Artykuł metodologiczny

Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania

16.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53018

⸱

16 września 2015

 ,  ,  , 
1Virginia Institute for Psychiatric and Behavioral Genetics, Department of Psychiatry, Virginia Commonwealth University School of Medicine, 2Institute for Drug and Alcohol Studies, Departments of Psychiatry, Pharmacology, and Neuroscience, Virginia Commonwealth University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Gryzonie są odpowiednim modelem do badania molekularnych substratów zachowania i złożonych zaburzeń psychicznych. Mikroiniekcja mózgu u obudzonych gryzoni może być wykorzystana do wyjaśnienia substratów chorobowych. Przedstawiono skuteczną i konfigurowalną metodę mikroiniekcji mózgu, a także wykonanie paradygmatu instrumentalnego, który określa ilościowo motywację.

Streszczenie

Mikroiniekcja mózgu może pomóc w wyjaśnieniu molekularnych substratów złożonych zachowań, takich jak motywacja. W tym celu gryzonie mogą służyć jako odpowiednie modele, częściowo dlatego, że reakcja na bodźce istotne behawioralnie i obwody analizujące wyniki działania bodźca są zadziwiająco podobne między ludźmi a gryzoniami. W badaniu molekularnych substratów złożonych zachowań, mikroiniekcja odczynników, które modyfikują, rozszerzają lub wyciszają określone systemy, jest nieocenioną techniką. Bardzo ważne jest jednak, aby miejsce mikroiniekcji było precyzyjnie ukierunkowane, aby ułatwić interpretację wyników. Przedstawiamy metodę produkcji narzędzi chirurgicznych i igieł do mikroiniekcji, która umożliwia dokładne mikroiniekcje i nieograniczone możliwości dostosowywania przy minimalnych kosztach. Co ważne, technika ta może być z powodzeniem wykonywana u obudzonych gryzoni, jeśli jest przeprowadzana w połączeniu z innymi artykułami JoVE, które obejmowały wymagane zabiegi chirurgiczne. Ponadto istnieje wiele paradygmatów behawioralnych, które dobrze nadają się do pomiaru motywacji. Współczynnik progresywny jest powszechnie stosowaną metodą, która określa ilościowo skuteczność wzmacniacza w utrzymaniu reakcji pomimo (często wykładniczo) rosnącego zapotrzebowania na pracę. Test ten jest wrażliwy na wielkość wzmacniacza i manipulacje farmakologiczne, co pozwala na określenie skuteczności wzmocnienia i / lub motywacji. Przedstawiamy również proste podejście do programowania oprogramowania operacyjnego w celu dostosowania do harmonogramu zbrojenia o progresywnym współczynniku.

Wprowadzenie

Gryzonie i ludzie reagują w niezwykle podobny sposób na bodźce behawioralne1-3. Sugeruje to, że gryzonie są odpowiednimi obiektami do wyjaśnienia molekularnych substratów zachowania izłożonych schorzeń psychicznych4. Zrozumienie molekularnych substratów złożonych procesów behawioralnych, takich jak motywacja, często wymaga mikroiniekcji do mózgu. Przedstawiona zostanie tu zarówno technika mikroiniekcji mózgu, jak i test motywacji pierwotnej. Szczury będą wykorzystywane jako obiekty, ale procedury te można łatwo dostosować do dobrze traktowanych myszy. Niniejszy dokument obejmuje procedury wytwarzania wymaganych kaniul, obturatorów (atrap kaniul lub styletów) oraz mikroiniektorów. Przedstawiona metoda jest znacznie bardziej elastyczna i bardziej opłacalna niż narzędzia prefabrykowane. Ta elastyczność okaże się cenna przy optymalizacji warunków. Co ważne, ponieważ procedura mikroiniekcji może być wykorzystana do przetestowania niezliczonej ilości hipotez; Przedstawione tu techniki powinny mieć szerokie zastosowanie. Na przykład ligandy receptorowe mogą być mikrowstrzykiwane, aby zrozumieć neurochemię3,5,6; Peptydy przepuszczalne dla komórek i małe cząsteczki mogą być mikrowstrzykiwane w celu zrozumienia wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych7-10; Toksyny, blokery kanałów jonowych lub koktajle antagonistów mogą być mikrowstrzykiwane, aby zrozumieć obwody1,11,12.

Podczas gdy przedstawiony tutaj ogólny protokół może być łatwo dostosowany przez użytkownika do jego konkretnych potrzeb, procedura ta jest szczególnie dobrze dostosowana do testów behawioralnych, ponieważ mikroiniekcja występuje u obudzonych gryzoni, które są tylko pod łagodnym ograniczeniem ręki. Nie jest wymagane znieczulenie ani specjalne ograniczenia. Jest to możliwe, ponieważ sam mózg nie odczuwa bólu. Jeśli jednak znieczulenie nie jest stosowane, mikroiniekcja musi odbywać się przez kaniule, które zostały wcześniej wszczepione stereotaktycznie. Dzieje się tak, ponieważ nocyceptory są obecne na skórze głowy, oponach mózgowych13, które są błonami otaczającymi mózg, oraz okostnej14, która jest błoną pokrywającą czaszkę. Należy zauważyć, że czasami pożądane jest mikroiniekcja w znieczuleniu. Jednym z przykładów jest sytuacja, w której wirus jest wstrzykiwany i można chcieć wstrzyknąć wirusa bezpośrednio za pomocą igieł ze stali nierdzewnej15 lub szklanych pipet, ponieważ może to zmniejszyć uszkodzenie tkanek i poprawić wydajność transdukcji. 16,17 Opisane poniżej mikroiostrzykacze mogą być w tym celu modyfikowane, a sugestie, jak to zrobić, można znaleźć w Dyskusji. Ponieważ inne artykuły JoVE wykazały stereotaktyczną implantację kaniuli mózgowej,18-20 procedury te nie zostaną tutaj omówione.

Prezentujemy te procedury mikroiniekcji razem z testem, który określa ilościowo motywację. Obecnie stosowanych jest kilka modeli umotywowanych zachowań u gryzoni, takich jak boks pasa startowego i skalowanie bariery. W tym miejscu opisujemy, jak używać harmonogramu wzmocnienia opartego na progresywnym współczynniku instrumentalnym do ilościowego określenia motywacji, w której reakcja instrumentalna jest utrzymywana przez wzmacniacz. Reakcja na współczynnik progresywny reaguje na wielkość wzmocnienia. 21,22 W związku z tym test ten jest rutynowo stosowany jako wskaźnik zastępczy dla motywacji i/lub wzmacniania skuteczności. 21,23-30 Ponieważ kilka doskonałych recenzji szczegółowo omówiło ten temat,21,24 skupimy się głównie na kwestiach praktycznych.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Virginia Commonwealth University i są zgodne z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

