaniuli w zaznaczonych punktach do wolno obracającej się tarczy odcinającej narzędzia obrotowego, aby naciąć rurkę. Obróć kaniulę o 180° i naciąć przeciwną stronę rurki. Całkowite przecięcie może spowodować zamknięcie rurki.
   10. Ostro zegnij rurkę kołnierza mikrowtryskiwacza, aby rozbić ją na odcinki ~5 mm.
   11. Rozwiercić wewnętrzną średnicę obu końców kołnierza za pomocą igły ze skosem 26 G (brązowa piasta), aby upewnić się, że większość zadziorów została usunięta. Niektóre małe zadziory chwytają drut mikrowtryskiwacza, a tym samym pomagają w klejeniu.
   12. Wsuń jeden kołnierz na każdą rurkę mikroiniektora ~2 cm od końca.
   13. Stwórz małą kałużę super kleju w rogu małej łodzi do ważenia.
   14. Użyj rurki kaniuli przyciętej do ~25 mm, aby nałożyć niewielką ilość super kleju na rurkę mikroiniektora ~5 mm od jednego końca. Następnie nasuń kołnierz na tę super kulkę kleju tak, aby znajdowała się ~1 mm od końca rurki do mikroiniekcji. Pokryj oba końce kołnierza klejem.
       Uwaga: Unikaj dużego nagromadzenia super kleju na kołnierzu, ponieważ zapobiegnie to uszczelnieniu plastikowej rurki wokół mikrowtryskiwacza. Chociaż ważne jest, aby unikać dostania się super kleju na otwarty koniec rurki mikrowtryskiwacza, ponieważ spowoduje to, że mikrowtryskiwacz stanie się bezużyteczny, ważne jest również, aby przesunąć kołnierz jak najbliżej końca, aby zminimalizować pustą objętość (bez wstrzyknięcia).
   15. Zespol gotowy mikrowtryskiwacz na zewnątrz innej małej łodzi ważącej kołnierzem do góry i pozostaw do wyschnięcia na 24 godziny.
   16. Zaopatrz się w kawałek plastikowej rurki do mikrowstrzykiwaczy o długości ~8 cm (PE20 lub odpowiednik), strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną sterylną wodą i igłę ze skosem 26 G (brązowa piasta).
   17. Przymocuj igłę 26 G (brązowa piasta) do strzykawki i wsuń odciętą rurkę na igłę, uważając, aby nie przebić rurki.
   18. Nasuń plastikową rurkę na koniec kołnierza wysuszonego, kompletnego mikrowtryskiwacza.
   19. Ścisnąć tłok strzykawki wypełniony wodą, aby sprawdzić drożność.
       Uwaga: Woda powinna tryskać bardzo daleko i prosto z końcówki mikrowtryskiwacza. Jeśli strumień nie jest prosty, miejsce wstrzyknięcia nie będzie prawidłowe. Źródłem rozpylonego na boki lub rozproszonego strumienia jest słaba przerwa (krok 1.4.5). Nie należy używać mikroiniektora, jeśli spray jest skierowany na boki lub rozproszony. Nie należy używać soli fizjologicznej, ponieważ może ona zatkać mikrowstrzykiwacz lub igłę.
   20. Odciągnąć strzykawkę do tyłu, aby usunąć wodę z mikrowstrzykiwacza. Przechowywać w suchej, szczelnie zamkniętej fiolce; np. szklana fiolka scyntylacyjna o pojemności 20 ml.
       Uwaga: Mikrowtryskiwacze mogą być sterylizowane w autoklawie po wyprodukowaniu przy użyciu większości super ^klejów,31 ale musi to być empirycznie określone. Alternatywne techniki sterylizacji obejmują tlenek etylenu i promieniowanie gamma.

