Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki

21.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53030

⸱

7 sierpnia 2015

 ,  ,  , 
1Department of Biomedical Sciences, Seoul National University College of Medicine, 2FARB Laboratory, Biomedical Research Institute, Seoul National University Hospital, 3College of Life Sciences, Gwangju Institute of Science and Technology, 4Department of Ophthalmology, Seoul National University College of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe to technika chirurgiczna służąca skutecznemu dostarczaniu genów do nabłonka barwnikowego siatkówki w oku myszy. Tutaj opisujemy łatwą i powtarzalną metodę subretinalnego wstrzykiwania wektorów wirusowych do nabłonka barwnikowego siatkówki u myszy eksperymentalnych.

Streszczenie

Oko jest małym i zamkniętym organem, co czyni je idealnym celem terapii genowej. Ostatnio w terapii genowej w retinopatiach zastosowano różne strategie wykorzystujące niewirusowe i wirusowe dostarczanie genów do siatkówki i nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE). Wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest najlepszym podejściem do dostarczania wektorów wirusowych bezpośrednio do komórek RPE. Przed rozpoczęciem badania klinicznego terapii genowej konieczne jest zweryfikowanie skuteczności terapii w modelach zwierzęcych różnych retinopatii. W ten sposób wstrzyknięcie podsiatkówkowe u myszy staje się podstawową techniką ocznej terapii genowej. W tym protokole zapewniamy łatwą i powtarzalną technikę wstrzykiwania wektorów wirusowych do siatkówki myszom eksperymentalnym. Technika ta jest modyfikowana z iniekcji doszklistkowej, która jest szeroko stosowaną techniką w klinikach okulistycznych. Reprezentatywne wyniki badania płaskiego montażu RPE/naczyniówki/twardówki pomogą zrozumieć skuteczność tej techniki oraz dostosować objętość i miano wektorów wirusowych do zakresu transdukcji genu.

Wprowadzenie

W okulistyce terapia genowa pojawiła się jako metoda leczenia monogenowych dziedzicznych retinopatii. Istnieją dziedziczne retinopatie związane z genami w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), w tym wrodzona amuroza Lebera1,2, barwnikowe zwyrodnienie siatkówki3 i choroideremia4. Dziedzina badawcza terapii genowej rozwija się zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i klinicznych z wykorzystaniem wektorów wirusowych, takich jak wirus związany z adenowirusem (AAV), lentiwirus (LV) i adenowirus (Ad)5. Różne wektory wirusowe mają różny tropizm w siatkówce. Aby terapia genowa była bezpieczna i skuteczna, wektory wirusowe powinny być starannie dobrane zgodnie z komórkami docelowymi i genami docelowymi.

Droga dostarczania genów jest również ważna dla skutecznego dostarczania genów do komórek docelowych, dlatego powinna być również starannie wybrana. Dwie najczęstsze metody dostarczania wektorów wirusowych do wnętrza gałki ocznej to iniekcja podsiatkówkowa i iniekcja doszklistkowa6. Ta ostatnia, iniekcja doszklistkowa, jest szeroko stosowana do dostarczania leków w leczeniu neowaskularyzacji naczyniówki w mokrym zwyrodnieniu plamki żółtej związanym z wiekiem (AMD) i obrzęku plamki żółtej w retinopatii cukrzycowej7. Droga doszklistkowa zapewnia ekspozycję wektorów wirusowych na siatkówkę szklistą i wewnętrzną, ale dyfuzja wektorów do siatkówki zewnętrznej jest ograniczona. Z drugiej strony, droga podsiatkówkowa zapewnia bezpośrednie dostarczanie wektorów wirusowych do potencjalnej przestrzeni między siatkówką a RPE, wywołując zlokalizowany pęcherzyk. Dlatego wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest obecnie uważane za bardziej efektywną drogę celowania w komórki fotoreceptorowe i RPE. Jeśli chodzi o podejście chirurgiczne, pars plana jest wybierany jako bezpieczny obszar do iniekcji doszklistkowej, aby uniknąć uszkodzenia siatkówki u ludzi. Po prostu modyfikując to podejście do myszy, mogliśmy wstrzykiwać wektory wirusowe podsiatkówkowo lub dożylnie za pomocą dostępu rąbkowego.

