Procedura decelularyzacji wątroby szczura w urządzeniu do perfuzji o oscylacyjnym ciśnieniu

Podsumowanie

Przedstawione techniki pobierania wątroby, kaniulacji i perfuzji przy użyciu naszego zastrzeżonego urządzenia umożliwiają zaawansowane ustawienia perfuzji w celu usprawnienia eksperymentów z decelularyzacją i recelularyzacją w wątrobach szczurów.

Streszczenie

Decelularyzacja i recelularyzacja narządów miąższowych może umożliwić wytwarzanie funkcjonalnych organów in vitro, a kilka protokołów decelularyzacji wątroby gryzoni zostało już opublikowanych. Naszym celem było usprawnienie procesu decelularyzacji poprzez budowę autorskiego urządzenia perfuzyjnego umożliwiającego selektywną perfuzję przez żyłę wrotną i/lub tętnicę wątrobową. Ponadto staraliśmy się przeprowadzić perfuzję w warunkach oscylacji ciśnienia otoczenia, aby poprawić jednorodność decelularyzacji. Jednorodność decelularyzacji perfuzyjnej była do tej pory niedocenianym czynnikiem. Podczas decelularyzacji obszary w obrębie narządu, które są słabo ukrwione, mogą nadal zawierać komórki, podczas gdy macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) w obszarach dobrze ukrwionych może być już dotknięta alkalicznymi detergentami. Oscylacyjne zmiany ciśnienia mogą naśladować zmiany ciśnienia w jamie brzusznej, które zachodzą podczas oddychania, aby zoptymalizować mikroperfuzję w wątrobie. W przedstawionym tutaj badaniu bezkomórkowe matryce wątroby szczura analizowano za pomocą barwienia histologicznego, analizy zawartości DNA i odlewania korozyjnego. Perfuzja przez tętnicę wątrobową wykazała bardziej jednorodne wyniki niż perfuzja żyły wrotnej. Zastosowanie warunków ciśnienia oscylacyjnego poprawiło skuteczność decelularyzacji perfuzyjnej. Najlepsze wyniki uzyskano u wątroby perfundowanej przez tętnicę wątrobową i w warunkach oscylacji ciśnienia. Zaprezentowane techniki pobierania wątroby, kaniulacji i perfuzji przy użyciu naszego autorskiego urządzenia umożliwiają zaawansowane konfiguracje perfuzji w celu usprawnienia eksperymentów z decelularyzacją i recelularyzacją w wątrobach szczurów.

Wprowadzenie

Decelularyzacja i recelularyzacja mogą umożliwić generowanie funkcjonalnych, nadających się do przeszczepu organów in vitro ¹. Usuwając komórki i materiał antygenowy (np. DNA, epitopy alfa-Gal) z narządu, można uzyskać nie- lub mniej immunogenną macierz zewnątrzkomórkową (ECM). Macierz ta zachowuje trójwymiarową mikroanatomię narządu i może służyć jako idealna biomatryca do ponownego zasiedlenia komórkami o innym, prawdopodobnie ksenogenicznym pochodzeniu ². W ten sposób zdecelularyzowana matryca wątroby szczura może zostać ponownie zasiedlona ludzkimi komórkami wątroby. Ta humanizowana mikrowątroba może służyć jako model ex vivo do badań nad chorobami (np. wrodzonymi chorobami metabolicznymi, chorobami wirusowymi lub nowotworami złośliwymi) lub do przedklinicznych testów farmaceutycznych ³.

Kilka różnych protokołów decelularyzacji perfuzji wątroby szczurów zostało już opublikowanych ^4-13. We wszystkich protokołach decelularyzacja została osiągnięta przez perfuzję alkalicznych detergentów jonowych lub niejonowych przez kaniulowaną żyłę wrotną. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, byliśmy pierwszą grupą, która zgłosiła decelularyzację wątroby szczura przez selektywną perfuzję przez żyłę wrotną i / lub tętnicę wątrobową ^{szczura 14}. Umożliwienie selektywnej perfuzji różnych układów naczyniowych w wątrobie może umożliwić lepsze wyniki decelularyzacji, a ponadto może odgrywać ważną rolę w ponownym zasiedlaniu komórek.