1. Przygotowanie narzędzi przed operacją i mikroiniekcją

  1. Przygotowanie do przygotowania materiałów:
    1. Przygotować rurki kaniulowe 26 G, drut obturatora 33 G, rurki igieł do mikroiniekcji 33 G, plastikowe rurki do mikroinjektora (PE20 lub odpowiednik), dwa proste kleszczyki hemostatyczne o średniej wadze, taśmę laboratoryjną, linijkę, marker permanentny, 70% etanol (v/v), fiolki do przechowywania (np. szklane fiolki scyntylacyjne 20 ml), superglue, małe łódeczki wagowe oraz narzędzie rotacyjne wyposażone w lekką tarczę tnącą.
      Uwaga: Pomocne jest przymocowanie narzędzia rotacyjnego do pudełka na końcówki pipet za pomocą pasków lub taśmy, co podnosi narzędzie. Podczas korzystania z narzędzia rotacyjnego ważne jest stosowanie ochrony oczu w celu uniknięcia obrażeń.
    2. Przykleić kawałek taśmy laboratoryjnej lub autoklawacyjnej do blatu.
  2. Przygotowanie kaniul:
    Uwaga: Do iniekcji obustronnej wymagane są co najmniej dwie kaniule na szczura. Jedna dodatkowa kaniula zostanie wykorzystana w kolejnym kroku.
    1. Odciąć fragment rurki kaniulowej o długości wystarczającej, aby uniknąć zgięcia podczas procesu znakowania i cięcia.
    2. Narysować cienkopisem linię referencyjną o długości 15 mm na taśmie z kroku 1.1.2. Będzie ona służyć jako prowadnica do wyznaczania kolejnych sekcji o długości 15 mm na rurce za pomocą ostrego markera permanentnego.
    3. W wyznaczonych punktach dotknąć rurki kaniulowej powoli obracającej się tarczy tnącej narzędzia rotacyjnego, aby naciąć rurkę. Obrócić kaniulę o 180˚ i naciąć przeciwległą stronę rurki. Nie należy przeciąć rurki całkowicie, ponieważ może to doprowadzić do niedrożności.
    4. Gwałtownie zgiąć rurkę, aby przełamać ją na sekcje o długości ~15 mm.
    5. Przytrzymać każdy przecięty koniec kaniuli prostopadle do tarczy tnącej między kciukiem a palcem wskazującym. Obracać rurkę kaniulową, dotykając końcówki do dużej przedniej powierzchni tarczy tnącej (tzn. nie do krawędzi). Pozwoli to uzyskać stępiony koniec. Uwaga: Nie wolno zginać kaniuli, ponieważ może to spowodować iniekcję poza docelowym obszarem.
    6. Przeczyścić oba końce kaniuli ściętą igłą 26 G (brązowy stożek), aby upewnić się, że wszystkie zadziory zostały usunięte, a kaniula jest drożna.
    7. Przeciągnąć próbkę drutu obturatora odciętego na długość ~35 mm przez przeciętą kaniulę, aby sprawdzić, czy nie ma wewnętrznych przeszkód.
    8. Pobrać każdą kaniulę pojedynczo za pomocą niezaciśniętych kleszczyków hemostatycznych i zmierzyć każdą gotową kaniulę linijką, aby upewnić się, że ma ona dokładnie 14 mm długości.
  3. Przygotowanie obturatorów:
    1. Zaciśnąć kaniulę w połowie długości za pomocą prostego kleszczyka hemostatycznego o średniej wadze. Położyć zaciśnięty kleszczyk na blacie. Kaniula powinna być prostopadła do blatu.
      Uwaga: Kaniula ta nie powinna być używana w chirurgii po zaciśnięciu kleszczykiem, ponieważ prawdopodobnie jest zgięta.
    2. Wprowadzić jeden koniec drutu obturatora do kaniuli, aż dotrze on do blatu. Poruszać drutem w kaniuli, aby upewnić się, że zadziór nie blokuje dostępu do blatu, tzn. do dna kaniuli. Odpowiednia długość obturatora zapobiega zatykaniu się i dodatkowemu bliznowaceniu tkanek.
    3. Zgiąć drut, ściskając go palcami, aż zostanie osiągnięty kąt ~30˚, zachowując kontakt między obturatorem a blatem. Upewnić się, że kąt zgięcia jest taki, aby przylegał on do nakrętki głowicy, a nadmiar był skierowany do przodu, co utrudni zwierzęciu jego usunięcie.
    4. Wyjąć drut z kaniul i odciąć nadmiar w odległości ~2,5 mm od zgięcia za pomocą małych cążek bocznych (obcinaczy do drutu).
      Uwaga: Do iniekcji obustronnej wymagane będą co najmniej dwa obturatory na szczura, ponieważ każda wszczepiona kaniula wymaga obturatora. Wykonanie dodatkowego zgięcia o ~35˚ w połowie obturatora pomoże również zapobiec jego usunięciu przez zwierzę. Przechowywać kaniule i obturatory w osobnych fiolkach (np. szklanych fiolkach scyntylacyjnych 20 ml) zawierających 70% etanol (v/v) do czasu użycia, ale przez co najmniej jedną noc (O/N).
  4. Przygotowanie i testowanie mikroinjektorów:
    1. Odciąć fragment rurki igły do mikroiniekcji o długości ~1 m.
    2. Przytrzymać jeden koniec rurki do mikroiniekcji prostopadle za pomocą zaciśniętych prostych kleszczyków hemostatycznych.
    3. Obracać kleszczyk, napinając rurkę, aby ciasno owinąć ją wokół kleszczyka co najmniej raz.
    4. Odmierzyć 32 mm od przeciwległego, wolnego końca rurki do mikroiniekcji, chwycić ten punkt prostopadle drugim prostym kleszczykiem hemostatycznym o średniej wadze i go zaciśnąć. Chwycić rurkę kleszczykami po stronie znaku 32 mm najbliżej wolnego końca, a nie po stronie najbliżej kleszczyka z nawiniętym drutem.
    5. Zginać rurkę w przód i w tył, utrzymując napięcie, aż pęknie.
      Uwaga: Pojedyncze, gwałtowne zgięcie w górę i w dół spowoduje czyste pęknięcie, co jest pożądane, aby zapewnić, że mikroiniekcja nastąpi w wybranym obszarze mózgu.
    6. Obejrzeć rurkę do mikroiniekcji, aby upewnić się, że oba końce są proste, a średnica wewnętrzna jest drożna.
    7. Przygotować rurkę kaniulową, która posłuży do wykonania kołnierza mikroinjektora.
    8. Odmierzyć i zaznaczyć kolejne sekcje o długości 5 mm rurki kaniulowej za pomocą markera permanentnego i linii referencyjnej 5 mm narysowanej na taśmie (krok 1.1.2).
      Uwaga: Każdy mikroinjektor wymaga jednego kołnierza. Kołnierze to po prostu krótkie kaniule przyklejone do drutu mikroinjektora.
    9. W zaznaczonych punktach dotknąć rurki kaniulowej powoli obracającej się tarczy tnącej narzędzia rotacyjnego, aby naciąć rurkę. Obrócić kaniulę o 180˚ i naciąć przeciwległą stronę rurki. Całkowite przecięcie może spowodować niedrożność rurki.
    10. Gwałtownie zgiąć rurkę kołnierza mikroinjektora, aby przełamać ją na sekcje o długości ~5 mm.
    11. Przeczyścić średnicę wewnętrzną obu końców kołnierza ściętą igłą 26 G (brązowy stożek), aby upewnić się, że większość zadziorów została usunięta. Niektóre małe zadziory pomogą utrzymać drut mikroinjektora i tym samym ułatwią klejenie.
    12. Nasunąć jeden kołnierz na każdą rurkę mikroinjektora w odległości ~2 cm od końca.
    13. Przygotować małą kroplę superglue w rogu małej łódeczki wagowej.
    14. Użyć skrawka rurki kaniulowej odciętego na ~25 mm, aby nanieść niewielką ilość superglue na rurkę mikroinjektora w odległości ~5 mm od jednego z końców. Następnie nasunąć kołnierz na tę kropelkę superglue tak, aby znajdował się ~1 mm od końca rurki do mikroiniekcji. Pokryć oba końce kołnierza klejem.
      Uwaga: Należy unikać dużego nagromadzenia superglue na kołnierzu, ponieważ uniemożliwi to uszczelnienie plastikowej rurki wokół mikroinjektora. Choć ważne jest, aby nie dopuścić do przedostania się superglue do otwartego końca rurki mikroinjektora, gdyż uczyni to mikroinjektor bezużytecznym, równie ważne jest nasunięcie kołnierza jak najbliżej końca, aby zminimalizować objętość martwą (nieiniekcyjną).
    15. Oprzeć gotowy mikroinjektor o zewnętrzną ściankę innej małej łódeczki wagowej kołnierzem do góry i pozostawić do wyschnięcia na 24 h.
    16. Przygotować kawałek plastikowej rurki do mikroinjektora (PE20 lub odpowiednik) o długości ~8 cm, strzykawkę 1 ml wypełnioną wodą sterylną oraz ściętą igłę 26 G (brązowy stożek).
    17. Zamocować igłę 26 G (brązowy stożek) do strzykawki i nasunąć przeciętą rurkę na igłę, uważając, aby nie przebić rurki.
    18. Nasunąć plastikową rurkę na koniec z kołnierzem wysuszonego, kompletnego mikroinjektora.
    19. Nacisnąć tłok strzykawki wypełnionej wodą, aby sprawdzić drożność.
      Uwaga: Woda powinna tryskać bardzo daleko i prosto z końcówki mikroinjektora. Jeśli strumień nie jest prosty, miejsce iniekcji będzie niewłaściwe. Przyczyną strumienia bocznego lub rozproszonego jest niewłaściwe pęknięcie (krok 1.4.5). Mikroinjektora nie należy używać, jeśli strumień jest boczny lub rozproszony. Nie należy używać soli fizjologicznej, ponieważ może ona zapchać mikroinjektor lub igłę.
    20. Cofnąć tłok strzykawki, aby usunąć wodę z mikroinjektora. Przechowywać w suchej, szczelnej fiolce; np. szklanej fiolce scyntylacyjnej 20 ml.
      Uwaga: Mikroinjektory mogą być autoklawowane po wykonaniu z większości rodzajów superglue,31 jednak musi to zostać sprawdzone empirycznie. Alternatywne techniki sterylizacji obejmują tlenek etylenu i naświetlanie gamma.