W tym artykule wideo pokazujemy łatwą i wygodną metodę podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych myszom RPE. Po pojedynczym nakłuciu z tyłu rąbka igłą 30 G 1/2, do przestrzeni podsiatkówkowej wprowadza się strzykawkę mikrolitrową wyposażoną w igłę o pojemności 33 G przez miejsce nakłucia rąbka. Wektory wirusowe o objętości 1,5 - 2 μl są wstrzykiwane do potencjalnej przestrzeni między siatkówką a RPE, wywołując pęcherzyki podsiatkówkowe. Zabieg ten może być wykonywany pod bezpośrednią wizualizacją przy użyciu mikroskopu operacyjnego. Powtarzana praktyka zagwarantuje powtarzalne wyniki nawet bez bezpośredniej wizualizacji powstawania pęcherzyków. Pomoże to naukowcom w przeprowadzaniu dokładnych i oszczędzających czas eksperymentów dotyczących dostarczania genów do siatkówki u myszy RPE.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem Association for Research in Vision and Ophthalmology dotyczącym wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzroku oraz wytycznymi i przepisami ustalonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Narodowego w Seulu oraz Komitet ds. Biochemicznego Bezpieczeństwa Szpitala Uniwersytetu Narodowego w Seulu.

1. Przygotowanie zestawu do iniekcji i wektorów wirusowych

  1. Przygotować strzykawkę mikrolitrową wyposażoną w tępą igłę 33 G, wysterylizowaną tlenkiem etylenu. Rozcieńczyć wektory wirusowe w PBS do odpowiedniego miana w mikroprobowce (np. 1 x 106 TU/µl). Kilkukrotnie przepłukać strzykawkę wektorami wirusowymi, aby usunąć powietrze z przestrzeni martwej strzykawki.

2. Podsiatkówkowe wstrzykiwanie wektorów wirusowych

  1. Zanurzyć dorosłe myszy (tj. w wieku 6–8 tygodni) w narkozie poprzez dostrzykłonowe podanie mieszaniny tiletaminy i zolazepamu (1:1, 2,25 mg/kg masy ciała) oraz hydrochlorku ksylazyny (0,7 mg/kg masy ciała) lub zastosować alternatywny, odpowiedni schemat znieczulenia.
  2. Rozszerzyć źrenice za pomocą kropli do oczu z fenylefryną 0,5% i tropikamidem 0,5%.
  3. Przygotować strzykawkę mikrolitrową, nabierając 1,5–2 µl wektorów wirusowych.
  4. Odsunąć powiekę i wysunąć gałkę oczną, aby odsłonić równik dla wygodnego wstrzyknięcia i ustawić ostrość pod mikroskopem operacyjnym. Utrzymać wysuniętą pozycję oka aż do zakończenia iniekcji, w przeciwnym razie podczas wstrzykiwania może dojść do przemieszczenia igły. Aby stabilnie przytrzymać gałkę oczną, należy umieścić palce na zewnątrz obrąbka oczodołu.
  5. Nanieść kroplę okulistycznego roztworu wiskoelastycznego na powierzchnię rogówki.
  6. Umieścić małe okrągłe szkiełko nakrywkowe na górnej części rogówki, aby umożliwić wizualizację siatkówki.
  7. Wykon PTA mały otwór nieco za limbusm, używając sterylnej igły 30 G 1/2, w celu późniejszej iniekcji podsiatkówkowej. Dla wygody otwór należy wykonać w części dolnej dla prawego oka i w części górnej dla lewego oka.
    UWAGA: Jeśli otwór zostanie wykonany w części skroniowej lub nosowej, trudno będzie go przykryć powieką po iniekcji. Pierwsze nakłucie powinno zostać wykonane nieco za limbusm, aby uniknąć naczyń limbalnych, które biegną wzdłuż limbusa i są łatwo rozpoznawalne. Należy uważać, aby podczas pierwszego nakłucia nie uderzyć igłą w soczewkę. Nie należy wprowadzać całej ściętej części igły, aby uniknąć przebicia soczewki.
  8. Wprowadzić tępe igłę 33 G strzykawki mikrolitrowej przez wcześniej wykonany otwór i posuwać igłę w przestrzeń podsiatkówkową do momentu wyczucia lekkiego oporu.
    UWAGA: W przypadku iniekcji podsiatkówkowej optymalny kąt prowadzenia igły wynosi około 45 stopni względem płaszczyzny tęczówki, a tępą igłę należy pchać tylnie w kierunku obszaru okołobrodawkowego. Przerywana linia kwadratu na Rysunku 1 wskazuje sugerowaną drogę igły przez jamę ciała szklistego dla iniekcji podsiatkówkowej.
    UWAGA: Podczas przebijania (lub przechodzenia przez) warstwy siatkówki nie będzie wyczuwalnego oporu, ponieważ są one bardzo miękkie. Zatem pierwsze odczucie lekkiego oporu wskazuje, że igła dotknęła już warstwy RPE i należy przerwać wprowadzanie igły. Należy uważać, aby nie przebić tkanki twardówki nadmiernym naciskiem, ponieważ igła powinna zostać umieszczona w potencjalnej przestrzeni podsiatkówkowej. Jeśli igła przebije tkankę twardówki zbyt dużą siłą, wejdzie ona bez oporu w okołogałkowe przestrzenie oczodołu. (Ten krok jest krytyczny)