2. Przygotowanie i wykonywanie mikroiniekcji

1. Zaopatrz się w gotowe mikrowtryskiwacze, plastikowy rurkę do mikrowstrzykiwaczy (PE20 lub równoważny), pompę do mikroiniekcji, dwie małe łódeczki do ważenia, sterylną wodę, 70% etanolu (v/v), aceton, dwie gazoszczelne szklane strzykawki 1 μl z igłą (25 G), drewniane aplikatory z bawełnianą końcówką, zapasowe obturatory, strzykawkę 1 ml, igłę 26 G (brązowa piasta), małe zakrzywione kleszczyki (zalecany styl #7), i chusteczki laboratoryjne.
2. Przygotowanie mikrowstrzykiwaczy do iniekcji:
   1. Zegnij gotowy mikrowtryskiwacz 15 mm od końca przeciwnego do kołnierza tak, aby kąt między nimi wynosił ~95°.
      Uwaga: Precyzyjne miejsce zgięcia jest niezbędne do dokładnego miejsca wtrysku. Przydatne jest użycie kleszczyków #7 (lub podobnych) do chwycenia mikrowtryskiwacza i schylania się w górę. Zawsze ponownie zmierz długość przed wykonaniem mikroiniekcji.
   2. Przyciąć plastikową rurkę (PE20) do ~70 cm i nasunąć na kołnierz mikrowtryskiwacza.
      Uwaga: Dodanie zakładek z taśmą do jednej plastikowej rurki w pobliżu zarówno mikrowtryskiwacza, jak i luźnego końca jest przydatne podczas wykonywania wstrzyknięć, zwłaszcza podczas wstrzykiwania dwóch różnych roztworów. Tabletki nie są zalecane do obu rurek, ponieważ stają się uciążliwe podczas wstrzykiwania.
3. Przygotowanie pompy do mikroiniekcji:
   1. Włącz pompę.
   2. Ustawić średnicę igły do mikroiniekcji, żądaną szybkość infuzji i docelową objętość wstrzyknięcia.
      Uwaga: Szybkość infuzji i objętość wstrzyknięć zależą od wymagań eksperymentalnych. Jest to rozwijane w Dyskusji. Niektóre pompy mają wstępnie załadowane stoły strzykawkowe. Jeśli nie, tabelę strzykawek można znaleźć na stronie internetowej producenta.
   3. Ustaw tryb pompy na "Objętość", aby precyzyjna objętość była dostarczana automatycznie. Jeśli zamiast tego wybrany jest tryb "Pompa", eksperymentator musi ręcznie zatrzymać pompę.
   4. Wyregulować ogranicznik pompy w taki sposób, aby strzykawka mogła napełnić się do objętości wstrzyknięcia plus dodatkowe 0,2 μl.
4. Przygotowanie strzykawki do mikroiniekcji i mikroiniektora do wstrzykiwań:
   1. Każdą gazoszczelną strzykawkę do mikroiniekcji zablokować w stojaku pompy do mikroiniekcji.
   2. Umieść końcówkę gazoszczelnej strzykawki w sterylnej wodzie znajdującej się w małej łódce do ważenia i delikatnie potrząśnij tłokiem, aby nasmarować drut wewnętrzny. Równomiernie pociągnij tłok do ogranicznika na pompie, aby napełnić go wodą.
   3. Wsuń rurkę PE20 podłączoną do mikrowtryskiwacza (w kroku 2.2) na igłę o wadze 26 G (brązowa piasta) przymocowaną do strzykawki o pojemności 1 ml wypełnionej sterylną wodą. Rozpyl sterylną wodę przez mikrowtryskiwacz i sprawdź wzór natrysku oraz odległość.
      Uwaga: Woda powinna tryskać bardzo daleko i prosto z końcówki mikrowtryskiwacza. Jeśli strumień nie jest prosty, miejsce wstrzyknięcia nie będzie prawidłowe.
   4. Umieść wysterylizowany mikrowstrzykiwacz na sterylnym polu.
   5. Zsuń rurkę z igły, trzymając rurkę mikrowtryskiwacza w pozycji pionowej, aby zapobiec kapaniu wody, jednocześnie przecinając rurkę poniżej obszaru uszkodzonego przez igłę.
   6. Popchnąć tłok strzykawki do mikroiniekcji lekko do przodu, aby utworzyć kroplę na końcu igły i wsunąć rurkę PE20 wypełnioną wodą (która jest podłączona do mikrowtryskiwacza) na igłę.
      Uwaga: Spowoduje to utworzenie połączenia ciecz-ciecz, które umożliwi odpowiednie przeciwciśnienie, które może usunąć zator, który może powstać na końcówce mikrowtryskiwacza.
   7. Popchnij tłok całkowicie do przodu, aby przygotować się do załadowania próbki i upewnić się, że w mikrowtryskiwaczu nie pozostał śladowy ilość etanolu.
   8. Sprawdź konfigurację pod kątem wycieków, kilkakrotnie dotykając kropli wody, która utworzyła się na końcówce mikrowtryskiwacza, czystą chusteczką laboratoryjną.
5. Uwaga: Po dotknięciu chusteczki laboratoryjnej powinna powstać tylko jedna mokra plama. Jeśli kropli jest więcej, oznacza to nieszczelność systemu.
6. Unikaj wycieków, kontrolując nakładanie super kleju (krok 1.4.14) i przycinając rurkę PE20 ostrymi nożyczkami lub żyletką za każdym razem, gdy rurka PE20 jest usuwana z dowolnego połączenia. Dodatkowo powtórz kroki od 2.4.3 do 2.4.8, aby usunąć wyciek.
7. Odciągnąć tłok strzykawki o 0,2 μl, tworząc pęcherzyk między sterylną wodą w wężyku/mikrowstrzykiwaczu PE20 a roztworem, który ma być wstrzykiwany.
8. Uwaga: Ten pęcherzyk zapobiega rozcieńczeniu wstrzykniętego środka, zanieczyszczeniu wody i pozwala na monitorowanie procesu wstrzykiwania, ponieważ będzie się on poruszał podczas wstrzykiwania. Należy wytworzyć pojedynczy, stały pęcherzyk. Jeśli jest uszkodzony, występuje nieszczelność lub końcówka mikrowtryskiwacza jest niedrożna; wskazując, że krok 2.4.8 (i towarzysząca mu uwaga) powinien zostać powtórzony.
9. Umieścić mikrowstrzykiwacz w odczynniku, który ma być wstrzykiwany, i powoli pociągnąć tłok strzykawki do blokady.
10. Przygotowanie zwierzęcia do wstrzyknięcia:
11. Przyłóż klatkę piersiową szczura do klatki piersiowej eksperymentatora. Oczyść obszar wokół kaniul bawełnianym aplikatorem nasączonym 70% etanolem (v/v).
12. Uwaga: Przy prawidłowym obchodzeniu się z myszami można delikatnie unieruchomić w złożonej dłoni. W przeciwnym razie może być wymagane scruffing.
13. Usuń zasłony za pomocą małych kleszczy i umieść w łodzi wagowej z 70% etanolem (v/v).
14. Wykonywanie iniekcji:
15. Umieść napełniony mikrowstrzykiwacz (krok 2.4.10) w kaniuli. Naciśnij przycisk start na pompie mikroiniekcyjnej i monitoruj ruch pęcherzyków.
16. Uwaga: Może być konieczne zastosowanie lekkiego nacisku, aby upewnić się, że mikrowtryskiwacze nie podnoszą się. Bańka (utworzona w kroku 2.4.9) powinna równomiernie przesuwać się i całkowicie wchodzić do mikrowtryskiwacza.
17. Wyjmij mikrowstrzykiwacze z kaniuli i wymień obturatory, po zakończeniu wstrzyknięcia i upływie okresu dyfuzji po wstrzyknięciu.
18. Uwaga: Typowy czas dyfuzji po wstrzyknięciu wynosi 2 – 4 minuty w przypadku odczynników farmakologicznych i 2 – 10 minut w przypadku wirusów. Pozostawienie mikrowstrzykiwacza w okresie po infuzji zapobiega cofaniu się iniekcji z powrotem w górę kaniuli, a nie dyfuzji do tkanki. Umieść obturatory z boku łodzi wagowej wypełnionej etanolem, aby umożliwić odpływ etanolu przed ponownym włożeniem do kaniuli.