W opisanym tutaj badaniu, wątroby były perfundowane w specjalnie zaprojektowanym urządzeniu do perfuzji, umożliwiającym perfuzję w warunkach oscylacji ciśnienia. Te warunki ciśnienia naśladują fizjologiczną zależną od układu oddechowego perfuzję wątroby: in situ wątroba wisi pod kopułą przepony, której ruch podczas oddychania ma bezpośredni wpływ na perfuzję wątroby. Wdech w szczególności prowadzi do obniżenia przepony i ściśnięcia wątroby, optymalizując odpływ wątrobowo-żylny, podczas gdy wydech prowadzi do uniesienia wątroby i obniżenia ciśnienia wewnątrzbrzusznego w celu optymalizacji dopływu wrotno-żylnego ¹⁵.

Naszym celem było ocenienie, czy warunki oscylacji ciśnienia mają wpływ na jednorodność decelularyzacji perfuzji wątroby szczura poprzez naśladowanie warunków wewnątrzbrzusznych ex vivo. Jednorodność procesu decelularyzacji może być niedocenianym czynnikiem w decelularyzacji perfuzyjnej. Wszystkie znane środki stosowane do decelularyzacji wątroby powodują zmiany w ECM. Komórki w słabo perfuzjowanych obszarach pozostają w ECM, podczas gdy inne obszary są już całkowicie pozbawione komórek. Aby rozpuścić pozostałe komórki, czas trwania perfuzji lub ciśnienie muszą zostać podwyższone, powodując więcej zmian w dobrze ukrwionych obszarach. Dlatego detergenty do decelularyzacji powinny być rozprowadzane jednorodnie w narządzie.

Protokół

Zwierzęta były trzymane w Zakładzie Medycyny Doświadczalnej (FEM, Charité, Berlin, Niemcy), a wszystkie protokoły eksperymentalne zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Krajowy Urząd Zdrowia i Spraw Lokalnych (LAGeSo, Berlin, Niemcy; nr rej. O 0365/11).