Schemat przekroju ludzkiego oka z zaznaczonymi rogówką, soczewką, siatkówką, nerwem wzrokowym oraz drogą wprowadzenia igły.
Rysunek 1. Schematiczny schemat wstrzyknięcia podsiatkówkowego.Przekrój oka myszy barwiony H&E, przedstawiający struktury z zaznaczoną drogą wprowadzenia igły do wstrzyknięcia podsiatkówkowego (punktowy kwadrat). Powiększenie: 40X, pasek skali: 500 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Delikatnie wstrzyknij wektory wirusowe (t.j. 1 x 106 TU/µl) do przestrzeni podsiatkówkowej, unikając drżeń, aby zapobiec niepożądanym uszkodzeniom tkanki, a następnie powoli wycofaj igłę. Podczas wstrzykiwania mocno przytrzymaj gałkę oczną, zgodnie z opisem w punkcie 2.4.
  2. Pod mikroskopem operacyjnym obserwuj powstanie pęcherza podsiatkówkowego po wstrzyknięciu, aby upewnić się, że nie wystąpiło krwawienie z siatkówki.

Zbliżenie oka ryby, tworzenie się zaćmy, obraz mikroskopowy, analiza zmętnienia soczewki.
Rysunek 2. Powstanie pęcherza podsiatkówkowego bez krwotoku do siatkówki.Widok mikroskopowy pęcherza podsiatkówkowego po wstrzyknięciu podsiatkówkowym pod mikroskopem operacyjnym wykazuje prawidłowe powstanie pęcherza bez wystąpienia krwotoku do siatkówki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Delikatnie zamknij powiekę, aby przykryć miejsce wstrzyknięcia w celu zapewnienia samouszczelnienia. Zwróć myszy do klatki macierzystej i utrzymuj je przy życiu aż do momentu oceny.
    UWAGA: Po zapoznaniu się badaczy z procedurami, mogą oni uzyskać powtarzalne wyniki przy użyciu szybkich procedur, pomijając te etapy (2.5, 6 i 10)