3. Sprzątanie po iniekcji

1. Zaopatrz się w jedną małą fiolkę z każdym: sterylną wodą, 70% EtOH i acetonem.
2. Czyszczenie mikrowtryskiwacza i strzykawki do mikroiniekcji:
   1. Wyjąć szklane strzykawki ze stojaka na strzykawki z pompką i rurkę do mikroiniekcji ze szklanej strzykawki.
   2. Odłączyć rurkę mikroiniektora od szklanej strzykawki i podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną sterylną wodą do rurki mikroiniektora za pomocą igły 26 G (brązowa piasta). Popchnąć tłok strzykawki o pojemności 1 ml do przodu, aby usunąć ~0,3 ml. Następnie przyłóż końcówkę mikrowtryskiwacza do chusteczki laboratoryjnej i wciągnij powietrze z powrotem przez mikrowtryskiwacz.
      Uwaga: Mikroiniektor i rurka mogą być ponownie użyte do podobnych eksperymentów, jeśli zostaną uznane za rozsądne.
   3. Umieścić szklaną igłę strzykawki w sterylnej wodzie i całkowicie odciągnąć tłok do tyłu. Następnie popchnij tłok całkowicie do przodu, aby przepłukać. Przyłóż szklaną końcówkę strzykawki do chusteczki laboratoryjnej, aby upewnić się, że nie pozostał żaden płyn.
   4. Powtórzyć krok 3.2.3 ze sterylną wodą, powietrzem, 70% EtOH i acetonem w następującej kolejności: sterylna woda, sterylna woda, powietrze, powietrze, 70% EtOH, 70% EtOH, powietrze, powietrze, aceton, aceton, powietrze, powietrze. Wykonanie wszystkich tych czynności czyszczenia pomoże zachować strzykawkę do mikroiniekcji.
   5. Umieścić strzykawkę (strzykawki) z mikrowstrzykiwaczem w opakowaniu i odciągnąć tłok z powrotem do 0,05 μl.
      Uwaga: Jest to ważne, ponieważ umożliwia popychanie lub ciągnięcie tłoka w celu usunięcia zablokowanego tłoka, który może wystąpić, jeśli po przechowywaniu utworzą się osady soli.