2. Przygotowanie i przeprowadzanie mikrowstrzykiwań

  1. Przygotować gotowe mikrostrzykawki, plastikowe rurki do mikroiniekcji (PE20 lub odpowiednik), pompę do mikroiniekcji, dwie małe łódki wagowe, wodę sterylną, etanol 70% (v/v), aceton, dwie szklane strzykawki gazoszczelne o objętości 1 μl z tępą igłą (25 G), drewniane aplikatory z watową końcówką, zapasowe obturatory, strzykawki 1 ml, igłę 26 G (brązowy piast), małą pęsetę zakrzywioną (zalecany typ nr 7) oraz chusteczki laboratoryjne.
  2. Przygotowanie mikrostrzykawek do iniekcji:
    1. Zgiąć gotową mikrostrzykawkę 15 mm od końca przeciwległego do kołnierza w taki sposób, aby kąt między nimi wynosił ~95˚.
      Uwaga: Precyzyjne miejsce zgięcia jest niezbędne dla prawidłowego rozmieszczenia miejsca iniekcji. Przydatne jest użycie pęsety nr 7 (lub podobnej) do uchwycenia mikrostrzykawki i zgięcia jej ku górze. Zawsze należy ponownie zmierzyć długość przed wykonaniem mikroiniekcji.
    2. Odciąć plastikową rurkę (PE20) na długość ~70 cm i nasunąć ją na kołnierz mikrostrzykawki.
      Uwaga: Przytwierdzenie znaczników z taśmy do jednej rurki plastikowej w pobliżu mikrostrzykawki oraz wolnego końca jest pomocne podczas wykonywania iniekcji, szczególnie przy podawaniu dwóch różnych roztworów. Nie zaleca się stosowania znaczników na obu rurkach, ponieważ stają się one uciążliwe podczas iniekcji.
  3. Przygotowanie pompy do mikroiniekcji:
    1. Włączyć pompę.
    2. Ustawić średnicę igły do mikroiniekcji, żądaną szybkość infuzji oraz docelową objętość iniekcji.
      Uwaga: Szybkość infuzji i objętość iniekcji zależą od wymagań eksperymentalnych. Jest to szczegółowo omówione w sekcji Dyskusja. Niektóre pompy mają wgrane tabele strzykawek. Jeśli nie, tabelę strzykawek można znaleźć na stronie internetowej producenta.
    3. Ustawić tryb pompy na „Volume”, aby precyzyjna objętość była podawana automatycznie. Jeśli zamiast tego wybrany zostanie tryb „Pump”, eksperymentator musi zatrzymać pompę ręcznie.
    4. Wyregulować ogranicznik pompy, aby strzykawka mogła zostać napełniona do objętości iniekcji plus dodatkowe 0.2 μl.
  4. Przygotowanie strzykawki do mikroiniekcji i mikrostrzykawki do iniekcji:
    1. Zablokować każdą gazoszczelną strzykawkę do mikroiniekcji w uchwycie pompy do mikroiniekcji.
    2. Umieścić końcówkę gazoszczelnej strzykawki w wodzie sterylnej znajdującej się w małej łódce wagowej i delikatnie poruszać tłokiem, aby nasmarować wewnętrzny drut. Równomiernie odsunąć tłok do ogranicznika pompy, aby napełnić strzykawkę wodą.
    3. Nasunąć rurkę PE20 połączoną z mikrostrzykawką (w kroku 2.2) na igłę 26 G (brązowy piast) przymocowaną do strzykawki 1 ml napełnionej wodą sterylną. Przetłoczyć wodę sterylną przez mikrostrzykawkę, a następnie sprawdzić wzór i zasięg strumienia.
      Uwaga: Woda powinna pryskać bardzo daleko i prosto z końcówki mikrostrzykawki. Jeśli strumień nie jest prosty, miejsce iniekcji będzie nieprawidłowe.
    4. Umieścić wysterylizowaną mikrostrzykawkę na sterylnym polu.
    5. Zsunąć rurkę z igły, trzymając rurkę mikrostrzykawki pionowo, aby zapobiec wyciekaniu wody, jednocześnie odcinając rurkę poniżej obszaru uszkodzonego przez igłę.
    6. Przesunąć tłok strzykawki do mikroiniekcji lekko do przodu, aby utworzyć kropelkę na końcu igły, a następnie nasunąć napełnioną wodą rurkę PE20 (połączoną z mikrostrzykawką) na igłę.
      Uwaga: Stworzy to połączenie ciecz-ciecz, co zapewni odpowiednie ciśnienie wsteczne, które może usunąć zator, który mógłby powstać na końcówce mikrostrzykawki.
    7. Przesunąć tłok całkowicie do przodu, aby przygotować się do pobrania próbki i upewnić się, że w mikrostrzykawce nie pozostały ślady etanolu.
    8. Sprawdzić szczelność układu, wielokrotnie dotykając czystą chusteczką laboratoryjną kropelki wody utworzonej na końcówce mikrostrzykawki.
  5. Uwaga: Podczas dotykania chusteczki laboratoryjnej powinna powstać tylko jedna mokra plamka. Jeśli pojawia się więcej kropel, w systemie występuje nieszczelność.
  6. Unikać nieszczelności poprzez kontrolowanie aplikacji superglue (krok 1.4.14) oraz przycinanie rurki PE20 ostrymi nożyczkami lub żyletką za każdym razem, gdy rurka PE20 jest usuwana z jakiegokolwiek połączenia. Dodatkowo powtórzyć kroki od 2.4.3 do 2.4.8, aby usunąć nieszczelność.
  7. Cofnąć tłok strzykawki o 0.2 μl, tworząc pęcherzyk powietrza między wodą sterylną w rurce PE20/mikrostrzykawce a roztworem do wstrzyknięcia.
  8. Uwaga: Pęcherzyk ten zapobiega rozcieńczeniu wstrzykiwanego preparatu, zanieczyszczeniu wody i pozwala na monitorowanie procesu iniekcji, ponieważ będzie się on przesuwał podczas podawania. Powinien powstać pojedynczy, jednolity pęcherzyk. Jeśli pęcherzyk jest rozdzielony, występuje nieszczelność lub końcówka mikrostrzykawki jest niedrożna, co wskazuje na konieczność powtórzenia kroku 2.4.8 (oraz towarzyszącej mu uwagi).
  9. Umieścić mikrostrzykawkę w odczynniku do wstrzyknięcia i powoli odsunąć tłok strzykawki do ogranicznika.
  10. Przygotowanie zwierzęcia do iniekcji:
  11. Przytrzymać klatkę piersiową szczura przy klatce piersiowej eksperymentatora. Oczyścić obszar wokół kaniul aplikatorem watowym nasączonym 7em etanolu (v/v).
  12. Uwaga: Przy odpowiednim obchodzeniu się, myszy można delikatnie unieruchomić w zagłębieniu dłoni. W przeciwnym razie może być konieczne chwycenie za kark.
  13. Wyjąć obturatory za pomocą małej pęsety i umieścić je w łódce wagowej z etanolem 70% (v/v).
  14. Wykonywanie iniekcji:
  15. Umieścić napełnioną mikrostrzykawkę (krok 2.4.10) w kaniuli. Nacisnąć start w pompie do mikroiniekcji i monitorować ruch pęcherzyka.
  16. Uwaga: Może być konieczne wywieranie lekkiego nacisku, aby upewnić się, że mikrostrzykawki nie wysuwają się. Pęcherzyk (utworzony w kroku 2.4.9) powinien przesuwać się równomiernie i całkowicie wejść do mikrostrzykawki.
  17. Wyjąć mikrostrzykawki z kaniuli i włożyć z powrotem obturatory, gdy iniekcja zostanie zakończona, a czas dyfuzji po iniekcji upłynie.
  18. Uwaga: Typowy czas dyfuzji po iniekcji wynosi 2 – 4 min dla odczynników farmakologicznych oraz 2 – 10 min dla wirusów. Pozostawienie mikrostrzykawki podczas okresu poinfuzyjnego zapobiega cofaniu się wstrzykiwanego preparatu przez kaniule zamiast jego dyfuzji do tkanki. Umieścić obturatory z boku łódki wagowej wypełnionej etanolem, aby pozwolić etanolowi spłynąć przed ponownym włożeniem ich do kaniuli.