3. Ocena skuteczności dostarczania genów do nabłonka pigmentowego siatkówki

  1. Uśmierć myszy w komorze z CO2. Wyłuskaj gałki oczne za pomocą nożyczek.
  2. Utrwal gałki oczne w 4% roztworze paraformaldehydu w temperaturze 4 °C przez minimum 1 h lub do kilku dni.
  3. Chwyć rogówkę precyzyjną pęsetą i nakłuj ją mikro-nożyczkami. Usuń rogówkę, rozcinając ją wzdłuż limbusa. Usuń soczewkę za pomocą pęsety.
  4. Przytnij ciało rzęskowe mikro-nożyczkami, aby umożliwić odwarstwienie siatkówki. Delikatnie oddziel całą siatkówkę od kompleksu nabłonka pigmentowego siatkówki (RPE)/naczyniówki/twardówki. Przetnij kompleks RPE/naczyniówki/twardówki promieniście od obwodu do centrum, w pobliżu nerwu wzrokowego, kilka razy, aby uzyskać od 4 do 8 płatów do montażu na płasko.
  5. Odwróć kompleks RPE/naczyniówki/twardówki stroną RPE do dołu i usuń wszystkie pozostałe tkanki po stronie twardówki, w tym mięśnie, spojówkę i nerw wzrokowy. Krok ten jest istotny dla uzyskania płaskiego kompleksu RPE/naczyniówki/twardówki, ponieważ każda pozostała tkanka powoduje nierówność preparatu.
  6. Inkubuj kompleks z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi zgodnie z celami badawczymi (opcjonalnie, szczegółowe metody znajdują się w literaturze). Zamontuj kompleksy RPE/naczyniówki/twardówki na płasko na szkiełku przedmiotowym i odsącz PBS za pomocą gąbki absorpcyjnej.
  7. Dodaj 30 µl medium montażowego i nałóż szkiełko nakrywkowe. Zaobserwuj próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu oceny skuteczności dostarczenia wektora. Przechowuj próbki w lodówce do dalszych obserwacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ocenić skuteczność wstrzyknięcia podsiatkówkowego w zakresie transdukcji genów wirusowych zgodnie z niniejszym protokołem, zastosowano komercyjnie dostępne wektory LV z promotorem CMV wykazującymi ekspresję zarówno GFP, jak i RFP w charakterze wskaźnika. Gałki oczne wyłuszczono po odpowiednim czasie, zależnie od celu badania. W celu uzyskania reprezentatywnych wyników, oczy wyłuszczono 10 i 20 tygodni po wstrzyknięciu podsiatkówkowym. Po całkowitym usunięciu siatkówki metodą opisaną powyżej, preparat płaski kompleksu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym artykule wideo szczegółowo opisaliśmy technikę iniekcji podsiatkówkowej z dostępu rąbkowego wraz z reprezentatywnymi wynikami płaskiego montażu RPE/naczyniówki/twardówki. Jest to łatwa i wygodna technika podsiatkówkowego wstrzykiwania wektorów wirusowych do RPE. Bezpośrednia wizualizacja powstawania pęcherzyków podczas iniekcji jest ważnym krokiem dla dokładnego podania dla początkujących. Istnieje kilka technik wstrzykiwań podsiatkówkowych przedstawionych w Journal of Visualized Experiments8-10. Przestr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez Seoul National University Research Grant (800-20140542), Pioneer Research Program of NRF/MEST (2012-0009544), oraz Bio-Signal Analysis Technology Innovation Program NRF/MEST (2009-0090895), oraz Grant NRF/MEST (2015M3A9E6028949).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PĘSETA DUMONT #5 11cm DUMOSTAR 0,1 x 0,06 mm KOŃCÓWKIWPI500233
VANNAS Nożyczki S/S, 105 mmWPI555583S
33 G igłaWPINF33BL-2
Strzykawka NanoFil, 10 mikrolitrów WPINANOFIL
RPE-KITWPIRPE-KITDo łatwego wstrzykiwania jedną ręką
30 G x 1/2 (0,3 mm x 13 mm) BD Igła PrecisionGlideTMBD305107Wstępne nakłucie do iniekcji podsiatkówkowej
Okulary nakrywkowe mikroskopu (nr 1 o średnicy 3 mm)Warner Instruments64-0720  (CS-3R)
Mikroskop operacyjny LeicaLeica LM M80
Mikroskop fluoresceneinowyNikonEclipse 80i
LentivirusThermo scientificTMO. LV-CtrSłuży do rozcieńczania wektorów
PBSGibco10010-015Służy do rozcieńczania wektorów
Troperin (Fenylefryna 0,5% - Tropikamid 0,5%)HanmiDo rozszerzania
Chlorowodorek proparakainy Roztwór okulistyczny USP, 0,5% (sterylny)Bausch& LombDo znieczulenia miejscowego
Healon GV OVDAbbott Medical Optics Inc.
Zoletil 50 (hipochloryn tiletaminy i hipochlorek zolazepamu)VirbacDo znieczulenia ogólnego
Rompun do wstrzykiwań (Ksylazyna HCl)BayerDo znieczulenia ogólnego