4. Programowanie testu motywacyjnego

1. Zaloguj się do stanu graficznego przy użyciu poświadczeń administratora.
2. Wybierz lub utwórz odpowiednią bazę danych.
3. Tworzenie harmonogramu zbrojenia z progresywnym współczynnikiem:
   1. Wybierz opcję Listy > Listy na poziomie bazy danych > Listy parametrów przejścia zdarzenia.
   2. Wybierz opcję "Dodaj". Wprowadź odpowiedni numer listy (L#) i opis.
   3. Wybierz opcję "Dodaj wydarzenia".
   4. Wprowadź wartość pierwszego harmonogramu zbrojenia i wybierz opcję 'Dodaj'. Powtórzenie.
      Uwaga: Wartości można określić za pomocą wzoru, w którym harmonogram współczynnika progresywnego = 5e ^{(j*(zdobyte wzmocnienie+1))-}5. ⁷ Aby dostosować to równanie do prawidłowego przetestowania hipotezy, wartość j musi być wyznaczona empirycznie lub uzyskana z literatury.
   5. Wybierz opcję "W kolejności" w polu "Kolejność wyboru".
   6. Wybierz opcję "Wstrzymaj wartość = do: ____" w polu "Po zakończeniu". Wprowadź w polu tekstowym wartość harmonogramu zbrojenia, która znacznie wykracza poza oczekiwaną odpowiedź. Będzie to wymagany wysiłek dla wszystkich kolejnych wpisów po wyczerpaniu listy.
4. Tworzenie protokołu eksperymentalnego:
   Uwaga: Stan graficzny przenosi obiekt przez serię stanów, które są zamykane na podstawie kryteriów czasu lub wydajności. Ustaw wszystkie dyskretne i kontekstowe wskazówki i parametry oznaczone poniżej jako "$", aby odpowiednio przetestować badaną hipotezę.
   1. Wybierz pozycję Plik> Utwórz protokół eksperymentu.
   2. Wprowadź żądany numer protokołu i opis w odpowiednim polu tekstowym.
   3. Wybierz opcję "Tworzenie stanu".
   4. Ustaw wszystkie bodźce zarówno dla "RDY – Stan gotowości", jak i "FIN – Stan zakończony".
   5. Wybierz pozycję "Nowy stan" i nadaj mu nazwę "S2 — Odpowiadanie na żądanie ściągnięcia".
   6. Wybierz "Nowy stan" i nazwij go "S3 – PR Reinforcer and Cue".
   7. Wybierz "Nowy stan" i nazwij go "S4 – Limit czasu".
   8. Zaznacz "S1" i nazwij go "S1 – Habituacja".
      1. Wybierz opcję Dodaj "Godzina przejścia do".
      2. Wprowadź odpowiedni czas ($) i jednostki ($), np. minuty i wybierz "S2" z listy rozwijanej DO S. Jednostka czasu 'units' została określona podczas początkowego tworzenia bazy danych.
         Uwaga: Utworzone przejście czasowe powinno wyglądać podobnie do [Po $ minutach GO P = 100%, TO S2] Rysunek 1 jest przykładem tego zdarzenia po utworzeniu.

Rysunek 1. Reprezentatywny przykład programowania #1. W tym przypadku zilustrowano stan rozdzielany czasem, w którym zdefiniowana przez użytkownika wartość $, pokazana tutaj w minutach, wskazuje, kiedy bieżący stan powinien zakończyć się do stanu 2 (S2).