1. Zbieranie wątroby

1. Przygotowanie przedoperacyjne
   1. Do mocowania użyj płytki korkowej. Połóż serwetę medyczną na talerzu. Za pomocą czterech igieł przymocuj maskę inhalacyjną do płytki korkowej do śródoperacyjnej narkozy inhalacyjnej.
2. Wstępne ułożenie kaniuli żyły wrotnej
   1. Podłączyć cewnik do żył obwodowych (G 20) do kranu trójdrożnego. Cewnik żylny powinien być przecięty skośnie, na długość ok. 1,5 cm.
   2. Odwietrzyć system za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wypełnionej roztworem Ringera. Bardzo ważne jest, aby ostrożnie odpowietrzać, ponieważ zator gazowy może negatywnie wpłynąć na decelularyzację perfuzyjną.
3. Wstępne ułożenie kaniuli tętniczej
   1. Użyj kaniuli motylkowej i przytnij igłę na długość 5 mm. Zamontuj rurkę o średnicy 5 cm (ID 0,58 mm; OD 0,96 mm) do igły 5 mm i przymocuj ją za pomocą superglue. Włóż rurkę o długości 2 cm (średnica wewnętrzna 0,28 mm; OD 0,61 mm) do większej rurki i przymocuj ją za pomocą superglue.
   2. Wsuń kolejną rurkę na tę konstrukcję jako łącznik i przymocuj ją za pomocą superglue. Odwietrzyć kaniulę tętniczą za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wypełnionej roztworem Ringera.
4. Znieczulenie i analgezja
   1. Wywołać narkozę szczura w komorze indukcyjnej znieczulenia za pomocą 3,5% izofluranu w tlenie przy natężeniu przepływu 1,5 l/min.
   2. Aby zapewnić bezpieczną analgezję podczas operacji, metamizol (100 mg/kg masy ciała) i małą dawkę ketaminy/medetomidyny (10 mg/0,1 mg na kg masy ciała) należy wstrzykiwać dootrzewnowo.
   3. Dostarczyć 1,5% izofluranu w 1 l/min tlenu przez maskę wziewną w celu późniejszego utrzymania znieczulenia chirurgicznego.
5. Ustalenia przedoperacyjne
   1. Obficie ogol brzuch za pomocą elektrycznego nożyca. Zwilż ogolone miejsce nacięcia na brzuchu 70% etanolem do dezynfekcji.
   2. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na przygotowanej płytce, włóż głowę do maski inhalacyjnej i przymocuj kończyny taśmą medyczną i szpilkami. Usuń nadmiar etanolu i sierści za pomocą kompresu z gazy.
6. Ocena znieczulenia
   1. Oceń głębokość znieczulenia, obserwując częstość oddechów. Gdy znieczulenie wydaje się wystarczająco głębokie (40-60 oddechów/min), sprawdź, czy analgezja jest wystarczająca, próbując wywołać odruch szczypania palca u nogi za pomocą kleszczy chirurgicznych, aby uszczypnąć skórę między palcami obu kończyn tylnych.
7. Podejście brzuszne
   1. Wykonaj środkowe nacięcie w ogonowej ścianie brzucha nad pęcherzem. Przyciąć od tego miejsca do obu bocznych łuków żebrowych w kształcie litery V. Uważaj, aby nie przeciąć membrany. Przeciągnij przeciętą ścianę brzucha nad klatką piersiową.
   2. Przymocuj mieczykowatą rurkę za pomocą zacisku overholt, pociągnij ją czaszkowo i przymocuj gumką. Użyj mokrych wacików, aby opróżnić jelito. Owiń jelito w mokry bandaż z gazy. Ponadto zakryj wszystkie brzegi brzucha mokrymi bandażami.
8. Przygotowanie wątroby
   1. Wypreparuj więzadło pospolite. Użyj mokrego bandaża z gazy, aby przytrzymać przyśrodkowy i lewy płat wątroby czaszkowo pod kopułą przepony. Odsłonić więzadło wątrobowo-nerkowe i górny płat wątroby.
   2. Użyj dwóch mikrokleszczyków i nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie wypreparować więzadło przyczepione do górnego płata omentalnego, aż płat będzie ruchomy. Przesuń płatek za pomocą mokrych wacików bawełnianych pod kompresem z gazy, przytrzymując przyśrodkowe i lewe płaty na miejscu.