3. Oczyszczanie po wtryskiwaniu

  1. Przygotować po jednej małej fiolce z następującymi substancjami: wodą sterylną, 70% EtOH oraz acetonem.
  2. Czyszczenie mikroinjektora i strzykawki do mikroiniekcji:
    1. Wyjąć szklane strzykawki ze statywu pompy oraz rurki do mikroiniekcji ze szklanej strzykawki.
    2. Odłączyć rurkę mikroinjektora od szklanej strzykawki i za pomocą igły 26 G (brązowy stożek) podłączyć do niej strzykawkę 1 ml wypełnioną wodą sterylną. Przesunąć tłok strzykawki 1 ml do przodu, aby wypchnąć ok. 0.3 ml cieczy. Następnie dotknąć końcówki mikroinjektora do ręcznika laboratoryjnego i wciągnąć powietrze przez mikroinjektor.
      Uwaga: Mikroinjektor i rurki mogą być ponownie wykorzystane w podobnych eksperymentach, jeżeli zostanie to uznane za zasadne.
    3. Zanurzyć igłę szklanej strzykawki w wodzie sterylnej i całkowicie odciągnąć tłok. Następnie całkowicie wysunąć tłok, aby wypłukać strzykawkę. Dotknąć końcówki szklanej strzykawki do ręcznika laboratoryjnego, aby upewnić się, że nie pozostała w niej ciecz.
    4. Powtórzyć krok 3.2.3, używając wody sterylnej, powietrza, 70% EtOH i acetonu w następującej kolejności: woda sterylną, woda sterylna, powietrze, powietrze, 70% EtOH, 70% EtOH, powietrze, powietrze, aceton, aceton, powietrze, powietrze. Wykonanie wszystkich tych etapów czyszczenia pomoże zachować sprawność strzykawki do mikroiniekcji.
    5. Umieścić strzykawkę(i) do mikroiniekcji w opakowaniu i odciągnąć tłok do wartości 0.05 μl.
      Uwaga: Jest to istotne, ponieważ pozwala na przesuwanie tłoka w przód lub w tył w celu odblokowania go, jeśli po przechowywaniu utworzą się osady soli.

4. Programowanie testu motywacji

  1. Zaloguj się do programu Graphic State, używając uprawnień administratora.
  2. Wybierz lub utwórz odpowiednią bazę danych.
  3. Tworzenie harmonogramu wzmocnień o progresywnym stosunku:
    1. Wybierz Lists > Database Level Lists > Event Transition Parameter Lists.
    2. Wybierz „Add”. Wprowadź odpowiedni numer listy (L#) i opis.
    3. Wybierz „Add Events”.
    4. Wprowadź pierwszą wartość harmonogramu wzmocnień i wybierz „Add”. Powtórz czynność.
      Uwaga: Wartości można wyznaczyć za pomocą wzoru, w którym progresywny harmonogram wzmocnień = 5e (j*(reinforcer earned+1))-5.7 Aby dostosować to równanie do właściwego przetestowania hipotezy, wartość j musi zostać określona empirycznie lub pobrana z literatury.
    5. W polu „Selection Order” wybierz opcję „In Order”.
    6. W polu „When Finished” wybierz opcję „Hold Value = to: ____”. W polu tekstowym wprowadź wartość harmonogramu wzmocnień, która znacznie przekracza oczekiwany poziom reakcji. Będzie to wymagany wysiłek dla wszystkich kolejnych wpisów po wyczerpaniu listy.
  4. Tworzenie protokołu eksperymentalnego:
    Uwaga: Graphic State przeprowadza obiekt przez serię stanów, z których wyjście następuje na podstawie kryteriów czasu lub wydajności. Ustaw wszystkie dyskretne i kontekstowe sygnały oraz parametry oznaczone poniżej symbolem „$”, aby odpowiednio przetestować badaną hipotezę.
    1. Wybierz File > Create Experiment Protocol.
    2. W odpowiednim polu tekstowym wprowadź pożądany numer i opis protokołu.
    3. Wybierz „State Creation”.
    4. Ustaw wszystkie bodźce zarówno dla stanu „RDY – Ready State”, jak i stanu „FIN – Finished State”.
    5. Wybierz „New State” i nazwij go „S2 – PR Responding”.
    6. Wybierz „New State” i nazwij go „S3 – PR Reinforcer and Cue”.
    7. Wybierz „New State” i nazwij go „S4 – Timeout”.
    8. Zaznacz „S1” i nazwij go „S1 – Habituation”.
      1. Wybierz Add „Time Go To”.
      2. Wprowadź odpowiedni czas ($) i jednostki ($), np. minuty, a następnie wybierz „S2” z rozwijanego pola TO S. Jednostka czasu „units” została określona podczas początkowego tworzenia bazy danych.
        Uwaga: Utworzone przejście czasowe powinno wyglądać podobnie do [After $ minutes GO P = 100%, TO S2]. Rysunek 1 przedstawia przykład takiego zdarzenia po jego utworzeniu.