9. Zaznacz pozycję "S2 — Odpowiadanie na żądanie ściągnięcia".
   1. Wybierz opcję Dodaj opcję "Przejdź do wydarzenia".
   2. Wprowadź nazwę listy zawierającej harmonogram współczynnika progresywnego, który został utworzony w kroku 4.3, w pierwszym polu tekstowym jako L$ (np. L1), wybierz odpowiedni operandum (np. dźwignię lub szturchanie nosem) z pierwszego pola rozwijanego i wybierz "S3" z listy rozwijanej DO S.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie może mieć wartość podobną do [IF L$1 – Active GO P = 100%, TO S3]. Identyfikator 1 – Aktywny został wyznaczony podczas tworzenia bazy danych. Tutaj 1 – Active odnosi się do operandum podłączonego do przełącznika pierwszego.
   3. Wybierz opcję "Dodaj godzinę przejścia do".
   4. Zaznacz pole "R", wprowadź odpowiedni czas i jednostki ($), a następnie wybierz "FIN" z listy rozwijanej DO S.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie czasowe może mieć odczyt podobny do [ R (zaznaczone) IF $ minuty GO P = 100%, TO FIN]. Zapewni to, że sesja zakończy się, jeśli po ustalonym progu nie będzie żadnej aktywności w tym operandum; Oznacza to, że sesja przekroczy limit czasu po tym, jak zwierzę wstrzyma się z odpowiedzią na operandum sparowane ze wzmocnieniem przez określony czas.
   5. Wybierz opcję Dodaj opcję "Przejdź do wydarzenia".
   6. Zaznacz pole "R", wprowadź 1 w pierwszym polu tekstowym, wybierz zwolnienie odpowiedniego operandum z pierwszego pola rozwijanego i wybierz "S2" z listy rozwijanej DO S.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie może brzmieć podobnie do [ R (zaznaczone) Po $ [1] Aktywne GO P = 100%, TO S2]. Ten krok zapewnia, że po zwolnieniu operandum (oznaczonego nawiasami powyżej) stan zostanie ponownie wprowadzony, resetując w ten sposób próg limitu czasu sesji (4.4.9.4). W tym momencie stan zakończy się, gdy zakończy się progresywny współczynnik zawarty na liście (Krok 4.4.9.2) lub upłynie limit czasu sesji (Krok 4.4.9.4). Tak więc za każdym razem, gdy operandum jest aktywowane, liczy się do współczynnika progresywnego. I za każdym razem, gdy operandum jest dezaktywowane; np. dźwignia jest zwolniona lub szturchnięcie nosem zostaje wysunięte, próg limitu czasu sesji (krok 4.4.9.4) jest resetowany. Rysunek 2 przedstawia wszystkie przejścia zaprogramowane dla "S2 – Odpowiadanie na żądanie ściągnięcia".

Rysunek 2. Reprezentatywny przykład programowania #2. W tym przypadku stan jest wybierany na podstawie jednego z dwóch kryteriów. L$ to harmonogram współczynnika progresywnego utworzony w kroku 4.3. Po zakończeniu harmonogramu stan wychodzi do stanu 3 (S3). Należy zauważyć, że to kryterium nie ma litery R, co pozwala harmonogramowi na przesuwanie się, a nie rozpoczynanie od nowa przy każdym ponownym wejściu w ten stan. Stan może również zakończyć się po '$' minutach, aby określić FIN. Jest to z góry określony próg limitu czasu, po przekroczeniu którego sesja zostanie zakończona, jeśli w tym oknie nie wystąpi żadna odpowiedź. Jest to wyjaśnione w dalszej części dyskusji. Na koniec próg limitu czasu sesji jest resetowany przy każdym wydaniu operandum. Zatem "[1]" oznacza zwolnienie operandum "1".

9. Podświetl "S3 – Wzmocnienie PR i wskazówka".
   1. Wybierz opcję "Dodaj godzinę przejścia do"
   2. Wprowadź odpowiedni czas i jednostki, aby dostarczyć wzmocnienie ($), a następnie wybierz "S4" z listy rozwijanej DO S.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie czasowe może mieć odczyt podobny do [After $ seconds GO P = 100%, TO S4].
10. Podświetl "S4 – Limit czasu".
    1. Wybierz opcję Dodaj "Godzina przejścia do"
    2. Wprowadź odpowiedni czas i jednostki, aby pozostać w stanie nieaktywnym ($) po dostarczeniu wzmacniacza, a następnie wybierz "S2" z listy rozwijanej DO S.
       Uwaga: Utworzone zdarzenie czasowe może mieć podobny odczyt jako [After $ seconds GO P = 100%, TO S2]. Stan "S4 – Limit czasu" może nie być wymagany dla wszystkich wzorów.
11. Wybierz pozycję resolve states.
    Uwaga: Ten protokół jest teraz gotowy do uruchomienia.

Wyniki

Tutaj ilustrujemy przykłady wyników, które można uzyskać za pomocą powyższej procedury. Najpierw pokazano typowy obszar, który jest transfekowany przez wektory wirusowe (ryc. 3). Ogólnie rzecz biorąc, w tkance prążkowia uzyskuje się transfekowaną objętość ~1^mm3. Objętość transfekowanego regionu można określić ilościowo na różnych odcinkach szeregowych przy użyciu metody Cavalieriego. ³² Co ważne, objętość transfekowana zależy od wielu czynników, takich jak rodzaj transfekowanej tkanki; serotyp wirusa; promotor; szybkość i objętość wstrzykiwania; liczba wstrzykniętych cząstek; wstrzykiwać pH; oraz czy użyto odczynników hiperosmolarnych, takich jak mannitol. ^33,34 Zazwyczaj mikroiniekujemy 10¹² cząstek/ml, 1 μl/stronę przez 10 minut i pozostawiamy dodatkowe 7 minut przed wymianą obturatorów. Dodatkowo, wstrzyknięcie ma zwykle pH około 8. Następnie pokazujemy, że motywacją można manipulować za pomocą ekspresji transgenu (ryc. 4) lub mikroiniekcji odczynnika farmakologicznego (ryc. 5).