   3. Po mobilizacji górnego płata wątroby należy przesunąć żołądek w lewo. Przymocuj żołądek za pomocą zacisku i wypreparuj mniejszą sieć za pomocą mikrokleszczy i nożyczek sprężynowych.
   4. Zmobilizuj dolny płat wątroby do momentu, aż stanie się ruchomy, a następnie przenieś płat z powrotem do jego jamy. Użyj zacisku Backhaus, aby utrzymać dwunastnicę. Przesuń dwunastnicę w lewo, aby rozciągnąć i odsłonić więzadło wątrobowo-nerkowe. Opisz wspólny przewód żółciowy w rozciągniętym więzadle wątrobowo-nerkowym.
   5. Wypreparować przewód żółciowy z tkanki tłuszczowej i trzustkowej. Przeciąć przewód żółciowy 1,5 cm od rozwidlenia dróg żółciowych. Wypreparuj żyłę wrotną z otaczającej tkanki tłuszczowej. Odsłonić żyłę żołądka i dwunastnicy.
   6. Podwiązać żyłę żołądkowo-dwunastniczą dwukrotnie jedwabiem 6-0 i podzielić żyłę między 2 ligatury. Wypreparuj pień trzewny i tętnicę wątrobową wspólną z otaczającej tkanki, aż ujawnią się wszystkie rami tętnicze.
   7. Uwolnij tętnicę żołądkowo-dwunastniczą od otaczającej tkanki. Zawiąż tętnicę żołądkowo-dwunastniczą dwukrotnie jedwabiem 6-0, tak aby krawaty były od siebie oddalone. Rozciąć tętnicę żołądkowo-dwunastniczą między 2 ligaturami.
   8. Uwolnij tętnicę śledzionową z otaczającej tkanki. Zawiąż tętnicę śledzionową dwukrotnie jedwabiem 6-0, tak aby więzy były od siebie oddalone. Rozetnij tętnicę śledzionową między 2 ligaturami.
   9. Uwolnij lewą tętnicę żołądkową od otaczających tkanek. Zawiąż lewą tętnicę żołądkową dwukrotnie jedwabiem 6-0, tak aby wiązania były od siebie oddalone. Wyciąć tętnicę między 2 ligaturami.
   10. Opisz dolną żyłę główną między prawą nerką a prawym bocznym płatem wątroby. Wypreparuj żyłę z przestrzeni zaotrzewnowej. Odsłoń aortę, podążając za pniem trzewnym.
   11. Wypreparuj tkankę tłuszczową zaotrzewnową. Wstrzyknąć 1000 IZ heparyny w 1 ml soli fizjologicznej do żyły głównej dolnej. Cofnij kaniulę i zamknij nacięcie wacikiem. Odczekaj 1-2 minuty na ogólnoustrojowe działanie heparyny.
   12. Opisz aortę kleszczami. Wypreparuj aortę i wykrwawij szczura. Ponadto należy wyciąć żyłę główną dolną dystalnie od nerki.
9. Kaniulacja żyły wrotnej (należy użyć kaniuli przygotowanej w punkcie 1.2)
   1. Wykonaj nacięcie w kształcie rybiego pyska w dystalnej żyle wrotnej. Otwórz nacięcie kleszczami i kaniuluj żyłę wrotną. Przepłukać wątrobę 20 ml roztworu Ringera, aż wątroba odbarwi się i przymocować kaniulę za pomocą ligatur (jedwab 6-0).
10. Kaniulacja tętnicza (należy użyć kaniuli przygotowanej w punkcie 1.3)
    1. Wypreparuj aortę nad pniem trzewnym. Uwolnij odcinek aorty z przestrzeni zaotrzewnowej. Przetnij segment aorty wzdłużnie, aby wygenerować łatkę aorty. Włóż samodzielnie zbudowaną kaniulę do statycznego uchwytu.
    2. Użyj 2 kleszczyków, aby wsunąć plaster aortalny na kaniulę. Podwiązać tętnicę wątrobową jedwabiem 6-0 nad kaniulą i przymocować plaster do łącznika.
11. Eksplantacja wątroby
    1. Otwórz przeponę, wykonaj okrągłe nacięcie i wypreparuj wątrobę z otaczających struktur.
12. składowanie
    1. Wątrobę należy przechowywać w sterylnym zbiorniku o pojemności 500 ml wypełnionym 350 ml roztworu Ringera do czasu użycia.