Schemat przepływu procesu z opisanymi krokami: AFTER, $, Minutes, GO, TO S2; sekwencja logistyczna.
Rysunek 1. Reprezentatywny przykład programowania nr 1. W tym przypadku przedstawiono stan ograniczony czasowo, w którym zdefiniowana przez użytkownika wartość $, podana tutaj w minutach, wskazuje, kiedy bieżący stan powinien przejść do stanu 2 (S2).

  1. Zaznacz „S2 – PR Responding”.
    1. Wybierz opcję „Add Event Go To”.
    2. W pierwszym polu tekstowym wprowadź nazwę listy zawierającej harmonogram progresywnego stosunku stworzony w kroku 4.3 jako L$ (np. L1), z pierwszej listy rozwijanej wybierz odpowiedni operandum (np. dźwignię lub otwór dla nosa), a z listy rozwijanej TO S wybierz „S3”.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie może wyglądać podobnie do [IF L$1 – Active GO P = 100%, TO S3]. Identyfikator 1 – Active został przypisany podczas tworzenia bazy danych. W tym przypadku 1 – Active odnosi się do operandum podłączonego do przełącznika pierwszego.
    3. Wybierz opcję „Add Time Go To”.
    4. Zaznacz pole „R”, wprowadź odpowiedni czas i jednostki ($), a z listy rozwijanej TO S wybierz „FIN”.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie czasowe może wyglądać podobnie do [ R (checked) IF $ minutes GO P = 100%, TO FIN]. Zapewni to zakończenie sesji w przypadku braku aktywności na tym operandum po osiągnięciu ustawionego progu; tzn. sesja wygaśnie, gdy zwierzę powstrzyma się od reagowania na operandum powiązanym z wzmocnieniem przez określony czas.
    5. Wybierz opcję „Add Event Go To”.
    6. Zaznacz pole „R”, wprowadź wartość 1 w pierwszym polu tekstowym, z pierwszej listy rozwijanej wybierz zwolnienie odpowiedniego operandum, a z listy rozwijanej TO S wybierz „S2”.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie może wyglądać podobnie do [ R (checked) After $ [1] Active GO P = 100%, TO S2]. Ten krok zapewnia, że po zwolnieniu operandum (wskazanym w nawiasach powyżej) stan zostanie ponownie wprowadzony, co zresetuje próg wygaśnięcia sesji (4.4.9.4). W tym momencie stan zostanie opuszczony, gdy zostanie zrealizowany progresywny stosunek zawarty na liście (Krok 4.4.9.2) lub gdy sesja wygaśnie (Krok 4.4.9.4). Zatem każde aktywowanie operandum jest zaliczane do progresywnego stosunku. Ponadto za każdym razem, gdy operandum zostanie dezaktywowano; np. gdy dźwignia zostanie zwolniona lub nos zostanie wycofany z otworu, próg wygaśnięcia sesji (Krok 4.4.9.4) jest resetowany. Rysunek 2 przedstawia wszystkie przejścia zaprogramowane dla „S2 – PR Responding”.

Tabela logiki warunkowej z instrukcjami IF dla sterowania procesem w programowaniu, podejmowanie decyzji.
Rycina 2. Reprezentatywny przykład programowania nr 2. W tym przypadku stan kończy się po spełnieniu jednego z dwóch kryteriów. L$ to harmonogram progresywnego stosunku stworzony w kroku 4.3. Po zakończeniu harmonogramu stan przechodzi do Stanu 3 (S3). Należy zauważyć, że to kryterium nie posiada parametru R, co pozwala na postęp harmonogramu zamiast jego ponownego rozpoczynania przy każdym powrocie do tego stanu. Stan może również zostać opuszczony po „$” minutach i przejść do stanu FIN. Jest to z góry określony próg czasu oczekiwania, po którym sesja zostanie zakończona, jeśli w tym oknie czasowym nie wystąpi żadna reakcja. Jest to wyjaśnione szerzej w sekcji Dyskusja. Wreszcie, próg czasu oczekiwania sesji jest resetowany przy każdym zwolnieniu operandum. Zatem „[1]” oznacza zwolnienie operandum „1”.

  1. Zaznacz „S3 – PR Reinforcer and Cue”.
    1. Wybierz „Add Time Go To”
    2. Wprowadź odpowiedni czas i jednostki dla podania wzmocnienia ($), a następnie wybierz „S4” z rozwijanego pola TO S.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie czasowe może wyglądać podobnie do [After $ seconds GO P = 100%, TO S4].
  2. Zaznacz „S4 – Timeout”.
    1. Wybierz „Add Time Go To”
    2. Wprowadź odpowiedni czas i jednostki dla pozostania w stanie nieaktywnym ($) po podaniu wzmocnienia, a następnie wybierz „S2” z rozwijanego pola TO S.
      Uwaga: Utworzone zdarzenie czasowe może wyglądać podobnie do [After $ seconds GO P = 100%, TO S2]. Stan „S4 – Timeout” może nie być wymagany dla wszystkich projektów.
  3. Wybierz resolve states.
    Uwaga: Protokół jest teraz gotowy do uruchomienia.

Wyniki

W tej części przedstawiamy przykłady wyników, które można uzyskać za pomocą opisanej powyżej procedury. W pierwszej kolejności pokazano typowy obszar poddany transfekcji wektorami wirusowymi (Rysunek 3). Zazwyczaj w tkance prążkowia uzyskuje się objętość transfekcji wynoszącą ~1 mm3. Objętość regionu poddanego transfekcji można ilościowo określić wycinając seryjne przekroje z zastosowaniem metody Cavalieriego.32 Należy zaznaczyć, że objętość transfekcji zależy od wielu czynników, takich jak rodzaj transfekowanej tkanki, serotyp wirusa, promotor, szybkość i objętość iniekcji, liczba wstrzykniętych cząstek, pH wstrzykiwanego preparatu oraz to, czy zastosowano odczynniki hiperosmolane, takie jak mannitol.33,34 Typowo mikroiniekujemy 1012 cząstek/ml, 1 µl na stronę w ciągu 10 min, a następnie odczekujemy dodatkowe 7 min przed zastąpieniem obturatorów. Dodatkowo, pH preparatu wynosi zazwyczaj około 8. Następnie wykazujemy, że motywację można manipulować poprzez ekspresję transgenu (Rysunek 4) lub mikroiniekcję odczynników farmakologicznych (Rysunek 5).