Na rysunku 4 wyraziliśmy receptor projektanta aktywowany wyłącznie przez (DREADDs). Po regionie kodującym receptor DREADD nastąpiło wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu i kaseta mCytryna. mCitrine umożliwia wygodną wizualizację transfekowanych komórek. DREADD sprzężono z heterotrimerycznym białkiem G Gαq. Aktywacja DREADD sprzężonego z Gαq może stymulować ^{astrocyty,28,35} a sam DREADD może być aktywowany przez ogólnoustrojowe podawanie N-tlenku klozapiny (CNO, 3 mg / kg, i.p). ^14,22,36 szczurów zostało przeszkolonych w zakresie reagowania dźwignią na wzmocnienie etanolem, gdzie 3 naciśnięcia dźwigni dawały 1 szansę na picie podczas codziennych 1-godzinnych sesji przez 60 kolejnych dni. Następnie szczury zostały zmuszone do abstynencji, a DREADD sprzężone z Gαq ulegały ekspresji w jądrze półleżącym w astrocytach rdzeniowych. Po 3 tygodniach abstynencji motywację do samodzielnego podawania etanolu mierzono za pomocą punktu granicznego. ^21,27-30 Aktywacja astrocytów rdzeniowych jądra półleżącego, poprzez ogólnoustrojowe podawanie CNO, zmniejszyła motywację szczurów do wznowienia samodzielnego podawania etanolu po abstynencji w porównaniu z nośnikiem. Co ważne, CNO nie miało wpływu na równie wyszkoloną kohortę, w której stwierdzono ekspresję białka zielonej fluorescencji zamiast DREADD.

Rysunek 3. Reprezentatywny brzuszny obszar prążkowia transfekowany wirusem mikroiniekowanym. Obraz ten ilustruje obszar astrocytów jądra półleżącego, które zostały transfekowane zgodnie z powyższą metodą. Dane są przedrukowane z Bull et ^al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegółowe informacje można znaleźć w tej publikacji oraz w towarzyszących jej materiałach uzupełniających. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Motywacja szczurów do samodzielnego podawania etanolu została zmniejszona przez aktywację transgenu, który ulegał nadmiernej ekspresji w jądrze półleżącym astrocytach rdzeniowych. Wirusowi wstrzyknięto mikroiniekcję, a motywację mierzono za pomocą punktu przerwania po upływie tygodnia na ekspresję wirusa. Ekspresja transgenu była receptorem projektanta aktywowanym wyłącznie przez (DREADDs). Jednoczynnikowa ANOVA (F(2,30)=3,29, p=0,04), po której nastąpiło post-hoc Scheffé, ujawniła, że aktywacja DREADD przez ogólnoustrojowe podawanie N-tlenku klozapiny (CNO, 3 mg / kg, ip) znacznie zmniejszyła motywację szczurów do samodzielnego podawania etanolu po abstynencji w porównaniu z CNO na nośniku, nie miała wpływu w równie wyszkolonej kohorcie, która wykazywała ekspresję białka zielonej fluorescencji (GFP) zamiast DREADD. Dane są przedrukowane z Bull et ^al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegółowe informacje można znaleźć w tej publikacji oraz w towarzyszących jej materiałach uzupełniających.

Rysunek 5. Mikroiniekcja blokerów połączeń szczelinowych zwiększyła motywację szczurów do samodzielnego podawania etanolu po abstynencji. Oceniono wpływ dwóch blokerów połączeń szczelinowych na motywację (mierzoną za pomocą punktu przerwania) szczurów do samodzielnego podawania etanolu: meflochinę i kwas 18-α-glicyretynowy (18-α). Dwukierunkowa ANOVA ujawniła, że mikrowstrzyknięcie blokerów połączeń szczelinowych do jądra półleżącego zwiększyło motywację szczurów do samodzielnego podawania etanolu po abstynencji (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Dane są przedrukowane z Bull et ^al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegółowe informacje można znaleźć w tej publikacji oraz w towarzyszących jej materiałach uzupełniających.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj procedura jest skutecznym sposobem wytwarzania kaniul do mikroiniekcji i mikroiniektorów, które pomogą w wyjaśnieniu molekularnych substratów motywowanego zachowania. Ta metoda ma kilka zalet. Po pierwsze, dzięki produkcji własnych implantów i mikroiniektorów można szybko zoptymalizować nowe parametry eksperymentalne; Oznacza to, że nie trzeba czekać na przybycie komponentów wykonanych na zamówienie. Po drugie, ze względu na małą średnicę kaniuli, można jednocześnie wszczepić więcej kaniuli. Skraca to wymagany czas operacji, co może poprawić przeżywalność, a także pozwala na wszczepienie wielu implantów na zwierzę. Po trzecie, oprogramowanie używane do sterowania komorami operacyjnymi z łatwością dostosowuje się do progresywnych harmonogramów proporcji, ponieważ paradygmat stałego współczynnika można szybko przekształcić w paradygmat współczynnika progresywnego, po prostu stosując listę parametrów przejścia zdarzenia, która zawiera żądany harmonogram zbrojenia.

