Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy. Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Oko jest małym i zamkniętym organem, co czyni je idealnym celem terapii genowej. Ostatnio w terapii genowej w retinopatiach zastosowano różne strategie wykorzystujące niewirusowe i wirusowe dostarczanie genów do siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest najlepszym podejściem do dostarczania wektorów wirusowych bezpośrednio do komórek RPE. Przed rozpoczęciem badania klinicznego terapii genowej konieczne jest zweryfikowanie skuteczności terapii w modelach zwierzęcych różnych retinopatii. W ten sposób wstrzyknięcie podsiatkówkowe u myszy staje się podstawową techniką ocznej terapii genowej. W tym protokole zapewniamy łatwą i powtarzalną technikę wstrzykiwania wektorów wirusowych do siatkówki myszom eksperymentalnym. Technika ta jest modyfikowana z iniekcji doszklistkowej, która jest szeroko stosowaną techniką w klinikach okulistycznych. Reprezentatywne wyniki badania płaskiego montażu RPE/naczyniówki/twardówki pomogą zrozumieć skuteczność tej techniki oraz dostosować objętość i miano wektorów wirusowych do zakresu transdukcji genu.
Wprowadzenie
W okulistyce terapia genowa pojawiła się jako metoda leczenia monogenowych dziedzicznych retinopatii. Istnieją dziedziczne retinopatie związane z genami w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), w tym wrodzona amuroza Lebera1,2, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki3 i choroideremia4. Dziedzina badawcza terapii genowej rozwija się zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych z wykorzystaniem wektorów wirusowych, takich jak wirus związany z adenowirusem (AAV), lentiwirus (LV) i adenowirus (Ad)5. Różne wektory wirusowe mają różny tropizm w siatkówce. Aby terapia genowa była bezpieczna i skuteczn....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Association for Research in Vision and Ophthalmology dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzroku oraz wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Narodowego w Seulu oraz Komitet ds. Biochemicznego Bezpieczeństwa Szpitala Uniwersytetu Narodowego w Seulu.
1. Przygotowanie zestawu do iniekcji i wektorów wirusowych
- Przygotować strzykawkę mikrolitrową wyposażoną w tępą igłę 33 G, wysterylizowaną tlenkiem etylenu. Rozcieńczyć wektory wirusowe w PBS do odpo....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Aby ocenić skuteczność wstrzyknięcia podsiatkówkowego w zakresie transdukcji genów wirusowych zgodnie z niniejszym protokołem, zastosowano komercyjnie dostępne wektory LV z promotorem CMV wykazującymi ekspresję zarówno GFP, jak i RFP w charakterze wskaźnika. Gałki oczne wyłuszczono po odpowiednim czasie, zależnie od celu badania. W celu uzyskania reprezentatywnych wyników, oczy wyłuszczono 10 i 20 tygodni po wstrzyknięciu podsiatkówkowym. Po całkowitym usunięciu siatkówki metodą opisaną powyżej, preparat płaski kompleksu.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule wideo szczegółowo opisaliśmy technikę iniekcji podsiatkówkowej z dostępu rąbkowego wraz z reprezentatywnymi wynikami płaskiego montażu RPE/naczyniówki/twardówki. Jest to łatwa i wygodna technika podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do RPE. Bezpośrednia wizualizacja powstawania pęcherzyków podczas iniekcji jest ważnym krokiem dla dokładnego podania dla początkujących. Istnieje kilka technik wstrzykiwań podsiatkówkowych przedstawionych w Journal of Visualized Experiments8-10. Przestr.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
To badanie było wspierane przez Seoul National University Research Grant (800-20140542), Pioneer Research Program of NRF/MEST (2012-0009544), oraz Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program NRF/MEST (2009-0090895), oraz Grant NRF/MEST (2015M3A9E6028949).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| PĘSETA DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0,1 x 0,06 mm KOŃCÓWKI | WPI | 500233 | |
| VANNAS Nożyczki S/S, 105 mm | WPI | 555583S | |
| 33 G igła | WPI | NF33BL-2 | |
| Strzykawka NanoFil, 10 mikrolitrów | WPI | NANOFIL | |
| RPE-KIT | WPI | RPE-KIT | Do łatwego wstrzykiwania jedną ręką |
| 30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) BD Igła PrecisionGlideTM | BD | 305107 | Wstępne nakłucie do iniekcji podsiatkówkowej |
| Okulary nakrywkowe mikroskopu (nr 1 o średnicy 3 mm) | Warner Instruments | 64-0720 (CS-3R) | |
| Mikroskop operacyjny Leica | Leica LM M80 | ||
| Mikroskop fluoresceneinowy | Nikon | Eclipse 80i | |
| Lentivirus | Thermo scientific | TMO. LV-Ctr | Służy do rozcieńczania wektorów |
| PBS | Gibco | 10010-015 | Służy do rozcieńczania wektorów |
| Troperin (Fenylefryna 0,5% - Tropikamid 0,5%) | Hanmi | Do rozszerzania | |
| Chlorowodorek proparakainy Roztwór okulistyczny USP, 0,5% (sterylny) | Bausch& Lomb | Do znieczulenia miejscowego | |
| Healon GV OVD | Abbott Medical Optics Inc. | ||
| Zoletil 50 (hipochloryn tiletaminy i hipochlorek zolazepamu) | Virbac | Do znieczulenia ogólnego | |
| Rompun do wstrzykiwań (Ksylazyna HCl) | Bayer | Do znieczulenia ogólnego |
Bibliografia
- Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
- Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber c....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