Na Rysunku 4 przedstawiono ekspresję projektowanego receptora aktywowanego wyłącznie przez projektowane leki (DREADDs). Za regionem kodującym receptor DREADD następowały wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu (IRES) oraz kaseta mCitrine. mCitrine umożliwia wygodną wizualizację transfekowanych komórek. Receptor DREADD został sprzężony z heterotrymericznym białkiem G Gαq. Aktywacja sprzężonego z Gαq receptoru DREADD może stymulować astrocyty,28,35 a sam DREADD może być aktywowany poprzez systemiczne podanie klozapiny-N-tlenku (CNO, 3 mg/kg, i.p).14,22,36 Szczury zostały przeszkolone w naciskaniu dźwigni w celu otrzymania wzmocnienia w postaci etanolu, gdzie 3 naciśnięcia dźwigni dawały 1 szansę na picie podczas codziennych, 1-godzinnych sesji przez 60 kolejnych dni. Następnie szczury zostały poddane wymuszonej abstynencji, a w astrocytach jądra półleżącego (nucleus accumbens core) wyekspresowano receptory DREADD sprzężone z Gαq. Po 3 tygodniach abstynencji zmierzono motywację do samopodawania etanolu, określając punkt krytyczny (breakpoint).21,27-30 Aktywacja astrocytów jądra półleżącego za pomocą systemicznego podania CNO zmniejszyła motywację szczurów do powrotu do samopodawania etanolu po abstynencji w porównaniu z grupą otrzymującą nośnik. Co istotne, CNO nie wywarło żadnego wpływu w analogicznie przeszkolonej grupie, w której zamiast DREADD wyekspresowano zielone białko fluorescencyjne (GFP).

Obraz mikroskopii fluorescencyjnej regionu przedniej spoistki po transfekcji; dołączony schemat atlasu mózgu.
Rycina 3. Reprezentatywny region brzusznego prążkowia po transfekcji mikroiniekcyjnym wirusem.Obraz ten ilustruje region astrocytów jądra półleżącego, które zostały poddane transfekcji zgodnie z powyższą metodą. Dane zostały przedrukowane z pracy Bull et al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegóły znajdują się w tej publikacji oraz w dołączonych materiałach uzupełniających. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy punktu krytycznego dla etanolu; DREADD, GFP, CNO; analiza porównawcza wyników eksperymentalnych.
Rysunek 4. Motywacja szczurów do samopodawania etanolu została zmniejszona poprzez aktywację transgenu nadmiernie ekspresowanego w astrocytach rdzenia jądra półleżącego. Wirus został wstrzyknięty za pomocą mikroiniekcji, a motywację zmierzono poprzez wyznaczenie punktu krytycznego po upływie jednego tygodnia na ekspresję wirusa. Ekspresowany transgen stanowił projektowany receptor aktywowany wyłącznie przez projektowane leki (DREADDs). Jednoczynnikowa analiza wariancji ANOVA (F(2,30)=3,29, p=0,04), a następnie test post-hoc Scheffé wykazały, że aktywacja DREADD poprzez systemiczne podanie klozapiny-N-tlenku (CNO, 3 mg/kg, ip) znacząco zmniejszyła motywację szczurów do samopodawania etanolu po okresie abstynencji w porównaniu z grupą kontrolną. CNO nie wywarło żadnego wpływu w równie dobrze wytrenowanej kohorcie, w której zamiast DREADD ekspresowane było zielone białko fluorescencyjne (GFP). Dane zostały przedrukowane z Bull et al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegóły znajdują się w tej publikacji oraz w towarzyszących jej materiałach uzupełniających.

wykres słupkowy analizy punktu krytycznego dla etanolu; traktowanie placebo i lekiem; zaznaczono istotność statystyczną
Rysunek 5. Mikroiniekcja blokerów połączeń szczelinowych zwiększyła motywację szczurów do samopodawania etanolu po okresie abstynencji. Oceniono wpływ dwóch blokerów połączeń szczelinowych na motywację (mierzoną za pomocą punktu krytycznego) szczurów do samopodawania etanolu: meflokiny oraz kwasu 18-α-glcyrrhizynowego (18-α). Dwuway ANOVA wykazała, że mikroiniekcja blokerów połączeń szczelinowych do jądra półleżącego (core) zwiększyła motywację szczurów do samopodawania etanolu po abstynencji (F(3,40)=5.56, p=0.003). Dane zostały przedrukowane z pracy Bull et al.13 za zgodą właściciela praw autorskich. Szczegóły znajdują się w tej publikacji oraz w towarzyszących jej materiałach uzupełniających.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj procedura jest skutecznym sposobem wytwarzania kaniul do mikroiniekcji i mikroiniektorów, które pomogą w wyjaśnieniu molekularnych substratów motywowanego zachowania. Ta metoda ma kilka zalet. Po pierwsze, dzięki produkcji własnych implantów i mikroiniektorów można szybko zoptymalizować nowe parametry eksperymentalne; Oznacza to, że nie trzeba czekać na przybycie komponentów wykonanych na zamówienie. Po drugie, ze względu na małą średnicę kaniuli, można jednocześnie wszczepić więcej kaniuli. Skraca to wymagany czas operacji, co może poprawić przeżywalność, a także pozwala na wszczepienie wielu implantów na zwierzę. Po trzecie, oprogramowanie używane do sterowania komorami operacyjnymi z łatwością dostosowuje się do progresywnych harmonogramów proporcji, ponieważ paradygmat stałego współczynnika można szybko przekształcić w paradygmat współczynnika progresywnego, po prostu stosując listę parametrów przejścia zdarzenia, która zawiera żądany harmonogram zbrojenia.