Aby zapewnić szerokie zastosowanie, przedstawiono ogólną procedurę mikroiniekcji, która powinna mieć szerokie zastosowanie w przypadku mikroiniekcji prawie każdego obecnie dostępnego odczynnika. W związku z tym przewidujemy, że technika ta będzie nadal miała podobnie wysoką użyteczność w przyszłości, z niewielkimi modyfikacjami. Zmieniając tylko kilka zmiennych, podejście to można zastosować do szerokiej liczby odczynników. Parametry, które najczęściej byłyby manipulowane, obejmują długość, na jaką mikroiniektor wystaje z kaniuli, objętość wstrzyknięcia i szybkość wstrzyknięcia. Na przykład można chcieć, aby wstrzykiwacz wystawał dalej od końcówki kaniuli, aby uniknąć blizny glejowej, która zwykle tworzy się wokół przewlekłych implantów. Dodatkowo można wstrzyknąć większą objętość. W przypadku mikroiniekcji wirusa prążkowia zwykle stosuje się objętość 1 μl, która jest zwykle wstrzykiwana przez dłuższy czas (często 7 – 10 minut plus 3 – 10 minut dodatkowy czas dyfuzji) w porównaniu z tą stosowaną w przypadku odczynników farmakologicznych (zwykle 0,3 – 0,5 μl w ciągu 2 – 3 minut plus 1 – 3 minuty dodatkowy czas dyfuzji). Użytkownik powinien zapoznać się z literaturą i/lub empirycznie określić parametry najlepiej dopasowane do swoich potrzeb. Niezależnie od tego, sukces tej procedury zależy krytycznie od 4 zmiennych: 1) długości kaniuli, 2) długości mikrowtryskiwacza, 3) jakości wzoru rozpylania mikroiniektora oraz 4) integralności systemu przed wstrzyknięciem. Ponieważ miejsce mikroiniekcji zależy od głębokości, na jaką mikroiniektor wystaje z kaniuli, konieczne jest, aby zarówno kaniule (krok 1.2.8), jak i długość mikroiniektora (po zgięciu, krok 2.2.1) były dokładnie znane i jednolite u wszystkich badanych. Można to łatwo kontrolować, łatwo odrzucając wszelkie narzędzia, które nie mają wymaganej długości podczas końcowego ponownego pomiaru. Co więcej, miejsce wstrzyknięcia można przewidzieć tylko wtedy, gdy występuje ono bezpośrednio pod kaniulą prowadzącą. W związku z tym każdy mikrowtryskiwacz, który nie rozpyla długiego, drobnego strumienia podczas badania (kroki 2.4.6), powinien zostać odrzucony. Wtrysk wysokiej jakości jest również związany z integralnością systemu przed wtryskiem. Jeśli po wylaniu całej wody z wtryskiwacza (przed napełnieniem odczynnikiem) na chusteczce laboratoryjnej zaobserwuje się wiele plam, należy usunąć wyciek (Uwaga dotycząca kroku 2.4.8). Ponadto, jeśli pęcherzyk (krok 2.4.9), który oddziela lek od wody w rurki PE20, nie jest jedną, pojedynczą pęcherzyką (po napełnieniu mikrowtryskiwacza odczynnikiem), oznacza to, że wtryskiwacz jest częściowo zatkany. To zatorowanie może uniemożliwić lub przekierować wstrzyknięcie. Temu również można łatwo zaradzić (uwaga dotycząca kroku 2.4.8).