2. Roztwory detergentów

1. 10% roztwór podstawowy Triton X-100
   1. Napełnij butelkę o pojemności 1 000 ml 900 ml dest. wody i dodaj 100 ml Triton X-100 (99,9%). Użyj mieszadła, aby rozpuścić Triton X-100. Napełnić butelkę dest. wodą, aż do osiągnięcia całkowitej objętości 1 000 ml.
2. 1% Tryton X-100
   1. Dodać 100 ml roztworu podstawowego (10%) do butelki o pojemności 1 000 ml. Dodać 900 ml aqua dest. i dwukrotnie wstrząsnąć butelką. Przefiltruj 1% roztwór Triton X-100 przez sterylny filtr.
3. 10% roztwór podstawowy SDS
   1. Napełnij butelkę o pojemności 1 000 ml 900 ml aqua dest. i dodaj 66,99 g SDS (99,9%, gęstość 0,67). Użyj mieszadła, aby rozpuścić SDS. Napełnić butelkę dest. wodą, aż do osiągnięcia całkowitej objętości 1 000 ml.
4. 1% SDS
   1. Dodać 100 ml roztworu podstawowego (10%) do butelki o pojemności 1 000 ml. Dodać 900 ml aqua dest. i dwukrotnie wstrząsnąć butelką. Przefiltruj 1% roztwór SDS przez sterylny filtr.

3. Decelularyzacja

1. Konfiguracja urządzenia perfuzyjnego

Rysunek 1: Schemat urządzenia perfuzyjnego do selektywnej perfuzji tętniczej i żyły wrotnej czterech wątroby szczurów w warunkach ciśnienia oscylacyjnego. (zmodyfikowany z Struecker i wsp. ¹⁴)

1. Podłączyć odpływ do trójdrogowego kranu i przedłużki Heidelberger w celu regulacji poziomu napełnienia i napełnić reaktor 500 ml 0,9% NaCl.
   

Rysunek 2: Schemat konfiguracji perfuzji.Połączyć komorę perfuzyjną (1 400 cm^{3) (}1) z dystalnym końcem (4) pułapki pęcherzykowej (5) przez wrotny dostęp żylny (2) lub przez dostęp tętniczy (3). Pułapka bąbelkowa (5) powinna być wyposażona w zasłonę (4) na dystalnym końcu i odpowietrznik (6). Podłącz pułapkę bąbelkową (5) do przedłużacza Heidelberger (7). Połącz przedłużenie Heidelberger z segmentem pompy (8). Ponadto podłącz segment pompy (8) do innego rozszerzenia Heidelberger (9). Włóż ostatnie przedłużenie Heidelbergera (9) do butelki z roztworem detergentu (10). Podłącz respirator (11) do komory perfuzyjnej (lub do dystrybutora ciśnienia w przypadku wielokrotnych perfuzji). Aby spuścić płyny z reaktora, podłącz odpływ do pojemnika na odpady (12).

1. Włóż segment pompy do pompy. Uruchom pompę, aby napełnić cykl PBS, zamknij dystalny koniec pułapki bąbelkowej i otwórz odpowietrznik. Gdy dno bańki zostanie bezpiecznie pokryte PBS (2-3 cm), zamknij odpowietrznik i otwórz dystalny koniec pułapki bąbelkowej.
2. Instalacja wątroby
   1. Połącz trójdrogowy kran kaniuli żyły wrotnej z odpowiednim dostępem do reaktora. Podłącz kaniulę tętniczą do dostępu tętniczego. Uważaj, aby do systemów nie dostało się powietrze.
3. Zastosowanie warunków ciśnienia oscylacyjnego
   1. Używaj respiratora o częstotliwości 15 uderzeń na minutę i amplitudzie 26 mbar (min. 4 mbar, maks. 30 mbar). Podłącz respirator do komory dystrybucji ciśnienia i podłącz komorę do reaktora. Rozpocznij aplikację ciśnieniową.
4. Protokół decelularyzacji
   1. Wykonać etapy perfuzji z natężeniem przepływu 5 ml/min. Rozpocząć decelularyzację od perfuzji wątroby 1% Triton X-100 przez 90 minut. Pozwól, aby ścieki ścieki przez odpływ urządzenia perfuzyjnego utrzymywały stały poziom płynu wewnątrz komory perfuzyjnej i powyżej perfundowanej wątroby. Po 90 minutach zmień detergent na 1% SDS.
      
      

Rysunek 3: Protokół perfuzji dla wszystkich grup eksperymentalnych.