Aby zapewnić szerokie zastosowanie, przedstawiono ogólną procedurę mikroiniekcji, która powinna mieć szerokie zastosowanie w przypadku mikroiniekcji prawie każdego obecnie dostępnego odczynnika. W związku z tym przewidujemy, że technika ta będzie nadal miała podobnie wysoką użyteczność w przyszłości, z niewielkimi modyfikacjami. Zmieniając tylko kilka zmiennych, podejście to można zastosować do szerokiej liczby odczynników. Parametry, które najczęściej byłyby manipulowane, obejmują długość, na jaką mikroiniektor wystaje z kaniuli, objętość wstrzyknięcia i szybkość wstrzyknięcia. Na przykład można chcieć, aby wstrzykiwacz wystawał dalej od końcówki kaniuli, aby uniknąć blizny glejowej, która zwykle tworzy się wokół przewlekłych implantów. Dodatkowo można wstrzyknąć większą objętość. W przypadku mikroiniekcji wirusa prążkowia zwykle stosuje się objętość 1 μl, która jest zwykle wstrzykiwana przez dłuższy czas (często 7 – 10 minut plus 3 – 10 minut dodatkowy czas dyfuzji) w porównaniu z tą stosowaną w przypadku odczynników farmakologicznych (zwykle 0,3 – 0,5 μl w ciągu 2 – 3 minut plus 1 – 3 minuty dodatkowy czas dyfuzji). Użytkownik powinien zapoznać się z literaturą i/lub empirycznie określić parametry najlepiej dopasowane do swoich potrzeb. Niezależnie od tego, sukces tej procedury zależy krytycznie od 4 zmiennych: 1) długości kaniuli, 2) długości mikrowtryskiwacza, 3) jakości wzoru rozpylania mikroiniektora oraz 4) integralności systemu przed wstrzyknięciem. Ponieważ miejsce mikroiniekcji zależy od głębokości, na jaką mikroiniektor wystaje z kaniuli, konieczne jest, aby zarówno kaniule (krok 1.2.8), jak i długość mikroiniektora (po zgięciu, krok 2.2.1) były dokładnie znane i jednolite u wszystkich badanych. Można to łatwo kontrolować, łatwo odrzucając wszelkie narzędzia, które nie mają wymaganej długości podczas końcowego ponownego pomiaru. Co więcej, miejsce wstrzyknięcia można przewidzieć tylko wtedy, gdy występuje ono bezpośrednio pod kaniulą prowadzącą. W związku z tym każdy mikrowtryskiwacz, który nie rozpyla długiego, drobnego strumienia podczas badania (kroki 2.4.6), powinien zostać odrzucony. Wtrysk wysokiej jakości jest również związany z integralnością systemu przed wtryskiem. Jeśli po wylaniu całej wody z wtryskiwacza (przed napełnieniem odczynnikiem) na chusteczce laboratoryjnej zaobserwuje się wiele plam, należy usunąć wyciek (Uwaga dotycząca kroku 2.4.8). Ponadto, jeśli pęcherzyk (krok 2.4.9), który oddziela lek od wody w rurki PE20, nie jest jedną, pojedynczą pęcherzyką (po napełnieniu mikrowtryskiwacza odczynnikiem), oznacza to, że wtryskiwacz jest częściowo zatkany. To zatorowanie może uniemożliwić lub przekierować wstrzyknięcie. Temu również można łatwo zaradzić (uwaga dotycząca kroku 2.4.8).

Jeśli ktoś chce dokonać mikroiniekcji, gdy zwierzę znajduje się w ramie stereotaktycznej, istnieją trzy możliwości. Po pierwsze, można zwiększyć długość kołnierza mikrowtryskiwacza tak, aby mógł być mocno trzymany przez manipulator stereotaktyczny, a także rozciągał się wystarczająco daleko, aby umożliwić podłączenie do rurki PE20. Po drugie, można by tymczasowo wszczepić kaniulę i użyć prezentowanego tutaj standardowego mikroiniektora. Po trzecie, można użyć pipet z ciągnionego i polerowanego szkła. Pytania z dnia 16,17 na dzień

Istotnym ograniczeniem przedstawionej tutaj procedury jest to, że najlepiej przeprowadzić ją u dobrze traktowanych szczurów, które są zaznajomione z procedurą. Szczury wykorzystane do danych opisanych w sekcji wyników nie wymagały specjalnych procedur obchodzenia się ze szczurami, ponieważ ten sam badacz zajmował się szczurami codziennie przez ponad 2 miesiące. Obejmowało to codzienną obserwację i manipulację implantem chirurgicznym przez co najmniej 2 tygodnie. Jednak szczury mogą być szybko przyzwyczajone do wielu technik, które są używane przed testem hamowania impulsów, na który może mieć wpływ stres. Te specjalne techniki habituacji zostały już wcześniej szczegółowo opisane. 43 Poza tymi procedurami zaleca się, aby szczury były przyzwyczajone do procedury mikroiniekcji, w której podczas iniekcji "pozorowanych" stosuje się skrócone mikroiniekcje. Podczas tych pozorowanych iniekcji bardzo ważne jest, aby mikrowstrzykiwacz nie wystawał w tkankę, aby ograniczyć uszkodzenie tkanki. Innymi słowy, mikrowtryskiwacz powinien być wygięty nie dłużej niż 14 mm. W związku z tym dokładne przyzwyczajenie wymagane do optymalnego wdrożenia tej techniki może być postrzegane jako ograniczenie.

Chociaż istnieje kilka paradygmatów behawioralnych do pomiaru motywacji, współczynnik progresywny jest powszechnie używany do ilościowego określenia wysiłku, jaki podmiot jest skłonny włożyć, aby uzyskać wzmacniacz. Paradygmat stosunku progresywnego tworzy miarę znaną jako punkt przerwania, który jest często definiowany jako maksymalna liczba naciśnięć dźwigni w ostatnim zakończonym stosunku; tj. maksymalna reakcja, która wygenerowała wzmocnienie. 21 Współczynnik progresywny jest wrażliwy na wielkość wzmocnienia. Na przykład wyższe dawki kokainy (lub sacharozy) dają wyższy punkt graniczny, a niższe dawki kokainy (lub sacharozy) dają niższy punkt graniczny. 21,22 W związku z tym punkt przerwania jest rutynowo używanym wskaźnikiem zastępczym dla motywacji i/lub wzmacniania skuteczności. 21,23-26 Ponieważ intencją punktu przerwania jest określenie, kiedy zwierzę przestaje reagować, ważnym parametrem paradygmatu progresywnego współczynnika jest długość sesji. Skończone długości sesji mogą nakładać fałszywy limit na wartości punktów przerwania, a sytuacja ta może być nasilona przez zabiegi wstępne, które nienormalnie zmniejszają tempo samodzielnego podawania lub zwiększają pauzy po wzmocnieniu. To zamieszanie można przezwyciężyć na wiele sposobów; Np. sesje, które kończą się, gdy zwierzę wstrzymało odpowiedź o pewną wielokrotność średniego odstępu między infuzjami. 44 Częściej stosowanym wariantem tego podejścia jest przerywanie sesji po wstrzymaniu odpowiedzi przez pewną empirycznie określoną wartość, która jest niezmienna u wszystkich badanych. Metodę zastosowania tego podejścia przedstawiliśmy w kroku 4.4.9.11.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma sprzecznych lub sprzecznych interesów.

Podziękowania

MSB jest wspierane przez Alcohol Beverage Medical Research Foundation, Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537), oraz fundusze startowe zapewnione przez Virginia Higher Education Equipment Trust Fund i VCU School of Medicine.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka kaniuliAmazon Supply / Małe częściHTXX-26T-6026 G, Hypotube S / S 316-TW 26GA
ObturatorAmazon Supply / Małe częściGWXX-0080-30-0533 gauge, drut S / S 316LVM 0,008 IN
Drut mikroiniektoraMicroGroup33RW 30433 gauge
Super GlueLoctite3924ACPłyn, nieżelowy, może być sterylizowany
w autoklawiePlastikowa rurka do mikrowtryskiwaczyBecton Dickson427406PE20
Średnia waga HemostatsWorld Precision Instruments501241-G
LinijkaFisher09-016150 mm
#7 KleszczeStoelting52100-77Dumont, Dumostar
Narzędzie obrotoweDremmel285Dwubiegowa
tarcza tnącaMcMaster Carr360215/16 "x 0,025"
Pompa mikroiniekcyjnaAparat HarvardPhD 2000
1 ul Szklana strzykawkaHamilton7001KHStyl igły: 25s / 2,75 "/ 3
aplikator z bawełnianą końcówkąFisher23-400-101
Chusteczki laboratoryjneKimwipes34133
Oprogramowanie operacyjneCoulbournGraficzne Państwowe
Izby OperacyjneCoulborunHabitest