Bibliografia

  1. Maguire, A. M., et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med. 358 (21), 2240-2248 (2008).
  2. Jacobson, S. G., et al. Gene therapy for leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years. Arch Ophthalmol. 130 (1), 9-24 (2012).
  3. Conlon, T. J., et al. Preclinical potency and safety studies of an AAV2-mediated gene therapy vector for the treatment of MERTK associated retinitis pigmentosa. Hum Gene Ther Clin Dev. 24 (1), 23-28 (2013).
  4. MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet. 383 (9923), 1129-1137 (2014).
  5. Trapani, I., Puppo, A., Auricchio, A. Vector platforms for gene therapy of inherited retinopathies. Prog Retin Eye Res. 43, 108-128 (2014).
  6. Liang, F. Q., Anand, V., Maguire, A. M., Bennett, J. Intraocular delivery of recombinant virus. Methods Mol Med. 47, 125-139 (2001).
  7. Peyman, G. A., Lad, E. M., Moshfeghi, D. M. Intravitreal injection of therapeutic agents. Retina. 29 (7), 875-912 (2009).
  8. Matsumoto, H., Miller, J. W., Vavvas, D. G. Retinal detachment model in rodents by subretinal injection of sodium hyaluronate. J Vis Exp. (79), (2013).
  9. Wert, K. J., Skeie, J. M., Davis, R. J., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye. J Vis Exp. (69), (2012).
  10. Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal transplantation of MACS purified photoreceptor precursor cells into the adult mouse retina. J Vis Exp. (84), e50932(2014).
  11. Sahel, J. A., Roska, B. Gene therapy for blindness. Annu Rev Neurosci. 36, 467-488 (2013).
  12. Allocca, M., et al. Novel adeno-associated virus serotypes efficiently transduce murine photoreceptors. J Virol. 81 (20), 11372-11380 (2007).
  13. Takahashi, K., et al. Sustained transduction of ocular cells with a bovine immunodeficiency viral vector. Hum Gene Ther. 13 (11), 1305-1316 (2002).
  14. Rolling, F., et al. Gene therapeutic prospects in early onset of severe retinal dystrophy: restoration of vision in RPE65 Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Bull Mem Acad R Med Belg. 161 (10-12), 497-508 (2006).
  15. Le Meur, G., et al. Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium. Gene Ther. 14 (4), 292-303 (2007).
  16. Alexander, J. J., Hauswirth, W. W. Adeno-associated viral vectors and the retina. Adv Exp Med Biol. 613, 121-128 (2008).
  17. Puche, N., et al. Genetic and environmental factors associated with reticular pseudodrusen in age-related macular degeneration. Retina. 33 (5), 998-1004 (2013).
  18. Campochiaro, P. A. Gene transfer for neovascular age-related macular degeneration. Hum Gene Ther. 22 (5), 523-529 (2011).
  19. Park, S. W., et al. Intracellular amyloid beta alters the tight junction of retinal pigment epithelium in 5XFAD mice. Neurobiol Aging. 35 (9), 2013-2020 (2014).
  20. Shin, B., et al. Intracellular cleavage of amyloid beta by a viral protease NIa prevents amyloid beta-mediated cytotoxicity. PLoS One. 9 (6), e98650(2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Myszy w terapii genowejmikroskopia immunofluorescencyjnadostarczanie wektorów wirusowychpreparat płaski RPEmiano wektora wirusowegoprzestrzeń podsiatkówkowa
Podejście rąbkowe - podsiatkówkowe wstrzyknięcie wektorów wirusowych do terapii genowej u myszy Nabłonek barwnikowy siatkówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.