Jeśli ktoś chce dokonać mikroiniekcji, gdy zwierzę znajduje się w ramie stereotaktycznej, istnieją trzy możliwości. Po pierwsze, można zwiększyć długość kołnierza mikrowtryskiwacza tak, aby mógł być mocno trzymany przez manipulator stereotaktyczny, a także rozciągał się wystarczająco daleko, aby umożliwić podłączenie do rurki PE20. Po drugie, można by tymczasowo wszczepić kaniulę i użyć prezentowanego tutaj standardowego mikroiniektora. Po trzecie, można użyć pipet z ciągnionego i polerowanego szkła. ^{Pytania z dnia 16,17} na dzień

Istotnym ograniczeniem przedstawionej tutaj procedury jest to, że najlepiej przeprowadzić ją u dobrze traktowanych szczurów, które są zaznajomione z procedurą. Szczury wykorzystane do danych opisanych w sekcji wyników nie wymagały specjalnych procedur obchodzenia się ze szczurami, ponieważ ten sam badacz zajmował się szczurami codziennie przez ponad 2 miesiące. Obejmowało to codzienną obserwację i manipulację implantem chirurgicznym przez co najmniej 2 tygodnie. Jednak szczury mogą być szybko przyzwyczajone do wielu technik, które są używane przed testem hamowania impulsów, na który może mieć wpływ stres. Te specjalne techniki habituacji zostały już wcześniej szczegółowo opisane. ⁴³ Poza tymi procedurami zaleca się, aby szczury były przyzwyczajone do procedury mikroiniekcji, w której podczas iniekcji "pozorowanych" stosuje się skrócone mikroiniekcje. Podczas tych pozorowanych iniekcji bardzo ważne jest, aby mikrowstrzykiwacz nie wystawał w tkankę, aby ograniczyć uszkodzenie tkanki. Innymi słowy, mikrowtryskiwacz powinien być wygięty nie dłużej niż 14 mm. W związku z tym dokładne przyzwyczajenie wymagane do optymalnego wdrożenia tej techniki może być postrzegane jako ograniczenie.

Chociaż istnieje kilka paradygmatów behawioralnych do pomiaru motywacji, współczynnik progresywny jest powszechnie używany do ilościowego określenia wysiłku, jaki podmiot jest skłonny włożyć, aby uzyskać wzmacniacz. Paradygmat stosunku progresywnego tworzy miarę znaną jako punkt przerwania, który jest często definiowany jako maksymalna liczba naciśnięć dźwigni w ostatnim zakończonym stosunku; tj. maksymalna reakcja, która wygenerowała wzmocnienie. ²¹ Współczynnik progresywny jest wrażliwy na wielkość wzmocnienia. Na przykład wyższe dawki kokainy (lub sacharozy) dają wyższy punkt graniczny, a niższe dawki kokainy (lub sacharozy) dają niższy punkt graniczny. ^21,22 W związku z tym punkt przerwania jest rutynowo używanym wskaźnikiem zastępczym dla motywacji i/lub wzmacniania skuteczności. ^21,23-26 Ponieważ intencją punktu przerwania jest określenie, kiedy zwierzę przestaje reagować, ważnym parametrem paradygmatu progresywnego współczynnika jest długość sesji. Skończone długości sesji mogą nakładać fałszywy limit na wartości punktów przerwania, a sytuacja ta może być nasilona przez zabiegi wstępne, które nienormalnie zmniejszają tempo samodzielnego podawania lub zwiększają pauzy po wzmocnieniu. To zamieszanie można przezwyciężyć na wiele sposobów; Np. sesje, które kończą się, gdy zwierzę wstrzymało odpowiedź o pewną wielokrotność średniego odstępu między infuzjami. ⁴⁴ Częściej stosowanym wariantem tego podejścia jest przerywanie sesji po wstrzymaniu odpowiedzi przez pewną empirycznie określoną wartość, która jest niezmienna u wszystkich badanych. Metodę zastosowania tego podejścia przedstawiliśmy w kroku 4.4.9.11.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurka kaniuli	Amazon Supply / Małe części	HTXX-26T-60	26 G, Hypotube S / S 316-TW 26GA
Obturator	Amazon Supply / Małe części	GWXX-0080-30-05	33 gauge, drut S / S 316LVM 0,008 IN
Drut mikroiniektora	MicroGroup	33RW 304	33 gauge
Super Glue	Loctite	3924AC	Płyn, nieżelowy, może być sterylizowany
w autoklawiePlastikowa rurka do mikrowtryskiwaczy	Becton Dickson	427406	PE20
Średnia waga Hemostats	World Precision Instruments	501241-G
Linijka	Fisher	09-016	150 mm
#7 Kleszcze	Stoelting	52100-77	Dumont, Dumostar
Narzędzie obrotowe	Dremmel	285	Dwubiegowa
tarcza tnąca	McMaster Carr	3602	15/16 "x 0,025"
Pompa mikroiniekcyjna	Aparat Harvard	PhD 2000
1 ul Szklana strzykawka	Hamilton	7001KH	Styl igły: 25s / 2,75 "/ 3
aplikator z bawełnianą końcówką	Fisher	23-400-101
Chusteczki laboratoryjne	Kimwipes	34133
Oprogramowanie operacyjne	Coulbourn	Graficzne Państwowe
Izby Operacyjne	Coulborun	Habitest