Wyniki

Jednorodność, a tym samym skuteczność różnych protokołów decelularyzacji, została oceniona za pomocą obserwacji makroskopowej, analizy histologicznej i analizy pozostałej zawartości DNA w zdecelularyzowanych matrycach wątroby. Ponadto wykonano odlewanie korozyjne w celu uwidocznienia nienaruszonej mikroanatomii wątroby po decelularyzacji.

Makroskopia

Podczas decelularyzacji wątroby stają się przezroczyste, co wskazuje na usunięcie zawartości komórkowej. Wątroby perf...

Dyskusja

Chociaż przedstawiona technika pobierania i decelularyzacji wątroby szczura jest łatwa do odtworzenia, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych kroków:

Podczas przygotowań do pobrania wątroby ważne jest, aby unikać ciężkiego krwawienia, ponieważ aktywuje ono krzepnięcie krwi i może prowadzić do tworzenia się skrzepów krwi w wątrobie. Naszym zdaniem korzystne jest nacięcie aorty brzusznej bezpośrednio przed kaniulacją żyły wrotnej, aby uniknąć napływu krwi przez tętnicę wątrobową podczas perfuz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Samodzielnie zbudowana kaniula tętnicza
Portex Niesterylne rurki polietylenowe	SIMS Portex	REF 800/110/100	0,28 mm ID 0,61 mm OD
Portex Niesterylne rurki polietylenowe	SIMS Portex	REF 800/110/200	0,58 mm ID 0,96 mm OD
Venodrop Bezpieczny cewnik motylkowy	Fresenius Kabi	3275851	21 G
kaniula żyły wrotnej
Cewnik żył obwodowych	BD	393224	BD Venflon Pro 20G
Zawór trójdrożny	smiths medical	888-101RE
Patyczki bawełniane	Hecht-Assistent	4302
Płatki kosmetyczne	Opatrunek chirurgiczny Shaoxing Zhengde	13H118-03
Bandaż z gazy	Hubei Haige  Instrumenty medyczne	14388
Ringer Solution	Fresenius Kabi	13 HKP022	1000 ml
10 ml Strzykawka	Braun	4606108V	10 ml/ Luer Solo
5 ml Strzykawka	Braun	4606061V	5 ml /Luer Solo
Szew (Jedwab 6/0)	Resorba	H1F	LOT 105001.81
serweta medyczna	Shaoxing Zhengde Opatrunek chirurgiczny	D0613011
chirurgiczny uchwyt na igły do narzędzi
	Geuder	17570
mikrokleszczyki	Inox-Electronic	91150-20
mikronożyczki	Martin	11-740-11
mikrokleszczyki	S& T
Zacisk	Nożyczki Aesculap	BH111R
	F S T	14501-14
kleszcze chirurgiczne	Aesculap	BD 557
Maska decelularyzacyjna
	Resmed	14.24.11.0004	SmartAIR ST
Charite, laboratorium inżynierii medycznej	na zamówienie urządzenie	decelularyzacji
pompa perystaltyczna ismatec reglo ICC	IDEX	ISM4408	4-kanałowy
Przedłużenie Heidelberger 75 cm	Fresenius Kabi	2873	75 cm
MS/CA segment	pompy IDEX	IS 3510	MS/CA/click'n'go/POM-C
Rurka CA 2-korkowa	Pharmed	BPT NSF-51
pułapka bąbelkowa		Produkt
Luer Lock złącze węża	Neolab	nr 02-1887
Detergenty
SDS granulki	Carl Roth	CN30.4	2,5 kg
Triton X-100	Carl Roth	3051.1	10 L
PBS	Gibco	14190-094	DPBS
barwienie
Eozyna 1%	Morphisto	10177
Mayer hematoksylina	AppliChem	A4840
barwienie gomori	Morphisto	11104
barwienie AlcainBlue-PAS	Morphisto	11388
Czerwień bezpośrednia 80	Sigma Aldrich	365548