Bibliografia

  1. Koob, G. F., Volkow, N. D. Neurocircuitry of addiction. Neuropsychopharmacology. 35 (1), 217-238 (2010).
  2. Kalivas, P. W., Peters, J., Knackstedt, L. Animal models and brain circuits in drug addiction. Mol Interv. 6 (6), 339-344 (2006).
  3. Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berl). 229 (3), 453-476 (2013).
  4. Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability). Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).
  5. Watson, D. J., et al. Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex. Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).
  6. Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice. J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).
  7. Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function. Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).
  8. Bowers, M. S., et al. Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking. Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).
  9. Abudara, V., et al. The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes. Front Cell Neurosci. 8, 306(2014).
  10. Cahill, E., et al. D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses. Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).
  11. McFarland, K., Kalivas, P. W. The circuitry mediating cocaine-induced reinstatement of drug-seeking behavior. J Neurosci. 21 (21), 8655-8663 (2001).
  12. Fuchs, R. A., Branham, R. K., See, R. E. Different neural substrates mediate cocaine seeking after abstinence versus extinction training: a critical role for the dorsolateral caudate-putamen. J Neurosci. 26 (13), 3584-3588 (2006).
  13. Ebersberger, A. Physiology of meningeal innervation: aspects and consequences of chemosensitivity of meningeal nociceptors. Microsc Res Tech. 53 (2), 138-146 (2001).
  14. Netter, F. H. Musculoskeletal System Part I: Anatomy; Physiology, and Metabolic Disorders. 8, 1st ed, CIBA-Geigy. Summit, New Jersey. (1987).
  15. Ferguson, S. M., Eskenazi, D., Ishikawa, M., Wanat, M. J., Phillips, P. E., Dong, Y., Roth, B. L., Neumaier, J. F. Transient neuronal inhibition reveals opposing roles of indirect and direct pathways in sensitization. Nat Neurosci. 14 (1), 22-24 (2011).
  16. Gonzalez-Perez, O., Guerrero-Cazares, H., Quinones-Hinojosa, A. Targeting of deep brain structures with microinjections for delivery of drugs, viral vectors, or cell transplants. J Vis Exp. (46), (2010).
  17. Inquimbert, P., Moll, M., Kohno, T., Scholz, J. Stereotaxic injection of a viral vector for conditional gene manipulation in the mouse spinal cord. J Vis Exp. (73), (2013).
  18. Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography. J Vis Exp. (67), (2012).
  19. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. J Vis Exp. (59), e3528(2012).
  20. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. J Vis Exp. (20), e880(2008).
  21. Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J Neurosci Methods. 66 (1), 1-11 (1996).
  22. Cheeta, S., Brooks, S., Willner, P. Effects of reinforcer sweetness and the D2/D3 antagonist raclopride on progressive ratio operant performance. Behav Pharmacol. 6 (2), 127-132 (1995).
  23. Roberts, D. C., Morgan, D., Liu, Y. How to make a rat addicted to cocaine. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 31 (8), 1614-1624 (2007).
  24. Arnold, J. M., Roberts, D. C. A critique of fixed and progressive ratio schedules used to examine the neural substrates of drug reinforcement. Pharmacol Biochem Behav. 57, 441-447 (1997).
  25. Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134 (3483), 943-944 (1961).
  26. Depoortere, R. Y., Li, D. H., Lane, J. D., Emmett-Oglesby, M. W. Parameters of self-administration of cocaine in rats under a progressive-ratio schedule. Pharmacol Biochem Behav. 45 (3), 539-548 (1993).
  27. Bowers, M. S., et al. Nucleus accumbens AGS3 expression drives ethanol seeking through G betagamma. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12533-12538 (2008).
  28. Bull, C., et al. Rat Nucleus Accumbens Core Astrocytes Modulate Reward and the Motivation to Self-Administer Ethanol after Abstinence. Neuropsychopharmacology. 39 (12), 2835-2845 (2014).
  29. Hopf, F. W., Chang, S. J., Sparta, D. R., Bowers, M. S., Bonci, A. Motivation for alcohol becomes resistant to quinine adulteration after 3 to 4 months of intermittent alcohol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 34 (9), 1565-1573 (2010).
  30. Hopf, F. W., et al. Reduced nucleus accumbens SK channel activity enhances alcohol seeking during abstinence. Neuron. 65 (5), 682-694 (2010).
  31. Salerni, C. M. Engineering Adhesives for Repeated Sterilization. , Henkel. Available from: http://www.henkelna.com/us/content_data/99736_Engineering_Adhesives_for_Repeated_Sterilization.pdf (2015).
  32. Gundersen, H. J., Jensen, E. B. The efficiency of systematic sampling in stereology and its prediction. J Microsc. 147 (Pt 3), 229-263 (1987).
  33. Mastakov, M. Y., Baer, K., Xu, R., Fitzsimons, H., During, M. J. Combined injection of rAAV with mannitol enhances gene expression in the rat brain. Mol Ther. 3 (2), 225-232 (2001).
  34. Burger, C., Nguyen, F. N., Deng, J., Mandel, R. J. Systemic mannitol-induced hyperosmolality amplifies rAAV2-mediated striatal transduction to a greater extent than local co-infusion. Mol Ther. 11 (2), 327-331 (2005).
  35. Agulhon, C., et al. Modulation of the autonomic nervous system by acute glial cell Gq-GPCR activation in vivo. J Physiol. 591 (22), 5599-5609 (2013).
  36. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. PNAS. 104 (12), 5163-5168 (2007).
  37. Cruikshank, S. J., et al. Potent block of Cx36 and Cx50 gap junction channels by mefloquine. PNAS. 101 (33), 12364-12369 (2004).
  38. Miguel-Hidalgo, J., Shoyama, Y., Wanzo, V. Infusion of gliotoxins or a gap junction blocker in the prelimbic cortex increases alcohol preference in Wistar rats. J Psychopharmacol. 23 (5), 550-557 (2008).
  39. Bowers, M. S., Lake, R. W., Rubinchik, S., Dong, J. Y., Kalivas, P. W. Elucidation of Homer 1a function in the nucleus accumbens using adenovirus gene transfer technology. Ann N Y Acad Sci. 1003, 419-421 (2003).
  40. Mackler, S. A., et al. NAC-1 is a brain POZ/BTB protein that can prevent cocaine-induced sensitization in the rat. J Neurosci. 20 (16), 6210-6217 (2000).
  41. Geyer, M. A., Swerdlow, N. R. Measurement of startle response, prepulse inhibition, and habituation. Curr Protoc Neurosci. 8, Unit 8.7(2001).
  42. Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey. Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wytwarzanie kaniulmontaż mikroinjektoracelowanie w mózg gryzonitest progresywnego stosunku (Progressive Ratio Assay)celowanie w jądro półleżąceprzygotowanie wody sterylnejustawianie objętości pompytechnika nacinania kaniuliokres dyfuzji mikroiniekcji
Mikroiniekcja mózgu gryzoni w celu zbadania molekularnych substratów umotywowanego zachowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.